Jonathan P. Fadok, 1,2 Tavis MK Dickerson, 2 e Richard D. Palmiter2 *
J Neurosci. Manuscrito do autor; disponível no PMC 2010 March 9.
Publicado na forma final editada como:
J Neurosci. 2009 setembro 9; 29 (36): 11089 – 11097.
doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1616-09.2009.
1 Programa de Pós-Graduação em Neurobiologia e Comportamento, Universidade de Washington, Seattle, WA 98195
2 Departamento de Bioquímica e Instituto Médico Howard Hughes, Universidade de Washington, Seattle, WA, 98195
* Correspondência deve ser dirigida a: Richard D. Palmiter, HHMI e Departamento de Bioquímica, Box 357370, Universidade de Washington, Seattle, WA 98195. O email: [email protected]
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Sumário
A dopamina (DA) está implicada em muitos comportamentos, incluindo a função motora, cognição e processamento de recompensa; no entanto, o papel do DA no processamento do medo permanece ambíguo. Para examinar o papel do DA na aprendizagem relacionada ao medo, camundongos com deficiência de dopamina (DD) foram testados em um paradigma de sobressalto potencializado pelo medo. A síntese de DA pode ser restaurada em camundongos DD através da administração de 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-Dopa), permitindo assim a avaliação do processamento do medo em um estado depletado ou -repletado por DA. O sobressalto potenciado pelo medo estava ausente nos camundongos DD, mas poderia ser restaurado pela administração de L-Dopa imediatamente após o condicionamento pelo medo. A restauração seletiva mediada por vírus da síntese de DA na área tegmentar ventral restaurou completamente o aprendizado do medo em camundongos DD e a restauração da síntese de DA para neurônios DA projetando-se para a amígdala basolateral restaurando a memória de curto prazo, mas não a memória de longo prazo ou sensibilização a choques. Nós também demonstramos que o receptor DA D1 (D1R) e os receptores tipo D2 são necessários para o aprendizado de medo dependente de sinalização.
Esses achados indicam que DA atuando em múltiplos subtipos de receptores dentro de múltiplas regiões alvo facilita a estabilização da memória do medo.
Palavras-chave: Dopamina, medo, sobressalto potencializado pelo medo, amígdala, receptor D1 de dopamina, receptor D2 de dopamina
Introdução
O neuromodulador DA é importante para o aprendizado relacionado à recompensa e o comportamento de busca de drogas (Schultz, 2002; Wise, 2004), e evidências acumuladas sugerem que DA também pode ser importante para a aprendizagem relacionada ao medo (Lamont e Kokkinidis, 1998; Guarraci e cols. 1999; Greba e Kokkinidis, 2000; Guarraci e outros, 2000; Greba e outros, 2001; Pezze e Feldon, 2004; de Oliveira e outros, 2006). Os neurônios DA do mesencéfalo ventral se projetam para áreas do cérebro límbico, importantes para o aprendizado do medo, e os níveis DA nessas áreas do cérebro aumentam durante eventos aversivos (Abercrombie et al., 1989; Kalivas e Duffy, 1995; Doherty e Gratton, 1997; Inglis e Moghaddam , 1999). Além disso, alguns neurônios DA do mesencéfalo aumentam suas taxas de disparo para estímulos aversivos e dicas preditivas (Guarraci e Kapp, 1999; Horvitz, 2000; Joshua et al., 2008). Além disso, o DA mostrou facilitar a potencialização a longo prazo, um correlato neural chave da memória, em áreas críticas para o medo da aprendizagem, como o hipocampo e a amígdala (Bissiere et al., 2003; Lemon e Manahan-Vaughan, 2006; Swant e Wagner, 2006).
Apesar do progresso feito em relação à fisiologia neuronal da DA ao medo, o papel preciso da DA e seus receptores cognatos na aprendizagem relacionada ao medo permanece sem solução. Injeções de antagonistas do tipo D1R sistemicamente, ou na amígdala, mostraram bloquear a aquisição ou expressão de aprendizado relacionado ao medo; entretanto, outros mostraram que esses medicamentos não têm efeito (Guarraci et al., 1999; Greba e Kokkinidis, 2000; de Oliveira et al., 2006). Além disso, os agonistas do tipo D1R mostraram aumentar ou não ter efeito sobre o condicionamento pelo medo (Guarraci et al., 1999; Greba et al., 2000; Inoue et al., 2000; de Oliveira et al., 2006). Discrepâncias análogas foram encontradas em estudos utilizando agonistas ou antagonistas para receptores do tipo D2R (Guarraci et al., 2000; Greba et al., 2001; Ponnusamy et al., 2005; de Oliveira et al., 2006). Estas discrepâncias podem ser devidas a metodologia comportamental, efeitos dose-dependentes de drogas injetáveis ou diferenças na escolha de agentes farmacológicos. Por exemplo, os antagonistas do receptor DA variam muito em sua seletividade, enquanto alguns estudos podem antagonizar mais seletivamente os receptores D2, outros podem estar antagonizando mais amplamente os receptores D2, D3 e D4 (Missale et al., 1998).
Para elucidar o papel do DA na aprendizagem relacionada ao medo, utilizamos camundongos sem DA (camundongos DD), assim como camundongos sem os receptores D1R ou DA D2 (D2R), e os testamos em um paradigma de sobressalto potencializado pelo medo. O medo potencializado pelo medo é um paradigma de condicionamento de medo pavloviano, no qual um estímulo neutro provoca um aumento na resposta de sobressalto acústico após pares com um choque nas patas (Koch, 1999). O medo potencializado pelo medo é um paradigma ideal para esses estudos, porque não depende de uma avaliação do comportamento de congelamento, que é difícil de medir em camundongos DD hipoativos (Zhou e Palmiter, 1995). Como os camundongos DD podem ser estudados em um estado depletado ou em DA, eles fornecem uma oportunidade ideal para estudar o papel do DA na aprendizagem e na formação da memória. Al disso, utilizando a distribuio mediada por vus da recombinase Cre, a sinalizao DA pode ser selectivamente restabelecida para regis alvo especicas por reactivao de um alelo Th de ratinhos DD (Hnasko et al., 2006). A restauração seletiva de DA para áreas alvo específicas permite a avaliação de regiões do cérebro reguladas pela sinalização DA durante o condicionamento pelo medo.
Materiais e Métodos
Animais e tratamentos
Camundongos DD foram gerados como descrito (Hnasko et al., 2006). Resumidamente, ratinhos DD (Thfs / fs; DbhTh / +) possuem dois alelos de tirosina hidroxilase (Th) não funcionais, que foram inactivados através da inserção de um gene de resistência à neomicina (NeoR) flanqueado por sítios Lox P no primeiro intrão do gene Th. . Esses camundongos também possuem um alelo de β-hidroxilase (Dbh) de dopamina intacto e um alelo de Dbh com uma inserção direcionada do gene Th. Os animais de controlo possuem pelo menos um alelo Th intacto e um alelo Dbh intacto. Níveis de catecolaminas não dopaminérgicas são normais em animais DD e os níveis de todas as catecolaminas são normais em animais de controlo (Zhou e Palmiter, 1995; Szczypka et al., 1999). Os ratinhos foram mantidos num meio genético C57BL / 6 X 129 / Sv. Devido à hipofagia grave, os ratinhos DD foram injetados diariamente (ip) com L-Dopa a 50 mg / kg, com um volume de 33 μl / g (Zhou e Palmiter, 1995), começando aproximadamente no dia pós-natal 10. Essas injeções restauram a função DA de 8 para 10 h (Szczypka et al., 1999). Foram descritos camundongos knockout de D1R (KO) e D2R KO (Drago et al., 1994; Kelly e outros, 1997). Ambas as estirpes foram mantidas num fundo C57BL / 6. Devido ao retardo de crescimento em camundongos D1R KO, eles foram desmamados em quatro semanas e, em seguida, receberam alimento umedecido para promover o crescimento. Todos os animais foram genotipados por análise de PCR. Camundongos machos e fêmeas foram submetidos a testes comportamentais entre as idades de 2-5 meses. Todos os ratinhos foram alojados sob um ciclo 12: 12 (claro: escuro) num ambiente de temperatura controlada com alimentos (5LJ5; PMI Feeds, St. Louis, MO) e água disponível ad libitum. Todos os experimentos comportamentais foram realizados durante o ciclo de luz. Todos os camundongos foram tratados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde e pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidados com Animais da Universidade de Washington.
Para avaliar se outros receptores do tipo D2 são importantes para a aprendizagem do medo, os ratos D2R KO receberam a eticloprida antagonista tipo D2 (Sigma, St. Louis, MO) a 0.5 mg / kg (ip). A eticloprida foi dissolvida em solução salina a 0.9% e foi administrada num volume final de 10 μl / g. Os ratinhos do tipo selvagem D2R (WT) foram injectados com veículo.
Aparelho
Câmaras de som atenuadoras de som (SR-Lab, San Diego Instruments, San Diego, CA) foram usadas para medir a inibição de prepulso, as respostas de sobressalto e o sobressalto potencializado pelo medo. Para as respostas de sobressalto, as leituras 65 1-msec foram tomadas, começando no início do pulso. Para medir a resposta ao choque nas patas, foram feitas leituras 500 1-msec, começando no início do choque. A amplitude de pico da resposta foi usada para calcular a inibição do prepúcio, respostas de sobressalto, sobressalto potencializado pelo medo e reatividade ao choque. O som do ruído branco foi produzido por um alto-falante de alta freqüência localizado no teto da câmara. O som de fundo foi mantido em um nível constante de 65 dB. Os níveis de som foram medidos em decibéis (escala A) usando um leitor de nível de som (RadioShack, Fort Worth, TX). Uma unidade de calibração foi usada para garantir a integridade das leituras de resposta de sobressalto (San Diego Instruments, San Diego, CA). Uma luz 8-watt foi montada na parede traseira da caixa de alarme para uso como sugestão.
Curvas de resposta de sobressalto
Após um período de habituação 5-min, os animais foram apresentados a uma série de sete tentativas com níveis sonoros crescentes: de 80 a 120 dB, com um ITI de 30 sec. Esta série foi apresentada vezes 10 para um total de ensaios 70. Em todas as tentativas, exceto em ensaios nulos nos quais não havia som, o pulso de som era 40 mseg.
Inibição pré-pulso
Aos animais foi dado um período de habituação 10-min após o qual os indivíduos foram apresentados com 5 40-mseg, 120-dB, ensaios de pulso isolados. Os ratos foram então apresentados com ensaios 50 de um ensaio de pulso de sobressalto sozinho, um dos três testes prepulse (5, 10 e 15-dB acima do fundo), ou um ensaio nulo em que não houve estímulo acústico. O intervalo intertrial (ITI) foi em média 15 sec (intervalo 5 – 25 sec). Um teste de sobressalto consistiu em um pulso 40-mseg, 120-dB de ruído branco. Os ensaios em Prepulse consistiram num pré-impulso de 20-mseg de intensidade 70, 75 ou 80-dB, que precedeu o pulso 40-ms de 120 por 100 mseg. A inibição de Prepulse foi calculada para cada nível de prepúcio usando a seguinte fórmula:% de inibição = [(resposta de sobressalto média no teste de prepulse / resposta de sobressalto média no ensaio de pulso isolado) × 100]. Os ratinhos DD foram testados num estado esgotado em DA, 18-24 h após injecção de L-Dopa.
Surto potencializado pelo medo (paradigma do dia 7)
No dia 1 (linha de base), após um período de habituação 5-min, os ratos receberam uma série de ensaios 20 pseudo-aleatoriamente ordenados, divididos uniformemente entre as condições de sinalização e sem sinal. Para ensaios sem sugestão, os animais foram apresentados com um pulso acústico 40-msec, 105-dB. Para os ensaios de sinalização, os animais foram apresentados com um sinal luminoso 10-sec, que foi co-terminado com um impulso 40-mseg, 105-dB. O ITI calculou a média 120 segundo (alcance 60 a 180 segundo).
O treinamento ocorreu nos dias 2, 4 e 6. Após um período de habituação 10-min, os ratos receberam apresentações 10 da luz indicadora, que co-terminou com um choque de choque 0.2-mA, 0.5-sec. O ITI calculou a média 120 segundo (alcance 60 a 180 segundo). As sessões de teste ocorreram nos dias 3, 5 e 7 e foram idênticas à sessão da linha de base descrita acima. Os camundongos DD estavam em estado depletado por DA, 18 para 24 h após sua última injeção de L-Dopa, durante as sessões de linha de base, treinamento e testes. A L-Dopa foi injetada após as sessões de treinamento, conforme indicado nas legendas das figuras. A fórmula a seguir foi usada para calcular o sobressalto potencializado pelo medo:% potenciação = [(média de respostas em tentativas de sinalização / média de respostas em ensaios sem sinalização-1) × 100].
Surto potencializado pelo medo (paradigma do dia 3)
Os dias 1 e 3 (linha de base e teste) deste paradigma foram idênticos aos descritos para o paradigma de sobressalto potencializado pelo medo do dia 7. No dia 2 (treinamento), os ratos receberam 30 emparelhamentos da luz de sinalização 10-sec com um choque automático 0.2-mA, 0.5-sec. A média do ITI foi de 120 seg (intervalo de 60 a 180 seg). Camundongos DD foram depleted DA durante a linha de base, treinamento e testes.
Memória de curto prazo
As sessões de linha de base e de teste foram idênticas às descritas para o paradigma do dia 7. No dia 2, após um período de habituação 5-min, os ratos receberam pares de 30 de uma luz de sinal 10-sec, que co-terminou com um choque de pé 0.5-sec, 0.2-mA. O ITI calculou a média 120 segundo (alcance 60 a 180). Após o treino, os ratos foram colocados nas suas gaiolas para 10 min antes do teste. A memória de curto prazo foi avaliada utilizando a mesma fórmula usada para o sobressalto potencializado pelo medo.
Sensibilização por Choque
As respostas à condição sem pistas durante a sessão de memória de curto prazo e sessões de teste foram calculadas para cada animal e a seguinte fórmula foi usada para calcular a sensibilização ao choque:% de sensibilização = [(resposta média de sobressalto durante o teste / resposta média de sobressalto na linha de base) 1) × 100].
Restauração mediada por recombinase Cre da função do gene Th
Os camundongos anestesiados com isoflurano (1.5-5%) foram colocados em um instrumento estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Para o restabelecimento da função do gene Th na área tegmentar ventral, o vírus recombinante AAV1-Cre-GFP (titulado em 1.2 × 1012 partículas / ml) foi injetado bilateralmente no mesencéfalo ventral (coordenadas em mm: 3.5 posterior a Bregma, 0.5 lateral à linha média , 4.5 ventral para Bregma; 0.5 μl / hemisfério). Para a restauração específica de BLA DA, o vírus Recombinant CAV2-Cre (titulado em 2.1 × 1012 partículas / ml) foi injetado bilateralmente (coordenadas em mm: 1.5 posterior a Bregma, 3.25 lateral à linha média, 5 ventral a Bregma; 0.5 μl / hemisfério) . Descrições detalhadas de ambos os vetores virais foram publicadas (Hnasko et al., 2006; Zweifel et al., 2008). Os vírus foram injectados durante um período de 10-min usando uma agulha de seringa de calibre 32 (Hamilton, Reno, NV) ligada a uma bomba de micro-infusão (WPI, Sarasota, FL).
Imunohistoquímica
Após a anestesia com 50 mg / ml de pentobarbital sódico (0.2-0.3ml / animal), os ratinhos foram perfundidos transcardiamente com solução salina tamponada com fosfato, seguido de 4% paraformaldeído em solução salina tamponada com fosfato. Os cérebros dissecados foram pós-fixados em 4% paraformaldeído durante a noite, crioprotegidos em 30% de sacarose em solução salina tamponada com fosfato e depois congelados rapidamente em isopentano. Secções coronais de flutuação livre (30 μm) foram imunocoradas com anticorpos anti-TH de ratinho (1: 1000, Chemicon) ou anti-TH de coelho (1: 2000, Chemicon). A imunofluorescência foi conseguida utilizando anticorpos secundários IgG conjugados com Cy2 ou Cy3 (1: 200, Jackson ImmunoResearch). Secções coradas foram montadas em lâminas, cobertas com lamínulas e fotografadas com um microscópio vertical claro (Nikon).
Análise estatística
As análises realizadas incluíram ANOVA de medidas repetidas e one-way, Fisher post-hoc e testes t de Student, como observado nos resultados. A análise estatística foi realizada utilizando o software Statistica (Statsoft, Tulsa, Oklahoma).
Consistentes
Camundongos DD apresentam resposta de sobressalto acústica intacta e inibição normal de prepulse
O sobressalto potencializado pelo medo requer respostas de sobressalto acústicas intactas e ativação sensório-motora. Para determinar se a resposta de sobressalto acústico é alterada na ausência de DA, as respostas dos camundongos DD com depleção de DA (18 a 24 h após L-Dopa) a níveis múltiplos de decibéis foram medidas e comparadas com controles (Figura 1A). Medidas repetidas ANOVA não mostraram efeito principal do genótipo e nenhuma interação significativa entre genótipo e nível sonoro.
Figura 1
DA é crítico para aprender o sobressalto potencializado pelo medo. A, Resposta acústica de sobressalto de controle (n=10, quadrados pretos) e camundongos DD (n=10, quadrados abertos) a diferentes intensidades sonoras. As respostas são relatadas em unidades arbitrárias. B, A inibição do pré-pulso foi testada em 3 intensidades diferentes de pré-pulso em camundongos controle (n=10, barras pretas) e DD (n=10, barras abertas). Asteriscos denotam p<0.05, ANOVA de medidas repetidas. C, Esquema ilustrando o paradigma de sobressalto potencializado pelo medo de 7 dias. Nos dias de linha de base e teste, os camundongos receberam 10 apresentações sem sinal (apresentação de duração de 40 ms de um pulso de sobressalto de 105 dB) e 10 apresentações de testes de sinal (sinal de luz de 10 segundos coterminando com o pulso de sobressalto) em ordem pseudoaleatória. Em dias de treinamento, os camundongos receberam 10 pares de sinais luminosos de 10 segundos que co-terminaram com duração de 0.5 segundos, choque nas patas de 0.2 mA. O aprendizado foi avaliado em dias de teste como uma porcentagem de potencialização em testes de sinais quando comparados a testes sem sinais. D, camundongos DD (n=10, barras abertas) que receberam L-Dopa 3 horas após o treinamento (dia 2 e 4) falharam em aprender (Teste 1 e 2). No entanto, quando os camundongos DD foram injetados imediatamente após o treinamento (dia 6), eles apresentaram um susto significativo potencializado pelo medo (Teste 3). Os asteriscos denotam p<0.05, ANOVA de medidas repetidas. E, Medidas de reatividade ao choque durante as sessões de treinamento (Controle n=10, barras pretas; DD n=10, barras abertas). As respostas são relatadas em unidades arbitrárias. F, Esquema ilustrando o paradigma de susto potencializado pelo medo de 3 dias usado para determinar o período de tempo crítico em que o DA é importante. Todos os 30 pares de estímulo-choque foram dados em um dia de treinamento e os camundongos DD foram tratados com L-Dopa imediatamente, 1 hora ou 3 horas após o treinamento. G, Apenas o controle (n = 8, barras pretas sólidas, C) e os camundongos DD injetados imediatamente após o treinamento (n = 7, listras verticais, 0 hora) exibiram sobressalto potencializado pelo medo no dia do teste. Este nível de sobressalto potencializado pelo medo foi significativamente maior do que o observado nos camundongos DD que receberam L-Dopa 1 hora (n = 6, listras diagonais) ou 3 horas (n = 6, barras abertas) após o treinamento. Os asteriscos denotam p < 0.05 quando comparados à linha de base, post-hoc de Fisher. Todos os valores relatados são médias ± SEM. Os camundongos DD e controle com DA esgotada também foram testados em um paradigma de inibição de pré-pulso, que é comumente usado para detectar déficits na ativação sensório-motora. A inibição do pré-pulso foi aumentada em camundongos DD (Figura 1B; medidas repetidas ANOVA, genótipo: F1, 18=5.37; p<0.05; nenhuma interação significativa do genótipo pelo nível do pré-pulso foi detectada). Esses dados indicam que camundongos DD não têm déficits em respostas de sobressalto ou diminuições em mecanismos de controle sensório-motor enquanto estão em um estado de depleção de DA e validam seu uso em experimentos de sobressalto potencializados pelo medo.
A dopamina é necessária em um momento crítico para a aprendizagem de sobressaltos potencializados pelo medo
Para determinar se o DA é necessário para aprender uma tarefa de condicionamento de medo, camundongos DD e controle foram submetidos a um paradigma de sobressalto potencializado por medo de 7 dias (Figura 1C). Camundongos DD foram treinados e testados em um estado de depleção de DA. Quando testados 24 horas após o treinamento, camundongos controle exibiram sobressalto potencializado por medo após uma única sessão de treinamento que não foi observada em camundongos DD (Figura 1D; medidas repetidas ANOVA, genótipo, F1, 18=7.4590, p<0.05). Mesmo após uma sessão de treinamento adicional, camundongos DD falharam em expressar sobressalto potencializado por medo, enquanto camundongos controle continuaram a expressar aprendizado robusto. Curiosamente, quando receberam L-Dopa imediatamente após o treinamento no dia 6, camundongos DD mostraram sobressalto potencializado por medo que foi significativamente maior do que a linha de base (ANOVA unidirecional F1, 18=9.1999, p<0.01) e não diferiu dos níveis de controle (Figura 1D). A reatividade ao choque em dias de treinamento para camundongos DD e controle não foi significativamente diferente entre genótipos em nenhum dia de treinamento, indicando que o déficit de aprendizagem em camundongos DD não foi devido à incapacidade de sentir o choque nas patas (Figura 1E). Para caracterizar a janela de tempo crítica para a ação do DA, um estudo adicional variou o tempo de administração de L-Dopa. Camundongos DD e controle receberam uma sessão de treinamento consistindo de 30 pares de choque leve (Figura 1F) e então injetados com L-Dopa imediatamente, 1 hora ou 3 horas após o treinamento e foram testados 24 horas depois. Camundongos DD injetados imediatamente após o treinamento expressaram um forte sobressalto potencializado pelo medo no dia do teste, semelhante ao dos controles, enquanto os camundongos DD injetados com L-Dopa 1 hora ou 3 horas após o treinamento não mostraram aprendizagem (Figura 1G; medidas repetidas ANOVA; tratamento × sessão F3, 23 = 5.1032, p < 0.01). Esses dados indicam que DA é necessário dentro de um período de tempo finito para o aprendizado em um paradigma de sobressalto potencializado pelo medo. No entanto, DA não é necessário para a expressão da memória de medo sinalizada, pois os animais DD sempre foram testados na ausência de DA. Além disso, a ausência de DA não prejudica a reatividade ao choque.
D1R é necessário para o sobressalto potencializado pelo medo
Para explorar quais receptores DA são necessários para o sobressalto potencializado pelo medo, primeiro analisamos camundongos D1R KO. Camundongos D1R KO e controle, do tipo selvagem (WT) foram testados em vários níveis de intensidade de pulso de sobressalto, conforme descrito para camundongos DD (Figura 2A). Não houve diferença significativa entre camundongos D1R KO e WT em nenhum nível de som testado, indicando que camundongos D1R KO têm uma resposta de sobressalto acústica intacta. Em concordância com estudos anteriores, observamos inibição intacta do pré-pulso em camundongos D1R KO (Ralph-Williams et al., 2002). Quando testados no paradigma de sobressalto potencializado pelo medo de 7 dias, os camundongos D1R KO falharam em expressar aprendizado em nenhum dos dias de teste (Figura 2B; medidas repetidas ANOVA genótipo × dia de teste F3, 48 = 6.28; p < 0.01), enquanto os camundongos WT tiveram sobressalto potencializado pelo medo significativo nos dias de teste 2 e 3 (p < 0.05 e p < 0.01, linha de base de controle versus teste 2 e 3, respectivamente, Fisher post-hoc). Os camundongos D1R KO tiveram maior reatividade ao choque do que os WT em todos os três dias de treinamento (Figura 2C; medidas repetidas ANOVA, genótipo F1, 16 = 10.18; p < 0.01; nenhum genótipo significativo × dia de treinamento foi observado). Assim, embora os camundongos D1R KO tenham respostas elevadas ao choque nas patas em comparação aos camundongos WT, eles prejudicaram significativamente o sobressalto potencializado pelo medo, mesmo após 3 dias de treinamento. Esses dados indicam um comprometimento da aprendizagem em animais D1R KO e implicam o D1R na mediação dos efeitos do DA no condicionamento do medo dependente de pistas. Figura 2 Camundongos D1R KO têm aprendizado significativamente prejudicado. A, Resposta de sobressalto acústico de camundongos D1R WT (n=9, quadrados pretos) e KO (n=9, quadrados abertos). B, Resultados do paradigma de sobressalto potencializado pelo medo de 7 dias com camundongos D1R. Camundongos D1R WT (n=9, barras pretas sólidas), mas não camundongos D1R KO (n=9, barras abertas), apresentaram sobressalto potencializado pelo medo no dia 3 do teste. Os asteriscos denotam p<0.01, comparando KO a WT, Fisher post-hoc. C, Medidas de reatividade ao choque. Camundongos D1R KO (n=9, barras abertas) têm respostas mais altas ao choque nas patas do que WT (n=9, barras sólidas). Os asteriscos denotam p<0.05, ANOVA de medidas repetidas. Todos os valores relatados são médias ± SEM. Para respostas de sobressalto e reatividade ao choque, os números são relatados em unidades arbitrárias.
O sobressalto potencializado pelo medo está intacto em ratos D2R KO, mas requer outros receptores semelhantes a D2
Para investigar se os receptores do tipo D2 são necessários para os estímulos potenciados pelo medo, os camundongos D2R KO e WT foram submetidos à resposta de sobressalto e aos testes de sobressalto potencializados pelo medo. Os ratos WT e D2R KO têm respostas de sobressalto equivalentes em todos os níveis de dB testados, indicando que os ratos D2R KO têm uma resposta de sobressalto acústica intacta (Figura 3A). Similar aos ratinhos D1R KO, observámos que os ratinhos D2R KO têm inibição de prepúcio intacta (Ralph-Williams et al., 2002). Quando testados no paradigma de sobressalto potencializado pelo medo do dia 7, os ratinhos WT e D2R KO mostraram um estímulo potenciado pelo medo a níveis equivalentes em todos os dias do teste 3 (Figura 3B) e a reatividade do choque não foi diferente entre os grupos (Figura 3C). Estes dados indicam que o D2R não é necessário para aprender o sobressalto potencializado pelo medo.
Figura 3
Os camundongos D2R KO têm sobressalto potencializado pelo medo intacto. A, Resposta de sobressalto acústico de camundongos D2R WT (n=8, quadrados pretos) e KO (n=8, quadrados abertos). B, Resultados do paradigma de sobressalto potencializado pelo medo de 7 dias com camundongos D2R. Tanto os camundongos WT (n=8, barras sólidas) quanto os KO (n=8, barras abertas) exibiram níveis significativos de sobressalto potencializado pelo medo. C, Medidas de reatividade ao choque durante o treinamento (WT, n=8, barras sólidas; KO, n=8, barras abertas). Os camundongos D, WT e D2R KO (n=11 cada) foram submetidos ao paradigma de sobressalto potencializado pelo medo de 3 dias. Os camundongos D2R KO receberam eticloprida (0.5 mg/kg) antes do treinamento e não expressaram sobressalto potencializado pelo medo no teste. Os asteriscos denotam p<0.01, KO versus WT, post-hoc de Fisher. Todos os valores relatados são média ± SEM Para respostas de sobressalto e reatividade ao choque, as respostas são relatadas em unidades arbitrárias. Estudos anteriores mostraram que a administração de antagonistas do tipo D2, sistemicamente ou diretamente na amígdala, prejudica o medo condicionado (Guarraci et al., 2000; Greba et al., 2001; Ponnusamy et al., 2005). Para explorar a discrepância entre seus resultados e os nossos, camundongos D2R KO receberam o antagonista do tipo D2R eticloprida (0.5 mg/kg; administrado ip) antes do treinamento no paradigma de sobressalto potencializado pelo medo de 3 dias. Quando testados 24 horas após o treinamento, camundongos WT injetados com veículo apresentaram um susto robusto potencializado pelo medo, enquanto camundongos D2R KO injetados com eticloprida não manifestaram aprendizado (Figura 3D; medidas repetidas ANOVA genótipo × dia F1, 20=7.5698, p<0.05). Esses resultados sugerem que, além do D1R, um membro da família de receptores DA semelhantes ao D2, mas não o D2R, é essencial para o susto potencializado pelo medo.
Memória de curto prazo é prejudicada em camundongos DD e D1R KO
O DA é necessário dentro de uma hora após o treinamento para aprender o susto potencializado pelo medo. Nesses experimentos, a memória de longo prazo para o susto potencializado pelo medo foi testada 24 horas após o treinamento. Decidimos testar se o DA também é necessário para a memória de curto prazo. Animais DD e controles foram submetidos a um paradigma de 2 dias que testou a memória de curto prazo 10 minutos após o treinamento (Figura 4A). No dia do teste, a sensibilização ao choque e a memória de curto prazo foram avaliadas. A memória de curto prazo foi definida como aumentos dependentes de pistas nas respostas de sobressalto, enquanto a sensibilização ao choque é uma potenciação dependente do contexto da resposta de sobressalto acústica após um choque no pé que é independente de uma pista (McNish et al., 1997; Richardson, 2000; Risbrough et al., 2008). Os camundongos DD tiveram significativamente menos sensibilização ao choque do que os controles (Figura 4B, p <0.05; teste t de Student). Da mesma forma, os ratos de controle demonstraram uma memória de curto prazo robusta que estava ausente em ratos DD (Figura 4B, p <0.05, DD versus controle, teste t de Student). Esses dados sugerem que a DA é necessária para a memória de curto e longo prazo do sobressalto potencializado pelo medo. Além disso, a DA é necessária para a aprendizagem do medo dependente do contexto, conforme analisado pela sensibilização ao choque. Esses dados também reforçam a conclusão anterior de que o DA é necessário em um período crítico para a estabilização do traço de memória condicionado ao medo. Figura 4 A memória de curto prazo e a sensibilização ao choque dependem do DA. A, Desenho do paradigma comportamental. No dia 1, as respostas iniciais de sobressalto foram obtidas. No dia 2, os camundongos receberam todos os 30 pares de estímulo e choque e foram colocados de volta em sua casa por 10 minutos antes do teste. B, camundongos de controle (n = 10, barras pretas) têm sensibilização ao choque significativamente maior e sobressalto potencializado pelo medo em comparação com DD (n = 10, barras abertas). Os asteriscos denotam p <0.05; Teste t de Student. Camundongos C, WT (n = 7, barras pretas) e D1R KO (n = 7, barras abertas) têm sensibilização ao choque intacta. Apenas WT tem sobressalto potencializado pelo medo durante o teste de memória de curto prazo. Os asteriscos denotam p <0.05, KO versus WT; Teste t de Student. Os camundongos D, WT (n = 8, barras pretas) têm sensibilização ao choque significativamente maior do que D2R KO (n = 8, barras abertas). Os níveis de potenciação pelo medo são semelhantes entre os camundongos WT e D2R KO. Os asteriscos denotam p <0.05, KO versus WT; Teste t de Student. Todos os valores relatados são médias ± SEM Para explorar quais subtipos de receptores mediam o papel do DA na memória de curto prazo e na sensibilização ao choque, camundongos D1R e D2R KO foram testados no mesmo paradigma dos camundongos DD. Os camundongos D1R KO tinham níveis significativamente mais baixos de memória de curto prazo do que os camundongos WT (Figura 4C, p <0.05; teste t de Student); no entanto, não houve diferença significativa entre os níveis de sensibilização ao choque em D1R KO e camundongos de controle, indicando que a aprendizagem dependente do contexto estava intacta. Os camundongos D2R KO tiveram níveis significativamente mais baixos de sensibilização ao choque do que WT (Figura 4D, p <0.05; teste t de Student), mas não houve diferença significativa entre os níveis de memória de curto prazo dos camundongos WT e KO. Esses resultados indicam que o papel da dopamina (DA) na memória de curto prazo dependente de estímulos é mediado pelo receptor D1, enquanto a sensibilização ao choque dependente do contexto depende criticamente do receptor D2.
A restauração do DA na amígdala basolateral é suficiente para permitir a memória de curto prazo
A amígdala basolateral é fundamental para a aquisição da memória de medo dependente de sinalização (Maren, 2003; Maren e Quirk, 2004; Sigurdsson et al., 2007). Além disso, há evidências que sugerem um papel importante do DA na facilitação da função da amígdala basolateral (Rosenkranz e Grace, 2002; Bissière et al., 2003; Marowsky et al., 2005). Para investigar se o DA na amígdala basolateral é necessário para o sobressalto potenciado pelo medo, os ratinhos DD e de controlo foram injectados bilateralmente com um vector CAV2-Cre na amígdala basolateral (Figura 5A). Este vetor é transportado retrogradamente do local da injeção para os neurônios DA, onde restaura a atividade do gene Th (Hnasko et al., 2006). A imuno-histoquímica revelou que a TH estava presente na amígdala basolateral de camundongos DD com CAV2-Cre-injetado (Figura 5J), mas ausente no estriado dorsal e no núcleo acumbente (Figura 5G). O TH foi primeiramente restaurado para um pequeno número de neurônios nas porções caudais da área tegmentar ventral (Figura 5D). Havia tipicamente menos células 10 TH positivas por 30-μm nos camundongos DD injetados, o que é consistente com o pequeno número de neurônios DA projetados pela amígdala relatados na literatura (Ford et al., 2006; Lammel et al. 2008; Margolis et al., 2008).
Figura 5
Restauração específica da região da expressão de TH endógena em camundongos DD. A, Esquema ilustrando coordenadas de injeção para experimentos de resgate de amígdala basolateral (BLA). Injectaram-se ratinhos DD (n = 7) e de controlo (n = 7) bilateralmente no BLA com vectores CAV2-Cre (0.5 uL / hemisfério). B, Esquema ilustrando coordenadas de injeção para experimentos de resgate de área tegmentar ventral (VTA). O AAV1-Cre-GFP foi injetado bilateralmente (0.5 uL / hemisfério) na VTA de ratos DD (n = 7) e controle (n = 10). Figuras adaptadas de Paxinos e Franklin, 2001. C – E, Comparação da coloração TH em corte coronal (ampliação 4 ×) mostrando mesencéfalo ventral de controle WT injetado com vírus, DD injetado BLA e DD injetado com VTA. C, imunohistoquímica de TH no mesencéfalo controle demonstra a presença de neurônios DA na VTA e substantia nigra pars compacta (SNpc; indicada pela seta). D, os ratinhos DD resgatados por BLA tinham um pequeno número de neurónios positivos para TH na VTA. Inserção é uma ampliação 40 × da região da caixa, mostrando a expressão TH no soma e nos processos. E, camundongos DD resgatados com VTA tiveram expressão TH predominantemente na VTA. Observe a ausência de coloração TH no SNpc (indicado pela seta). F – H, seção coronal (4 × ampliação) de camundongos DD injetados por vírus WT, resgatados por BLA e resgatados por VTA, mostrando expressão de TH em estriado dorsal e núcleo accumbens. F, WT vírus injetados controles têm TH expressão em toda a totalidade do dorsal (indicado pela seta) e estriado ventral. G, Não há expressão TH detectada no estriado de camundongos DD resgatados por BLA. H, camundongos DD resgatados por VTA têm expressão de TH no nucleus accumbens, com apenas uma escassez de manchas no estriado dorsal (indicado pela seta). I-K, seção coronal (10 × ampliação) mostrando a expressão de TH no BLA de camundongos DD de controle de WT injetado com vírus, resgatado por BLA e resgatado por VTA.
Camundongos injetados com amígdala basolateral foram submetidos a um paradigma de sobressalto potencializado por medo de 3 dias. A memória de curto prazo e a sensibilização ao choque foram avaliadas 10 minutos após o treinamento e a memória de longo prazo para sobressalto potencializado por medo foi avaliada 24 horas após o treinamento (Figura 6A). Curiosamente, apenas a memória de curto prazo foi restaurada em camundongos DD injetados com amígdala basolateral. Os níveis de memória de curto prazo foram os mesmos dos controles, mas os níveis de memória de longo prazo (p<0.05; teste t de Student) e sensibilização ao choque (p<0.05; teste t de Student) foram significativamente menores do que os controles. Durante o treinamento, os níveis de reatividade ao choque foram os mesmos entre os grupos (Controle: 1613±333 versus DD resgatado por BLA: 1758±260). Esses dados sugerem que as projeções DA para a amígdala basolateral, emanando principalmente do aspecto caudal da área tegmentar ventral, são suficientes para a aquisição de curto prazo da memória de medo sinalizada, mas as projeções DA para outras áreas cerebrais corticais ou límbicas são provavelmente essenciais para o aprendizado contextual e estabilização de longo prazo do traço de memória de medo. Figura 6 Camundongos DD resgatados da amígdala basolateral (BLA) restauraram a memória de curto prazo, enquanto camundongos DD resgatados da área tegmentar ventral (VTA) restauraram totalmente o aprendizado. A, Controle WT injetado com vírus (n=7) e camundongos DD resgatados da BLA (n=7) foram submetidos ao paradigma de sobressalto potencializado pelo medo de 3 dias. À esquerda, a sensibilização ao choque é significativamente menor em camundongos resgatados da BLA. No meio, a memória de curto prazo (STM) foi restaurada aos níveis de controle em camundongos resgatados da BLA. Direita, Memória de longo prazo (LTM), avaliada 24 horas após o treinamento, está ausente em camundongos resgatados por BLA. B, Resultados do controle WT (n=10) e camundongos DD resgatados por VTA (n=7) no paradigma de sobressalto potencializado pelo medo de 3 dias. Esquerda, Sensibilização ao choque em camundongos DD resgatados por VTA não foi significativamente diferente do controle. Meio e direita, Níveis de memória STM e LTM foram os mesmos do controle em camundongos resgatados por VTA. Asteriscos denotam p<0.05, resgate versus controle, teste t de Student. Todos os valores relatados são médias ± SEM
Restauração de TH para neurônios DA área ventral tegmentar é suficiente para a aprendizagem
Existem dois circuitos DA principais que emanam do mesencéfalo ventral; o circuito mesostriatal, originário principalmente da substantia nigra pars compacta, e o circuito mesocorticolimbico, originário primariamente da área tegmentar ventral. O circuito mesocorticolímbico projeta-se amplamente para núcleos cerebrais conhecidos por serem importantes para o condicionamento do medo dependente de sinais, incluindo a amígdala basolateral (Bjorklund e Dunnett, 2007; Lammel et al., 2008). Para investigar se a restauração mais completa do DA mesocorticolímbico é necessária para a memória de longo prazo e sensibilização ao choque; Ratinhos DD e de controlo foram injectados bilateralmente com um vector AAV1-Cre-GFP na área tegmentar ventral para activar especificamente o gene Th endógeno (Figura 5B).
A imunohistoquímica foi usada para detectar quais neurônios DA e quais alvos haviam restaurado a expressão de TH. A coloração TH está ausente em ratinhos DD não recuperados (Hnasko et al., 2006). A imunohistoquímica revelou que a restauração de TH em camundongos DD injetados na área tegmentar ventral era altamente específica para a área tegmentar ventral e seus alvos (Figura 5E, H, K). Houve uma escassez de coloração TH no estriado dorsal, um dos principais alvos dos neurônios DA provenientes da substantia nigra pars compacta (Figura 5H), enquanto que o núcleo accumbens e a amígdala basolateral tinham expressão robusta de TH (Fig 5H, K).
Camundongos injetados na área tegmentar ventral foram submetidos ao mesmo paradigma de sobressalto potencializado por medo do dia 3 como camundongos basolaterais injetados em amígdala (Figura 6B). Sensibilidade a choque, memória de curto prazo e memória de longo prazo foram restauradas para controlar os níveis nos camundongos DD injetados na área tegmentar ventral. A reatividade de choque durante o treinamento foi a mesma entre os grupos (Controle: 1653 ± 268 versus DD: 1602 ± 198 recuperado por VTA). Estes dados sugerem que as projeções de AD da área tegmentar ventral são suficientes para a formação de memória de medo e de longo prazo, bem como sensibilização ao choque dependente do contexto.
Discussão
Esses resultados demonstram que o DA é necessário para o condicionamento ao medo medido, medido pelo sobressalto potencializado pelo medo. Os camundongos DD falharam em exibir o medo potencializado pelo medo, a menos que o DA tenha sido restaurado imediatamente após o treinamento. Os ratos DD também têm memória de curto prazo prejudicada e sensibilização a choques. Importante, inibição pré-pulso não foi menor em camundongos DD depletados em DA, indicando que a ativação sensório-motora não é diminuída na ausência de DA. Pesquisas anteriores mostraram que os psicoestimulantes que aumentam a transmissão de DA podem reduzir a inibição de prepúcio (Schwarzkopf et al., 1992; Bubser e Koch, 1994; Ralph et al., 1999; Swerdlow et al., 2006; Doherty et al. outros demonstraram que a inibição farmacológica de receptores de dopamina aumenta a inibição do pré-pulso (Schwarzkopf et al., 2007; Depoortere et al., 1993). Consistente com esses achados, os camundongos DD tiveram um aumento pequeno, mas significativo, na inibição do pré-pulso em relação aos camundongos controle. Estudos anteriores também demonstraram que a inibição farmacológica dos receptores DA pode reduzir a resposta de sobressalto acústico (Davis e Aghajanian, 1997; Schwarzkopf et al., 1976). Os camundongos DD com depleção de dopamina não alteraram significativamente as respostas de sobressalto acústico; no entanto, houve uma tendência a respostas reduzidas em comparação com os controles, especialmente em intensidades de estímulo elevadas, consistente com relatórios anteriores (Schwarzkopf et al., 1993).
Os dados apresentados aqui demonstram claramente que DA não é importante para a recuperação ou expressão de memória de medo dependente de sinal porque os ratos DD não requerem DA durante a sessão de teste para expressar o medo potencializado pelo medo que foi previamente adquirido pela injeção de L-Dopa imediatamente após Treinamento. Além disso, nossos experimentos argumentam contra a necessidade de DA para o processamento inicial do estímulo durante o treinamento, porque os camundongos DD foram depletados com dopamina durante todas as sessões de treinamento. Em vez disso, nossos dados sugerem que o DA é necessário para a estabilização precoce do rastreio de memória porque os ratos DD não expressam memória de curto prazo, e a memória de longo prazo é vista apenas quando a L-Dopa é administrada imediatamente, mas não 1 hr Treinamento. Presumivelmente, a injeção de L-Dopa em camundongos DD imediatamente após o treinamento estabiliza o traço de memória, permitindo que ele entre em uma forma de longo prazo. Estímulos aversivos causam aumentos prolongados nos níveis de DA dentro das regiões cerebrais cruciais para o condicionamento do medo que permitiriam tal estabilização da memória do medo (Abercrombie et al., 1989; Kalivas e Duffy, 1995; Doherty e Gratton, 1997; Inglis e Moghaddam, 1999). Consistente com nossos dados, outros mostraram que manipulações pós-treinamento da função DA alteram a memória relacionada ao medo (Bernaerts e Tirelli, 2003; Lalumière et al., 2004; LaLumiere et al., 2005).
Nossas descobertas indicam que múltiplos subtipos de receptores DA são necessários para o sobressalto potencializado pelo medo. Os camundongos D1R KO não possuem memória de curto e longo prazo para sobressalto potencializado pelo medo, sugerindo um papel crucial para este subtipo de receptor na mediação dos efeitos do DA na aprendizagem do medo dependente de sinalização. Curiosamente, o aprendizado de medo dependente do contexto estava intacto em camundongos D1R KO. Estes dados corroboram outros estudos que mostram que os antagonistas do tipo D1R atenuam a aprendizagem do medo condicionada por estímulo sem afetar a sensibilização ao choque, e demonstram que as manipulações farmacológicas nessas experiências foram específicas para o D1R (Lamont e Kokkinidis, 1998; Guarraci et al., 1999) . Esses dados também são consistentes com estudos que demonstram um papel crítico para o D1R em outros paradigmas de aprendizagem dependentes de sinais (Smith et al., 1998; Eyny e Horvitz, 2003).
O D2R KO tinha um sobressalto intacto potenciado pelo medo, mas faltava sensibilização ao choque. Greba et al. (2001) mostraram que o antagonismo intra-amígdico do D2R levou a um comprometimento da sensibilização ao choque e do sobressalto potencializado pelo medo, sem afetar o sobressalto inicial ou as respostas ao choque nas patas. A ativação do D2R leva à indução de potenciação de longo prazo no BLA, que presumivelmente seria vital para a memória de sobressalto potencializada pelo medo (Bissiere et al., 2003). Nossos dados demonstram que o D2R não é necessário para o aprendizado de medo dependente de sinal, mas sim que este subtipo de receptor DA é importante para a sensibilização ao choque dependente do contexto. Injectar ratinhos D2R KO sistemicamente com a eticlopride antagonista semelhante a D2 antes do treino preveniu o sobressalto potenciado pelo medo; Portanto, é provável que outros receptores semelhantes ao D2R, que também são inibidos pela eticloprida, sejam críticos em sobressaltos potencializados pelo medo (Sigala e outros, 1997; Bernaerts e Tirelli, 2003; Laviolette e outros, 2005; Swant e Wagner , 2006). Assim, as deficiências na aprendizagem dependente de sinal, causadas por antagonistas do tipo D2 em estudos anteriores, podem ser atribuídas a estas drogas que inibem outros membros da família D2R.
A restauração seletiva de TH endógena especificamente para a área tegmentar ventral levou a uma restauração da aprendizagem em camundongos DD. A imuno-histoquímica indicou que o HT foi restaurado para importantes núcleos límbicos, como o nucleus accumbens e a amígdala basolateral, mas não para o estriado dorsal. Além disso, havia muito poucos neurônios positivos para TH na substantia nigra pars compacta. Esses dados indicam que o DA dos neurônios da área tegmentar ventral é importante para o condicionamento ao medo cued e contextual.
Camundongos com restauração seletiva de DA para a amígdala basolateral expressaram memória de curto prazo, mas não memória de longo prazo ou sensibilização ao choque. Estudos anteriores mostraram que DA facilita a função da amígdala através de alterações no tônus inibitório GABAérgico e este efeito é mediado pelo D1R ou pelo D2R (Bissière et al., 2003; Kroner e outros, 2005; Marowsky et al., 2005). Os dados aqui apresentados demonstram que o AD na amígdala basolateral é crítico para a aquisição de memória de curto prazo para sobressalto potencializado pelo medo, mas não é suficiente para a estabilidade a longo prazo da memória. A restauração da memória de curto prazo é mediada por um pequeno número de neurônios DA basolaterais que projetam a amígdala emana da área tegmentar ventral. A restauração mais ampla da TH endógena em camundongos DD resgatados na área tegmentar ventral levou à memória intacta de curto e longo prazo; portanto, a restauração do TH para outros circuitos mesocorticolímbicos provavelmente é necessária para estabelecer memória de longo prazo para sobressalto potencializado pelo medo. Estudos anteriores sugerem que o núcleo accumbens e o córtex pré-frontal também podem ser alvos importantes de DA durante o condicionamento pelo medo (Kalivas e Duffy, 1995; Murphy et al., 2000; Pezze et al., 2003; LaLumiere et al., 2005; Laviolette et al. al., 2005; Floresco e Tse, 2007). Portanto, é possível que a sinalização DA no núcleo accumbens ou no córtex pré-frontal seja necessária para a formação da memória de longo prazo.
Em resumo, nosso estudo utilizou uma combinação de modelos genéticos de camundongos, farmacologia e resgate de função específico da região para demonstrar que o DA é necessário para o medo potencializado pelo medo, uma tarefa de condicionamento de medo dependente de sinalização. Estas descobertas enfatizam um papel importante para este neurotransmissor fora do processamento de recompensa. Além disso, nosso estudo indica a necessidade de DA atuando em múltiplos receptores DA concomitantemente em múltiplas regiões cerebrais para o condicionamento do medo dependente de sinalização. Estudos recentes revelaram que os neurônios DA da área tegmentar ventral variam significativamente em suas propriedades moleculares e fisiológicas de acordo com a localização do alvo (Ford et al., 2006; Margolis et al., 2006; Bjorklund e Dunnett, 2007; Lammel et al., 2008; Margolis et al., 2008). Os experimentos que realizamos nos quais o gene Th foi reativado seletivamente em neurônios DA projetados para a amígdala basolateral revelam que eles são uma pequena população selecionada de neurônios da área tegmentar ventral, em vez de colaterais de neurônios DA que se projetam para outras regiões cerebrais. Nossos dados, combinados com estudos que demonstram a heterogeneidade das populações de neurônios DA, enfatizam a necessidade de entender o papel de cada um desses circuitos DA discretos. Expandir o conhecimento das muitas funções comportamentais e fisiológicas do DA para incluir a aprendizagem relacionada ao medo pode levar a uma melhor compreensão dos distúrbios prevalentes relacionados ao medo, como transtorno de estresse pós-traumático, transtorno obsessivo-compulsivo e transtorno de ansiedade generalizada.
Agradecimentos
Esta investigação foi apoiada em parte pelo Serviço de Saúde Pública, National Research Service Award, T32 GM07270, do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais e NIH National Institutes of General Medical Sciences Grant 4 R25 GM 058501-05. Agradecemos a Ilene Bernstein, Lisa Beutler, Charles Chavkin e Larry Zweifel pelos comentários úteis sobre o manuscrito, Albert Quintana pela ajuda em histologia e Valerie Wall pela manutenção de colônias de camundongos. Agradecemos também ao Dr. Miguel Chillon (Unidade de Produção Vetorial do CBATEG na Universitat Autonoma de Barcelona) pelo CAV2 e Matthew During pelo vírus AAV1.
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