Fadok JP, Darvas M, Dickerson TMK, Palmiter RD
(2010) PLoS ONE 5 (9): e12751. doi: 10.1371 / journal.pone.0012751
Jonathan P. Fadok1,2, Martin Darvas2, Tavis MK Dickerson 2, Richard D. Palmiter2
1 Programa de Pós-Graduação em Neurobiologia e Comportamento, Universidade de Washington, Seattle, Washington, Estados Unidos da América,
2 Departamento de Bioquímica e Instituto Médico Howard Hughes, Universidade de Washington, Seattle, Washington, Estados Unidos da América
O neurotransmissor dopamina (DA) é essencial para aprender em um condicionamento de medo pavloviano paradigma conhecido como sobressalto potencializado pelo medo (FPS). Camundongos sem a capacidade de sintetizar DA não conseguem aprender a associação entre o estímulo condicionado e o choque que induz o medo. Anteriormente, demonstramos que a restauração da síntese de DA para neurônios da área tegmentar ventral (VTA) foi suficiente para restaurar o FPS. Aqui, usamos uma abordagem de restauração viral seletiva de alvo para determinar quais regiões mesocorticolímbicas do cérebro que recebem sinalização DA do VTA requerem DA para FPS. Nós demonstramos que a restauração da síntese de DA para a amígdala basolateral (BLA) e nucleus accumbens (NAc) é necessária para a memória de longo prazo do FPS. Esses dados fornecem informações cruciais sobre os circuitos dependentes de dopamina envolvidos na formação da memória relacionada ao medo.
Introdução
O DA é sintetizado por neurônios em núcleos discretos no cérebro, incluindo o hipotálamo, bulbo olfatório e mesencéfalo ventral [1]. Os neurônios DA na VTA do mesencéfalo ventral se projetam para áreas do cérebro límbico que são importantes para o condicionamento do medo, como o córtex pré-frontal, o hipocampo, a amígdala e o NAc [1], [2], [3]. Consistente com um papel de DA no condicionamento ao medo, a taxa de disparo dos neurônios DA é alterada por estímulos indutores de medo, bem como pistas que predizem resultados aversivos [4], [5], [6]. Além disso, em resposta a estímulos com medo ou situações estressantes, os níveis de AD aumentam em várias regiões do cérebro límbico. [7], [8], [9], [10] e manipulações farmacológicas e genéticas da função DA podem interromper o aprendizado em paradigmas de condicionamento do medo [11], [12], [13], [14].
No condicionamento do medo pavloviano, um estímulo condicionado neutro, como a luz, é associado a um estímulo aversivo e incondicionado, como um choque nas patas. Após o treinamento, a apresentação do estímulo condicionado por si só provoca respostas de medo [3]. O FPS é um paradigma de condicionamento do medo pavloviano comumente empregado, no qual a aprendizagem é avaliada por aumentos na resposta de sobressalto acústico [15]. Nós demonstramos anteriormente que os neurônios DA na VTA são suficientes para aprender em um paradigma FPS [12]. Além disso, demonstramos que DA na BLA é suficiente para produzir memória de curto prazo (STM), mas não memória de longo prazo (LTM), da associação de choque-cue. Dos alvos remanescentes dos neurônios VTA DA, o NAc recebe a maior inervação e, portanto, foi o principal local candidato para a formação de LTM para FPS [2].
Uma grande literatura apoia o papel do DA dentro do NAc para processos de aprendizagem associativa em paradigmas baseados em recompensas [16]. Atualmente, não está claro se o DA no NAc também é importante para o aprendizado do condicionamento do medo pavloviano. No entanto, estudos mostraram que os níveis de DA aumentam no NAc em resposta a estímulos com medo e dicas preditivas [10]. Além disso, o NAc é fortemente inervado pelo BLA [16], [17], um núcleo essencial para o condicionamento pelo medo, e o DA facilita a função neuronal tanto no NAc como no BLA [18], [19], [20], [21] ]. Portanto, é possível que a conectividade entre o BLA e o NAc, e a sinalização DA em ambas as regiões, seja necessária para o condicionamento do medo pavloviano.
Para determinar se DA é necessário no NAc e BLA para LTM em condicionamento de medo pavloviano, fizemos uso do modelo de camundongo deficiente em dopamina (DD) que não possui a capacidade de sintetizar DA devido à inserção de um stop transcricional / translacional flanqueado por loxP cassete no gene da tirosina hidroxilase (Thfs) [22]. Na presença de Cre recombinase, a sinalização DA pode ser seletivamente restaurada para regiões-alvo específicas por reativação do alelo Thfs através da remoção do cassete de parada. Usamos um vus retrogradamente traficado expressando Cre recombinase para restaurar selectivamente DA para o NAc sozinho, ou para o NAc e BLA. Nossos resultados demonstram que DA no NAc e BLA é suficiente para estabelecer LTM para FPS.
Consistentes
Restauração de TH em ratos DD com salvamento viral
Para determinar onde no cérebro DA é necessário para a formação de LTM para FPS, a função DA foi restaurada em camundongos DD via injeções de recombinase CAV2-Cre. Este vírus infecta seletivamente os neurônios e é transportado retrogradamente a partir do local da injeção [23]. Se injetado em um núcleo alvo de neurônios DA em camundongos DD, este vírus será traficado de volta para os neurônios DA do mesencéfalo ventral, onde excisa a cassete de parada floxed reativando assim o gene Th, restaurando a produção de TH e permitindo a produção de DA apenas para o alvos selecionados [22]. Usamos essa técnica em duas coortes separadas de camundongos. Como o NAc é o maior alvo dos neurônios DA da VTA [2], supomos que esse núcleo pode ser crítico para a formação de LTM para FPS; portanto, injeções bilaterais de CAV2-Cre foram feitas no NAc em uma coorte. Também testamos a hipótese de que o DA pode ser necessário em múltiplos alvos do VTA para LTM. Para testar isso, injeções bilaterais foram feitas tanto no NAc quanto no BLA de camundongos DD.
A imuno-histoquímica foi usada para confirmar a restauração da função de TH em camundongos DD injetados com vírus (Figura 1). Como esperado, houve um forte sinal para TH no NAc de camundongos controle que co-localizaram com o transportador DA (DAT) (Figura 1A-D). TH também foi detectado no BLA de ratos de controle (Figura 1E); entretanto, a imunorreatividade do DAT foi muito baixa no BLA e, portanto, não é mostrada. A imunohistoquímica também foi realizada em tecido cerebral de camundongos DD não injetados (Figura 1 F – J). Não houve sinal TH detectável no NAc (Figura 1F, G), mas a coloração DAT estava presente (Figura 1H, I). O BLA de camundongos DD também foi amplamente desprovido de coloração TH (Figura 1J).
Figura 1
Restauração seletiva de TH em camundongos DD resgatados por vírus.
A imuno-histoquímica de camundongos DD injetados com NAc mostrou que o TH foi restaurado em grande parte do NAc (Figura 1K-N). Nenhum TH detectável foi observado no BLA de camundongos DD injetados com NAc (Figura 1O). O duplo resgate para o NAc e o BLA resultou em um sinal robusto para TH no NAc (Figura 1P-S) e um forte sinal TH no BLA (Figura 1T). Estes dados demonstram que a injeção viral de CAV2-Cre foi altamente eficaz na restauração da expressão de TH específica para as regiões do cérebro injetadas.
Para confirmar que o resgate viral de TH levou à restauração de DA em camundongos DD injetados, nós quantificamos os metabólitos DA, DA e norepinefrina usando cromatografia líquida de alta performance (HPLC; Tabela 1). Para este experimento, realizamos resgate no NAc ou na amígdala para também determinar se o resgate de TH em um alvo de projeções de DA influenciaria os níveis de DA em outra região não injetada. Descobrimos que os camundongos DD com depleção de dopamina tiveram 0.51% dos níveis de DA controlados nos níveis de controle NAc e 1.39% na amígdala. Os ratos DD resgatados por NAc tinham níveis de DA que eram 34.0% de controlo no NAc; ainda os níveis de AD na amígdala foram os mesmos que os níveis de DD não injetados (1.57%). Os camundongos DD resgatados por amígdala tiveram níveis de AD na amígdala que eram 38.4% de controle, mas os níveis de DA no NAc eram os mesmos que os níveis de DD não resgatados (0.46%). Estes resultados demonstram que o resgate mediado por vírus de TH leva a níveis elevados de DA em regiões alvo injetadas de camundongos DD.
Além disso, a injeção de vírus no NAc ou na amígdala não levou à elevação dos níveis de DA no outro alvo. Finalmente, como TH é expresso em neurônios noradrenérgicos de camundongos DD [24], [25], atribuímos a pequena quantidade de TH observada em IHQ do BLA em camundongos DD a axônios noradrenérgicos. A presença de norepinefrina no BLA de camundongos DD não resgatados foi confirmada com HPLC (Tabela 1).
tabela 1
Quantificação de HPLC de metabólitos DA, NE e DA.
A dopamina é necessária no NAc e na BLA para memória de longo prazo
O sobressalto potencializado pelo medo é uma forma de condicionamento pavloviano em que um estímulo condicionado provoca aumentos na resposta de sobressalto acústico [15]. Para garantir que a restauração seletiva de DA apenas para o NAc, ou apenas para o NAc e BLA, não prejudique a resposta de sobressalto acústico em si, curvas de resposta de sobressalto foram geradas para controles e camundongos DD resgatados (Figura 2A). A análise de variância de medidas repetidas bidirecional (RM ANOVA) revelou um efeito significativo da intensidade do som (F(4,172) = 37.1, p<0.01), mas nenhuma interação grupo por tratamento. Perturbações da função DA também podem causar diferenças no controle sensório-motor que podem prejudicar o FPS [15], [26]. Para analisar o controle sensório-motor, todos os camundongos foram testados em vários níveis em um paradigma de inibição de pré-pulso (PPI) (Figura 2B). Houve um efeito significativo da intensidade do pré-pulso (RM ANOVA F(2,86) = 57.79, p<0.01), mas nenhuma interação grupo por tratamento. Esses resultados demonstram que o resgate seletivo da sinalização DA para o NAC, ou NAc e BLA, causado por nossas manipulações experimentais não alterou a resposta de sobressalto acústico ou o controle sensório-motor. Figura 2 A restauração de DA para NAc e BLA é suficiente para LTM para FPS. Os camundongos foram submetidos a um paradigma de condicionamento de medo (Figura 2C). Durante o treinamento, os camundongos receberam 30 testes nos quais uma sugestão de luz de 10 segundos foi pareada com um leve choque no pé (0.5 segundos, 0.2 mA). A memória de curto prazo (STM) foi testada 10 minutos após o treinamento e a LTM foi testada 24 horas depois. Não houve diferenças significativas entre os grupos antes do condicionamento. Após o treinamento, a STM foi completamente restaurada em camundongos DD com restauração para NAc e BLA. O STM em camundongos DD injetados com NAc foi prejudicado, mas esse efeito não atingiu significância; no entanto, eles tiveram significativamente menos LTM do que os camundongos controle (p<0.05; pós-teste de Bonferroni). O LTM foi completamente restaurado aos níveis de controle em camundongos DD injetados bilateralmente no NAc e no BLA. Não houve diferenças significativas entre os grupos na reação comportamental ao choque nas patas (Figura 2D). Esses dados demonstram que o DA no NAc e no BLA é suficiente para facilitar o LTM para FPS.
Discussão
Acredita-se que o AD facilite a consolidação e a formação de LTM em regiões cerebrais límbicas como a amígdala, NAc e hipocampo [27], [28], [29], e estudos prévios sugeriram um papel para DA no condicionamento do medo pavloviano [ 13]. Anteriormente, demonstramos que o DA é crítico para estabilizar o rastreamento de memória em um paradigma de FPS [12] Além disso, o restabelecimento da função DA para o circuito mesocorticolímbico proveniente do VTA foi suficiente para restaurar STM e LTM para FPS, mas a restauração para o BLA sozinho restaurou apenas o STM [12]. No entanto, os locais de ação de DA necessários para a formação de LTM neste tipo de aprendizado eram desconhecidos. Aqui, demonstramos que a restauração da síntese de DA para o NAc e BLA é suficiente para LTM para FPS. Nós também achamos que a restauração de neurônios TH para DA projetando-se para o NAc não foi tão eficaz em resgatar o STM como a restauração do BLA [12], ou a restauração tanto do BLA quanto do NAc. Isto sugere que o NAc pode ser mais importante para a formação de LTM que STM.
Uma possível limitação à abordagem de restauração viral é que os neurônios DA podem enviar projeções colaterais para mais de um alvo. Assim, a injeção de vírus no NAc poderia restaurar o TH e, portanto, o DA, para o BLA. Nossos resultados imuno-histoquímicos sugerem que os neurônios DA que inervam o NAc são uma população distinta daqueles que inervam o BLA porque a injeção do vírus em uma região do cérebro aumentou a coloração de TH apenas nessa região. Os resultados da HPLC reforçam esse argumento porque os níveis de DA estão elevados no NAc de camundongos DD resgatados por NAc e não na amígdala. Esses achados são consistentes com numerosos estudos que exploraram a heterogeneidade dos neurônios DA baseados no alvo de projeção [30], [31], [32], [33].
Os circuitos e mecanismos subjacentes à necessidade de DA tanto no NAc como no BLA para o condicionamento do medo pavloviano permanecem sem solução. Curiosamente, o BLA envia projeções para o NAc [16], [34] e essas sinapses podem sofrer potenciação de longo prazo, um correlato celular chave de aprendizado e memória [35]. Além disso, o DA facilita o LTP no BLA e NAc [18], [21]. Assim, durante o condicionamento do medo pavloviano, é possível que o DA no BLA facilite a atividade das células piramidais glutamatosas [19], [20], [36], incluindo aquelas que projetam para o NAc [34], enquanto DA no NAc facilita LTP de BLA para sinapses NAc, promovendo assim a formação de LTM. Determinar o tempo exato de eventos dependentes de DA no BLA e NAc para FPS aumentará nossa compreensão desse processo.
Materiais e Métodos
Declaração de ética
Todos os camundongos foram tratados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde e os procedimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados com Animais Institucionais da Universidade de Washington (2183-02).
Animais e tratamentos
Os ratos DD foram gerados como descrito [22]. Resumidamente, ratinhos DD (Thfs / fs; DbhTh / +) possuem dois alelos de tirosina-hidroxilase (Th) inactivados que podem ser reativados condicionalmente por recombinase Cre. Os camundongos DD possuem um alelo β-hidroxilase (Dbh) de dopamina intacto e um alelo Dbh com inserção direcionada do gene Th para permitir a produção normal de norepinefrina [24], [25]. Animais de controlo possuem pelo menos um alelo Th intacto e um alelo Dbh intacto. Camundongos machos e fêmeas foram submetidos a testes comportamentais entre as idades de 2-6 meses. Todos os ratinhos foram alojados sob um ciclo 12 12 (claro: escuro) num ambiente de temperatura controlada com alimentos (5LJ5; PMI Feeds, St. Louis, MO) e água disponível ad libitum. Todos os experimentos comportamentais foram realizados durante o ciclo de luz. Como os ratos DD são gravemente hipofágicos, foram injectados diariamente (intraperitonealmente) com 3, 4-di-hidroxi-L-fenilalanina (L-Dopa) a 50 mg / kg a um volume de 33 µl / g, começando aproximadamente no período pós-natal 10 [25] Após a injeção viral, os camundongos DD foram mantidos com injeções diárias de L-Dopa até que pudessem comer adequadamente sem mais tratamento com L-Dopa.
Injeções virais
Os camundongos anestesiados com isoflurano (1.5-5%) foram colocados em um instrumento estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Para restauração da função do gene Th no nucleus accumbens sozinho, o vírus recombinante CAV2-Cre (titulado em 2.1 × 1012 partículas / ml) foi injetado bilateralmente (coordenadas em mm: 1.7 anterior a Bregma, 0.75 lateral a linha média, 4.75 ventral a Bregma; 0.5 / hemisfério) em camundongos DD e controle. Para dupla restauração de DA ao NAc e BLA, o vírus CAV2-Cre foi injetado bilateralmente no NAc, como acima, e o BLA (coordenadas em mm: 1.5 posterior a Bregma, 3.25 lateral para linha média, 5 ventral para Bregma; 0.5 µl / hemisfério) em camundongos DD e controle. A descrição detalhada deste vetor viral foi publicada [22]. Os vírus foram injectados ao longo de um período de 10-min utilizando uma agulha de seringa de calibre 32 (Hamilton, Reno, NV) ligada a uma bomba de micro-infusão (WPI, Sarasota, FL). Os murganhos de controlo apenas de NAc e coortes de resgate duplo foram compilados num grupo e não diferiram em nenhum parâmetro comportamental.
Aparelho
Câmaras de som atenuadoras de som (SR-Lab, San Diego Instruments, San Diego, CA) foram usadas para medir a inibição de prepulso, resposta de sobressalto e sobressalto potencializado pelo medo, como descrito [12]. A amplitude de pico da resposta foi usada para calcular a inibição do prepúcio, respostas de sobressalto, sobressalto potencializado pelo medo e reatividade ao choque. Os níveis de som foram verificados usando um leitor de nível de som (RadioShack, Fort Worth, TX). Uma unidade de calibração foi usada para garantir a integridade das leituras de resposta de sobressalto (San Diego Instruments, San Diego, CA). Uma luz 8-watt foi montada na parede traseira da caixa de alarme para uso como sugestão.
Curvas de resposta de sobressalto
Após um período de habituação 5-min, os animais foram apresentados com séries 10 de testes com níveis crescentes de pulso de som: de nulo, no qual não havia som, para 105 dB, com um ITI de 30 sec. Todos os pulsos de som foram 40 ms.
Inibição pré-pulso
O PPI foi medido conforme descrito [12]. Resumidamente, após um período de habituação, os ratos foram apresentados com 5, 40-msec, 120-dB, ensaios de pulso sozinho. Os ratos foram então apresentados com ensaios 50 de um ensaio de pulso de sobressalto sozinho, um dos três testes prepulse (5, 10 e 15-dB acima do fundo), ou um ensaio nulo em que não houve estímulo acústico. A inibição de Prepulse foi calculada para cada nível de prepúcio usando a seguinte fórmula:% de inibição = [(resposta média de sobressalto no teste de prepulso / resposta média de sobressalto no teste de pulso isolado) × 100].
Tempestade potencializada pelo medo
Todos os ratinhos foram testados usando o paradigma 3-day FPS como descrito [12]. Resumidamente, na linha de base, os ratos receberam uma série de ensaios 20 pseudo-aleatoriamente ordenados, divididos igualmente entre as condições de cue e sem cue. No dia 2, os ratos receberam pares 30 (2 min média ITI) da luz indicadora 10-sec com um choque de pé 0.2-mA, 0.5-sec. Os ratos foram então colocados nas suas gaiolas para 10 min antes de testar a memória de curto prazo. No dia 3, o LTM foi avaliado. A fórmula a seguir foi usada para calcular o sobressalto potencializado pelo medo:% potenciação = [(média de respostas em tentativas de sinalização / média de respostas em ensaios sem sinalização-1) × 100].
Imunohistoquímica
Preparou-se tecido cerebral de ratinho para anise histolica utilizando tnicas padr, como descrito [12]. Secções coronais de flutuação livre (30 µm) foram imunocoradas com anticorpos de coelho anti-TH (1 2000, Millipore) e anti-DAT de rato (1 1000, Millipore). Os anticorpos secundários eram conjugados com Cy2 ou Cy3 (1 200, Jackson ImmunoResearch). As fotografias foram tiradas com um microscópio vertical de campo claro (Nikon).
Cromatografia líquida de alto desempenho
Os ratos foram eutanasiados com Beuthanasia (250 mg / kg) e depois os cérebros foram removidos e colocados numa placa de mármore gelada. Utilizando uma matriz cerebral de ratinho (Activational Systems, Warrren, MI), fatias de 1-mm de espessura foram tomadas através do NAc ou da amígdala. Perfuradores de tecido (1-mm de diâmetro) foram então retirados, colocados em tubos de microcentrífuga 1.7 ml e rapidamente congelados em azoto líquido. As amostras foram armazenadas a −80 ° C até serem enviadas para o Laboratório Principal de Neurochemistry (Dry Laboratory) para o Centro de Pesquisa de Neurociência Molecular da Universidade de Venderbilt.
Análise estatística
A análise estatística foi realizada usando o software GraphPad Prism (La Jolla, Califórnia).
Agradecimentos
Agradecemos a Larry Zweifel pelos comentários úteis sobre o manuscrito, Glenda Froelick e Albert Quintana pela ajuda em histologia, e Valerie Wall pela manutenção da colônia de camundongos. Agradecemos também ao Dr. Miguel Chillon (Unidade de Produção Vetorial do CBATEG na Universitat Autonoma de Barcelona) pelo CAV2.
Notas de rodapé
Interesses concorrentes: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Financiamento: Esta investigação foi apoiada em parte pelo Howard Hughes Medical Institute, Public Health Service, National Research Service Award, T32 GM07270, do National Institute of General Medical Sciences e NIH National Institutes of General Medical Sciences 'Grant 4 R25 GM 058501- 05 Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
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