Proc Natl Acad Sci EUA A. 2007 Mar 20; 104 (12): 5181-6. Epub 2007 Mar 9.
Ventura R, Morrone C, Puglisi-Allegra S.
fonte
Fundação Santa Lucia, Centro Europeu de Pesquisa do Cérebro (CERC), Via del Fosso di Fiorano 65, Roma 00143, Itália. [email protected]
Sumário
Evidências recentes sugerem que estímulos recompensadores e aversivos afetam as mesmas áreas do cérebro, incluindo o córtex pré-frontal medial e o núcleo accumbens. Embora o nucleus accumbens seja conhecido por responder a estímulos salientes, independentemente de sua valência hedônica, com liberação seletiva aumentada de dopamina, pouco se sabe sobre o papel do córtex pré-frontal na motivação relacionada à recompensa e à aversão ou sobre os neurotransmissores envolvidos. Aqui encontramos que a depleção seletiva de norepinefrina no córtex pré-frontal medial de camundongos aboliu o aumento da liberação de norepinefrina pelo córtex pré-frontal e de dopamina pelo nucleus accumbens, induzida por alimentos, cocaína ou cloreto de lítio e prejudicou o condicionamento induzido pelo lítio cloreto (aversão) e comida ou cocaína (preferência). Esta é uma evidência de que a transmissão da norepinefrina cortical pré-frontal é necessária para a atribuição de saliência motivacional a estímulos relacionados à recompensa e à aversão através da modulação da dopamina no núcleo accumbens, uma área do cérebro envolvida em todos os comportamentos motivados.
Os animais, assim como os humanos, têm uma propensão a buscar recompensas e evitar punições. Esse comportamento claramente adaptativo envolve a capacidade de representar o valor de recompensar e punir estímulos, estabelecer previsões sobre eles e usar essas previsões para orientar o comportamento (1). Na medida em que as emoções podem ser definidas como “estados provocados por reforços (recompensas e punidores)” (2), compreender as áreas do cérebro envolvidas no processamento de estímulos aversivos ou recompensadores motivacionalmente salientes pode ser relevante para a compreensão de numerosos défices emocionais em humanos.
Dados recentes indicam que o nucleus accumbens (NAc) e o córtex pré-frontal (CPF) constituem um substrato comum para o processamento de estímulos recompensadores e aversivos (3-7). O corpo estriado ventral (ou NAc) está envolvido no processamento das informações subjacentes ao controle motivacional do comportamento direcionado aos objetivos, e estudos em humanos e animais dão suporte a um papel geral para essa área cerebral no processamento de estímulos gratificantes e aversivos, independentemente da valência (3-8 ).
Além disso, um grande corpo de evidências sugere que o pFC está diretamente envolvido no comportamento direcionado por objetivos, bem como no processamento afetivo (1, 9). No entanto, embora a transmissão de dopamina no NAc tenha sido proposta para mediar um processo compartilhado de “saliência motivacional” em valência positiva e negativa (3, 6), o papel do CPF nesse processo e o substrato neuroquímico envolvido ainda são desconhecidos.
A transmissão de noradrenalina no CPF é ativada por estímulos aversivos (10, 11) e por estímulos apetitivos aversivos e condicionados (12, 13). Além disso, recentemente demonstrou-se que a norepinefrina no pFC medial (mpFC) estava envolvida nos efeitos recompensadores de algumas drogas comumente usadas através de sua ação moduladora da liberação de dopamina no NAc (14, 15). Isto sugere que a transmissão da norepinefrina cortical pré-frontal envolve a dopamina acla- mada para processar estímulos salientes motivacionais.
Aqui, usando ratos, nos propusemos a avaliar se o sistema de dopamina pré-frontal cortical de norepinefrina / mesoacumbas é um substrato neural comum envolvido no processamento de estímulos afetivamente positivos e negativos. Em particular, investigamos se a norepinefrina no mpFC, através de sua ação moduladora do sistema mesolímbico dopaminérgico, é necessária para a atribuição de saliência motivacional a estímulos relacionados à recompensa e à aversão.
Como a experiência é um dos principais determinantes do impacto motivacional de qualquer estímulo dado (7), avaliamos os efeitos da primeira exposição a recompensar estímulos naturais (alimento saboroso, chocolate ao leite) e farmacológico (cocaína) e a um estímulo farmacológico aversivo [cloreto de lítio]. (LiCl)] em norepinefrina cortical pré-frontal e liberação de dopamina acumbal por microdiálise intracerebral. Além disso, para determinar se a transmissão pré-frontal de norepinefrina rege o aumento do fluxo de dopamina induzida pela primeira exposição a esses estímulos salientes motivacionalmente, também avaliamos os efeitos da depleção seletiva de norepinefrina no mpFC sobre a liberação de dopamina na NAc e na liberação de norepinefrina no mpFC induzida pela primeira exposição para esses estímulos.
Finalmente, investigamos os efeitos da depleção pré-frontal noradrenérgica seletiva na preferência de lugar condicionada (PPC) induzida por chocolate e cocaína e na aversão condicionada ao lugar (CPA) induzida por LiCl. Um procedimento de condicionamento de lugares foi escolhido para este estudo porque permitiu a avaliação da aquisição de propriedades apetidas e aversivas condicionadas a estímulos emparelhados com recompensas primárias e eventos aversivos e porque um grande corpo de evidências mostra que é uma medida confiável de processos subjacentes. atribuição de saliência motivacional a estímulos (3, 16).
RESULTADOS
Experiência 1.
Para avaliar se a primeira exposição a estímulos salientes gratificantes e aversivos afeta a norepinefrina pré-frontal e o fluxo de dopamina, avaliamos, por microdiálise intracerebral, os efeitos do consumo sistêmico de cocaína ou LiCl e chocolate na liberação de noradrenalina no mpFC e na saída de dopamina no NAc. Além disso, para verificar se a transmissão noradrenérgica cortical é necessária para a saída de dopamina induzida pela primeira exposição a esses estímulos motivacionalmente salientes, avaliamos os efeitos da depleção noradrenérgica seletiva na resposta de dopamina induzida pela cocaína, chocolate e LiCl. Cocaína, chocolate e LiCl produziram um aumento dependente do tempo na saída de norepinefrina no mpFC dos grupos tratados com sham, atingindo um aumento máximo de ≈200% em 40 min, ≈70% em 120 min e ≈100% em 60 min, respectivamente (Fig. 1a). Embora o aumento da liberação de noradrenalina no CPF em resposta à cocaína tenha sido amplamente relatado, até onde sabemos, este é o primeiro relato de aumento do fluxo de norepinefrina induzido pela primeira exposição ao chocolate ou ao LiCl sistêmico no mpFC. Esses estímulos também produziram um aumento paralelo dependente do tempo na saída de dopamina na NAc dos animais tratados com sham (Fig. 1b), de acordo com a visão de que esta área desempenha um papel importante no processamento de estímulos salientes independentemente da sua valência (3 , 6). Os efeitos dessa depleção na liberação de norepinefrina no mpFC também foram avaliados. A depleção pré-frontal de norepinefrina foi obtida pela depleção neurotóxica seletiva de aferentes de norepinefrina corticais pré-frontais (grupos depletados de norepinefrina) no mpFC após a proteção da dopamina por um inibidor seletivo de captação. Este método produziu um profundo esgotamento dos níveis teciduais de norepinefrina (≈90%), deixando os níveis teciduais de dopamina praticamente inalterados. Os animais de controlo (grupos tratados de forma simulada) foram sujeitos ao mesmo tratamento que os murganhos esgotados com norepinefrina, mas receberam veículo intracerebral. (Os níveis de norepinefrina no tecido foram os seguintes: grupo tratado com sham, 698 ± 26 ng / g tecido húmido; grupo sem norepinefrina, 63 ± 17 ng / g tecido húmido. Os níveis de tecido de dopamina foram os seguintes: grupo tratado com 203 ± 18 ng / g tecido húmido; grupo sem norepinefrina, 189 ± 16 ng / g tecido húmido.)
FIG. 1.
Depleções de norepinefrina cortical pré-frontal na norepinefrina extracelular em mpFC e dopamina em NAc. Norepinefrina extracelular (NE) em mpFC (a) e dopamina (DA) em NAc (b) de animais tratados de forma simulada ou sem norepinefrina injetados com solução salina, (mais ...)
A depleção seletiva de norepinefrina no mpFC prejudicou o aumento da liberação de dopamina e norepinefrina cortical pré-frontal induzida por ambos os medicamentos e chocolate (Fig. 1), embora não tenha afetado significativamente a dopamina extracelular basal no NAc (grupo tratado simulado, 1.35 ± 0.15 pg per Grupo com depleção de norepinefrina 20, 1.29 ± 0.18 pg por 20 μl) ou norepinefrina extracelular basal em mpFC (grupo tratado simulado, 1.31 ± 0.18 pg por 20 μl; grupo depletado de norepinefrina, 1.26 ± 0.17 pg por 20 μl). Os valores basais médios de dopamina no NAc e de norepinefrina no mpFC para cada grupo [salina, cocaína (20 mg / kg), LiCl (3 meq / kg) e chocolate] não diferiram significativamente
Nossos resultados indicam que a transmissão noradrenérgica intacta dentro do mpFC é uma condição necessária para a estimulação da liberação de dopamina induzida por estímulos recompensadores e aversivos dentro do NAc, sugerindo fortemente seu papel principal na saliência motivacional.
Experiência 2.
Para investigar se a transmissão pré-frontal de norepinefrina é necessária para adquirir as propriedades condicionadas apetecíveis e aversivas a estímulos pareados com recompensas primárias e eventos aversivos, avaliamos os efeitos da depleção seletiva de norepinefrina pré-frontal no condicionamento do local.
A depleção noradrenérgica pré-frontal aboliu a CPP induzida por cocaína e chocolate, bem como CPA induzida por LiCl. Assim, embora os animais tratados com placebo tivessem uma preferência significativa pelo compartimento emparelhado com cocaína ou chocolate e uma aversão significativa ao compartimento emparelhado com LiCl (Fig. 2a), os animais depletados com norepinefrina não mostraram preferência por nenhum dos compartimentos (Fig. 2b). ).
FIG. 2.
Depleção de norepinefrina cortical pré-frontal no condicionamento local. Efeitos do consumo de alimentos (1 g de chocolate ao leite; grupo com tratamento simulado, n = 8; grupo sem norepinefrina, n = 8) e injeção sistêmica (ip) de solução salina (Sal) (grupo tratado com simulação, (mais ...)
Note-se que em experimentos preliminares, observamos que CPP e CPA de animais tratados com sham eram indistinguíveis dos animais naïve. Animais que experimentaram emparelhamento com solução salina em ambos os compartimentos não mostraram preferência por nenhum dos compartimentos, independentemente da condição da lesão (tratamento simulado ou falta de noradrenalina). O comportamento de animais depletados com norepinefrina tratados com cocaína, chocolate ou LiCl foi semelhante ao dos animais que experimentaram apenas a solução do veículo durante o treinamento; isto é, eles não mostraram preferência por nenhum compartimento.
DISCUSSÃO
Aqui relatamos evidências de que a transmissão da norepinefrina cortical pré-frontal, através da modulação da dopamina no NAc, é uma condição necessária para a atribuição de saliência motivacional a estímulos relacionados à recompensa e à aversão.
Primeiro, porque a experiência prévia é um dos principais determinantes do impacto motivacional de qualquer estímulo dado (7), avaliamos, por microdiálise intracerebral, os efeitos da primeira exposição a cocaína sistêmica ou LiCl, bem como os efeitos do consumo de chocolate sobre noradrenalina ou dopamina. release em mpFC e NAc, respectivamente. A cocaína, o chocolate e o LiCl produziram um aumento dependente do tempo na dopamina, bem como no fluxo de norepinefrina pré-frontal dos grupos tratados com sham. Um aumento significativo do excesso de norepinefrina foi evidente no mpFC de animais tratados de forma simulada dentro de 20 min de receber chocolate; o transbordamento subseqüentemente retornou aos níveis de linha de base e foi seguido por um grande aumento sustentado. Embora esse aumento de norepinefrina induzido por chocolate bifásico no mpFC não tenha se igualado ao aumento de dopamina no NAc, o aumento inicial provavelmente estava relacionado ao impacto do alimento palatável e ao aumento de dopamina no NAc. Por outro lado, o segundo grande aumento pode representar um correlato neuroquímico da excitação cortical necessária para processar informações espaciais relacionadas à busca e localização da recompensa alimentar (17). De fato, tem sido sugerido que o aumento do fluxo de norepinefrina serve para sinalizar a presença de estímulos com alta saliência motivacional (17). Assim, esse aumento do fluxo de norepinefrina pode permitir a atenção seletiva necessária para procurar alimento palatável adicional e pode ajudar na aquisição de propriedades apetidas condicionadas a estímulos pareados com alimentos. No entanto, os efeitos colaterais da ingestão de alimentos na noradrenalina não podem ser descartados.
Embora o aumento da liberação de dopamina na NAc induzida por estímulo recompensador ou aversivo e aumento da liberação de noradrenalina no CPF em resposta à cocaína tenha sido amplamente relatado, até onde sabemos, este é o primeiro relato de aumento do fluxo de norepinefrina induzido pela exposição ao chocolate ou ao LiCl no mpFC. Mais importante ainda, mostramos aqui que a transmissão noradrenérgica cortical pré-frontal é necessária para a saída de dopamina acumbal induzida pela primeira exposição a esses estímulos motivacionalmente salientes. De fato, nenhum aumento significativo na norepinefrina pré-frontal e no fluxo de dopamina, induzido por esses estímulos, foi evidente em camundongos depletados com norepinefrina. A noradrenalina no mpFC pode ativar a liberação de dopamina mesoacumbiana através da projeção cortical pré-frontal excitatória para células de dopamina da área tegmentar ventral (18, 19) e / ou através de projeções glutamatérgicas corticoacumbais (20). Além disso, um papel para projeções de pFC para o locus coeruleus em exercer uma influência excitatória pode ser considerado porque este núcleo foi mostrado para ativar neurônios dopaminérgicos da área tegmentar ventral (21-23), o que poderia levar ao aumento da liberação de dopamina no NAc.
Assim, nossos resultados, de acordo com relatórios anteriores, mostram que ambos os estímulos recompensadores incondicionais e aversivos aumentam o fluxo de saída de norepinefrina no mpFC (10-15) bem como a liberação de dopamina no NAc (3, 24). Mais importante, no entanto, eles demonstram que a transmissão noradrenérgica intacta no mpFC é uma condição necessária para a estimulação da libertação de dopamina induzida por estímulos farmacológicos e naturais recompensadores e aversivos dentro do NAc. Portanto, eles apontam para norepinefrina pré-frontal e a transmissão da dopamina como um sistema neural cuja ativação por estímulos aversivos e recompensadores incondicionados é provavelmente um substrato para a saliência motivacional. Esta visão é apoiada por resultados de experimentos comportamentais sobre os efeitos da depleção pré-frontal de norepinefrina no condicionamento de lugar induzido por cocaína, chocolate ou LiCl.
Assim, o segundo achado importante deste estudo é que a depleção da norepinefrina cortical pré-frontal prejudica tanto a PPC induzida pela cocaína ou alimentos quanto a PCR induzida pelo LiCl. Embora animais tratados de forma simulada tenham uma preferência significativa pelo compartimento pareado com cocaína ou chocolate e uma significativa aversão ao compartimento pareado com LiCl, os animais depletados com norepinefrina não mostraram preferência por nenhum compartimento, demonstrando assim que a transmissão da noradrenalina cortical pré-frontal intacta é necessária para a aquisição de propriedades condicionadas a estímulos pareados com eventos recompensadores primários ou aversivos em um procedimento de condicionamento de lugar.
Os resultados atuais indicam que, em camundongos pré-frontais cortados com norepinefrina cortical, a falta de liberação de noradrenalina induzida pela exposição a estímulos gratificantes e aversivos (cocaína, alimento ou LiCl, estímulo não condicionado) impediu a atribuição de saliência motivacional ao estímulo condicionado (padrão espacial) durante as sessões de emparelhamento. Além disso, observe que a depleção pré-frontal de norepinefrina não interferiu nos processos associativos ou mnemônicos porque, como mostrado anteriormente, os animais com depleção de norepinefrina mostraram-se capazes de aprender uma tarefa de esquiva passiva (15) e de associar o contexto aos efeitos da droga (14). No entanto, mais investigações são necessárias para entender a natureza precisa das deficiências de animais com depleção de noradrenalina cortical pré-frontal.
A transmissão dopaminérgica dentro do NAc é considerada como mediadora do impacto hedônico da recompensa ou de alguns aspectos do aprendizado da recompensa (ver ref. 25 para revisão). Nossos resultados, de acordo com uma visão diferente (3), mostram que a transmissão da dopamina no NAc desempenha um papel tanto no comportamento positivamente quanto no aversivamente motivado; mais importante, no entanto, eles demonstram que esse processo motivacional é regido pela noradrenalina cortical pré-frontal. De fato, a depleção seletiva pré-frontal de norepinefrina produz o bloqueio da CPA induzida por cocaína ou chocolate e CPA e o comprometimento da liberação de dopamina na NAc induzida por esses estímulos salientes em camundongos controle, demonstrando assim a transmissão pré-frontal noradrenérgica, através da modulação. A liberação de dopamina no NAc é uma condição necessária para o processamento motivacional de estímulos relacionados à recompensa e à aversão.
Em conjunto, os resultados atuais de experimentos comportamentais e de microdiálise demonstram que a transmissão pré-frontal de norepinefrina não apenas medeia as propriedades recompensadoras de drogas vulgarmente abusadas, como sugerido por estudos anteriores (14, 15), mas é necessário para atribuição de saliência motivacional tanto para recompensa como para estímulos relacionados à aversão, mostrando ainda que drogas aditivas, bem como estímulos farmacológicos aversivos, exploram o mesmo mecanismo neurobiológico que os estímulos naturais.
Em conclusão, nossos dados ampliam achados anteriores que apontam para o sistema dopaminérgico mesolímbico como um “sistema de saliência” envolvido em todos os comportamentos motivados (3, 6, 26). Eles também demonstram que este sistema está sob controle cortical pré-frontal de norepinefrina, apoiando a visão de que estímulos recompensadores e aversivos afetam vias similares no SNC (7).
Nossos resultados fornecem insights sobre a neurobiologia da recompensa e da aversão, pois mostram que o processamento de estímulos salientes gratificantes e aversivos envolve as mesmas áreas cerebrais; isto é, eles apontam para a transmissão dopaminérgica pré-frontal noradrenérgica e acumbal como um sistema neural comum. A compreensão dos sistemas de neurotransmissores ativados por estímulos afetivos ou aversivos afetivamente e seus mecanismos moleculares ajudará a fornecer uma base para elucidar o funcionamento dos sistemas neurais envolvidos em emoções positivas e também negativas..
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais
Ratinhos machos da estirpe consanguínea C57BL / 6JIco (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), que são vulgarmente utilizados na fenotipagem neurocomportamental, foram alojados como descrito anteriormente (8, 9). Cada grupo experimental consistia em seis a oito animais. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com a lei nacional italiana (Decreto Legislativo nº 14, 15) que rege o uso de animais para pesquisa.
Drogas.
Hidrato de cloral, 6-hidroxidopamina (6-OHDA), GBR 12909, cloridrato de cocaína e LiCl foram adquiridos à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Cocaína (20 mg / kg), LiCl (3.0 meq / kg), hidrato de cloral (350-450 mg / kg) e GBR 12909 (15 mg / kg) foram dissolvidos em solução salina (0.9% NaCl) e injetados ip volume de 10 ml / kg. O 6-OHDA foi dissolvido em solução salina contendo metabissulfito de sódio (0.1 M). Para experiências alimentares, a recompensa foi o chocolate ao leite (1 g; Nestlé, Vevey, Suíça).
Microdiálise.
Os animais foram anestesiados com hidrato de cloral (450 mg / kg), montados numa armação estereotáxica (David Kopf Instruments, Tujunga, CA) equipado com um adaptador de ratinho e implantados unilateralmente com uma cânula guia (aço inoxidável, diâmetro exterior do veio de 0.38 mm ; Metalant AB, Estocolmo, Suécia) em mpFC ou em NAc (14, 15). O comprimento da cânula guia foi 1 mm para mpFC e 4.5 mm para NAc. A cânula guia foi fixada com cola epoxi, e cimento dental foi adicionado para estabilização adicional. As coordenadas de bregma [medidas de acordo com os métodos de Franklin e Paxinos (27)] foram as seguintes: + 2.52 anteroposterior e 0.6 lateral para mpFC e + 1.60 anteroposterior e 0.6 lateral para NAc [principalmente incluindo a subdivisão de conchas (27)]. A sonda (comprimento da membrana de diálise de 2 mm para mpFC e 1 mm para NAc e diâmetro externo de 0.24 mm, sonda de microdiálise com cupropano de MAB 4; Metalant AB) foi introduzida 24 h antes das experiências de microdiálise. Os animais foram levemente anestesiados com hidrato de cloral (350 mg / kg) para facilitar a inserção manual da sonda de microdiálise na cânula guia. Os animais foram devolvidos às suas gaiolas em casa. A tubulação de saída e sonda de entrada foi protegida por Parafilm aplicado localmente. As membranas foram testadas quanto à recuperação in vitro de dopamina e norepinefrina (a recuperação relativa foi a seguinte: dopamina, 10.7 ± 0.82%; norepinefrina, 12.2 ± 0.75%; n = 20) no dia anterior ao uso para verificar a recuperação.
A sonda de microdiálise foi conectada a uma bomba CMA / 100 (Carnegie Medicine, Stockholm, Sweden) por meio de tubulação PE 20 (Metalant AB) e um binário de líquido de canal duplo de torque ultrabaixo (modelo 375 / D / 22QM; Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA) para permitir a livre circulação. O fluido cerebrospinal artificial (147 mM NaCl / 1 mM MgCL / 1.2 mM CaCl2 / 4 mM KCl) foi bombeado através da sonda de diálise a uma taxa de fluxo constante de 2 μl / min. Os experimentos foram realizados 22–24 h após a colocação da sonda. Cada animal foi colocado em uma gaiola circular munida de equipamento de microdiálise (Instech Laboratories) e com cama gaiola no chão. A perfusão da diálise foi iniciada 1 hora depois. Após o início da perfusão de diálise, os camundongos foram deixados sem perturbação por for2 h antes da coleta das amostras de linha de base. A concentração média das três amostras coletadas imediatamente antes do tratamento (variação <10%) foi tomada como concentração basal. Antes do início dos experimentos de microdiálise, os camundongos foram designados a um dos diferentes tratamentos (solução salina, cocaína, chocolate ou LiCl) em cada grupo (tratamento simulado ou sem norepinefrina). Para experimentos com alimentos, os animais foram colocados em um esquema de privação de alimento (28) 4 dias antes do início dos experimentos.
O dialisado foi recolhido a cada 20 min para 120 (para grupos cocaína e LiCl) ou 160 (para grupos alimentares) min. Apenas os dados de ratos com uma cânula colocada corretamente são relatados. As colocações foram avaliadas por coloração com azul de metileno. Vinte microlitros das amostras de dialisado foram analisadas por HPLC. O restante 20 μl foi mantido para possível análise posterior. Concentrações (pg por 20 μl) não foram corrigidas para recuperação da sonda. O sistema HPLC consistia de um sistema Alliance HPLC (Waters, Milford, MA) e um detector coulométrico (modelo 5200A; Coulochem II, ESA, Chelmsford, MA) provido de uma célula condicionadora (M 5021) e uma célula analítica (M 5011) . A célula de condicionamento foi ajustada para 400 mV, o eletrodo 1 foi ajustado para 200 mV e o eletrodo 2 foi ajustado para −250 mV. Foi utilizada uma coluna Nova-Pack C18 (3.9 150 mm; águas) mantida a 33 ° C. O caudal foi de 1.1 ml / min. A fase móvel foi como descrito anteriormente (14, 15). O limite de detecção do ensaio foi de 0.1 pg.
Depleção de norepinefrina no mpFC.
Anestesia e conjunto cirúrgico são descritos acima. Os animais foram injetados com GBR 12909 (15 mg / kg) 30 min antes da microinjeção 6-OHDA para proteger os neurônios dopaminérgicos. A injeção bilateral de 6-OHDA (1.5 μg por 0.1 μl para 2 min para cada lado) foi feita em mpFC [coordenadas + 2.52 anteroposterior, ± 0.6 lateral e −2.0 ventral em relação a bregma (27)] através de aço inoxidável cânula (diâmetro exterior de 0.15 mm; Unimed, Lausanne, Suíça) ligada a uma seringa 1-μl por um tubo de polietileno e accionada por uma bomba CMA / 100. A cânula foi deixada no local por mais 2 min após o término da infusão. Os animais tratados com Sham foram submetidos ao mesmo tratamento, mas receberam veículo intracerebral. Os animais foram utilizados para experiências de microdiálise ou comportamentais 7 dias após a cirurgia.
Norepinefrina e os níveis de tecido de dopamina em mpFC foram avaliados como descrito anteriormente (14, 15) para avaliar a extensão da depleção.
Coloque o condicionamento.
Experimentos comportamentais foram realizados usando um aparelho de condicionamento de lugar (14, 15, 29). O aparelho compreendia duas câmaras de plexiglas cinzentas (15 × 15 × 20 cm) e um beco central (15 × 5 × 20 cm). Duas portas de correr (4 × 20 cm) ligavam o beco às câmaras. Em cada câmara dois paralelepípedos triangulares (5 × 5 × 20 cm) feitos de acrílico preto e dispostos em diferentes padrões (sempre cobrindo a mesma superfície da câmara) foram usados como estímulos condicionados. Os animais foram utilizados para experiências comportamentais 7 dias após a cirurgia. Antes do condicionamento, os ratos foram designados para um dos diferentes tratamentos (solução salina, cocaína, chocolate ou LiCl) dentro de cada grupo (tratamento simulado ou falta de noradrenalina).
O procedimento de treinamento para condicionamento de lugares foi descrito anteriormente (14, 15). Resumidamente, no dia 1 (pré-teste), os ratos estavam livres para explorar todo o aparelho para 20 min. Durante os dias seguintes 8 (fase de condicionamento), os ratos foram confinados diariamente para 40 min alternadamente em uma das duas câmaras. Para condicionamento de lugar com estímulos farmacológicos, um dos padrões foi consistentemente emparelhado com solução salina e o outro com cocaína (20 mg / kg ip, CPP) ou LiCl (3.0 meq / kg ip, CPA) durante a fase de condicionamento. Estas doses foram escolhidas com base em estudos anteriores que demonstraram que os ratos C57BL / 6JIco exibem uma CPP mais forte a uma dose de cocaína de 20 mg / kg (30, 31) e uma tendência para a aversão no teste CPA com uma dose LiCl de 3.0 meq / kg (32). Para os animais do grupo controle, ambas as câmaras foram pareadas com solução salina. Para CPP com comida, um dos padrões foi consistentemente emparelhado com comida padrão (1 g de dieta padrão de rato) e o outro com comida saborosa (1 g de chocolate ao leite). Os animais foram colocados num horário de restrição de alimentos (28) 4 dias antes do condicionamento ter começado. Esse cronograma durou todo o condicionamento.
Para todos os experimentos de condicionamento de local, os emparelhamentos foram equilibrados de modo que para metade de cada grupo experimental o estímulo não condicionado (cocaína, chocolate ou LiCl) fosse emparelhado com um dos dois padrões; para a outra metade de cada grupo, o estímulo não condicionado foi emparelhado com o outro padrão. O teste de expressão de CPP ou CPA foi realizado no dia 10 usando o procedimento de pré-teste. Os dados comportamentais foram coletados e analisados pelo sistema de rastreamento de vídeo totalmente automatizado EthoVision (Noldus, Wageningen, Holanda). Resumidamente, o sistema experimental é gravado por uma câmera de vídeo CCD. O sinal é então digitalizado (por um dispositivo de hardware denominado frame grabber) e passado para a memória do computador. Posteriormente, os dados digitais são analisados por meio do software EthoVision para obtenção do “tempo gasto” (em segundos), que é utilizado como dado bruto para pontuação de preferência em cada setor do aparelho por cada sujeito.
Estatísticas.
Coloque condicionamento.
Para expericias de condicionamento de lugar, as anises estatticas foram realizadas calculando o tempo (em segundos) gasto em compartimentos centrais (Centro), droga / chocolate emparelhados (Emparelhado) e salino / emparelhamento padr de alimentos emparelhados (Desparelhado) no dia do teste. No caso de animais recebendo pareamento salino com ambos os compartimentos, o compartimento pareado foi identificado como o primeiro ao qual eles foram expostos.
Efeitos da depleção seletiva de norepinefrina cortical pré-frontal no condicionamento do local.
Os dados dos experimentos de condicionamento de lugar foram analisados usando ANOVA de medidas repetidas com um entre fator (pré-tratamento, dois níveis: placebo e norepinefrina) e um dentro de fator (pareamento, três níveis: Centro, Pareado e Não Pareado) para cada tratamento [ solução salina / salina, solução salina / cocaína (20 mg / kg), solução salina / LiCl (3 meq / kg) e alimento padrão / chocolate]. Como as comparações importantes são aquelas entre compartimentos emparelhados e não pareados, as comparações médias do tempo gasto nessas câmaras foram feitas usando ANOVA de medidas repetidas dentro de cada grupo.
A ANOVA de duas vias revelou interação significativa de pré-tratamento × pareamento para cocaína [F (2, 28) = 3.47; P <0.05], LiCl [F (2, 28) = 4.55; P <0.05] e chocolate [F (2, 28) = 3.5; P <0.05].
ANOVA de medidas repetidas dentro de cada grupo revelou um efeito significativo do fator de emparelhamento apenas para animais tratados com simulação de injeção de cocaína [F (1, 14) = 24.3; P <0.0005], LiCl [F (1, 14) = 10.3; P <0.01], ou chocolate [F (1, 14) = 7.31; P <0.05].
Depleção de noradrenalina no mpFC.
Os efeitos da depleção de norepinefrina pré-frontal nos níveis de dopamina e norepinefrina em mpFC foram analisados por ANOVA de duas vias. Os fatores foram os seguintes: lesão (dois níveis: tratamento simulado e sem norepinefrina) e experimento (dois níveis: experimento comportamental e experimentos de microdiálise). As comparações individuais entre os grupos foram realizadas quando apropriado por teste post hoc, o teste de múltiplos intervalos de Duncan. As análises estatísticas foram realizadas em dados de experimentos comportamentais e de microdiálise. ANOVA de duas vias para efeitos da depleção de norepinefrina pré-frontal nos níveis de dopamina e norepinefrina no tecido em mpFC mostrou um efeito de lesão significativo para norepinefrina apenas [F (1, 188) = 2.02; P <0.0005], mas sem efeitos experimentais.
Microdiálise.
As análises estatísticas foram realizadas em dados brutos (concentrações de pg por 20 μl). Os efeitos da depleção de norepinefrina pré-frontal na liberação de norepinefrina em mpFC ou no fluxo de dopamina em NAc de animais desafiados com cocaína (20 mg / kg) ou LiCl (3 meq / kg) foram analisados por ANOVA de medidas repetidas com dois entre fatores (pré-tratamento, dois níveis, tratamento simulado e norepinefrina depletada; e tratamento, três níveis, solução salina, cocaína e LiCl) e um dentro do fator (tempo, sete níveis, 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 120). Os efeitos da depleção de norepinefrina pré-frontal na liberação de norepinefrina em mpFC ou no fluxo de dopamina em NAc de animais expostos ao chocolate foram analisados por ANOVA de medidas repetidas com um fator entre (pré-tratamento, dois níveis, tratamento simulado e norepinefrina depletada) e um dentro do fator ( tempo, nove níveis, 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 e 160). Os efeitos simples foram avaliados por ANOVA de uma via para cada ponto de tempo. As comparações individuais entre os grupos foram realizadas quando apropriado por teste post hoc, o teste de múltiplos intervalos de Duncan.
Análises estatísticas para os efeitos de estímulos farmacológicos no fluxo de norepinefrina pré-frontal revelaram um pré-tratamento significativo × tratamento × interação de tempo [F (12, 180) = 4.98; P <0.005]. As análises estatísticas para os efeitos do consumo de chocolate na liberação de norepinefrina revelaram uma interação pré-tratamento × tempo [F (8, 80) = 7.77; P <0.005]. As análises de efeito simples revelaram um efeito significativo de tempo apenas para o grupo tratado com sham e uma diferença significativa entre os grupos tratados com sham e sem norepinefrina após a injeção de cocaína ou LiCl, bem como após o consumo de chocolate.
As análises estatísticas para efeitos de estímulos farmacológicos no fluxo de dopamina acumbal revelaram um pré-tratamento significativo × tratamento × interação de tempo [F (12, 180) = 10.02; P <0.0005]. As análises estatísticas dos dados do chocolate revelaram uma interação significativa de pré-tratamento × tempo [F (8, 80) = 2.12; P <0.05]. As análises de efeito simples revelaram um efeito significativo do tempo apenas para os grupos tratados com sham e uma diferença significativa entre os grupos tratados com sham e sem norepinefrina após a injeção de drogas (cocaína ou LiCl), bem como após o consumo de chocolate.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos ao Dr. E. Catalfamo pela assistência hábil. Esta pesquisa foi financiada pelo Ministero della Ricerca Scientifica e Tecnológica (PRIN 2005), pela Università “La Sapienza” Ateneo (2004 / 2005) e pela Ministero della Salute (Progetto Finalizzato RF03.182P).
ABREVIATURAS
Núcleo NAC accumbens
córtex pré-frontal do pfc
pFC medial mpFC
Preferência de local condicionado por CPP
CPA condicionado aversão ao lugar
6-OHDA 6-hidroxidopamina.
NOTAS
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Este artigo é uma submissão direta da PNAS.
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