Ativação de Receptores de Dopamina no Núcleo Accumbens Promove o Comportamento da Abordagem Coadjuvada por Sucrose (2016)

Animais

Oito Long-Evans macho que pesavam 275-300g foram adquiridos da Harlan e alojados individualmente num ciclo de luz / escuridão 12 h. Todos os experimentos foram conduzidos na fase leve. O cuidado com os animais era idêntico aos relatos publicados anteriormente (Nicola, 2010; du Hoffmann et al. 2011; McGinty et al. 2013; du Hoffmann e Nicola, 2014; Morrison e Nicola, 2014). Na chegada, os ratos receberam 1 semana de descanso e foram então habituados a serem manuseados pelo experimentador. Após a habituação, os animais eram alimentos restritos a ~ 90% de peso corporal de alimentação livre antes de iniciar os estágios iniciais do treinamento. Após os estágios iniciais do treinamento, os animais receberam livre acesso à ração de laboratório padrão em sua gaiola. Todos os procedimentos com animais foram consistentes com os Institutos Nacionais de Saúde dos EUA. Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Albert Einstein College of Medicine.

Câmaras Operantes

O treinamento comportamental ocorreu em câmaras operantes (30 × 25 cm) adquiridas da Med Associates. Os experimentos foram conduzidos em gabinetes de atenuação de som com luzes azuis da casa iluminadas. Um ruído branco constante (65 dB) foi reproduzido dentro da câmara para limitar as distrações do ruído externo. As câmaras operantes eram equipadas com um receptáculo de recompensas em uma parede. Um fotobeamo localizado na frente do receptáculo mediu os tempos de entrada e saída do receptáculo. Uma bomba de seringa, localizada fora da câmara, foi usada para distribuir recompensa de sacarose líquida no receptáculo de recompensa. Os carimbos de hora comportamentais foram gravados com uma resolução de 1 ms.

Treinamento de tarefas 2CS

Os animais tiveram restrição alimentar durante os estágios iniciais de treinamento. A primeira etapa do treinamento exigia que os animais entrassem no recipiente de ração, o que desencadeava a entrega de sacarose líquida a 10%. Após um atraso de 10 s para permitir o consumo da recompensa, os animais tiveram que deixar o receptáculo e entrar novamente para ganhar uma recompensa adicional. Nos estágios de treinamento subsequentes, atrasos de 20 se 30 s foram introduzidos entre a disponibilidade de recompensa. O desempenho do critério foi definido em 100 recompensas ganhas em 1 h. Depois que o desempenho do critério foi estabelecido com um atraso de 30 s entre a disponibilidade da recompensa, duas pistas auditivas foram introduzidas que previam uma recompensa pequena ou grande (150 ou 250 μl de solução de sacarose a 10% em água). As pistas auditivas consistiam em um tom de sirene (que percorria a frequência de 4 a 8 kHz em 400 ms) e um tom intermitente (tom de 6 kHz ligado por 40 ms, desligado por 50 ms); As sugestões foram atribuídas a grandes e pequenas recompensas aleatoriamente para cada rato e a relação de magnitude da sugestão-recompensa permaneceu constante durante o treinamento e experimentos para um determinado rato. A entrega da recompensa dependia do rato entrar no receptáculo de recompensa durante a apresentação da sugestão, momento em que a sugestão foi encerrada. As dicas duraram até 5 s. O intervalo inter-ensaio foi escolhido pseudo-aleatoriamente a partir de uma distribuição exponencial truncada com uma média de 30 s. Uma vez que os animais responderam a> 80% dos sinais, os animais foram alimentados ad libitum em suas gaiolas de casa a partir desse ponto até o final dos experimentos. Após o desempenho da tarefa estabilizado, a concentração de sacarose da recompensa líquida foi reduzida de 10% para 3%; os volumes não foram alterados. O comportamento foi monitorado diariamente até que o desempenho da tarefa assintótica fosse alcançado.

Cirurgia

Após o desempenho comportamental estabilizado, cânulas-guia bilaterais visando o núcleo NAc foram cronicamente implantadas como descrito anteriormente (Nicola, 2010; Lardeux et al. 2015). Resumidamente, os animais foram anestesiados com isofluorano e colocados numa armação estereotáxica com a cabeça achatada. Pequenos orifícios foram perfurados bilateralmente no crânio a 1.4 mm anterior e ± 1.5 mm lateral de Bregma. Um braço estereotáxico foi usado para colocar precisamente as cânulas nesses orifícios e depois abaixá-los no cérebro até uma profundidade final de 6 mm a partir do topo do crânio (2 mm acima do NAc). As cânulas foram mantidas no lugar com parafusos ósseos e cimento dentário. Dois postes roscados foram colocados verticalmente no crânio e embutidos no cimento dentário. Essas postagens faziam a interface com parafusos em um estágio de cabeça contendo dois LEDs, o que permitia rastreamento automatizado de vídeo durante os experimentos. Os animais receberam o antibiótico enrofloxacina antes e no dia 1 após a cirurgia. Após a cirurgia, os ratos receberam 1 semana para recuperar antes de um breve período de treinamento pós-cirúrgico na tarefa 2CS.

Drogas

Os medicamentos foram adquiridos à Sigma e recentemente dissolvidos em solução salina estéril 0.9% no dia em que foram utilizados. As doses de medicamento por lado foram: “Agonista D1 baixo”, 0.1 μg SKF81297; “Agonista D1 alto”, 0.4 μg SKF81297; “Antagonista D1”, 1.1 μg Schering 23390; “Agonista D2 baixo” 1 μg quinpirole; “Agonista D2 alto”, 10 μg quinpirole; "Antagonista D2," 2.2 μg raclopride.

Procedimento de microinjeção

Como descrito anteriormente (Nicola, 2010; Lardeux et al. 2015), os ratos foram suavemente contidos com uma toalha enquanto os injetores 33 ga foram inseridos nas cânulas guia de tal modo que o injetor estendeu 2 mm ainda mais ventral a partir da parte inferior da guia, alcançando o centro do núcleo NAc. Após 1 min, injectou-se 0.5 μL da solução de fármaco em 2 min com uma bomba de seringa de precisão. As drogas receberam 1 min para difundir, após o que os animais foram imediatamente colocados nas câmaras operantes. A ordem das injeções de drogas foi randomizada entre os ratos. As injeções foram realizadas duas vezes por semana (às terças e quintas ou sextas-feiras), com uma sessão não injetada intermediária no dia anterior a cada injeção para garantir que o comportamento se recuperasse da injeção anterior.

Rastreamento de vídeo

Nos dias de teste, a posição do rato foi registrada usando uma câmera aérea (30 quadros / s) e sistema de rastreamento automatizado (Plexon Cineplex ou Noldus Ethovision). Este sistema rastreou as posições xey dos LEDs vermelhos e verdes presos à cabeça do rato. Conforme descrito anteriormente (Nicola, 2010; McGinty et al. 2013; du Hoffmann e Nicola, 2014; Morrison e Nicola, 2014), para determinar a posição do rato na câmara operante, calculamos um centróide (o ponto central) entre os LEDs para cada quadro de vídeo. Posições ausentes de até 10 quadros sucessivos foram interpolados linearmente; se> 10 quadros sucessivos estivessem faltando, os dados eram descartados. Para cada quadro, calculamos então o DP das distâncias das posições dos centróides dentro de uma janela temporal de 200 ms. Quando o log é transformado, esses valores de DP foram distribuídos bimodalmente, com o pico inferior representando épocas de não movimento e o pico superior de movimento. Em seguida, ajustamos duas funções gaussianas a essas distribuições e o limite de movimento foi determinado como o ponto em que as distribuições superior e inferior se sobrepõem menos. O movimento foi definido como 8 quadros consecutivos acima desse limite.

A análise dos dados

Um rato não conseguiu recuperar os níveis de desempenho pré-cirúrgico após o implante da cânula e, portanto, não foi submetido a microinjeções. As cânulas de um segundo rato ficaram entupidas e, consequentemente, algumas microinjeções não foram realizadas. Assim, os dados foram obtidos a partir de microinjeções 7 para alguns experimentos e 6 para outros. Carimbos de tempo comportamentais e dados brutos de posição de rastreamento de vídeo foram exportados e a análise foi realizada com rotinas personalizadas no ambiente de computação estatística R (R Core Team, 2013).

Em figuras 1B – E, calculamos a taxa de resposta de sinalização dividindo o número de sinais respondidos pelo número de sinais apresentados em caixas 15 min ou 1 h e os traçamos como médias de sessão cruzada. Para avaliar as variáveis ​​de tarefa que influenciam o desempenho em cada droga, foram utilizadas medidas repetidas ANOVA com razão de resposta como variável dependente contra dois fatores, intervalo de tempo (1 e 2 h) e tipo de sinalização (grande e pequeno). Post-hoc emparelhado de duas caudas t-testes foram usados ​​dentro de cada condição de droga para testar se o tempo da sessão e o tipo de sugestão (grande e pequeno) influenciou significativamente a taxa de resposta. Welch de duas caudas t-testes foram usados ​​para comparar rácios de resposta para cada droga para solução salina. Valores de P para post-hoc t-testes foram corrigidos usando o procedimento de correção de comparações múltiplas de Sidak. O limiar de significância para todos os testes estatísticos foi fixado em p <0.05. Os resultados de todos os testes estatísticos podem ser encontrados na Tabela Table11.

  

Figura 1

Os agonistas e antagonistas dos receptores D1 e D2, respectivamente, promovem e atenuam a abordagem de recompensa. (UMA) 2CS + esquema de tarefa. O tempo não está em escala. (B, C) Relação de resposta média de sessão única (% de sugestões respondidas) em intervalos de tempo mínimo 15 para sugestões que ...

  

tabela 1

Resultados estatísticos.

Em figuras 2F, G, pistas sem resposta foram sinalizadas pela primeira vez e “pausas” foram definidas como ≥2 tentativas sucessivas sem resposta. A duração da pausa foi definida como o intervalo de tempo entre sugestões e respostas. O tempo acumulado gasto em pausas é plotado em relação ao número de pausa seqüencial (painéis da esquerda) e o tempo médio acumulado gasto em pausas até o final da sessão é mostrado nos gráficos de barras (painéis da direita). ANOVAs unidirecionais com o tipo de droga como um fator foram usadas para avaliar se o número de pausas ou o tempo acumulado gasto em pausas diferiram entre as drogas. Post-hoc Welch de duas caudas corrigido por Sidak t-testes foram usados ​​para comparar o número de pausa e o tempo total gasto em pausas em cada droga e solução salina.

  

Figura 2

Os agonistas do receptor D1 e D2 diminuem o tempo gasto no estado não responsivo. (A – E) Rasters mostram cinco sessões de exemplo, uma para cada medicamento (apenas doses elevadas). Cada linha representa a hora em que uma sugestão prevê grande (preto) ou pequena recompensa (laranja) ...

In Figuras 4A, C, F, H, cada tentativa t foi codificado como eliciando uma resposta (R +) ou não induzindo uma resposta (R−). Calculamos então a probabilidade empírica da ocorrência de R + ou R− em t+ 1. Este procedimento resulta em medidas de probabilidade 4, cada uma das quais está associada a um padrão único de resposta e nenhuma resposta nos dois ensaios consecutivos, t e t+ 1: P_{(R + R +)}, P_{(R + R-)}, P_{(R − R−)}, P_{(R − R +)}. Quando essas probabilidades são organizadas de modo que cada par que começa com o mesmo tipo de resposta (R + ou R−) esteja na mesma linha de uma matriz 2 × 2, cada linha é somada a uma; ou seja, a matriz está correta estocástica. Em Figuras 4A, C, F, H, plotamos (separadamente para cada fármaco) as probabilidades médias para cada par com os valores de linha dessas matrizes no mesmo eixo. Por exemplo, P_{(R + R +)}, P_{(R + R-)} estão no eixo vertical porque cada par começa com um R +. Como cada linha de cada matriz soma um, os valores da matriz são todos positivos, e o rato pode passar livremente de um estado responsivo (R +) para não-responsivo (R−) e vice-versa, a matriz estocástica pode descrever um Markov cadeia para a qual um vetor de probabilidade estacionário π pode ser calculado. Esses vetores de probabilidade são estimativas da probabilidade de encontrar o rato no estado responsivo e não responsivo em um estado estacionário da cadeia de Markov (Figura (Figure3) .3). Para calcular os componentes de π, nós transpusemos cada matriz, encontramos os autovalores da esquerda das matrizes transpostas e então dividimos esses valores pela sua soma (o que garante que os componentes de π somam a 1). O vetor de probabilidade médio para cada grupo de tratamento é plotado nas Figuras 4B, D, G, I. Assim, temos duas maneiras únicas de caracterizar o comportamento: pela matriz estocástica, que mostra graficamente as probabilidades médias de transição e pelo vetor de probabilidades estacionárias, o que gera uma estimativa da probabilidade de o rato estar tanto no responsivo quanto no não responsivo. Estado. Para comparar esses vetores de probabilidade entre fármacos e tempo, subtraímos os dois componentes de π, uma abordagem que preserva informações sobre a direção relativa do par de estimativas de probabilidade. Em figuras 4E, J, plotamos os quartis mediano e médio da sessão cruzada dessas diferenças dentro de cada droga separadamente para cada sessão hr. Para determinar para cada droga se esses vetores de probabilidade diferiram entre a primeira e a segunda hora das sessões, comparamos suas diferenças com os testes de postos sinalizados de Wilcoxon. Em seguida, realizamos testes de postos sinalizados de Wilcoxon não pareados (solução salina vs. droga) em cada hora e corrigimos os valores de 6 p (um para cada droga vs. soro fisiológico) com uma correção de Sidak.

  

Figura 3

Esquema de um modelo de Markov de dois estados. Em um determinado teste, um rato pode permanecer no estado responsivo (círculo à esquerda e seta em loop) ou não-responsivo (círculo à direita e seta em loop) ou em transição para o outro estado (setas entre os círculos). Cada ...

  

Figura 4

Os agonistas do receptor D1 e D2 promovem transições do estado não responsivo para responsivo. (A, C, F, H). Estes gráficos mostram as probabilidades de transição associadas para todos os possíveis pares de resposta / sem resposta do 4, calculados com a equação dada no ...

Em figuras 5A, B, pistas para as quais o animal respondeu foram isoladas pela primeira vez. Na figura Figura 5A, 5A, as latências do animal para iniciar o movimento dirigido para o receptáculo (barras da esquerda) e para alcançar o receptáculo de recompensa (barras da direita) foram calculadas e traçadas como a média da sessão cruzada. Na figura Figura 5B, 5B, calculamos, para cada tentativa, o comprimento do caminho (em cm) que o animal percorreu até o receptáculo a partir de sua posição no início da sugestão. Em seguida, calculamos a razão de dois valores: (A) a distância em linha reta entre a posição do rato no início da sugestão e o receptáculo, e (B) o comprimento do caminho real percorrido para chegar ao receptáculo. Essas relações A: B são denominadas valores de “eficiência do caminho”; eles variam de 0 a 1, com valores próximos a 1 indicando caminhos mais eficientes (menos tortuosos). As eficiências do caminho foram traçadas como médias de sessão cruzada para cada tipo de droga. Para avaliar se cada um desses valores de latência ou a medida de eficiência do caminho diferia entre os medicamentos, realizamos ANOVAs de uma via com o medicamento como fator. Na figura Figura 5C, 5CPara cada ensaio com uma entrada de receptáculo recompensada, contamos o número de entradas de receptáculos 5 s antes do início do sinal e 5 s após o início da sinalização. Estas contagens foram então convertidas em taxas (entradas por s), somando-as em todos os testes recompensados ​​da sessão e dividindo este valor pelo número de tentativas recompensadas multiplicadas por 5 s (o maior tempo de duração possível). As taxas médias de sessões cruzadas para cada droga são mostradas nos gráficos de barras na Figura Figura5C.5C. Para comparar essas duas taxas, para cada medicamento, usamos ANOVA de medidas repetidas com intervalo de tempo (intervalos pré e pós-sinal) como variável independente. Para comparar as taxas de entrada do receptáculo entre solução salina e droga dentro de cada intervalo de tempo, realizamos o teste de Welch corrigido por Sidak t-testes Na figura Figura 5D, 5D, classificamos as tentativas pelo intervalo inter-trial anterior (ITI) e agrupamos esses valores em caixas 10 s. Em seguida, calculamos as taxas de resposta para estudos com ITIs que caíram dentro de cada caixa e calculamos a média de sessões cruzadas para cada medicamento. Utilizamos o número de bin do ITI como um fator em uma ANOVA de medidas repetidas para avaliar se, em cada medicamento, a probabilidade de resposta variou em todas as durações do ITI. Na figura Figura 5E, 5EPara cada tentativa, calculamos a distância total percorrida (em cm) durante o ITI anterior ao início da sinalização. Em seguida, calculamos a distância média percorrida nas ITIs antes das pistas às quais o animal respondeu e, de forma semelhante, para as quais o animal não respondeu. Para avaliar se a distância total percorrida diferiu entre os ensaios com e sem uma resposta cued subsequente, dentro de cada droga, usamos medidas repetidas ANOVA com o tipo de resposta como um fator. Em seguida, realizamos post-hoc Welch corrigido por Sidak t-testes para comparar os comprimentos médios percorridos para cada tipo de resposta (droga vs. solução salina).

  

Figura 5

Os agonistas da dopamina aumentam a locomoção, mas o aumento da resposta à cue não é atribuível ao aumento da locomoção. (UMA) O grupo de barras da esquerda mostra os efeitos da injeção de agonistas salinos, D1 e D2 na latência média para iniciar o movimento após ...

Histologia

Os animais foram profundamente anestesiados com Euthasol e decapitados com uma guilhotina. Cérebros foram rapidamente removidos do crânio e depois fixados em formalina. Antes de fatiar com um criostato, os cérebros foram crioprotegidos por imersão em 30% de sacarose por vários dias. Seções (50 μm) foram coradas para a substância Nissl para visualizar a cânula e as trilhas dos injetores. As estimativas dos locais de injeção para cada animal são mostradas na Figura Figura 66.

  

Figura 6

Reconstrução histológica de locais de injeção. A figura representa duas secções coronais de cérebro de rato que abrangem a maior parte da extensão ântero-posterior do NAc (0.8-2.8 mm anterior de Bregma). Pontos pretos representam estimativas da localização ...

Probabilidade de resposta

Nós treinamos ratos 8 para responder a sinais auditivos distintos que previam uma recompensa pequena ou grande de sacarose (Figura (Figure1A) .1A). Mesmo que os animais não estivessem restritos a alimento, eles responderam a quase todas as pistas que indicaram 10% de sacarose líquida (Figuras 1B, Clinhas pretas), embora não discriminem substancialmente entre grandes (Figure1B) 1B) e pequeno (Figura (Figure1C) 1Cdisponibilidade de recompensa. Em contrapartida, a partir do primeiro dia em que a concentração de recompensa da sacarose foi reduzida de 10% para 3%, verificou-se uma pronunciada degradação das respostas ao longo dos 2 h dos testes (Figuras 1B, Clinhas cinzas). Há pelo menos duas explicações possíveis para esse efeito. Primeiro, pode ser devido a um estado de saciedade à medida que os animais acumulam nutrientes com respostas sucessivas às pistas. No entanto, isso é improvável porque o nutriente acumula mais rapidamente com 10% do que 3% de recompensas de sacarose do mesmo volume, mas a degradação foi muito mais pronunciada com 3% de sacarose. A segunda possibilidade, que nós favorecemos, é que enquanto a 10% sacarose é suficientemente reforçadora para manter a resposta durante a sessão, volumes equivalentes de 3% de sacarose não são. Seja qual for a sua causa, o efeito degradado nos permitiu perguntar se a ativação de receptores de dopamina usando agonistas exógenos aumenta a taxa de resposta. Esta pergunta não pode ser respondida usando recompensas 10% de sacarose ou em animais com restrição alimentar, porque a resposta inicial está próxima de 100% nessas condições e, portanto, não pode ser aumentada.

Quando o desempenho estabilizou, 4 dias após a mudança para 3% de recompensas de sacarose, uma diferença em responder a sugestões de recompensa grandes e pequenas foi evidente no início da sessão (compare Figura Figura 1B1B com figura Figura 1C); 1C); essa diferença diminuiu conforme a sessão progrediu e a resposta aos dois tipos de sinalização diminuiu. Esta diferença significativa entre resposta grande e pequena da sugestão também é evidente na taxa de resposta média na primeira hora da sessão após injeções salinas (controle de veículo) no NAc: os sujeitos responderam a 54 ± 5% de grandes pistas associadas à recompensa e 33 ± 3% de pequenas sugestões associadas à recompensa (Figuras 1D, E, círculos pretos à esquerda). A probabilidade de responder a ambas as pistas foi menor na segunda hora; Além disso, a razão de resposta para as pistas grandes e pequenas era estatisticamente indistinguível durante esse período (Figuras 1D, Ecírculos pretos à direita; veja a tabela Table11 para resultados estatísticos). Portanto, os animais responderam mais a sugestões que preveem grandes recompensas do que pequenas apenas na primeira metade da sessão.

Para examinar o padrão temporal de responder com mais detalhes, construímos gráficos de varredura que mostram o tempo de cada apresentação de sugestão e se o animal respondeu (varredura superior, figura Figura 2A) 2A) ou não (raster inferior). Como mostrado em uma sessão de exemplo anterior à qual a solução salina foi injetada, tanto as respostas quanto as falhas de resposta tipicamente ocorreram em grupos de várias pistas sucessivas (Figura (Figure2A) .2A). Isso sugere que há dois estados que ditam a probabilidade de resposta: responsivos e não responsivos. Além disso, à medida que a sessão progrediu, a redução na probabilidade de resposta foi devido a períodos mais longos de tempo gasto no estado não responsivo (Figura (Figure2A, 2A, top raster). Para quantificar a duração da mudança dos estados não responsivos, plotamos, para cada sessão, o tempo acumulado gasto no estado pausado (não responsivo) em relação ao número de pausa seqüencial. Em essencialmente todas as sessões de injeção salina, essas linhas se tornaram mais íngremes no final da sessão, indicando que os estados individuais não responsivos se tornaram mais longos à medida que as sessões progrediam (Figuras 2F, Glinhas pretas).

Para avaliar a contribuição da dopamina core NAc para a decisão de responder a dicas preditivas de recompensa, aumentamos ou diminuímos farmacologicamente a sinalização do receptor de dopamina D1 ou D2 por microinjeção do agonista do receptor D1 SKF 81297 ou antagonista SCH 23390, ou o quinpirole agonista do receptor D2 ou raclopride antagonista. Descobrimos que ambos os agonistas D1 e D2 aumentaram significativamente a resposta aos estímulos (Figura (Figure1D, 1DQuadrados vermelhos claros; Figura Figura 1E, 1E, quadrados azuis claros); em particular, a dose baixa de cada agonista aumentou respondendo apenas na segunda hora, enquanto as altas doses aumentaram em toda a sessão (Figura (Figure1D, 1DQuadrados vermelhos claros; Figura Figura 1E, 1E, quadrados azuis claros abertos). Geralmente, responder a sugestões de recompensa grandes e pequenas foi aumentado para graus aproximadamente equivalentes, e este foi o caso para os agonistas dos receptores D1 e D2 (Figuras 1D, E e mesa Table11).

Estes aumentos na taxa de resposta foram acompanhados por um padrão diferente de resposta em comparação com os animais tratados com solução salina (Figuras 2B, C). Em contraste com a condição de controle, onde o tempo gasto no estado não responsivo aumentou conforme a sessão progrediu, as respostas dos animais tratados com agonistas foram comparativamente sustentadas durante toda a sessão, com breves mas relativamente frequentes transições para o estado não responsivo. (Figura (Figure2F, 2F, Agonista D1, linhas vermelhas claras; Figura Figura 2G, 2G, Agonista D2, linhas azuis claras). Ambos os agonistas reduziram significativamente o tempo acumulado no estado de pausa não responsivo e impediram em grande parte o aumento acentuado no tempo acumulado gasto em pausas que ocorreram na segunda hora da sessão em animais tratados com solução salina.

Os antagonistas dos receptores D1 e D2 tiveram o efeito oposto dos agonistas. Os antagonistas reduziram fortemente a resposta às dicas na primeira metade da sessão, deixando a resposta na segunda metade inalterada (provavelmente devido a um efeito de chão) (Figura 1). (Figure1D), 1D), triângulos vermelhos escuros; (Figura (Figure1E, 1E, triângulos azuis escuros). Ambos os antagonistas também prolongaram significativamente o tempo acumulado gasto no estado não responsivo (Figuras 2D, E, F, G).

Probabilidades de transição

O aumento nas respostas de sinalização causadas pelos agonistas D1 e D2, bem como o maior tempo gasto no estado responsivo do que no estado não responsivo, pode ser explicado por uma maior probabilidade de transição do estado não responsivo para o estado responsivo, ou, inversamente, uma probabilidade diminuída de transição do estado responsivo para o não responsivo (ou ambos). Para determinar qual deles foi o caso, implementamos um modelo simples de dois estados de Markov (Figura (Figure3) 3) calculando as matrizes de probabilidade de transição empírica para os possíveis pares de eventos sucessivos de 4: duas respostas cued sucessivas (R + R +), uma resposta a uma sugestão seguida por uma não resposta à próxima sugestão (R ​​+ R−), uma não -response seguido por uma resposta (R − R +), e uma não resposta seguida por uma não resposta (R − R−). Observe que R + R + e R − R − correspondem a permanecer nos estados responsivo e não responsivo, respectivamente; e que R + R− e R − R + correspondem à transição de um estado para outro. A probabilidade de cada um desses pares de resultados foi calculada dividindo-se o número de vezes que o par ocorreu em uma determinada janela de tempo (por exemplo, a primeira hora da sessão) pelo número de vezes que o primeiro membro do par ocorreu (por exemplo, P_{(R + R-)} = N_{(R + R-)} / N_{(R +)}; veja a seção Métodos, Análise de dados). Observe que a probabilidade de transição de um estado é, portanto, 1 menos a probabilidade de permanecer em um estado (por exemplo, P_{(R + R-)} = 1 - P_{(R + R +)}). Assim, nas figuras 4A, C, F, H, os dados no eixo vertical dos gráficos à esquerda mostram a probabilidade média (através de ratos) de manter ou fazer a transição para fora do estado responsivo, enquanto os dados no eixo horizontal mostram a probabilidade de manter ou fazer a transição para fora do estado não responsivo .

Na primeira hora de testes comportamentais, os ratos tratados com solução salina tenderam a agrupar suas respostas: se eles respondiam a uma sugestão, a probabilidade de uma resposta à próxima sugestão era maior que a de uma não resposta (P_{(R + R +)} > P_{(R + R-)}; Figura Figura 4A, 4A, eixo vertical); inversamente, se eles não respondiam a uma sugestão, a probabilidade de uma não resposta para a próxima sugestão era maior que a de uma resposta (P_{(R − R−)} > P_{(R − R +)}; Figura Figura 4A, 4A, eixo horizontal). O tratamento com o agonista D1 ou D2 não alterou fortemente a probabilidade de permanecer no estado responsivo (R + R +) [ou, equivalentemente, a probabilidade de transição para o estado não responsivo (R + R−)] em comparação com a solução salina. injeções (Figura (Figure4A, 4A, eixo vertical). No entanto, os animais tratados com agonistas fizeram uma transição significativamente mais freqüente do estado não responsivo para o responsivo (e, de forma equivalente, permaneceram no estado não responsivo com menos frequência; Figura 4A, 4A, eixo horizontal).

Na segunda hora da sessão, os ratos tratados com solução salina mostraram uma diminuição acentuada na probabilidade de que eles passariam do estado não responsivo para o responsivo em comparação com a primeira hora (Figura (Figure4C4C vs. figura Figura 4A, 4A, eixo horizontal). Além disso, eles eram mais propensos a fazer a transição do estado responsivo para o não responsivo na segunda hora do que o primeiro (Figura (Figure4C4C vs. figura Figura 4A, 4A, eixo vertical). Portanto, à medida que a sessão progrediu, sob condições de controle, o declínio na resposta (Figuras 1B, D) deveu-se tanto a estados não responsivos mais longos quanto a estados responsivos mais curtos. O tratamento com os agonistas D1 ou D2 alterou as probabilidades de resposta na segunda hora ao longo de ambos os eixos (Figura (Figure4C) .4C). Portanto, enquanto na primeira hora os agonistas aumentaram a probabilidade de transição do estado não responsivo sem afetar as transições fora do estado responsivo, na segunda hora, os agonistas aumentaram as transições para fora do estado não responsivo e diminuíram as transições fora do estado responsivo - o que significa que os agonistas aumentaram o tamanho dos estados responsivos e diminuíram o comprimento dos estados não responsivos. Notavelmente, esses efeitos dos agonistas fizeram com que as probabilidades de transição da segunda hora se assemelhassem àquelas na primeira hora na condição de controle. Ou seja, os agonistas impediram o declínio em responder na segunda hora, impedindo o deslocamento normal em direção a probabilidades de transição que favoreciam o estado não responsivo.

Tanto o D1 quanto o antagonista D2 mudaram de resposta na primeira hora ao longo de ambos os eixos, indicando que eles encorajavam as transições para o estado não-responsivo, bem como impediam as transições para o estado responsivo. (Figure4F) .4F). Curiosamente, na segunda hora, as probabilidades de transição no antagonista e na solução salina eram quase idênticas (Figura (Figure4H), 4H), e as probabilidades de transição em animais tratados com antagonistas não foram significativamente diferentes na primeira e segunda hora (Figura (Figure4F4F vs. figura Figure4H) .4H). Esses resultados indicam que os antagonistas D1 e D2 induzem, na primeira hora, um conjunto de probabilidades de transição quase idênticas àquelas que normalmente ocorrem na segunda metade da sessão em condições de controle, correspondendo a longos períodos de não-responsividade a sinais .

Para comparar estatisticamente essas probabilidades de transição em droga e solução salina, resolvemos cada matriz em vetores de probabilidade; isto é, estimamos, a partir das matrizes de transição, a probabilidade de cada rato em cada condição estar em um estado responsivo e não-responsivo no estado estacionário de uma cadeia de Markov (ver Métodos, seção Análise de dados e Figura Figure3) .3). Em figuras 4B, D, é evidente que na condição de controle (solução salina), as distribuições de probabilidade para o estado responsivo e não responsivo mudam fortemente para o estado não responsivo na segunda hora. Em contraste, essas probabilidades são relativamente estáveis ​​em ambos os agonistas em toda a sessão. Em antagonista (figuras 4G, eu), a distribuição das probabilidades de cada estado é fortemente deslocada para o estado não responsivo em ambas as horas e estas probabilidades são quase idênticas às da segunda hora em animais tratados com solução salina. Em figuras 4E, J subtraímos, para cada sessão hr e cada droga, os componentes dos vetores de probabilidade mostrados nas Figuras 4B, D, G, I. Assim, valores acima e abaixo de zero indicam uma probabilidade maior de estar no estado responsivo e não responsivo, respectivamente. Durante a primeira hora em solução salina, havia uma probabilidade quase igual de estar nos estados responsivo e não responsivo. Na segunda hora, esta distribuição de probabilidades de estado mudou significativamente para o estado não-responsivo (Figura (Figure4E, 4E, pontos pretos à esquerda vs. pontos pretos à direita). Na dose alta de qualquer um dos agonistas, houve um aumento significativo na probabilidade de estar no estado responsivo na primeira hora em relação à solução salina (Figura (Figure4E, 4Epontos à esquerda) e isto foi mantido na segunda hora da sessão (Figura (Figure4E, 4E, pontos certos). Assim, a ativação constitutiva dos receptores de dopamina é suficiente para promover e manter o estado responsivo sob condições de saciedade normativa. Os antagonistas tiveram o efeito oposto; eles mudaram de maneira significativa e significativa as distribuições de probabilidade de estado em direção ao estado não responsivo na primeira e segunda hora da sessão. Além disso, não houve diferença estatisticamente entre as distribuições de probabilidade de estado no antagonista e na solução salina durante a segunda hora da sessão. Assim, o bloqueio da ativação do receptor de dopamina induz um estado não responsivo com a mesma eficácia que a experiência de tarefa ao longo do tempo na condição de controle. Além disso, a ativação desses mesmos receptores promove uma transição poderosa para o estado responsivo a estímulos que predizem a recompensa alimentar mesmo na ausência de necessidade calórica.

Locução locomotiva

É possível que os efeitos agonistas resultem de maiores entradas de receptáculos não direcionados, devido a um aumento não específico na locomoção, em vez de um aumento nas respostas de abordagem dirigida a receptáculos. Para comparar essas hipóteses, usamos dados de rastreamento de vídeo para examinar os parâmetros de movimento pós-estímulo em estudos em que o animal respondeu à sugestão. Não houve diferença estatisticamente significante entre as sessões controle e agonista na latência para iniciar a locomoção após o início do estímulo (Figura (Figure5A, 5A, barras à esquerda) ou a latência para alcançar o receptáculo (Figura (Figure5A, 5A, barras certas). Além disso, a eficiência do caminho do movimento cued (razão entre o comprimento de uma linha reta entre o animal e o receptáculo e o comprimento do caminho que o animal realmente seguia) não foi alterada pelos tratamentos agonistas (Figura 1). (Figure5B) .5B). Como não-direcionados, movimentos aleatórios que resultam na entrada do receptáculo seriam menos diretos (e, portanto, menos eficientes) e / ou ocorriam com maior latência, essas observações sugerem que os animais tratados com agonistas realizaram movimentos direcionados em direção ao receptáculo de recompensa após cue início de uma forma semelhante aos seus movimentos de abordagem em salina.

Em seguida, avaliou-se se os aumentos induzidos por agonistas nas entradas coordenadas poderiam ter sido devidos a um aumento não específico. Examinando apenas ensaios com uma resposta, comparamos a taxa de entradas de receptáculos nos 5 s antes do início da sugestão para a taxa de entrada nos 5s após o início da sugestão. Os agonistas não aumentaram significativamente a taxa média de entradas espontâneas ou coordenadas (Figura (Figure5C) 5C) que sugere que a entrada do receptáculo permanece sob controle de sugestão no agonista. Juntos, os resultados em figuras 5A – C demonstram que o aumento na probabilidade de abordagem cued causada pelos agonistas não é atribuível a fatores inespecíficos, como um aumento na locomoção não direcionada ou a taxa de entradas de receptáculos incorretos.

Locomoção durante ITIs

Embora o aumento induzido por agonista na resposta dirigida não tenha sido atribuído a um aumento na locomoção não-direcionada, esta conclusão não exclui a possibilidade de que os agonistas, no entanto, induziram um aumento concomitante da locomoção não direcionado para o receptáculo. Para quantificar a locomoção durante o ITI, primeiro perguntamos se a probabilidade de uma resposta ao estímulo variava em função do comprimento do ITI. Como mostrado na figura Figura 5D, 5DA taxa de resposta (colapsada através de sinais grandes e pequenos) foi razoavelmente constante ao longo de toda a gama de comprimentos de ITI tanto no agonista como na solução salina. Em seguida, calculamos a distância média percorrida por s do ITI para cada um dos grupos de tratamento e comparamos essa taxa de locomoção nos ensaios em que os ratos responderam e não responderam ao estímulo subsequente. Curiosamente, na condição de controle (solução salina), houve significativamente mais locomoção durante as ITIs, seguido por uma abordagem de receptáculo com cuadr (Figura 1). (Figure5E, 5E, barra preta à direita) do que quando os animais não conseguiram fazer uma abordagem subsequente do receptáculo (Figura (Figure5E, 5E, barra preta à esquerda). Esses resultados sugerem que a locomoção incorrida ocorre com maior frequência quando o animal está em estado responsivo.

Para determinar se esse processo envolve a ativação do receptor de dopamina no NAc, avaliamos os efeitos dos agonistas da dopamina na locomoção durante o ITI. O agonista D1 aumentou significativamente a locomoção durante ITIs com e sem uma resposta subsequente; Da mesma forma, o agonista D2 causou um aumento significativo (ensaios sem resposta) ou uma tendência a um aumento (ensaios de resposta) (Figura (Figure5E) .5E). Assim, os agonistas da dopamina causaram um aumento global na locomoção durante os ITIs. Na presença de agonistas, essa locomoção ocorreu em níveis similarmente altos, independentemente de o animal ter respondido subseqüentemente, sugerindo que a locomoção da ITI é mais sensível à ativação do receptor da dopamina do que a resposta à cue. Em suma, os resultados mostrados na Figura Figura 55 sugerem que, por meio de um mecanismo dentro do NAc, a ativação do receptor de dopamina viola os animais tanto para maior probabilidade de responder aos estímulos como para maiores taxas de locomoção espontânea, e que embora a dopamina tenha ambos efeitos, a maior probabilidade de resposta impulsionada pela dopamina não é uma consequência espúria de taxas mais altas de locomoção espontânea.

A dopamina NAc é necessária e suficiente para uma abordagem taxada

A abordagem indicada por estímulo é fortemente dependente da projeção de dopamina mesolímbica da VTA para a NAc somente em circunstâncias muito específicas: aquelas em que a resposta envolve “abordagem flexível” (Nicola, 2010) [também chamado de “taxic” (Petrosini et al., 1996) ou "orientação" (O'keefe e Nadel, 1978) aproximação; o termo “abordagem táxica” será usado aqui]. A abordagem táxi se refere à locomoção que é direcionada para um objeto visível a partir de locais de partida que variam em ocasiões de abordagem. É importante ressaltar que a abordagem táxica requer que o cérebro calcule um novo caminho de movimento para cada evento de abordagem [ao contrário da abordagem "práxica", "orientação" ou "inflexível", que ocorre quando os locais de início e término são constantes entre os eventos de abordagem (O'keefe e Nadel, 1978; Petrosini et al. 1996; Nicola 2010)]. O presente estudo estende a conclusão de que a dopamina NAc é necessária para abordagem taxativa de quatro maneiras. Primeiro, enquanto a dependência da abordagem taxic na dopamina mesolímbica foi primeiramente estabelecida usando uma tarefa de estímulo discriminativo (DS) que exigia que o animal se aproximasse de um operando para obter a recompensa de sacarose entregue em um receptáculo próximo (Yun et al. , 2004a,b; Ambroggi et al. 2008; Nicola 2010), na presente tarefa, os animais tinham simplesmente que se aproximar do próprio receptáculo de recompensa. Como na tarefa DS, as sugestões foram apresentadas em intervalos longos e variáveis, resultando em diversos locais de início no início da sugestão devido ao movimento do animal sobre a câmara durante o intervalo intertrial (não mostrado) - condições sob as quais o comportamento de abordagem é necessariamente táxico. Nossa observação de que a injeção de antagonista do receptor de dopamina D1 e D2 no núcleo de NAc reduziu a proporção de sinais aos quais o animal respondeu em paralelo com as observações anteriores com a tarefa DS (Yun et al., 2004a,b; Ambroggi et al. 2008; Nicola 2010). Semelhante aos achados anteriores com uma tarefa de atraso progressivo (Wakabayashi et al., 2004Nossos resultados confirmam, em uma tarefa muito mais simples, que a inclusão de uma contingência operante explícita em um local diferente do local de entrega de recompensa não é um recurso de tarefa crítica que torna o comportamento da abordagem taxonômica dependente da dopamina NAc.

Segundo, enquanto estudos anteriores foram conduzidos em animais com restrição alimentar, o presente trabalho demonstra que a abordagem taxica é prejudicada pela injeção de antagonista de dopamina NAc mesmo em animais ad libitum acesso à comida. A dependência da abordagem táxica da dopamina mesolímbica não é, portanto, uma função do déficit de nutrientes ou do estado de fome do sujeito. De fato, os presentes resultados apóiam um papel da dopamina mesolímbica na promoção de uma abordagem induzida por estímulos para alimentos de alto teor calórico, mesmo na ausência de uma necessidade homeostática de calorias, apoiando a hipótese de que este circuito contribui para comer em excesso e obesidade (Berridge et al., 2010; Kenny 2011; Stice et al. 2013; Meye e Adan, 2014).

Terceiro, enquanto estudos anteriores usaram antagonistas da dopamina para mostrar que a dopamina NAc é necessária para a abordagem taxada, no presente trabalho nós demonstramos que aumentar a ativação do receptor de dopamina do NAc D1 ou D2 por injeção de agonistas desses receptores é suficiente para aumentar a probabilidade A sugestão irá suscitar uma abordagem táctica. Este experimento não foi possível na maioria dos estudos anteriores, porque os ratos com restrição alimentar respondem próximo a 100% de pistas que predizem os nutrientes de forma confiável, impondo um teto aos potenciais efeitos agonistas. No entanto, quando a previsão de sacarose tornou-se menos confiável em uma tarefa “probabilística de estímulo” na qual a PS previu recompensa de 10% de sacarose em apenas 15% dos ensaios, a probabilidade de resposta foi menor e o bloqueio farmacológico da recaptação de dopamina aumentou essa probabilidade (Nicola et al. 2005). No presente estudo, ratos foram alimentados com ração ad libitum e a recompensa pela resposta da sugestão foi de 3% em vez de 10% de sacarose. Sob essas condições, mesmo que as pistas previssem a recompensa de forma confiável, os animais responderam a uma fração menor do que sob condições de restrição alimentar ou de sacarose, eliminando o efeito teto e permitindo avaliar os efeitos dos agonistas na abordagem taxada. Consistente com os resultados da tarefa PS, a injeção de agonista de dopamina no núcleo NAc produziu um aumento robusto na resposta à cue. Os presentes resultados, portanto, estabelecem que a ativação do receptor da dopamina do núcleo NAc é necessária e suficiente para promover a abordagem taxada, apoiando nossa conclusão anterior de que a dopamina mesolímbica é parte do mecanismo causal da iniciação da abordagem taxônica (du Hoffmann e Nicola, 2014).

Quarto, nossa observação de que os agonistas D1 e D2 têm efeitos muito semelhantes que são opostos aos efeitos dos antagonistas D1 e D2 tem implicações importantes para as conclusões sobre a especificidade dos efeitos das drogas. Na maioria dos estudos anteriores, os antagonistas D1 e D2 microinjetados apresentaram comportamento muito semelhante (Hiroi e White, 1991; Ozer et al. 1997; Koch et al. 2000; Yun et al. 2004b; Eiler et al. 2006; Pezze et al. 2007; Lex e Hauber, 2008; Liao 2008; Nicola 2010; Shin et al. 2010; Haghparast et al. 2012; Steinberg et al. 2014) e eletrofisiológico (du Hoffmann e Nicola, 2014) efeitos. Como a concentração de antagonistas injetados necessária para observar os efeitos é muito maior do que as constantes de ligação dessas drogas para seus receptores-alvo, a similaridade dos efeitos antagonistas D1 e D2 questiona sua especificidade: é possível que as drogas se liguem ao mesmo receptor de dopamina, ou a uma terceira classe de receptores que não é um receptor de dopamina. No primeiro caso, a ativação de um dos receptores não deve produzir nenhum efeito comportamental; no último caso, a ativação de nenhum receptor deve produzir um efeito comportamental. No entanto, descobrimos que os agonistas D1 e D2 produzem efeitos comportamentais e que os seus efeitos são idênticos entre si e precisamente opostos aos dos antagonistas. Seria notável se 4 diferentes drogas agissem no mesmo receptor fora do alvo. Portanto, o cenário mais provável é que todas as drogas atuem especificamente em seus receptores-alvo.

Os efeitos dos agonistas da dopamina não se devem a um aumento generalizado da locomoção

Uma complicação potencial com a interpretação de que os agonistas dopaminérgicos promoveram a resposta cue é que o efeito poderia ter sido devido a um aumento generalizado na locomoção, resultando em entradas espúrias de receptáculos que teriam ocorrido se uma sugestão foi ou não apresentada. De fato, na condição de controle, os dados de rastreamento de vídeo obtidos durante a sessão revelaram que a taxa de locomoção durante o intervalo intertal foi correlacionada experimentalmente com a probabilidade de entrada do receptáculo durante a apresentação da sugestão subsequente. Além disso, os agonistas aumentaram tanto a locomoção durante os intervalos interjugais quanto indicaram a probabilidade de resposta. Uma maneira de descartar um efeito motor generalizado é usar um estímulo preditivo sem recompensa (NS) para mostrar que a resposta à apresentação de NS não é aumentada pelos agonistas. Nós não incluímos um NS em nosso design. Nossa hipótese é que se tivéssemos feito isso, teríamos observado um aumento na locomoção durante o SN (como ocorreu durante o intervalo intertrial), mas não um aumento nas entradas dos receptáculos. Esta hipótese é baseada em várias observações indicando que o aumento da probabilidade de entrada após a apresentação da sugestão não foi um resultado do aumento da locomoção generalizada. Em primeiro lugar, o aumento da locomoção durante o intervalo entre estudos causado pelos agonistas foi desacoplado do aumento na resposta à cue, ocorrendo mesmo durante os intervalos que foram seguidos por uma não resposta à sugestão (Figura 1). (Figure5E) .5E). Em segundo lugar, a probabilidade de uma entrada do receptáculo uncued durante o ITI não foi aumentada pelos agonistas (Figura (Figure5C) .5C). Finalmente, em comparação com entradas direcionadas, seria esperado que entradas resultantes de um aumento generalizado na locomoção ocorressem em latência mais longa após o início da sinalização, e se esperasse que o animal seguisse um caminho mais circular desde sua localização no início da sinalização até o receptáculo; entretanto, os agonistas não aumentaram as latências de entrada de sinalização (Figure5A) 5A) nem diminuiu a eficiência do trajeto do movimento (Figure5B) .5B). Juntos, esses resultados indicam que o aumento nas entradas do receptáculo cued causado pelos agonistas não é devido ao aumento concomitante da locomoção. Uma explicação mais provável é que alguns eventos locomotores espontâneos eram abordagens tóxicas para objetos dentro da câmara, e a probabilidade de tais abordagens foi aumentada pelos agonistas, assim como a probabilidade de abordagem taxativa em resposta às nossas sugestões explicitamente apresentadas foi aumentada.

Falta de uma diferença pronunciada em responder a pistas que preveem grandes e pequenas recompensas

Outra diferença entre a tarefa atual e nossos estudos anteriores usando tarefas DS e PS é que apresentamos duas dicas preditivas de recompensa, que previam grandes e pequenos volumes de sacarose, ao invés de uma sugestão preditiva de recompensa e um estímulo não-preditivo de recompensa ( NS). Nós incluímos dicas preditivas de recompensa dupla no projeto da tarefa, a fim de avaliar se as manipulações de receptores de dopamina NAc diferencialmente influenciam o comportamento desencadeado por pistas preditivas de diferentes magnitudes de recompensa. No entanto, não pudemos conduzir tal análise porque os animais não diferenciaram de forma robusta os dois sinais. Quando a recompensa foi 10% sucrose, não houve diferenças significativas na taxa de resposta entre pistas preditivas de recompensa grande e pequena; e quando a recompensa foi 3% sucrose, uma pequena diferença (~ 20%) foi observada apenas na primeira hora da sessão (Figura (Figure1) .1) Essas observações contrastam com o comportamento típico na tarefa de SD usando exatamente os mesmos estímulos auditivos, em que os animais respondem a> 80% das apresentações de SD e <10% das apresentações de NS (Nicola, 2010) Mais recentemente, descobrimos que em uma tarefa semelhante à presente, usando os mesmos dois estímulos auditivos, mas com uma pista preditiva de recompensa contingente à entrada do receptáculo e uma NS, a resposta ao SN foi bastante elevada (> 20%; não mostrado ) Esta alta resposta (em comparação com a baixa taxa de resposta NS em tarefas DS com um requisito operante explícito) é provavelmente devido a algum grau de generalização entre as pistas preditivas e não preditivas, bem como à falta de uma contingência de resposta operante. A ausência de tal contingência significa que a resposta à sugestão é menos difícil e requer menos esforço do que responder à sugestão na tarefa DS, potencialmente explicando a diferença na probabilidade de resposta NS. Se taxas de resposta> 20% para um SN são comuns, elas devem ser ainda maiores quando a dica prediz uma pequena quantidade de recompensa, exatamente como observado no presente estudo.

Declínio na resposta ao longo do tempo pode ser um efeito de extinção

Uma característica marcante do comportamento observado em nossa ad libitum animais alimentados com ração foi um declínio na probabilidade de resposta à sugestão durante a sessão 2 h, que foi muito mais pronunciada quando a recompensa foi 3% de sacarose do que quando foi 10% de sacarose. Os ratos que receberam acesso livre à sacarose apresentam um declínio similar na taxa de lambida desde o início da sessão, o que é atribuível à saciedade: mecanismos de detecção de nutrientes pós-ingestivos sinalizam para o cérebro, resultando em redução do consumo (Smith, 2001). No entanto, é improvável que a saciedade seja responsável pelo declínio na resposta à cue aqui observado, pois a maior ingestão de nutrientes quando 10% de sacarose fosse a recompensa produziria um declínio mais rápido na resposta do que quando a 3% de sacarose fosse entregue. (Figura (Figure1) .1). Outra explicação possível é que o declínio é um efeito semelhante à extinção que é devido ao fornecimento de reforços que são de magnitude insuficiente para manter a resposta às pistas dos testes subseqüentes. Embora não tenhamos evidências diretas de que este seja o caso, simplesmente deixar de fornecer sacarose também resulta em um declínio na resposta (não mostrado). Embora este verdadeiro efeito de extinção seja mais rápido do que o observado aqui, o curso de tempo de extinção mais lento no presente caso seria esperado porque uma pequena quantidade de sacarose foi entregue. Além disso, quando uma maior concentração de sacarose (10%) foi entregue, quase nenhum declínio foi observado, consistente com a idéia de que os reforços de sacarose 3% eram de magnitude insuficiente para manter a resposta.

Que 3% de sacarose é menos reforçadora do que 10% dificilmente é surpreendente, dado não só que 3% de sacarose é menos preferida em relação à água do que 10% (Sclafani, 1987), mas também que 10% sucrose é mais susceptível de ativar mais fortemente os processos pós-ingestão que detectam a ingestão de nutrientes, o que pode contribuir para o reforço, mesmo na ausência de sabor (de Araujo et al., 2012; Sclafani e Ackroff, 2012; Sclafani, 2013; de Araujo, 2016). Esses processos promovem a sinalização da dopamina e, de fato, parecem ser responsáveis ​​pela capacidade dos reforçadores nutritivos de sacarose de sustentar o desempenho da tarefa de razão progressiva muito mais do que os reforçadores não nutritivos doces (Beeler et al., 2012). De fato, sinais preditivos de sacarose provocam mais liberação de dopamina no NAc do que estímulos preditivos de adoçantes não nutritivos (McCutcheon et al., 2012) e, sob algumas condições, a sacarose provoca mais liberação de dopamina do que o adoçante (Beeler et al., 2012). Estes resultados sugerem que um sinal de dopamina atenuada durante as sessões de 3% de sacarose (vs. 10%) poderia ser responsável pelo declínio tipo extinção na resposta quando a menor concentração de sacarose foi usada.

Consistente com essa hipótese, a ativação e inibição dos receptores de dopamina interagiram com o efeito semelhante à extinção. D1 ou injeção de agonista do receptor de dopamina D2 aumentaram a taxa inicial (primeira hora) de resposta e reduziram grandemente a magnitude do declínio normal na resposta da primeira à segunda hora em comparação com a condição de controle (Figuras 1D, E), essencialmente impedindo o efeito de extinção. Em contraste, a injeção de antagonista D1 ou D2 reduziu a taxa de resposta na primeira hora da sessão para valores indistinguíveis daqueles normalmente observados na segunda hora, imitando e / ou acelerando a extinção. Uma possibilidade é que a dopamina do núcleo NAc faça parte do mecanismo de reforço que impede a extinção. Esta ideia é consistente com o papel proposto para a dopamina como um sinal de erro de predição de recompensa, que é pensado para ser a base para mudanças aprendidas na representação neural do valor previsto pelos estímulos (Montague et al., 1996; Schultz et al. 1997; Schultz, 1998). Também é consistente com o papel da dopamina em “reinicializar” tais representações de valor (Berridge, 2012). Por outro lado, espera-se que os agonistas da dopamina ativem constitutivamente os receptores de dopamina, imitando assim a chamada dopamina “tônica”; embora os agonistas ativassem os receptores de dopamina no momento em que a recompensa fosse administrada, eles também ativariam os receptores em um grau similar em todos os outros momentos. É difícil conceituar como esse sinal constante pode ser interpretado como um erro de previsão ou como um sinal de “reinicialização” que serve para indicar que um evento de reforço discreto ocorreu.

Uma hipótese alternativa é que os fármacos dopaminérgicos não interferiram no reforço, mas com um mecanismo neural que ativa diretamente o comportamento da abordagem cued. Esta proposta é apoiada por nossos estudos prévios demonstrando que uma grande proporção (quase metade) dos neurônios NAc é estimulada por sugestões em uma tarefa de DS (Ambroggi et al., 2008; McGinty et al. 2013; du Hoffmann e Nicola, 2014; Morrison e Nicola, 2014); além disso, em uma tarefa de abordagem de receptáculo com cuida semelhante à usada aqui (isto é, sem uma contingência de resposta operante), uma proporção similar de neurônios NAc é excitada (Caref e Nicola, 2014). Usando o rastreamento de vídeo, estabelecemos que essas excitações precedem o início da locomoção da abordagem e prevêem a latência na qual ela ocorrerá (McGinty et al., 2013; du Hoffmann e Nicola, 2014; Morrison e Nicola, 2014). Além disso, a injeção de antagonistas da dopamina no NAc reduziu a magnitude dessas excitações, ao mesmo tempo em que prejudicou a capacidade de iniciar a abordagem cued (du Hoffmann e Nicola, 2014). Esses resultados sugerem que a dopamina facilita diretamente as excitações evocadas por estímulos dos neurônios NAc que conduzem a abordagem, talvez tornando-as mais excitáveis ​​em resposta à entrada glutamatérgica (Nicola et al., 2000, 2004; Hopf et al. 2003). Assim, o tratamento de neurônios NAc com agonistas de receptores de dopamina pode ter aumentado a probabilidade de comportamento de abordagem cued por mimetizar um efeito neuromodulador excitatório da dopamina endógena e, assim, aumentar a magnitude das excitações evocadas por estímulos.

Padrão de resposta agrupada pode ser devido a flutuações nos níveis de dopamina tônica

Outra característica do desempenho da tarefa dos animais é que as respostas e não respostas às pistas não foram distribuídas aleatoriamente, mas pareciam agrupadas em rajadas de várias respostas consecutivas ou não respostas. Nas condições de controle (injeção de veículo ou sem injeção), os agrupamentos de resposta foram mais longos e mais frequentes no início da sessão, tornando-se mais curtos e menos frequentes no final da sessão; e necessariamente vice-versa para clusters sem resposta. Este padrão sugere que existem dois estados, responsivo e não responsivo (Figura (Figure3), 3), que flutuam com um curso de tempo de minutos, e que mudam de um viés inicial em direção ao estado responsivo para um viés posterior em direção ao estado não responsivo. A injeção de agonista dopaminérgico promoveu o estado responsivo diminuindo a probabilidade de transição para o estado não responsivo (alongando os aglomerados de resposta) e aumentando a probabilidade de transição para o estado responsivo (encurtando aglomerados de não resposta), enquanto os antagonistas tiveram o efeito oposto. As conseqüências mais notáveis ​​dos efeitos agonistas ocorreram na segunda hora da sessão, quando as drogas parecem ter evitado o aumento normal da tendência para o estado não-responsivo: as probabilidades da segunda hora de transição continuaram a se assemelhar às da primeira hora, em vez de mudando para favorecer o estado não responsivo. Em contraste, os antagonistas tiveram seus maiores efeitos na primeira hora, quando causaram as probabilidades de transição favorecerem o estado não responsivo, similar às probabilidades de transição que normalmente ocorrem na segunda hora.

Os efeitos dos agonistas e antagonistas da dopamina nas probabilidades de transição são consistentes com a hipótese de que o estado de resposta é uma função da ocupação do receptor de dopamina. Assim, quando os níveis de dopamina NAc atingem e excedem um limiar, o animal está no estado responsivo; abaixo deste limite, o animal está no estado não responsivo. Testar essa hipótese exigiria a medição dos níveis de dopamina tônica à medida que os animais executassem essa tarefa ou uma tarefa semelhante; a hipótese prevê que os níveis de dopamina devem ser maiores durante os agrupamentos de resposta do que os agrupamentos de não resposta. Embora, até onde sabemos, os estudos anteriores de microdiálise não tenham investigado se as flutuações no nível da dopamina se correlacionam com a probabilidade da abordagem taxonômica local, uma investigação anterior descobriu que os níveis de dopamina NAc eram mais altos quando os pellets eram depositados em intervalos mínimos 45 s ou 4 necessitando de uma abordagem taxica para obter os alimentos em cada ensaio) do que quando os alimentos estavam disponiveis livremente (uma situacao que minimiza a necessidade de abordagem taxica) (McCullough e Salamone, 1992). Estudos que têm variados requisitos de taxa de resposta operante produziram resultados um pouco conflitantes, com alguns observando uma correlação positiva entre taxa de resposta operante e nível de dopamina (McCullough et al., 1993; Sokolowski et al. 1998; Cousins ​​et al. 1999) e outros encontrando exceções a essa relação proposta (Salamone et al., 1994; Primos e Salamone, 1996; Ahn e Phillips, 2007; Ostlund et al. 2011). Uma possível explicação para essa discordância é que diferentes tarefas operantes envolvem a necessidade de abordagem taxista em diferentes graus (Nicola, 2010); correlações com o nível de dopamina podem ser mais robustas para a probabilidade de abordagem tática do que para a taxa de resposta operante.

Uma proposta relacionada é que os níveis de dopamina tônica não apenas conduzem a taxas mais rápidas de resposta (ou talvez maior probabilidade de abordagem tóxica), mas também que os níveis de dopamina são determinados pela taxa de reforço (Niv et al., 2005, 2007), uma ideia que recentemente ganhou apoio experimental (Hamid et al., 2016). Assim, os níveis de dopamina em animais que trabalham para reforços nutritivos devem ser menores em ad libitummais alimentados do que em animais famintos [como é de fato o caso (Ostlund et al., 2011)], e menor quando o reforçador é 3% sucrose do que quando é um volume equivalente de 10% de sacarose. Os baixos níveis de dopamina propostos em 3% de sacarose podem resultar em uma reação em cadeia, com baixa dopamina, resultando em uma baixa probabilidade de responder a qualquer sugestão dada; falhas em responder, por sua vez, eleva a taxa de reforço e, portanto, o nível de dopamina ainda mais baixo, e, portanto, a probabilidade de resposta na próxima apresentação de sugestão também se torna menor. O resultado seria uma redução progressiva na taxa de resposta semelhante à observada aqui.

Conclusões: A abordagem táctica cual é um modelo para investigação da regulação da dopamina mesolímbica por estado nutricional

A baixa probabilidade de resposta dependente da dopamina ad libitumOs animais alimentados aqui observados são consistentes com muitos estudos recentes de regulação dos neurônios da dopamina por mensageiros, como colecistocinina, orexina, grelina, leptina, insulina e peptídeo semelhante ao glucagon 1, que sinalizam o estado nutricional do corpo detectado por vários mecanismos. Em geral, os sinais que relatam déficit de nutrientes aumentam a atividade neuronal da dopamina, enquanto os sinais que relatam saciedade ou excesso de nutrientes a diminuem (Ladurelle et al., 1997; Helm et al. 2003; Krügel et al. 2003; Abizaid et al. 2006; Fulton et al. 2006; Hommel et al. 2006; Narita et al. 2006; Kawahara et al. 2009; Leinninger et al. 2009; Quarta et al. 2009, 2011; Jerlhag et al. 2010; Perry et al. 2010; Domingos et al. 2011; España et al. 2011; Skibicka et al. 2011, 2012a,b, 2013; Davis et al. 2011a,b; Mebel et al. 2012; Patyal et al. 2012; Egecioglu et al. 2013; Cone et al. 2014, 2015; Mietlicki-Baase et al. 2014). A extraordinária sensibilidade da sinalização dopaminérgica mesolímbica ao estado nutricional é consistente com a proposta de que a probabilidade de comportamento dependente de dopamina mesolímbico pode mudar instantaneamente como resultado do valor, relativo ao estado nutriente, do reforçador (Berridge, 1998). 2012). Observamos que reforçadores de baixo valor entregues a animais relativamente saciados resultam em probabilidades de resposta flutuantes sobrepostas a um declínio geral na probabilidade de resposta. Essas observações, juntamente com as mudanças dramáticas nas probabilidades de resposta e transição produzidas pela injeção de agonistas e antagonistas da dopamina no NAc, sugerem que, sob nossas condições, o nível de dopamina é mantido em níveis baixos por mecanismos de detecção de nutrientes. O controle dos níveis de dopamina por esses e outros parâmetros (como a taxa de reforço recente) pode produzir níveis de dopamina que flutuam em torno do limiar para desencadear uma resposta, fazendo com que as respostas de estímulo e as não respostas ocorram em grupos. O paradigma comportamental que usamos aqui - abordagem taxonômica cued reforçada com sacarose mesolímbica ad libitumOs animais alimentados com animais é, portanto, ideal para uma investigação mais aprofundada da regulação da dinâmica da dopamina por estado de nutrientes, taxa de reforço e outros parâmetros, e do mecanismo pelo qual essas variáveis ​​afetam o comportamento dependente de dopamina da NAc.

Declaração de conflito de interesse

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Este trabalho foi apoiado por subvenções do NIH (DA019473, DA038412, DA041725), da Fundação da Família Klarman e NARSAD para SN.

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