Proc Natl Acad Sci EUA. 2009 Nov 24; 106 (47): 20016 – 20020.
Publicado on-line 2009 Nov 9. doi: 10.1073 / pnas.0908789106
PMCID: PMC2785284
Pietro Cottone,a,b,c,d,1,2 Valentina Sabino,a,b,c,d,1 Marisa Roberto,a,c,d Michal Bajo,e Lara Pockros,a Jennifer B. Frihauf,a,c,d,f Eva M. Fekete,a,c,d Luca Steardo,g Kenner C. Rice,h Dimitri E. Grigoriadis,i Bruno Conti,d,e George F. Koob,a,c e Eric P. Zorrillaa,c,d,2
Sumário
Dieta para controlar o peso corporal envolve ciclos de privação de alimentos saborosos que podem promover a compulsão alimentar. O presente estudo mostra que ratos retirados do acesso intermitente a alimentos palatáveis exibem alimentação excessiva de alimentos palatáveis após acesso renovado e um estado de abstinência afetivo caracterizado pelo fator de liberação de corticotropina-1 (CRF1) comportamentos reversíveis pelo antagonista do receptor, incluindo hipofagia, déficits motivacionais para obter alimentos menos palatáveis e comportamento semelhante ao ansiogênico. A retirada foi acompanhada por aumento da expressão de CRF e CRF1 responsividade eletrofisiológica no núcleo central da amígdala. Propomos que o recrutamento de anti-recompensa extra-hipotalâmico CRF-CRF1 os sistemas durante a abstinência de alimentos apetitosos, análogos à abstinência de drogas abusadas, podem promover a seleção compulsiva de alimentos palatáveis, alimentação insuficiente de alternativas mais saudáveis e um estado emocional negativo quando a ingestão de alimentos saborosos é evitada.
Formas de obesidade e distúrbios alimentares, semelhantes à dependência de drogas, podem ser conceituadas como condições recidivantes crônicas com períodos alternados de abstinência (ou seja, dieta para evitar alimentos palatáveis "proibidos") e recaída (ou seja, compulsivo, muitas vezes incontrolável, alimentos apetitosos) que continuam apesar das consequências negativas (1). Embora as propriedades positivas de reforço de alimentos saborosos sejam bem conhecidas (2, 3), menos atenção tem sido dada às suas propriedades de reforço negativas (4-6), a saber, o aumento da probabilidade de uma resposta comportamental produzida pela remoção de um estímulo aversivo (por exemplo, ingestão de alimentos palatáveis para aliviar estados emocionais negativos). Ciclos intermitentes de uso prolongado de drogas de abuso podem levar progressivamente à “dependência afetiva”, observada como uma necessidade de quantidades maiores e / ou mais regulares da droga para manter um determinado ponto emocional, bem como um estado emocional negativo após a cessação da droga. ingestão de drogas (7, 8). Tal retirada afetiva pode manter o uso e motivar a recaída através das propriedades de reforço negativas de continuar e retomar o uso de drogas, respectivamente (7, 8).
Os sistemas de stress cerebral com factor libertador de corticotropina extra-hormonal (CRF) estão supostamente envolvidos na transição do uso de drogas para a dependência, durante a qual a ingestão de drogas abusadas se torna cada vez mais motivada por estes mecanismos de reforço negativos, em vez de positivos. O CRF desempenha um papel motivacionalmente relevante nas síndromes de abstinência de todas as principais drogas de abuso, incluindo álcool, nicotina, cocaína, opiáceos, anfetaminas e tetrahidrocanabinol (7, 8). Por analogia, hipoteticamente, ciclos repetidos de acesso prolongado e intermitente a alimentos altamente palatáveis foram induzidos a induzir neuroadaptações do sistema de IRC semelhantes àquelas observadas em modelos de dependência de drogas (4, 5, 9).
Resultados
O acesso intermitente e prolongado a alimentos apetitosos conduz progressivamente a um subalinhamento de dietas menos preferidas quando não há disponibilidade de alimentos palatáveis e ao excessivo consumo de alimentos apetitosos após um acesso renovado (10-12). Para testar a hipótese de que o CRF1 sistemas medeiam estas adaptações alimentares, ratos Wistar machosn = 20) receberam uma dieta à vista ad libitum (Chow / Chow) por semana ou receberam ração ad libitum durante 5 dias (fase C) seguida por uma dieta altamente palatável e açucarada durante os dias 2 (fase P) (Chow / Palatable ) (Vejo Fig. S1 para horário de dieta e Fig. S2 para efeitos do cronograma de dieta na ingestão de alimentos e peso corporal). Após 7 semanas de ciclo da dieta, os ratos receberam o CRF não peptídico1 antagonista do receptor R121919 (0, 5, 10 e 20 mg / kg, sc) em um delineamento em quadrado latino (13). Os tratamentos receberam 1 h antes de mudar de dieta saborosa para comida ou de comida para dieta saborosa. O R121919 diminuiu, de forma dependente da dose, a ingestão de dieta apetitosa e aumentou a ingestão de alimentos em ração / ratos (Dieta Phase × Diet Schedule × dose de droga: F3,54 = 7.25, P <0.001), sem alterar a ingestão dos controles de ração. R121919 diminuiu a ingestão da dieta altamente palatável mediante acesso renovado ao alimento palatável (fase P) (FIG. 1A). Em testes independentes, o CRF1 antagonista do receptor aumentou a ingestão da ração menos palatável em Chow / ratos palatáveis retirados da dieta palatável (fase C) (FIG. 1B). Assim, atenuando tanto a hipofagia da comida quanto o excesso de comida saborosa, o R121919 atenuou a amplitude do ciclo de ingestão (a diferença entre a ingestão durante a primeira fase P palatável e a primeira retirada para a fase C da dieta: Dieta × Dose de Drogas: F3,54 = 7.25, P <0.001) (FIG. 1C). Apoiando um recrutamento progressivo de CRF-CRF1 a dieta, ao invés de um efeito agudo da dieta, o R121919 não reduziu a ingestão de alimentos apetitosos após uma única exposição à dieta ou aumentou a ingestão de ração durante uma primeira retirada de alimentos apetitosos (Fig. S3).
A retirada do acesso intermitente e prolongado a alimentos apetitosos também pode aumentar o comportamento semelhante à ansiedade (11). Para testar a hipótese de que o CRF1 os receptores estão envolvidos nos sinais comportamentais emocionais negativos que se seguem à retirada do alimento palatável, os ratos receberam R121919 (0, 20 mg / kg, sc, pré-tratamento 1-h) e testados num desenho entre indivíduos no labirinto em cruz elevado (14), 5 – 9 h depois de ter mudado de dieta apetecível para ração. Ratos Chow / Palatable tratados com veículo exibiram menos tempo de braço aberto do que os controles alimentados com ração, refletindo um efeito semelhante ao ansiogênico, durante a retirada de 7 semanas de ciclo de dieta (FIG. 2A), um efeito ainda não observado após apenas dois ciclos de retirada (Fig. S4). O pré-tratamento com R121919 (20 mg / kg, a dose que modulou tanto o consumo excessivo de alimentos palatáveis como o consumo de ração) bloqueou a diminuição da exploração do braço aberto por ratos Chow / Palatable a uma dose que não alterou o comportamento do labirinto em controles de ração ( Programa de Dieta × Dose: F1,43 = 7.25, P <0.02; FIG. 2Uma esquerda). A administração de R121919 não alterou a atividade geral medida como entradas de braço fechado. Portanto, o R121919 bloqueou o aumento do comportamento semelhante à ansiedade associado à retirada do acesso intermitente e prolongado a alimentos palatáveis, sem alterar o comportamento dos controles, sugerindo recrutamento de CRF1 sistemas.
Retirada de acesso intermitente e prolongado a comida saborosa também pode levar a déficits motivacionais para obter dietas menos preferidas, um índice potencial de comportamento semelhante ao hipoedôni- co (10). Analogamente, a resposta para reforçadores gustatórios menos preferidos sob esquemas de reforço de proporção progressiva foi previamente usada para indexar os déficits motivacionais observados durante a retirada da droga (15). Para determinar o envolvimento do CRF1 testamos os efeitos do R121919 sobre o desempenho de ratos ciclados na dieta para obter sua ração menos preferida sob um esquema de proporção progressiva. Confirmando as descobertas anteriores (10), Ratos Chow / Palatable tratados com veículo exibiram motivação reduzida para trabalhar para obter a ração menos palatável, refletida por um ponto de quebra diminuído e respostas totais diminuídas emitidas em comparação com ratos Chow / Chow (10) (Fig. S5). O pré-tratamento com R121919 (20 mg / kg, a dose eficaz no aumento da hipofagia da ração, reduzindo a hiperfagia dos alimentos saborosos e reduzindo o comportamento semelhante ao ansiogênico) atenuou seletivamente os déficits no desempenho da proporção progressiva em ratos submetidos à dieta a uma dose ineficaz nos controles da ração (breakpoint: Diet Schedule × Drug: F1,15 = 8.17, P <0.02; Respostas totais: Cronograma de Dieta × Medicamento: F1,15 = 9.14, P <0.01; FIG. 2B, esquerda). Contra a interpretação alternativa de que R121919 facilitou o desempenho em ratos Chow / Palatable, diminuindo a saciedade pós-anestésica, R121919 bloqueou os déficits em responder tão cedo quanto 5 min na sessão (Diet Schedule × Drug: F1,15 = 2.55, P <0.05) (FIG. 2B direito). Portanto, o CRF1 o antagonista do receptor atenuou os défices motivacionais na resposta da relação progressiva para reforçadores gustatórios menos preferidos que é visto em animais retirados do acesso prolongado intermitente a alimentos altamente saborosos.
Para testar a hipótese de que a retirada de alimentos palatáveis poderia ativar o sistema de CRF extra-hipotalâmico relacionado ao estresse, os níveis de RNAm e peptídeo do CRF no núcleo central da amígdala foram medidos por PCR quantitativo em tempo real e RIA, respectivamente. Os ratos foram sujeitos a ciclos de dieta por 7 semanas ou alimentados com ração continuamente. Após anestesia e decapitação, punções cerebrais do núcleo central da amígdala foram coletadas durante a retirada e após a renovação do acesso à dieta palatável. A retirada de alimentos palatáveis em ratos Chow / Palatable induziu um aumento de cinco vezes na expressão de mRNA do CRF no núcleo central da amígdala em comparação com ratos Chow / Chow (FIG. 3A). Por outro lado, o mRNA do CRF retornou aos níveis de controle com acesso renovado a alimentos saborosos (F2,19 = 6.97, P <0.01). A expressão de mRNA de CRF no núcleo central da amígdala não mudou quando ratos Chow / Palatable foram ciclados apenas uma vez (Chow / Chow vs. Chow / Palatável: 5.5 ± 2.2 vs. 6.3 ± 1.7 ns), apoiando um recrutamento progressivo de CRF- CRF1 sistemas pela história da dieta, ao invés de um efeito agudo da dieta. Além disso, a expressão de mRNA do CRF não se alterou no núcleo accumbens, no córtex pré-frontal ou no córtex insular, sustentando a especificidade regional dos achados (Fig. S6). Curiosamente, não foram observadas alterações significativas na expressão do ARNm do CRF no núcleo paraventricular do hipotálamo ou na corticosterona circulante no mesmo intervalo de tempo em ratos / ratosFigs. S6 e S7), sugerindo a hipótese de que mudanças nos sistemas de estresse amigdalinos, em vez de hipotálamo, no CRF, subestimaram as adaptações comportamentais. Além disso, a imunorreatividade do peptídeo CRF no núcleo central da amígdala de animais retirados da dieta palatável foi 70% maior do que em animais alimentados com ração, mas retornou aos níveis de controle alimentados com acesso à dieta palatável (F2,24 = 4.01, P <0.01) (FIG. 3B). Assim, a retirada do alimento palatável ativou o sistema de peptídeo CRF relacionado ao estresse no núcleo central da amígdala, de forma análoga aos achados nos modelos de retirada de droga e etanol (7, 8). Porque o acesso renovado a alimentos apetitosos diminuiu a ativação do sistema de CRF extra-hipotalâmico no núcleo central da amígdala, em que a ativação do CRF está ligada à ansiedade (16), os presentes resultados também sugerem que alimentos palatáveis podem adquirir propriedades reforçadoras negativas, aliviando as conseqüências afetivas negativas da abstinência (17).
Testar a hipótese de que ratos retirados de alimentos apetitosos podem apresentar sensibilidade aumentada ao CRF1 modulação antagonista da sinalização do ácido γ-aminobutírico (GABA) no núcleo central da amígdala, que ocorre durante a retirada do etanol (18), examinamos o efeito do R121919 na transmissão GABAérgica do núcleo central dos neurônios da amígdala em uma preparação de fatia. Ratos Wistar machos (n = 14) foram submetidos a ciclos de dieta por 7 semanas e sacrificados após terem passado para a ração menos palatável. A transmissão basal GABAérgica no núcleo central das sinapses da amígdala não diferiu em relação à história da dieta (n = Células 23) em todas as intensidades de estímulo usadas para evocar potenciais pós-sinápticos inibidores de GABA (IPSP). No entanto, 20 min superfusão com R121919 (1 μM) induziu uma maior redução no GABA evocadoA-IPSPs no núcleo central dos neurônios da amígdala de ratos Chow / Palatable (M ± SEM: 30 ± 6%, n = Células 9) do que nas de controles alimentados com ração (M ± SEM: 12 ± 6%, P <0.05, n = Células 11) (FIG. 4). Após um período mínimo de washout de 30, os IPSPs de ambos os grupos retornaram a níveis semelhantes aos da linha de base. Portanto, consistente com a superativação da amígdala CRF-CRF1 sistema e efeitos observados durante a retirada do etanol (18), ratos ciclados em dieta mostraram uma sensibilidade aumentada aos efeitos inibitórios de um CRF1 antagonista do receptor no núcleo central da transmissão gabaérgica da amígdala.
Discussão
Os resultados coletivos fornecem evidências funcionais de que uma história de acesso intermitente e prolongado a alimentos palatáveis leva a neuroadaptações progressivas e motivacionais relevantes no CRF-CRF extra-hipotalâmico relacionado ao estresse.1 sistemas. Especificamente, o CRF seletivo1 O antagonista de receptor R121919 afetou diferencialmente e seletivamente a alimentação em ratos ciclados em dieta, aumentando a ingestão regular de ração e diminuindo a ingestão de alimentos altamente palatáveis após acesso renovado. O CRF1 O antagonista do receptor também bloqueou seletivamente o aumento do comportamento parecido com a ansiedade e os déficits motivacionais na resposta para rações menos preferidas que foram observadas durante a abstinência da dieta saborosa. Retirar o acesso à dieta palatável aumentou a expressão do gene e peptídeo do CRF no núcleo central da amígdala, efeitos que foram eliminados com acesso renovado. Adicionalmente, ratos ciclados a dieta mostraram uma sensibilidade aumentada aos efeitos inibitórios de um CRF1 antagonista do receptor na transmissão GABAérgica no núcleo central da amígdala, sugerindo ainda a superativação da amígdala CRF-CRF1 sistema. O consumo excessivo de alimentos apetitosos após acesso renovado pode resultar do aumento da ativação do sistema de CRF do período de abstinência recém-concluído, visto como expressão aumentada de CRF e sensibilidade eletrofisiológica ao CRF1 bloqueio do receptor no núcleo central da amígdala. CRF1 o pré-tratamento do antagonista imediatamente antes do acesso palatável ao alimento é, portanto, interpretado como opondo-se ao CRF-CRF inicialmente presente1 superativação do sistema de retirada. O curso de tempo breve de comida saborosa excessos demais visto em animais não tratados (10) pode refletir o curso do tempo pelo qual a expressão, liberação e efeitos do peptídeo CRF se normalizam quando o acesso ao alimento palatável é recuperado, como visto no presente estudo. Assim, a ingestão intermitente de dietas saborosas pode induzir um deslocamento alostático em sistemas de recompensa do cérebro com recrutamento de anti-recompensa CRF-CRF1 sistemas no núcleo central da amígdala.
Esses resultados têm implicações não apenas para a compulsão alimentar, mas também para a motivação em geral. A ativação repetida de sistemas hedônicos provocou processos similares aos do oponente no cérebro (ie, recrutamento de CRF1 circuitos) que eram distintos de uma simples perda de função em sistemas transmissores de recompensa. Essas neuroadaptações entre sistemas (19) também ocorrem durante a transição para a dependência de todas as principais drogas de abuso (7, 8). A generalização para estímulos não medicamentosos no presente estudo sugere que os processos motivacionais podem se tornar perturbados em indivíduos que experimentam repetidos contrastes na intensidade dos estímulos hedônicos ao longo do tempo (20) Adaptativamente, tais processos podem mudar o comportamento de busca de alimentos e consumo para alimentos densos em energia e de alta recompensa, enquanto desvalorizam os esforços para obter alimentos menos ricos em energia e de baixa recompensa (ou não alimentos), uma adaptação evolutivamente útil quando há custos de forrageamento (por exemplo, exposição a predadores, tempo limitado e recursos de energia). No ambiente de hoje, entretanto, os mesmos processos podem levar à ingestão de alimentos que promovem a obesidade em detrimento de alternativas menos saborosas, mas talvez mais nutritivas.
Assim, mudanças semelhantes ao vício no CRF1 sistemas podem ajudar a conduziri) ingestão de alimentos palatáveis densos em energia, (iisubconsumo de alternativas mais saudáveis, e (iii) o estado emocional negativo associado que ocorre quando o acesso a alimentos palatáveis é evitado (4, 5, 10-12, 17). Traduzida para a condição humana, a ativação do sistema de IRC pode promover a recaída da alimentação na obesidade e distúrbios alimentares relacionados, bem como outras sequelas motivacionais negativas da abstinência cíclica de alimentos saborosos.
Materiais e Métodos
Assuntos.
Ratos Wistar machos (n = 155, 180-230g, 45 dias de idade) foram obtidos de Charles River e alojados à chegada em gaiolas plásticas com topo de arame (19 × 10.5 × 8 polegadas) num ciclo de luz reversa 12 h: 12 h (10 : 00 h se apaga), viveiro com umidade (60%) e temperatura controlada (22 ° C). Os ratos tiveram acesso a ração de roedores à base de milho, 485% de gordura, 7012% proteína, energia metabolizável 65 cal / 13 g] e água ad libitum por 21 semana antes do consumo de ração. início dos experimentos. Procedimentos experimentais aderiram ao Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publicação número 341-100, revista 1) e os "Princípios de cuidados com animais de laboratório" (http://www.nap.edu/readingroom / bookslabrats) e foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee do The Scripps Research Institute.
Drogas.
O R121919 foi sintetizado como descrito em Chen et al. (21). R121919 é uma afinidade alta (Ki = CRN seletivo 3.5 nM)1 antagonista com propriedades físico-químicas superiores a muitos outros CRF1 antagonistas (por exemplo, diminuição da logP e logD, aumento da solubilidade em água) (13). Para o ensaio, o R121919 foi primeiro solubilizado em 1 M HCl (10% do volume final) e depois diluído para um veículo final de 20% (p / v) de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (Sigma-Aldrich), titulado de novo com NaOH para pH 4.5. A solução R121919 foi administrada sc (sc) num volume de 2 mL / kg.
Ad Libitum Diet Alternation.
Após a aclimatação, os ratos foram divididos em dois grupos pareados para a ingestão de alimentos, peso corporal e eficiência alimentar dos dias prévios 3-4. Um grupo recebeu uma dieta (Chow) ad libitum 7 dias por semana (Chow / Chow), e um segundo grupo recebeu ração ad libitum por 5 dias por semana, seguido de 2 dias de acesso ad libitum aos altamente palatáveis dieta com alto teor de sacarose e sabor chocolate (“palatável”; Chow / Palatable). A dieta palatável é uma dieta nutricionalmente completa, com sabor de chocolate e rica em sacarose (50% kcal), baseada em AIN-76A, comparável em proporções de macronutrientes e densidade de energia à dieta da dieta [TestDiet; Fórmula 5TUL com sabor de chocolate: 66.8% (kcal) de carboidrato, 12.7% de gordura, 20.5% de proteína, energia metabolizável 3.48 kcal / g; formulado como 45-mg pellets de precisão para aumentar sua preferência (22, 23)]. Por brevidade, os primeiros dias 5 (apenas chow) e os últimos dias 2 (comida ou palato de acordo com o grupo experimental) de cada semana são referidos em todas as experiências como fases C e P. Dietas nunca foram simultaneamente disponíveis. A dieta da dieta foi: Dieta 485 da Harlan Teklad 7012 [65% (kcal) de carboidrato, 13% de gordura, 21% proteína, 341 cal / 100 g] ou 5TUM formulada como pastilhas extrusadas 4- 5-g [65.5 % (kcal) de carboidrato, 10.4% de gordura, 24.1% de proteína, energia metabolizável 330 cal / 100 g; TestDiet]. Similar aos estudos anteriores, o alimento Harlan Teklad LM-485 foi usado nos experimentos de alimentação e labirinto em cruz elevado (11), enquanto o ChD TestDiet 5TUM (10) foi utilizado na razão progressiva, no ARNm do CRF, no conteúdo do peptídeo do CRF, no RIA da corticosterona e em experimentos eletrofisiológicos.
Como publicado anteriormente (10), as preferências relativas de dieta, calculadas como a percentagem de ingestão diária (kcal) da primeira dieta em relação à segunda dieta, foram as seguintes: 5TUL Dieta de Chocolate (dieta moderada de açúcar) versus ração Harlan LM-485 (M ± SEM preferência 90.7 ± 3.6%) e 5TUL Dieta de Chocolate (dieta açucarada e palatável) vs. 5TUM comida (preferência M ± SEM 91.2 ± 3.7%).
Labirinto em Cruz Elevado.
O teste do labirinto em cruz elevado foi realizado conforme descrito em Cottone et al. (24). Os ratos Chow / Palatable foram sujeitos a ciclos de dieta durante pelo menos 7 semanas e foram pré-tratados com veículo ou 20 mg / kg R121919 (−1 h, sc) e testados 5-9 h após terem passado da dieta palatável para a ração (P → fase C). Ratos controle Chow / Chow foram testados concomitantemente em um delineamento entren = 47). A dieta de comida estava disponível ad libitum até o momento do teste. Para mais detalhes, consulte o Texto SI.
Tabela de Relação Progressiva de Reforço para Alimentos.
O programa de taxa progressiva de reforço para alimentação foi realizado conforme descrito em Cottone et al. (10). Os animais receberam ração ad libitum A / I (5g pastilhas extrudidas) nas suas gaiolas em casa ao longo da experiência, salvo indicação em contrário. Reforços alimentares foram 45-mg pastilhas de precisão, de composição idêntica à dieta de ração de gaiola doméstica extrusada. As sessões terminaram quando os indivíduos não concluíram uma proporção para 14 min, com o último índice concluído definido como o ponto de interrupção. Os ratos Chow / Palatable foram sujeitos a ciclos de dieta durante, pelo menos, 7 semanas e depois foram prtratados com R121919 (-1 h, sc) no momento de serem mudados de dieta apetecel para chow (fase P? C). Ratos controle Chow / Chow foram testados concomitantemente em um delineamento entren = 17). Doses de R121919 (0, 20 mg / kg de peso corporal, sc) foram administradas num delineamento intraequivalente, dentro de dois ciclos de dieta. Para mais detalhes, consulte o Texto SI.
PCR quantitativo em tempo real.
Ratos (n = 20) foram submetidos a ciclos de dieta por 7 semanas, anestesiados e decapitados durante as duas condições de dieta (dias 5 e 7 de cada ciclo semanal). Os cérebros foram rapidamente removidos e cortados coronalmente em uma matriz cerebral, e o núcleo central da amígdala, nucleus accumbens, córtex insular e punções do córtex pré-frontal foram coletados em um estágio de gelo. O RNA total foi preparado a partir de cada punção cerebral usando um protocolo padrão para extração de RNA de tecidos animais. O RNA total (1 μg) foi então transcrito reversamente na presença de Oligo (dT) 20 de acordo com as instruções do fabricante. As reações quantitativas de RT-PCR foram realizadas em um volume de 20 μL usando primers de 0.5 μM e 4 mM de MgCl2. Os resultados foram analisados por métodos de segunda derivada e expressos em unidades arbitrárias, normalizadas para níveis de expressão do gene de referência, CypA. Todas as reações de RT-PCR para uma determinada sequência foram realizadas dentro da mesma execução. Para mais detalhes, consulte o Texto SI.
Extração Ácida Peptídica e RIA CRF.
Ratos (n = 25) foram ciclados a dieta por pelo menos 7 semanas, anestesiados e decapitados durante as duas condições da dieta (dias 5 e 7 de cada ciclo semanal). Cérebros foram rapidamente removidos e cortados coronalmente em uma matriz cerebral, e o núcleo central dos punções da amígdala foi coletado em um estágio gelado. A extração de ácido peptídico seguiu um procedimento já estabelecido (25). A imunorreactividade do tipo CRF tecidular foi quantificada com um RIA de fase sida sensel e especico adaptado de Zorrilla et al. (26). Para mais detalhes, consulte o Texto SI.
RIA de corticosterona.
Ratos (n = 12) foram submetidos a ciclos de dieta por pelo menos 7 semanas, e o sangue da cauda foi coletado durante as duas condições de dieta (dias 5 e 7 de cada ciclo semanal). Os níveis plasmáticos de imunorreatividade semelhante à corticosterona foram determinados com um kit RIA disponível comercialmente, de acordo com as instruções do fabricante (MP Biomedicals, Inc.) (26). Para mais detalhes, consulte o Texto SI.
Estudos Eletrofisiológicos
Preparação de Fatia.
O núcleo central das fatias da amígdala foi preparado conforme descrito anteriormente (27, 28) de ratos (n = 7 / grupo) que foi submetido a ciclos de dieta durante, pelo menos, 7 semanas, anestesiados e decapitados 2-3 h após terem sido retirados de alimentos saborosos. Os cérebros foram rapidamente removidos e colocados em líquido cefalorraquidiano artificial gelado (aCSF), gaseificado com 95% O2 e 5% CO2. Fatias foram cortadas, incubadas em uma configuração de interface por cerca de 30 min, e completamente submersas e continuamente superfusadas com aCSF aquecido a gás. As drogas foram adicionadas ao aCSF a partir de soluções estoque para obter concentrações conhecidas no superfusato. Nas taxas de superfusão 2 – 4 mL / min utilizadas, as concentrações da droga atingem 90% da concentração do reservatório dentro de 2 min.
Eletrofisiologia.
Nós registramos o núcleo central dos neurônios da amígdala com micropipetas afiadas usando o modo descontínuo de voltagem ou corrente. Mantivemos a maioria dos neurônios perto do seu potencial de membrana em repouso. Os dados foram adquiridos com um pré-amplificador e armazenados para posterior análise usando o software pClamp. GABA farmacologicamente isoladoA potenciais pós-sinápticos inibitórios mediados por receptores (GABAA-IPSPs) foram evocados estimulando localmente dentro do núcleo central da amígdala através de um eletrodo bipolar estimulante, enquanto superfusando os bloqueadores do receptor de glutamato CNQX e APV e GABAB bloqueador de receptor CGP 55845A. Para determinar os parâmetros de resposta para cada célula, realizamos um protocolo de entrada e saída. Uma faixa de correntes foi aplicada, começando na corrente de limiar necessária para induzir uma IPSP até a tensão necessária para induzir a amplitude máxima. Nós normalizamos três intensidades de estímulo de passos iguais (limiar, metade-máximo e máximo) como 1-3 ×. Etapas de corrente hiperpolarizantes e despolarizantes (incrementos 200-pA, duração 750-ms) também foram aplicadas para gerar curvas de corrente de tensão (VI). Quantificamos as amplitudes de IPSP evocadas e as respostas VI usando o software Clampfit. Todas as medidas foram tomadas antes da superfusão com o CRF seletivo1 antagonista do receptor R121919 (1 μM), durante a sua superfusão (20 min), e após o washout (30 min). Para mais detalhes, consulte o Texto SI.
Estatísticas.
Comparações de grupos usadas de Student t-testes (comparações de dois grupos) ou análise de variância (ANOVA) (comparações de pelo menos três grupos), estes últimos interpretados por análise de efeito principal simples ou comparações de Newman-Keuls após efeitos omnibus significativos (P <0.05). Os dados do experimento de alimentação foram analisados por ANOVAs mistos de três vias com Programa de Dieta como o fator entre os sujeitos e Dose e Fase da Dieta como fatores dentro dos sujeitos. Os dados do experimento do labirinto em cruz elevado foram analisados por ANOVAs de duas vias com Cronograma de Dieta e Dose como fatores entre sujeitos. Para o esquema de proporção progressiva do experimento de reforço, o ponto de interrupção e as respostas totais foram analisados por ANOVAs mistos de duas vias com o esquema de dieta como o fator entre sujeitos e a Dose como o fator dentro dos sujeitos. O curso de tempo de resposta durante os primeiros 5 min foi analisado por ANOVAs mistos de três vias com Programa de Dieta como o fator entre sujeitos e Dose e Tempo como fatores dentro dos sujeitos. Os dados dos estudos eletrofisiológicos foram analisados com ANOVA entre sujeitos ou ANOVA dentro dos sujeitos com medidas repetidas, conforme apropriado. Os dados do RIA de corticosterona foram analisados por ANOVA mista de duas vias com Programa de Dieta como o fator entre os sujeitos e a Fase da Dieta como o fator dentro dos sujeitos. Os pacotes estatísticos usados foram Instat 3.0, Prism 4.0 (GraphPad), Systat 11.0 e SPSS 11.5 (SPSS).
Agradecimentos.
Agradecemos Mike Arends pela assistência editorial, Mary Gichuhi pela assistência administrativa e Bob Lintz, Jeanette Helfers, Stephanie Dela Cruz e Molly Brennan pela assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Doenças Renais DK70118, DK26741 e P30DK56336; Instituto Nacional sobre Drug Abuse Grant DA023680; Instituto Nacional sobre Abuso de Álcool e Alcoolismo Concede AA016731 e AA015566; Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Concessão de Derrame IT32NS061847-01A2; Instituto Nacional de Envelhecimento Grant AG028040; Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue Grant HL088083; a Ellison Medical Foundation; e o centro Pearson para o alcoolismo e a pesquisa do addiction. Uma parte deste trabalho foi apoiada pelos Programas de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional sobre Drug Abuse e do Instituto Nacional sobre Abuso de Álcool e Alcoolismo. Este é o número do manuscrito 19807 do The Scripps Research Institute.
Notas de rodapé
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Este artigo é uma submissão direta PNAS.
Este artigo contém informações de suporte on-line em www.pnas.org/cgi/content/full/0908789106/DCSupplemental.
Referências
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