Decodificando Circuitos Neurais que Controlam a Busca por Sacarose Compulsiva (2015) (MECANISMO DE BINGE)

A fim de identificar neurônios LH que fornecem entrada monossináptica para o VTA in vivo e observar sua atividade durante os comportamentos de movimento livre, usamos uma estratégia de vírus duplo para expressar seletivamente o canalrodopsina-2 (ChR2) em neurônios LH fornecendo entrada monossináptica para o VTA (Figuras 1A e S1). Injetamos um vetor viral adeno-associado (AAV)₅) carregando ChR2-eYFP em um construto de quadro de leitura aberto duplo-invertido (DIO) dependente de Cre-recombinase no LH para infectar somata local e injetou um vírus herpes simplex retrogradamente viajando (HSV) carregando Cre-recombinase no VTA. A recombinação subsequente permitiu a expressão de opsina e fluoróforo seletivamente nos neurônios LH, fornecendo entrada monossináptica para o VTA. Para confirmar nossa abordagem, realizamos gravações ex vivo de patch-clamp de células inteiras em fatias horizontais do cérebro contendo o LH e registradas de neurônios que expressam ChR2-eYFP, bem como neurônios LH vizinhos que eram ChR2-eYFP negativos (figura 1B). As latências de pico evocadas por luz, medidas desde o início do pulso de luz até o pico do potencial de ação, variaram de 3-8 ms (figura 1C). Também descobrimos que nenhuma das células não expressas (ChR2-negativo) registradas mostrou respostas excitatórias à fotoestimulação (n = 14; figura 1C), apesar de sua proximidade com células que expressam ChR2.

A fim de realizar a fotoidentificação optogeneticamente mediada in vivo, um optrode foi implantado no LH para registrar a atividade neuronal durante uma tarefa de busca de sacarose. Na mesma sessão de gravação, fornecemos vários padrões de fotoestimulação para identificar neurônios LH-VTA que expressam ChR2 (Figuras 1D e S1). Examinamos a distribuição das latências da fotorresistência excitatória em todos os neurônios LH, exibindo uma mudança na taxa de disparo em resposta à iluminação e observamos uma distribuição bimodal (figura 1E). Observamos uma população de neurônios durante as gravações in vivo com latências em um intervalo de 3-8 ms. Isso era idêntico ao intervalo de latência encontrado em neurônios LH-VTA que expressam ChR2 quando gravamos ex vivo. Chamamos essas unidades de unidades de "Tipo 1" (Figuras 1C, 1E e 1F). Além disso, havia uma população distinta de células com latências de fotorresposta de ∼100 ms (Figuras 1E e 1G), e nós denominamos essas unidades “Tipo 2”. Também observamos neurônios que foram inibidos em resposta à fotoestimulação de neurônios LH-VTA (Figura S2), e nós denominamos essas unidades “Tipo 3”. Comparamos a duração do potencial de ação (medida do pico ao vale) e as taxas médias de disparo das unidades Tipo 1 e Tipo 2, bem como aquelas que não mostraram uma resposta de foto (figura 1H) A distribuição das durações do potencial de ação do Tipo 1 (figura 1I) e tipo 2 (figura 1J) unidades mostra que a maioria das unidades do Tipo 1 tem uma duração do potencial de ação inferior a 500 μs (84%; n = 16/19, distribuição binomial, p = 0.002).

Embora as unidades do Tipo 1 atendam aos critérios padrão para serem classificadas como expressando ChR2 (Cohen et al., 2012, Zhang et al., 2013), não estava claro se a fotorresposta de latência mais longa das unidades do Tipo 2 era indicativa de neurônios expressando ChR2 que responderam mais lentamente à fotoestimulação ou se esse efeito foi devido à atividade da rede. Dado que os neurônios LH expressando ChR2 (Tipo 1) se projetam diretamente para o VTA, uma possibilidade era que os neurônios do Tipo 2 estivessem recebendo feedback do VTA (figura 1K) Outra possibilidade era que os neurônios do tipo 2 fossem ativados por colaterais de axônios de neurônios do tipo 1 (figura 1EU). Para diferenciar entre estes dois modelos de circuito possíveis, inibimos o VTA em conjunto com fotoidentificação no LH.

Com base em nossos modelos de circuito, esperamos que a inibição distal não tenha efeito sobre as fotorresponses dos neurônios LH que expressam ChR2. No entanto, se os fotonsensores de LH fotorrespondem, mas não expressam, confiam no feedback do VTA para obter uma resposta bloqueada ao tempo para a iluminação (figura 1K), esperamos uma atenuação de photoresponses nestes neurônios em cima da inibição de VTA. Nós expressamos ChR2 em células LH-VTA como acima, mas desta vez também expressou halorodopsina 3.0 (NpHR) na VTA e implantou uma fibra óptica na VTA, além do optrode em LH (figura 2UMA). Nós entregamos os mesmos padrões de iluminação de luz azul no LH para todas as três épocas, mas também fotoinibiu o VTA com luz amarela na segunda época (figura 2UMA).

As fotorresponsivas das unidades Tipo 1 para iluminação de luz azul no LH não foram afetadas pela fotoinibição do VTA, o que é consistente com a expressão de ChR2 em neurônios do tipo 1 LH-VTA (figura 2B). Em contraste, a maioria das unidades do Tipo 2 (87%; n = 13/15, distribuição binomial, p = 0.004) mostrou uma atenuação significativa de fotorrespostas a pulsos de luz azul entregues no LH após fotoinibição de neurônios VTA. As respostas das unidades de Tipo 1 e Tipo 2 durante a fotoinibição de VTA foram significativamente diferentes (qui-quadrado = 7.64, p = 0.0057; Figuras 2B e 2C). Estas diferenças também podem ser vistas nas pontuações máximas de Z durante épocas individuais (figura 2D) e com a época yellow-ON normalizada para a época amarela-OFF (figura 2E) Esses dados sugerem que os neurônios Tipo 2 LH recebem informações (direta ou indiretamente) da VTA (figura 1K) em vez de via colaterais locais de axônios (figura 1EU).

Tendo identificado esses dois tipos distintos de neurônios LH na alça LH-VTA, queríamos examinar a atividade neural natural durante uma tarefa de autoadministração de sacarose (figura 3UMA). Os camundongos foram treinados para realizar respostas nosepoke para uma sugestão de previsão de entrega de sacarose em uma porta adjacente (como em Tye et al., 2008). Para nos permitir diferenciar as respostas neurais ao nariz e ao sinal, o sinal e a sacarose foram administrados em um esquema de reforço parcial, em que 50% dos sinais de nariz foram emparelhados com um sinal e entrega de sacarose.

As unidades do tipo 1 mostraram respostas fásicas à entrada da porta de sacarose, como visto em uma unidade representativa Tipo 1 (figura 3B), bem como os dados da população para todas as unidades Tipo 1 (figura 3C). As respostas fásicas das unidades Tipo 2, no entanto, refletiram principalmente respostas à sugestão de previsão de recompensa (Figuras 3D e 3E). Os padrões de disparo normalizados de todos os neurônios registrados (n = 198, dividido em unidades de tipo 1, 2, 3 e não responsivas) são exibidos para cada componente de tarefa: nosepokes emparelhados com o cue, nosepokes na ausência do cue, e porta de entrada de sacarose (figura 3F). Todas as unidades do Tipo 1 que mostraram mudanças fásicas relevantes à tarefa na atividade (74%; n = 14/19) foram excitadas ou inibidas pela entrada da porta de sacarose, com um pequeno número também mostrando inibição fásica para a sugestão preditiva de recompensa (Figuras 3B, 3C e 3G). Em contraste, as unidades Tipo 2 eram mais heterogêneas, com neurônios responsivos à tarefa codificando a sugestão seletivamente (35%), a entrada de entrada de sacarose seletivamente (26%), ou ambas as entradas cue e port (12%; Figuras 3D, 3E e 3H). Para ilustrar a força das respostas das unidades Tipo 1 e Tipo 2 a eventos relacionados a tarefas, plotamos cada célula em um gráfico tridimensional de acordo com o escore Z (figura 3EU). Para mostrar a distribuição de mudanças fásicas no disparo para múltiplos eventos relacionados a tarefas em um nível qualitativo, plotamos o número de células de cada tipo de foto-resposta que caiu em uma dada categoria (figura 3J).

Dado o papel bem definido do VTA no erro de previsão de recompensa (por exemplo, a redução fásica do disparo do neurônio DA em resposta à omissão inesperada de uma recompensa e a excitação fásica em resposta à entrega de recompensa inesperada) (Schultz et al., 1997), investigamos se os neurônios de LH codificariam a omissão inesperada de uma recompensa de sacarose. Para fazer isso, registramos a atividade neural de neurônios fotorresponsivos durante a mesma tarefa de recompensa de sugestão em animais bem treinados, mas omitimos aleatoriamente 30% das entregas de sacarose após a sugestão (figura 4UMA).

A maioria das unidades Tipo 1 (88%; n = 15/17, distribuição binomial, p = 0.001) eram insensíveis à omissão de recompensa (Figuras 4B e 4D), ao passo que um grande subconjunto de unidades do Tipo 2 (67%; n = 12/18) mostrou uma resposta significativamente diferente para ensaios apresentados e omitidos por recompensa (Figuras 4C e 4D). Concluímos que os neurônios LH-VTA (Tipo 1) codificavam a ação de entrar no porto, pois essas respostas de porta eram persistentes mesmo com a omissão de recompensa (figura 4D), em contraste com as unidades do Tipo 2 (qui-quadrado = 10.9804, p = 0.0009).

Para determinar se as respostas Tipo 1 à entrada de porta estavam realmente codificando a resposta condicionada (CR), ao contrário do comportamento geral de busca de recompensa ou exploratório, registramos em camundongos não treinados que ainda não haviam adquirido a tarefa. Em camundongos sem experiência, nós entregamos sacarose para o porto na ausência de uma sugestão preditiva (entrega de recompensas imprevisível) e descobrimos que as unidades Tipo 1 não mostraram respostas fásicas à entrada do porto (Figuras 4E, 4F e 4I), consistente com o modelo que os neurônios do tipo 1 codificam o CR (figura 4J).

Em seguida, para determinar se a atividade da unidade Tipo 2 é consistente com um perfil de resposta semelhante a um erro de previsão de recompensa, também registramos esses neurônios em animais bem treinados durante a entrega de recompensas imprevisíveis (figura 4G). Descobrimos que um subconjunto de unidades do Tipo 2 respondeu a entregas imprevistas de sacarose (50%; Figuras 4G – 4I). Em conjunto, os subconjuntos de unidades Tipo 2 são sensíveis à omissão de recompensa inesperada (Figuras 4C e 4D) e entrega de recompensas imprevisíveis (Figuras 4G – 4I), consistente com um perfil de resposta semelhante a um erro de previsão de recompensa.

Como mostramos acima, as unidades Tipo 1 representam um correlato neural de CR. É importante ressaltar que o aumento na taxa de disparo começa antes da CR, aumentando até que a CR seja concluída (Figuras 3B, 3C e 4B). Para determinar se a ativação da via LH-VTA poderia promover a RC, queríamos testar a capacidade de ativação de LH-VTA na condução de RC em face de uma conseqüência negativa. Em camundongos do tipo selvagem, expressamos ChR2-eYFP ou eYFP sozinho em corpos de células LH e implantamos uma fibra óptica sobre a VTA (Figuras 5A e S4) Por outro lado, para testar o papel da via LH-VTA na mediação de CR ou comportamentos relacionados à alimentação, expressamos bilateralmente NpHR-eYFP ou eYFP sozinho em células LH e implantamos uma fibra óptica acima do VTA (Figuras 5A e S4).

Projetamos uma tarefa de condicionamento pavloviana na qual os ratos necessitados de alimento tiveram que atravessar uma grade de choque para recuperar uma recompensa de sacarose (figura 5B). Na primeira época de “linha de base” (com a grade de choque desligada), verificamos que cada rato adquiriu a tarefa de abordagem condicionada de Pavlovian. Na segunda época (“choque”), a grade de choque aplicou leves choques nos pés a cada segundo. Finalmente, na terceira época ("Choque + Luz"), continuamos a aplicar choques nos pés, mas também iluminamos os terminais LH no VTA com luz azul (10 Hz) em camundongos que expressam ChR2 e controles eYFP correspondentes e luz amarela (constante) para camundongos expressando NpHR e seus controles eYFP (figura 5B).

Observamos um número significativamente maior de entradas de porta por sinal durante a época Shock + Light e uma pontuação de diferença significativamente maior (época Shock + Light - época somente de choque) em camundongos ChR2 em relação a camundongos eYFP (figura 5C e Filme S1). Em contraste, a fotoinibição da via LH-VTA resultou em uma redução significativa nas entradas portuárias por pontuação cue e diferença nos ratos NpHR em relação aos ratos eYFP (figura 5D e Filme S2). Experiências de extinção em sessão durante as quais as apresentações de dicas não foram seguidas por entregas de sacarose mostraram tendências similares em vigor (Figura S4).

É importante ressaltar que queríamos determinar se as mudanças na busca de sacarose que obtivemos foram causadas por mudanças no comportamento relacionado à alimentação ou sensibilidade à dor. Observamos que a fotoativação da projeção LH-VTA aumentou significativamente o tempo gasto com a alimentação em camundongos bem alimentados no grupo ChR2 (figura 5E) No entanto, a fotoinibição da via LH-VTA não reduziu significativamente a alimentação (figura 5F), embora esses animais tenham sido privados de alimentos para aumentar nossa capacidade de detectar uma redução em relação ao período de referência (comparar com animais saciados em figura 5E) Em nenhum dos ChR2 (figura 5G) nem grupo NpHR (figura 5H) observamos uma diferença na latência para retirada da cauda da água quente (Ben-Bassat et al., 1959, Grotto e Sulman, 1967), indicando que a manipulação da projeção do LH-VTA não estava alterando a analgesia.

Para estudar a composição dos componentes de transmissão rápida de entradas de LH para o VTA que estavam provocando esses efeitos, realizamos gravações de patch-clamp de células inteiras de neurônios VTA em uma preparação de fatia aguda enquanto ativamos opticamente entradas de LH que expressam ChR2-eYFP (Figuras 6A e S5) Dado que existe uma heterogeneidade bem estabelecida dentro do VTA, incluindo ∼65% de neurônios DA, ∼30% de neurônios GABA e ∼5% de neurônios glutamato (Margolis et al., 2006, Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et al., 2007), enchemos as células com biocitina durante o registro para permitir a identificação do tipo de célula usando imunohistoquímica post-hoc para tirosina hidroxilase (TH; figura 6B), além de registrar a corrente de cátions ativada por hiperpolarização (I_h) e mapeamento da localização da célula (Figuras 6Banda S5).

Primeiro, registramos no clamp de corrente durante a fotoestimulação das entradas de LH que expressam ChR2 e observamos que os neurônios 23 de 27 mostraram uma resposta de tempo bloqueado à fotoestimulação das entradas de LH (figura 6C). A maioria dos neurônios DA amostrados no VTA recebeu uma entrada excitatória líquida do LH (56%), enquanto outro subconjunto mostrou inibição líquida (30%; figura 6C). A distribuição espacial desses neurônios DA é mapeada em um atlas para cortes horizontais contendo o VTA (figura 6D).

Para estabelecer a contribuição monossináptica das entradas de LH para os neurônios VTA DA, usamos o mapeamento de circuito assistido por ChR2, onde os registros de tensão-clamp foram realizados na presença de tetrodotoxina (TTX) e 4-aminopiridina (4AP; Petreanu et al., 2007) . Consistente com nossas observações de gravações de clamp de corrente, observamos que a maioria dos neurônios VTA DA registrados receberam exclusivamente entrada monossináptica excitatória do LH (67%), em comparação com neurônios VTA DA que receberam exclusivamente entrada monossináptica inibitória (11%), ou ambos (22%; Figuras 6E e S6).

Identificamos neurônios VTA GABA por meio da injeção de um fluoróforo dependente de Cre (AAV₅-DIO-mCherry) no VTA de camundongos VGAT :: Cre e utilizou a expressão de mCherry para direcionar o registro de neurônios VTA GABA (n = 24; figura 6F). Quarenta e seis por cento dos neurônios VTA GABA responderam com excitação líquida, enquanto 54% respondeu com inibição líquida à fotoestimulação das entradas de LH que expressam ChR2 (figura 6G). A distribuição espacial dessas células é mostrada em figura 6H. Após o exame do input monossináptico do LH (como descrito acima), descobrimos que 18% dos neurônios GABA amostrados receberam exclusivamente estímulo excitatório e 9% recebeu entrada exclusivamente inibitória (figura 6EU). No entanto, em relação aos neurônios VTA DA, descobrimos que mais neurônios VTA GABA receberam tanto o GABA excitatório mediado por AMPAR quanto o inibitório_AEntrada monossináptica mediada por R do LH (73%; qui-quadrado = 5.0505, p = 0.0246; Figuras 6I e S6).

Dado que nossas gravações ex vivo forneceram evidências que apoiam a entrada robusta das projeções GABAérgica e glutamatérgica de LH para o VTA, a seguir investigamos o papel de cada componente independentemente. Para fazer isso, usamos linhas de camundongos transgênicos que expressam Cre-recombinase em neurônios que expressam o transportador vesicular de glutamato 2 (VGLUT2) ou o transportador vesicular GABA (VGAT). Injetamos AAV₅-DIO-ChR2-eYFP ou AAV₅-DIO-eYFP no LH de ratos VGLUT2 :: Cre e VGAT :: Cre e implantou uma fibra óptica sobre o VTA (Figura S7). Estes animais foram então corridos em cada um dos ensaios comportamentais figura 5.

Não observamos diferenças detectáveis ​​no número de entradas de porta feitas por sinal entre os camundongos que expressam ChR2 ou eYFP no LH^saciarProjeção de VTA (figura 7A) ou no LH^GABAProjeção de VTA (figura 7B). No entanto, após a análise de vídeo, observamos comportamentos aberrantes de roer no LH^GABA-VTA: Grupo ChR2 sob iluminação de luz azul (ver Filmes S3 e S4). Em LH^saciar-VTA ratinhos, embora houvesse uma tendência para uma redução na alimentação com fotoestimulação no grupo ChR2 em comparação com o grupo eYFP, isto não foi estatisticamente significativo (figura 7C). Em contraste, observamos um aumento robusto no tempo gasto alimentando em ratos saciados após a iluminação no LH^GABA-VTA: grupo ChR2 relativo aos controles (figura 7D e Filme S3). Em nenhum dos grupos de animais houve um efeito de estimulação luminosa no ensaio de retirada da cauda (Figuras 7E e 7F).

Durante a tarefa de alimentação, como fizemos durante a tarefa de busca de sacarose, novamente notamos sequências motoras aberrantes relacionadas à alimentação que não eram direcionadas à comida. Nós filmamos um rato representativo no LH^GABA-VTA: grupo ChR2 em uma câmara transparente vazia, e após fotoestimulação de 20 Hz, observamos sequências motoras apetitivas incomuns, como lamber e roer o chão ou espaço vazio (Filme S4). Quantificamos esses comportamentos de "roer" durante a tarefa de alimentação no LH-VTA selvagem (figura 7G), LH^saciar-VTA (figura 7H) e LH^GABA-VTA (figura 7I) grupos e mostraram que LH^GABA-VTA: Ratinhos ChR2 roeram mais do que o tipo selvagem ou LH^saciar-VTA: ratinhos ChR2 quando fotoestimulados, em comparação com os respectivos grupos eYFP (figura 7J). Nós consideramos se os aberrantes comportamentos relacionados à alimentação podem ser separados da alimentação direcionada apropriadamente em freqüências mais baixas. No entanto, quando testamos o LH^GABA-VTA: grupo ChR2 com trens de luz azul de 5 Hz e 10 Hz, observamos uma relação proporcional entre a frequência de estimulação e alimentação e mastigação (figura 7K)

A projeção de LH para o VTA foi explorada com estudos de colisão por estimulação elétrica (Bielajew e Shizgal, 1986) e há muito se acredita que desempenhe um papel no processamento de recompensas (Hoebel e Teitelbaum, 1962, Margules e Olds, 1962) papel tem sido um desafio. Aqui, estamos fornecendo uma dissecação detalhada de como componentes individuais do loop LH-VTA processam diferentes aspectos de uma tarefa relacionada à recompensa.

Através do uso de fototagia mediada por optogenética (figura 1), identificamos duas populações separadas de neurônios LH: células que enviam projeções para o VTA (Tipo 1) e células que recebem feedback do VTA (Tipo 2; figura 2) - embora essas populações não precisem ser mutuamente exclusivas, já que é possível que os neurônios do LH possam enviar e receber insumos de e para o VTA. Curiosamente, descobrimos que relativamente poucos neurônios fotorresistentes estão fora da distribuição bimodal que encapsula essas duas populações (Figuras S2Banda 1E). Diante disso, em combinação com o longo atraso de latência nas fotorrespostas Tipo 2 (∼100 ms), especulamos que pode haver uma via dominante contribuindo para a atividade dos neurônios Tipo 2. Além disso, como o DA se liga a receptores acoplados à proteína G, a cinética é mais lenta do que a maioria das sinapses glutamatérgicas (Girault e Greengard, 2004) e pode explicar esse agrupamento de unidades fotorresponsivas de latência de 100 ms. Também é possível que o VTA possa fornecer feedback indireto através de outras regiões distais, via regiões intermediárias excitatórias, como a amígdala, ou com desinibição via nucleus accumbens (NAc) ou núcleo leito da estria terminal (BNST).

Curiosamente, enquanto a fotoestimulação das unidades do Tipo 1 evoca respostas excitatórias nas unidades do Tipo 2, as unidades do Tipo 1 e 2 apresentam propriedades de codificação comportamentais distintas. Por exemplo, os números das unidades Tipo 1 e Tipo 2 que codificam seletivamente a sugestão preditiva de recompensa são significativamente diferentes (n = 0/19 Tipo 1 versus n = 12/34 Tipo 2, qui-quadrado = 8.67, p = 0.003) . Esse padrão de resposta paradoxal pode ser devido a processos computacionais em um elemento de circuito intermediário, como o VTA, que pode estar desempenhando um papel ativo durante a tarefa comportamental, mas inativo durante a fototagging. Além disso, o estado comportamental do animal pode influenciar a forma como esses dados são processados.

Nossos experimentos de omissão de recompensa nos permitiram distinguir entre a codificação neural LH do CR e o consumo do estímulo incondicionado (US). Nessas experiências, um subconjunto de unidades Tipo 2 respondeu à sugestão preditiva de recompensa (CS) e aos EUA e também mostrou uma diminuição na taxa de disparo quando as recompensas esperadas foram omitidas. Além disso, um subconjunto de unidades Tipo 2 também mostra uma excitação fásica após entrega de recompensa inesperada (Figuras 4G e 4H). Esses dados são uma reminiscência da forma como os neurônios DA no VTA codificam o erro de previsão de recompensa (Cohen et al., 2012, Schultz et al., 1997). Especulamos que os neurônios VTA podem transmitir sinais de erro de predição de recompensa para um subconjunto de neurônios LH, que estão bem posicionados para integrar esses sinais para a determinação de uma saída comportamental apropriada. Especificamente, o LH está fortemente interconectado com uma infinidade de outras áreas do cérebro (Berthoud e Münzberg, 2011) e tem sido causalmente associado a estados homeostáticos como sono / excitação e fome / saciedade (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

O comportamento compulsivo de busca por recompensa foi discutido principalmente no contexto do vício em drogas, em que um paradigma clássico para a busca compulsiva de drogas tem sido examinar o grau em que o comportamento de busca por drogas persiste em face de uma consequência negativa, como um choque no pé (Belin et al., 2008, Pelloux et al., 2007, Vanderschuren e Everitt, 2004). Adaptamos esta tarefa para a sacarose visando nos permitir investigar se a ativação da via do LH-VTA era suficiente para promover a busca compulsiva de sacarose. Dado que uma diferença distinta entre droga e recompensa natural é que as recompensas com drogas não são necessárias para a sobrevivência, há controvérsia sobre quais comportamentos constituiriam comportamento compulsivo de busca por sacarose ou comida. Uma interpretação alternativa de nossos dados é que a ativação da via LH-VTA simplesmente aumenta o impulso motivacional ou o desejo de buscar reforçadores de apetite. Como as taxas de obesidade aumentaram nas últimas décadas (Mietus-Snyder e Lustig, 2008), a alimentação compulsiva e o vício em açúcar são condições prevalentes que são uma grande ameaça à saúde humana (Avena, 2007). O comportamento alimentar em camundongos saciados (totalmente alimentados) após a ativação da via LH-VTA é uma reminiscência de comportamentos alimentares vistos em humanos com diagnóstico de transtorno de comer compulsivo (ou transtorno da compulsão alimentar periódica) (DSM-V).

Tem sido proposto que ações repetidas levam à formação de hábitos, que por sua vez levam à busca de recompensa compulsiva que caracteriza a dependência (Everitt e Robbins, 2005). Nossa descoberta de que os neurônios LH-VTA apenas codificam a entrada da porta após o condicionamento sugere que esta via codifica seletivamente uma resposta condicionada, e não apenas uma ação motivada. Isso é consistente com nossas observações de que otimizar ativamente essa projeção pode promover a busca de recompensa compulsiva em face de uma conseqüência negativa (figura 5C), bem como na ausência de necessidade (como visto em camundongos saciados, figura 5E) Esta interpretação é adicionalmente substanciada por nossa descoberta de que a fotoinibição da via LH-VTA seletivamente reduz a procura compulsiva de sacarose (figura 5D), mas não reduz a alimentação em ratos com restrição alimentar (figura 5F). Um dos maiores desafios no tratamento de compulsão excessiva ou transtornos de compulsão alimentar é o risco de prejudicar comportamentos alimentares em geral. De uma perspectiva translacional, podemos ter identificado um circuito neural específico como um alvo potencial para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas para comer compulsivamente em excesso ou dependência de açúcar sem sacrificar os comportamentos naturais de alimentação.

Mostramos que, além de um componente LH-VTA glutamatérgico (Kempadoo et al., 2013), há também um componente GABAérgico significativo na projeção (Leinninger et al., 2009), e que os neurônios LH fazem sinapse diretamente em DA e Neurônios GABA no VTA (figura 6). No entanto, há uma diferença no equilíbrio da entrada excitatória / inibitória nos neurônios VTA DA e GABA.

Enquanto usamos o processamento imuno-histoquímico para verificar a identidade dos neurônios VTA, também medimos I_h, uma corrente catiônica não específica de retificação interna ativada por hiperpolarização (Lacey et al., 1989, Ungless and Grace, 2012). A presença dessa corrente tem sido amplamente utilizada em estudos eletrofisiológicos para identificar neurônios DA, mas tem se mostrado presente apenas em subpopulações de neurônios DA, delineadas por alvo de projeção (Lammel et al., 2011). Embora já tenha sido proposto em uma revisão por Fields e colegas que "os neurônios do LH fazem sinapses com as projeções de VTA para o PFC, mas não aqueles que se projetam para o NAc" (Fields et al., 2007), nossos dados sugerem que esta controvérsia seja reaberta para uma investigação mais aprofundada. Mesmo que tenhamos observado um subconjunto de neurônios DA que recebeu excitação líquida do LH e possuía um I muito pequeno_h (consistente com os neurônios DA mPFC-ou NAc com projeção medial de CA), também observamos um subconjunto de neurônios DA que receberam estímulo excitatório líquido e mostraram um grande I_h (consistente com as características dos neurônios DA projetando-se na concha lateral do NAc; Figura S5; Lammel et al., 2011). Por outro lado, os neurônios VTA DA que receberam uma entrada inibitória líquida mostraram um I muito pequeno_h ou não tinha essa corrente, o que é consistente com a noção de que o LH envia dados predominantemente inibitórios para os neurônios VTA DA que se projetam para o mPFC ou a camada medial do NAc. Também mostramos que as entradas de LH podem ser observadas em VTA medial e lateral, sugerindo que o LH fornece entradas para neurônios VTA com diversos alvos de projeção, pois é sabido que o alvo de projeção VTA corresponde um pouco à localização espacial ao longo de um eixo médio-lateral ( Lammel et al., 2008).

O papel da via LH-VTA na promoção da recompensa foi anteriormente atribuído à transmissão glutamatérgica no VTA (Kempadoo et al., 2013), já que o promotor CaMKIIα é frequentemente considerado seletivo para neurônios de projeção excitatória. No entanto, nossos dados mostram claramente que a expressão de ChR2 sob o controle do promotor CaMKIIα também tem como alvo os neurônios de projeção GABAérgicos no LH (figura 6).

O comportamento provocado pela fotoestimulação do LH^GABA-VTA via foi frenético, mal direcionado e mal-adaptativo (Filme S4). Uma interpretação é que a ativação do LH^GABAO caminho -VTA envia um sinal ao rato que causa o reconhecimento de um reforço apetitivo. Uma interpretação alternativa é que o LH^GABAO caminho da VTA pode estimular a saliência de incentivo ou um intenso “querer”, consistente com um sinal subjacente à abordagem condicionada, mas em um nível não fisiológico que produz esse comportamento aberrante relacionado à alimentação (Berridge e Robinson, 2003). Consistente com isso, é possível que a ativação do LH^GABAA projeção de VTA realmente produz sensações intensas de desejo ou necessidade de se alimentar. No entanto, nossos experimentos mostram que a ativação do LH^GABA-VTA não produz um aumento na busca compulsiva de sacarose, mas isso é provavelmente devido ao comportamento excessivo de roer e apetitoso aberrante focado em objetos não alimentícios na câmara de teste. Embora seja difícil determinar a experiência do camundongo durante essa manipulação, é claro que os comportamentos relacionados à alimentação apropriadamente dirigidos requerem a ativação coordenada dos componentes GABAérgico e glutamatérgico da via LH-VTA.

As manipulações optogenéticas e farmacogenéticas são ferramentas poderosas para estabelecer relações causais, mas não revelam as propriedades endógenas e fisiológicas dos elementos do circuito neural. Nosso estudo unifica informações sobre a conectividade sináptica, a função endógena que ocorre naturalmente e o papel causal da via LH-VTA, fornecendo um novo nível de percepção sobre como a informação é integrada nesse circuito. Estes resultados destacam a importância de examinar o papel funcional dos neurônios por conectividade, além de marcadores genéticos. Os neurônios LH-VTA codificaram seletivamente a ação de busca de recompensa, mas não codificaram estímulos ambientais, enquanto os estímulos de recompensa e sugestões preditivas de recompensa foram codificados por uma população discreta de neurônios LH a jusante da VTA. Além disso, identificamos uma projeção específica que está ligada causalmente ao comportamento compulsivo de busca e alimentação de sacarose. A heterogeneidade na projeção do LH-VTA é necessária para proporcionar um equilíbrio adaptativo entre motivação motora e regulação de comportamentos apetitivos apropriadamente direcionados. Esses achados fornecem insights relevantes para condições patológicas, como transtorno excessivo compulsivo, dependência de açúcar e obesidade.