Receptores dopaminérgicos D2 em disfunção de recompensa semelhante ao vício e compulsão alimentar em ratos obesos (2010)

Comente: Este estudo demonstra que quando um animal tem acesso ilimitado, um forte reforçador natural (comida muito estimulante) pode causar um declínio nos receptores D2. Este declínio foi visto em quase todos os ratos e ocorreu muito rapidamente. Quando a comida “altamente palatável” foi removida, os ratos se recusaram a comer ração normal. Os ratos continuaram a comer compulsivamente (quando podiam), apesar de emparelhar choques elétricos com o consumo de comida “altamente palatável”.

• Estudo completo

Nat Neurosci. 2010 de maio; 13(5): 635-641. Publicado on-line 2010 March 28. doi:  10.1038 / nn.2519

Sumário

Descobrimos que o desenvolvimento da obesidade foi associado ao surgimento de um déficit progressivamente pior nas respostas de recompensa neural. Mudanças similares na homeostase da recompensa induzida pela cocaína ou heroína são consideradas cruciais no desencadeamento da transição da tomada de drogas casual para compulsiva. Nesse sentido, detectamos comportamento de alimentação tipo compulsivo em ratos obesos, mas não magros, medido como consumo de alimentos palatáveis ​​que era resistente à ruptura por um estímulo condicionado aversivo. Os receptores D2 de dopamina estriatal (D2Rs) foram reprimidos em ratos obesos, como tem sido relatado em humanos dependentes de drogas. Além disso, o knockdown mediado por lentivírus de D2Rs do estriado acelerou rapidamente o desenvolvimento de déficits de recompensa semelhantes ao vício e o início da busca de alimentos compulsivos em ratos com acesso prolongado a alimentos com alto teor de gordura e palatáveis. Esses dados demonstram que o consumo excessivo de alimentos palatáveis ​​desencadeia respostas neuroadaptativas semelhantes ao vício nos circuitos de recompensa do cérebro e impulsiona o desenvolvimento da compulsão alimentar. Mecanismos hedônicos comuns podem, portanto, estar por trás da obesidade e do vício em drogas.

Introdução

A alimentação é influenciada pelo prazer e pela recompensa, e a obtenção de uma recompensa alimentar pode motivar fortemente o consumo1. No entanto, os mecanismos hedônicos que contribuem para a obesidade ainda são pouco conhecidos. Em humanos hiperfágicos com deficiência congênita de leptina, a atividade no estriado dorsal e ventral, que são componentes centrais dos circuitos de recompensa do cérebro, aumenta acentuadamente em resposta a imagens de alimentos2, e a terapia de reposição de leptina atenua tanto a atividade estriatal quanto o "gosto" auto-relatado de alimentos3 . Isso sugere que o corpo estriado é importante nos aspectos hedônicos do comportamento alimentar. Foi demonstrado recentemente que a ativação do estriado em resposta a alimentos altamente palatáveis ​​é embotada em indivíduos obesos quando comparados a controles magros3. Além disso, a hipofunção do estriado dorsal e o ganho de peso a longo prazo são mais pronunciados em indivíduos com o alelo TaqIA do locus do gene DRD4-ANKK2, o que resulta na diminuição da expressão de D1R no estriado e demonstrou predispor os indivíduos a transtornos de dependência de substância2, 4 Essas e outras observações semelhantes levaram à proposta de que déficits no processamento de recompensas podem ser um importante fator de risco para o desenvolvimento de obesidade, e que indivíduos obesos podem consumir alimentos palatáveis ​​compulsivamente para compensar a hipossensibilidade de recompensas5. Notavelmente, não está claro se os déficits no processamento da recompensa são constitutivos e precedem a obesidade, ou se o consumo excessivo de comida saborosa pode levar à disfunção da recompensa e, assim, contribuir para a obesidade induzida pela dieta.

Uma característica que define os indivíduos com sobrepeso e obesidade é que eles continuam a comer demais, apesar das consequências negativas e sociais bem conhecidas. De fato, muitos indivíduos com sobrepeso expressam o desejo de limitar o consumo de alimentos, mas ainda lutam para controlar sua ingestão e consomem repetidamente além de suas necessidades energéticas7, 8. O desenvolvimento de comportamento alimentar insensível a resultados negativos é análogo ao comportamento compulsivo de consumo de drogas visto em toxicodependentes humanos, que é igualmente impermeável às consequências negativas9. Aqui nós investigamos os efeitos do acesso prolongado a uma dieta rica em gordura e palatável sobre a sensibilidade dos sistemas de recompensa do cérebro em ratos. Também examinamos a ligação entre a desregulação hedônica induzida pela dieta e o surgimento da busca compulsiva de alimentos. Finalmente, investigamos o papel dos D2Rs do estriado nessas respostas comportamentais semelhantes à dependência.

Déficits de recompensa semelhantes ao vício em ratos obesos

Para testar os efeitos do acesso restrito ou estendido a uma dieta rica em gordura palatável, preparamos ratos Wistar machos (300−350 g) com um eletrodo estimulador bipolar no hipotálamo lateral e os treinamos por 10-14 dias em um ensaio discreto procedimento de recompensa por estimulação cerebral de limiar atual (BSR) até que limiares de recompensa estáveis ​​fossem estabelecidos4. No procedimento BSR, os ratos respondem vigorosamente para obter uma autoestimulação elétrica gratificante por meio do eletrodo estimulante permanente, com a intensidade de estimulação mínima que mantém o comportamento de autoestimulação denominado limiar de recompensa10. Como os limiares de recompensa permanecem estáveis ​​e inalterados por períodos prolongados em condições básicas, este procedimento fornece uma medida sensível da capacidade de resposta dos sistemas de recompensa do cérebro. Após o estabelecimento de limiares de BSR estáveis ​​(definidos como <10% de variação nos limiares em três sessões consecutivas), alocamos os ratos em três grupos que não mostraram diferenças nos pesos corporais médios ou limiares de recompensa entre os grupos. Os três grupos tiveram acesso diferenciado a uma dieta "estilo cafeteria", que consiste em alimentos palatáveis ​​com alta densidade energética, prontamente disponíveis para consumo humano (ver Métodos Online). Os ratos tiveram 0 h (ratos apenas com ração; n = 9), 1 h (ratos com acesso restrito; n = 11) ou 18-23 h (ratos com acesso estendido; n = 11) acesso à dieta por dia durante 40 dias consecutivos. As dietas de cafeteria são conhecidas por resultar em obesidade induzida por dieta em ratos11. Todos os ratos também tiveram acesso ad libitum à ração padrão de laboratório, com limiares de recompensa, ganho de peso e ingestão calórica registrados durante todo.

O peso aumentou acentuadamente em ratos com acesso prolongado à dieta do refeitório em comparação com os grupos de acesso restrito ou somente acesso restrito (Fig. 1a). O peso também tendeu a aumentar nos ratos de acesso restrito em comparação com os ratos apenas para raças, mas este efeito não atingiu significância estatística. O desenvolvimento da obesidade em ratos de acesso estendido foi estreitamente associado com um déficit de piora na função de recompensa do cérebro, refletido em limiares de RRS progressivamente elevados (Fig. 1b). Como não foram observadas diferenças nas latências de resposta para BSR entre os três grupos (Fig. Suplementar), déficits no desempenho comportamental não podem explicar essa observação. Foram notificados défices semelhantes na função de recompensa do cérebro em ratos com acesso prolongado mas não restrito a auto-administrações intravenosas de cocaína ou heroína1, 12, 13. Assim, o acesso prolongado a alimentos com alto teor de gordura e palatáveis ​​pode induzir déficits viciantes na função de recompensa do cérebro, considerada uma importante fonte de motivação que pode levar a excessos alimentares e contribuir para o desenvolvimento da obesidade14, 1.

Figura 1: Ganho de peso e disfunção de recompensa em ratos com acesso prolongado a uma dieta de cafeteria.

(a) Ganho de peso médio (± sem) em ratos de acesso restrito, acesso restrito e acesso estendido (acesso × interação do dia: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 em comparação com o grupo apenas de ração, teste post hoc). (b) Mudança percentual média (± sem) dos limiares de recompensa da linha de base (acesso x interação de tempo: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 em comparação com o grupo somente ração, teste post hoc).

Quando examinamos detalhadamente o comportamento alimentar (Fig. 2), descobrimos que a ingestão calórica diária total foi semelhante entre os ratos somente para ração e com acesso restrito (Fig. 2a, d). Em contraste, a ingestão calórica total em ratos com acesso prolongado foi quase o dobro da dos ratos com acesso restrito e somente para ração (Fig. 2a, d). Embora os ratos com acesso restrito e somente ração mantivessem aproximadamente a mesma ingestão calórica diária (Fig. 2a, d), os ratos de acesso restrito obtinham apenas 33% de suas calorias diárias de ração (Fig. 2b, d), indicando que eles desenvolveram um comportamento de alimentação do tipo compulsivo e consumiram ~ 66% de sua ingestão calórica diária durante sua sessão de acesso 1 h ao refeitório diet15 (Fig. 2d). Ratos de acesso estendido obtiveram apenas uma pequena fração (~ 5%) de sua ingestão calórica total de ração (Fig. 2b); eles consumiram a dieta da cafeteria quase exclusivamente (Fig. 2d). A mudança na preferência alimentar nos grupos de acesso restrito e de acesso estendido também se refletiu em um aumento acentuado na ingestão de gordura em comparação com ratos somente para ração (Fig. 2c e Suplementação da Fig. 2). Consistente com relatos anteriores 16, houve uma tendência para o consumo da dieta da cafeteria diminuir ao longo do tempo nos ratos de acesso estendido. Isso pode refletir o desenvolvimento de tolerância à palatabilidade dos itens alimentares fornecidos como parte da dieta do refeitório ao longo do tempo. No entanto, a preferência pela dieta de cafeteria versus ração padrão permaneceu consistentemente alta nesses ratos (Figura 3 Complementar). Esses dados demonstram que o acesso prolongado, mas não restrito, a uma dieta rica em gordura e palatável induz déficits de recompensa semelhantes ao vício, excesso de comida e perda do balanço energético homeostático. Por outro lado, o acesso restrito a alimentos apetitosos dá origem a padrões de consumo semelhantes a compulsão, mas não interrompe o equilíbrio energético homeostático nem a função de recompensa do cérebro. No entanto, é possível que o acesso restrito à dieta da cafeteria por mais de 40 dias consecutivos induziria ganho significativo de peso e interrupção da função de recompensa do cérebro.

Figura 2: Padrões de consumo em ratos com acesso prolongado a uma dieta de cafeteria.

(a) Ingestão calórica média (± sem) diária em ratos apenas com ração, de acesso restrito e de acesso estendido (acesso: F1,324 = 100.6, P <0.0001; tempo: F18,324 = 7.8, P <0.0001; acesso × interação do tempo: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 em comparação com o grupo apenas de ração, teste post hoc). (b) Ingestão calórica média diária (± sem) da ração (acesso: F2,504 = 349.1, P <0.0001; tempo: F18,504 = 5.9, P <0.0001; acesso × interação do tempo: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 em comparação com o grupo somente ração, teste post hoc). (c) Ingestão calórica média diária (± sem) da gordura (acesso: F2,486 = 118.7, P <0.0001; tempo: F18,486 = 8.8, P <0.0001; acesso × interação do tempo: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 em comparação com o grupo somente ração, teste post hoc). (d) Comparação da ingestão calórica total média (± sem) e calorias consumidas exclusivamente de ração, durante todo o período de 40 dias de acesso (acesso: F2,54 = 25.0, P <0.0001; fonte de calorias: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; acesso x interação da fonte de calorias: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 em comparação com o total de calorias no grupo apenas de ração, ### P <0.001 em comparação com o total de calorias no mesmo grupo de ratos, teste post hoc).

Após 40 dias, os ratos não tiveram mais acesso à dieta saborosa, mas continuaram a ter acesso ad libitum à ração padrão de laboratório. Avaliamos os limites de recompensa e o consumo de ração diariamente durante o período de 'abstinência' forçada. As elevações nos limiares de recompensa persistiram por pelo menos 2 semanas nos ratos de acesso estendido quando eles não tinham mais acesso à dieta palatável (Fig. 3a). Isso contrasta com os déficits relativamente transitórios (~ 48 h) na função de recompensa relatados em ratos em abstinência de cocaína autoadministrada13. Houve também uma diminuição acentuada na ingestão calórica (Fig. 3b) e uma diminuição gradual no peso corporal (Fig. 3c) em ratos de acesso estendido, e em menor extensão em ratos de acesso restrito, durante este período de abstinência, consistente com relatórios anteriores11, 15. Após 14 dias de abstinência, os ratos foram mortos e a colocação dos eletrodos foi determinada por coloração com violeta cresil (Fig. 3d).

Figura 3: Disfunção de recompensa persistente e hipofagia durante a abstinência em ratos com acesso prolongado a uma dieta de cafeteria.

(a) Alteração percentual média dos limiares de recompensa da linha de base (± sem) durante a abstinência de uma dieta rica em gordura saborosa (acesso: F2,112 = 3.7, P <0.05; tempo: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 em comparação com o grupo apenas com ração, teste post hoc). (b) Ingestão calórica média (± sem) no último dia de acesso à dieta rica em gordura (linha de base) e durante os 14 dias de abstinência quando apenas ração padrão estava disponível (acesso: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; tempo: F6,168 = 65.6, P <0.0001; acesso x interação de tempo: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 em comparação com o grupo apenas ração, teste post hoc). (c) Mudança no peso corporal médio (± DP) em comparação com o peso corporal no último dia de acesso à dieta rica em gordura (linha de base) e durante os 14 dias de abstinência quando apenas ração padrão estava disponível (acesso: F1,126 = 37.2, P <0.0001; tempo: F7,126 = 3.1, P <0.01; acesso x interação de tempo: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 em comparação com o grupo apenas ração, teste post hoc). (d) Reconstrução histológica da localização dos eletrodos estimuladores de BSR no hipotálamo lateral de ratos apenas com comida (triângulos), de acesso restrito (quadrados) e de acesso estendido (círculos).

D2Rs estriatais em ratos obesos: papel nos déficits de recompensa

Em seguida, testamos a hipótese de que o consumo excessivo de uma dieta saborosa de cafeteria pode reduzir a densidade D2R estriatal, contribuindo para o desenvolvimento de hipossensibilidade de recompensa semelhante ao vício. Uma nova coorte de ratos apenas com ração, acesso restrito e acesso estendido teve acesso à dieta de refeitório até que houvesse um aumento estatisticamente significativo no peso corporal nos ratos com acesso estendido em comparação com o grupo apenas com ração (P <0.05 ; Fig. 4a). A expressão estriatal da forma ligada à membrana supostamente fortemente glicosilada (~ 70 kDa) do D2R foi menor nos ratos de acesso estendido do que nos ratos de acesso restrito ou apenas ração (Fig. 4b; consulte Métodos Online). Quando dividimos os ratos em cada grupo de acesso em dois subgrupos com base em uma divisão mediana dos pesos corporais (leve ou pesado), encontramos uma relação inversa clara entre o peso corporal e a expressão de D2R estriatal (Fig. 4a, c). Não detectamos diminuições estatisticamente significativas na expressão das formas imaturas não glicosiladas (~ 39 kDa) e citoplasmáticas glicosiladas intermediárias (~ 51 kDa) do D2R (Fig. Suplementar 4) 17, indicando que a expressão de D2R estriatal em ratos de acesso estendido é provavelmente regulada através de mecanismos pós-transcricionais.

Figura 4: O ganho de peso está inversamente relacionado aos níveis de D2R do estriado.

(a) Ratos de apenas comida, de acesso restrito e de acesso estendido foram subdivididos em dois grupos por condição de acesso com base em uma divisão mediana de pesos corporais: leve (L) ou pesado (H). (b) Todo o complexo estriado foi coletado de todos os ratos e os níveis de D2R em cada grupo medidos por western blotting. A banda D2R associada à membrana foi resolvida em 70 kDa, e o controle de carga de proteína é exibido abaixo (β-actina, 43 kDa). Os imunoblots de comprimento total são mostrados na Figura Suplementar 12. (c) Quantidades relativas de D2R no estriado de ratos apenas com ração, acesso restrito e acesso estendido foram quantificados por densitometria (F2,6 = 5.2, P <0.05, principal efeito do acesso; * P <0.05 e ** P <0.01 em comparação com o grupo ração-apenas-L).

A seguir, para testar a relevância funcional das reduções induzidas por dieta no D2R do estriado para função de recompensa do cérebro, projetamos e validamos um vetor lentiviral para fornecer um RNA interferente de gancho curto (shRNA) para derrubar o D2R (Lenti-D2Rsh; Fig. 5 e Complementar Fig. 5). Os limiares de recompensa começaram a aumentar em ratos tratados com Lenti-D2Rsh quase imediatamente após ter sido permitido acesso estendido à dieta do refeitório, enquanto os limites de recompensa permaneceram inalterados em ratos de acesso estendido tratados com um vetor de lentivírus vazio (Lenti-controle) durante o período relativamente curto de acesso à dieta do refeitório (14 d; Fig. 6a). As latências de resposta foram inalteradas em ambos os grupos de ratos, mostrando que este efeito não foi secundário a déficits no desempenho da tarefa (Figura Complementar 6). Os limiares de recompensa também foram inalterados em ratos tratados com Lenti-D2Rsh ou Lenti-control que tiveram acesso a ração somente durante o mesmo período (Fig. 6b).

Os limiares permaneceram persistentemente elevados durante um 15 extra de abstinência quando todos os ratos tiveram acesso apenas a ração padrão (Fig. Suplementar 7). O knockdown do D2R do estriado, portanto, aumentou a vulnerabilidade à hipofunção de recompensa induzida pela dieta, mas não alterou a atividade de base dos sistemas de recompensa do cérebro.

Figura 5: knockdown mediado por lentivírus da expressão de D2R do estriado.

(a) Representação gráfica das áreas estriatais nas quais Lenti-D2Rsh foi superexpresso. Os círculos verdes no hemisfério estriado esquerdo representam os locais em que as infusões virais foram direcionadas. A coloração verde no hemisfério estriatal direito é uma coloração imunoquímica representativa para a proteína fluorescente verde (GFP) do cérebro de um rato Lenti-D2Rsh. (b) Imunoblot representativo da expressão diminuída de D2R no corpo estriado de ratos Lenti-D2Rsh. Os imunoblots de comprimento total são mostrados na Figura Suplementar 13. (c) Quantidades relativas de D2R no estriado de ratos Lenti-controle e Lenti-D2Rsh, quantificados por densitometria (* P <0.05 em comparação com o grupo de controle Lenti, teste post hoc ) (d) A infecção de células gliais no estriado pelo vetor Lenti-D2Rsh não foi detectada. A coloração verde é GFP de vírus; vermelho é a proteína glial fibrilar ácida marcadora de astrócitos (GFAP); os núcleos das células são destacados pela coloração DAPI em azul. Setas brancas indicam uma área localizada de gliose encontrada apenas no local da injeção do vírus no corpo estriado e não nos tecidos circundantes nos quais o vírus se difundiu. Mesmo nesta área, nenhum dos astrócitos é positivo para GFP. As setas amarelas na imagem ampliada destacam os astrócitos GFP-negativos típicos que foram detectados. (e) Níveis elevados de infecção neuronal no estriado pelo vetor Lenti-D2Rsh. A coloração verde é GFP de vírus; vermelho é o marcador nuclear neuronal NeuN; os núcleos das células são destacados pela coloração DAPI em azul. As setas amarelas na imagem ampliada destacam neurônios GFP-positivos e NeuN-positivos no corpo estriado. (f) Uma imagem de maior ampliação de um neurônio infectado por vírus (GFP-positivo) no estriado de ratos Lenti-D2Rsh que mostra as características morfológicas típicas de neurônios espinhosos médios.

Figura 6: O knockdown do D2R no estriato aumenta a vulnerabilidade para recompensar a disfunção em ratos com acesso prolongado a uma dieta de cafeteria.

(a) Mudança percentual média (± sem) dos limiares de recompensa da linha de base em ratos Lenti-controle e Lenti-D2Rsh que estenderam o acesso à dieta de refeitório por 14 dias consecutivos (vírus: F1,156 = 5.9, P <0.05; tempo: F13,156 = 2.2, P <0.05; vírus x interação de tempo: F13,156 = 2.2, P <0.05; #P <0.05, efeito de interação). (b) Mudança percentual média (± sem) dos limiares de recompensa da linha de base em ratos Lenti-controle e Lenti-D2Rsh que tiveram acesso apenas para ração. (c) Ingestão calórica média (± sem) de ratos durante 14 dias de ração apenas ou acesso estendido (acesso: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Ganho de peso médio (± sem) durante 14 dias de ração apenas ou acesso estendido (acesso: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, efeito principal do acesso).

Descobrimos que a ingestão calórica (Fig. 6c) e o ganho de peso (Fig. 6d) foram similares nos grupos Lenti-D2Rsh e Lenti-controle correspondentes sob condições de acesso somente à ração ou estendida (Figs. Suplementares 8 e 9). Assim, o knockdown D2R do estriado não alterou nem a preferência pela dieta da cafeteria nem a ingestão calórica total quando o alimento palatável estava livremente disponível para consumo.

Comer compulsivo em ratos obesos: papel para D2R do estriado

Em seguida, testamos a hipótese de que a alimentação compulsiva pode surgir em ratos com acesso prolongado à dieta de cafeteria e que déficits na sinalização estriatal D2R podem contribuir para esse efeito. Uma nova coorte de ratos apenas com ração, acesso restrito e acesso estendido foi permitido o acesso à dieta de refeitório por> 40 dias até que aumentos de peso estatisticamente significativos ocorressem nos ratos estendidos (P <0.05 em comparação com ratos apenas com ração; dados não mostrando). Todos os três grupos de ratos tiveram então permissão de acesso de apenas 30 minutos por dia à dieta de refeitório por 5-7 dias em uma câmara operante até que a ingestão estável fosse alcançada (definida como variação <10% na ingestão diária). Metade dos ratos em cada condição de acesso foi então exposta a uma luz (estímulo condicionado) emparelhada com aplicação de choques nas patas (grupo punido), enquanto os ratos restantes em cada grupo foram expostos à luz indicadora na ausência de choque nas patas (grupo não punido ) No dia do teste, examinamos os efeitos da exposição à luz indicadora sozinha no consumo de alimentos saborosos (Fig. 7; consulte Métodos Online). Descobrimos que a ingestão calórica média durante as sessões de linha de base de 30 minutos foi maior nos ratos de acesso restrito e somente ração do que nos ratos de acesso estendido (Fig. 7a, b). Isso sugere que os ratos de acesso restrito e apenas ração consumiram alimentos saborosos durante as sessões de acesso intermitente de 30 minutos, refletido no fato de que esses ratos consumiram ~ 40-50% de sua ingestão calórica diária, normalmente ~ 100 kCal, durante essas sessões (Fig. 7a, b). Em contraste, os ratos de acesso estendido parecem resistentes a desenvolver esse comportamento de alimentação compulsiva, talvez porque sua história de acesso quase ilimitado à comida saborosa por> 40 dias consecutivos estabeleceu padrões de alimentação que eram relativamente inflexíveis de mudar. No dia do teste, não observamos efeitos estatisticamente significativos da reprodução da luz de sinalização sobre o consumo de alimentos nos ratos não punidos dos grupos de apenas ração, acesso restrito ou acesso estendido quando comparados com a ingestão durante o período de linha de base (Fig. 7a). A luz indicadora sozinha, portanto, não tinha relevância motivacional. Em ratos punidos, a luz de sinalização emparelhado com choque diminuiu significativamente a ingestão de comida palatável nos ratos de apenas ração e de acesso restrito. No entanto, a luz indicadora não teve efeito sobre a ingestão de comida palatável nos ratos de acesso estendido, mostrando que seu consumo era insensível a pistas ambientais aversivas que previam adversidade. A ingestão de energia basal nos ratos de acesso estendido foi menor do que nos outros grupos. No entanto, como a ingestão de ração durante períodos de tempo semelhantes foi muito menor (Fig. 7d), é improvável que isso represente um 'efeito de chão' que confunde nossos achados. Juntos, nossos dados apóiam a ideia de que o comportamento alimentar do tipo compulsivo pode surgir em ratos de acesso estendido de uma maneira análoga ao consumo compulsivo de cocaína visto em ratos com histórico de acesso estendido à droga18.

Figura 7: Resposta do tipo compulsivo para alimentos saborosos.

(a) Consumo médio (± sem) de dieta palatável em ratos não punidos durante as sessões de linha de base de 30 minutos e no dia do teste quando os ratos foram expostos a um estímulo condicionado neutro que não foi previamente pareado com choque nocivo nas patas (acesso: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 em comparação com ratos apenas ração). (b) Consumo médio (± sem) de dieta palatável em ratos punidos durante as sessões de linha de base de 30 min e no dia do teste, quando os ratos foram expostos a um estímulo condicionado que foi previamente pareado com choque nocivo nas patas (acesso: F2,21 = 3.9 , P <0.05; sugestão: F1,21 = 8.6, P <0.01; acesso x interação de sugestão: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 em comparação com a ingestão durante a sessão de linha de base, #P <0.05 em comparação com ratos apenas ração). (c) Consumo médio (± sem) de dieta palatável durante as sessões de linha de base de 30 min e no dia do teste em ratos Lenti-controle e Lenti-D2Rsh que anteriormente tinham apenas ração ou acesso estendido a uma dieta de refeitório (sugestão: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 comparado com a ingestão durante as sessões de linha de base, teste post hoc). (d) Consumo médio (± sem) de ração durante as sessões de linha de base de 2 min e no dia do teste em ratos Lenti-controle e Lenti-D1,26Rsh que anteriormente tinham apenas ração ou acesso estendido a uma dieta de refeitório (sugestão: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX comparado com a ingestão durante as sessões de linha de base, teste post hoc).

Finalmente, examinamos os efeitos do estímulo condicionado emparelhado com punição na ingestão de alimentos nos ratos Lenti-controle e Lenti-D2Rsh que anteriormente tinham acesso apenas à ração ou acesso estendido à dieta de refeitório (ratos da Fig. 6). Descobrimos que a ingestão de alimentos palatáveis ​​na linha de base durante as sessões de linha de base de 30 min foi igualmente alta (~ 40 kCal) em todos os quatro grupos (Fig. 7c). Além disso, o consumo diário total de ração (na gaiola doméstica) foi semelhante entre os quatro grupos de ratos durante as sessões de condicionamento e no dia do teste (Fig. 10 suplementar). Os 14 dias de acesso anterior à dieta de refeitório, portanto, não foram suficientes para bloquear o comportamento alimentar compulsivo de uma maneira semelhante à observada em ratos que tiveram> 40 dias de acesso estendido à dieta de refeitório (Fig. 7a, b). O estímulo de luz de sinalização aversiva interrompeu a ingestão de comida palatável em ratos Lenti-controle e Lenti-D2Rsh que anteriormente tinham acesso apenas para ração (Fig. 7c). Da mesma forma, o estímulo condicionado aversivo interrompeu a ingestão de comida palatável nos ratos controle Lenti que anteriormente tinham acesso prolongado de 14 dias à dieta de refeitório. Em contraste, o estímulo condicionado aversivo não teve impacto sobre o consumo de comida palatável nos ratos Lenti-D2Rsh que anteriormente tinham acesso prolongado de 14 dias à dieta de refeitório (Fig. 7c). Os limiares de BSR permaneceram significativamente elevados nesses ratos quando registrados 48 h após a sessão de teste, enquanto os limiares permaneceram estáveis ​​e inalterados nos outros três grupos de ratos

(Fig. Suplementar 11). Para verificar que a resistência à supressão induzida pelo estímulo condicionado da ingestão de alimentos saborosos nos ratos Lenti-D2Rsh de acesso estendido não foi secundária a comprometimentos em processos de condicionamento clássicos, testamos os efeitos do estímulo condicionado aversivo no consumo de ração padrão menos palatável todos os quatro grupos de ratos. Em contraste com o consumo de alimentos palatáveis, descobrimos que todos os quatro grupos de ratos consumiram pouca comida (~ 2 kCal) durante as sessões iniciais 30 min (Fig. 7d) e que a ingestão de ração foi interrompida em todos os quatro grupos por uma magnitude similar após a exposição ao estímulo condicionado aversivo (Fig. 7d). Estes dados demonstram que o knockdown de D2Rs do estriado acelerou acentuadamente o surgimento de uma alimentação compulsiva de alimentos saborosos, mas apenas em ratos com uma história de acesso prolongado. Além disso, como a compulsão alimentar foi detectada apenas em ratos Lenti-D2Rsh que apresentaram limiares elevados de RNS, a hipofunção da recompensa induzida pela dieta pode ser um antecedente necessário para o surgimento da busca compulsiva de alimentos.

Discussão

A facilidade de acesso a alimentos com alto teor de gordura e palatável é considerada um importante fator de risco ambiental para a obesidade 19. Descobrimos que o acesso prolongado a uma dieta estilo cafeteria altamente palatável resultou em excessos e ganho de peso, juntamente com o aumento progressivo dos limiares de RRS em ratos. Este efeito nos limiares de RSE pode ser explicado pela diminuição gradual da capacidade de resposta dos circuitos de recompensa do cérebro, uma interpretação consistente com o fato de que a restrição alimentar e a perda de peso podem aumentar 20, enquanto a sobrealimentação aguda pode diminuir temporariamente o SNNX, respondendo pela RRS em ratos. Este achado representa uma extensão do trabalho mostrando que a superalimentação aguda de ratos através de um tubo de alimentação intragástrico21 e distensão gástrica ou infusão intravenosa de glucagon que mimetiza a saciedade pós-prandial21, 22, 23, diminui em resposta à recompensa da resposta lateral hipotalâmica e aumenta as respostas semelhantes à aversão stimulation24. Trabalhos anteriores também mostraram que repetidamente alimentação forçada de ratos através de tubos intragástricos até que seu peso tenha aumentado por 25g similarmente diminui as taxas de resposta para BSR, um efeito que persiste até que o peso corporal tenha normalizado200. Como nesses achados em ratos, a resposta da RSE hipotalâmica lateral aos gatos foi inibida pela alimentação prévia à saciação 23, mostrando que as interações entre a função de recompensa do cérebro e o estado metabólico são conservadas e, portanto, são passíveis de ocorrer em humanos também. A facilidade de acesso e a conseqüente ingestão excessiva de dietas no estilo cafeteria em humanos é considerada um contribuinte ambiental importante para a atual epidemia de obesidade nas sociedades ocidentais26. Nossos dados mostram que a hipofunção da recompensa surge em ratos que voluntariamente comem demais uma dieta cafeteria apetecível semelhante à consumida pelos humanos e que esse efeito se torna progressivamente pior à medida que ganham mais peso. Notavelmente, todos os ratos com elevação de limiar de recompensa ≥19% tinham eletrodos de BSR localizados dentro de ~ 20 μm do fórnice dorsolateralmente. A sensibilidade dos neurônios relacionados à recompensa nesta área é aumentada pela restrição alimentar de uma maneira que é sensível ao hormônio derivado da gordura leptina, e essa região do cérebro é considerada um importante substrato para a recompensa alimentar 500. Os circuitos cerebrais que regulam a hedonia alimentar são, portanto, inibidos por sinais postestivos que preveem a saciedade, consistentes com estudos recentes de imagens humanas que mostram que a distensão gástrica 27 e o peptídeo pós-prandial derivado do intestino YY28-3 modulam a atividade de regiões do cérebro envolvido no processamento de recompensas. Além disso, os sistemas de recompensa também são inibidos pelo ganho excessivo de peso. Relatórios recentes indicam que a leptina circulante, um regulador chave do balanço de energia, pode penetrar nos tecidos cerebrais e inibir a atividade dos circuitos de recompensa36, 29, 3, 27.

Os déficits de recompensa em ratos com sobrepeso podem refletir diminuições contra-adaptativas na sensibilidade basal dos circuitos de recompensa do cérebro para se opor à sua superestimulação por alimentos saborosos. Essa hipofunção de recompensa induzida por dieta pode contribuir para o desenvolvimento da obesidade, aumentando a motivação para consumir dietas "obesogênicas" de alta recompensa para evitar ou aliviar esse estado de recompensa negativa6. Isso pode ser responsável pela hipofagia que observamos no acesso estendido ratos e em menor grau em ratos de acesso restrito quando o alimento palatável foi retirado e apenas a ração menos palatável estava disponível. Tal cenário também é consistente com dados de estudos de imagem do cérebro humano em que a ativação embotada do corpo estriado em resposta a alimentos altamente palatáveis, particularmente em indivíduos com polimorfismos genéticos que diminuem a expressão de D32R estriatal, está associada ao ganho de peso a longo prazo2. Não está claro se essa hipossensibilidade de recompensa em indivíduos obesos se manifesta antes do desenvolvimento da obesidade e está relacionada apenas a fatores genéticos ('síndrome de deficiência de recompensa') ou se comer em excesso pode causar interrupção no processamento de recompensa. Nossos dados demonstram que o acesso estendido a alimentos saborosos de alta energia e subsequente excesso de alimentação embotam a sensibilidade e podem, portanto, representar um importante mecanismo hedônico que promove o desenvolvimento da obesidade. Disfunção de recompensa semelhante à relatada aqui em ratos obesos também é detectada em ratos com uma história de acesso estendido a cocaína intravenosa ou autoadministração de heroína, mas não naqueles com uma história de acesso restrito4, 12, 13. Além disso, a transição de A busca de drogas casual a compulsiva foi proposta como resultado de uma tentativa de aliviar o estado persistente de recompensa diminuída induzida por esta disfunção de recompensa induzida por drogas14, 12, 32. Assim, nossos dados indicam que a obesidade e a dependência de drogas podem compartilhar mecanismos hedônicos subjacentes.

A regulação negativa da expressão de D2R do estriado é uma notável resposta neuroadaptativa ao consumo excessivo de alimentos saborosos. De fato, reduções na densidade do D2R estriado são observadas em indivíduos com sobrepeso4, 34 e roedores35, 36. Por outro lado, os indivíduos com anorexia nervosa têm D2R37 do estriado elevado, e a perda de peso em indivíduos obesos após a cirurgia bariátrica (bypass gástrico) está associada à D2R densidade 28 estriada elevada. O polimorfismo genético referido como o alelo TaqIA A1 resulta em diminuição da densidade do D2R do estriado, e indivíduos portadores deste alelo estão super-representados em populações obesas4. O alelo TaqIA também aumenta a vulnerabilidade ao álcool, opioides e dependência de estimulantes psicomotores38. Reduções na densidade do D2R do estriado que ocorrem por fatores genéticos constitutivos ou como conseqüência de excessos podem, portanto, contribuir para os mecanismos neurobiológicos da obesidade. Descobrimos que os níveis do estriado da isoforma 70 kDa D2R, que se pensa reflectir o D2R associado à membrana, estavam inversamente relacionados com o peso corporal em ratos dos grupos apenas de comida, acesso restrito e acesso estendido (Fig. 4). O knockdown da expressão do D2R no estriado, mais proeminente no estriado dorsolateral (Fig. 5), fez com que os limiares da RNS aumentassem quase imediatamente após a exposição à dieta da cafeteria. As diminuições na expressão de D2R no estriado aceleraram rapidamente o surgimento de hipofunção de recompensa em ratos com acesso prolongado a alimentos altamente palatáveis, uma descoberta consistente com dados de imagens cerebrais que indicam que déficits na densidade do estriatório contribuem para recompensar a hipofunção em indivíduos obesos2.

Três características dos ratos Lenti-D2Rsh também são dignas de nota. Primeiro, embora o knockdown D2R estriado combinado com o acesso prolongado à dieta palatável tenha resultado em elevar os limiares de RNS, não houve diferenças na ingestão calórica ou no ganho de peso nestes ratos em comparação com os ratos de controlo. Isso pode refletir o fato de que os ratos só tinham 14 d de acesso à dieta da cafeteria; períodos mais longos de acesso podem ter resultado em maior ganho de peso ao longo do tempo, similarmente à maior suscetibilidade ao ganho de peso observado em humanos com déficits na sinalização D2R do estriado4. No entanto, a vantagem de limitar o acesso à dieta do refeitório apenas para 14 d é que os ratos knockdown com acesso estendido foram o único grupo a mostrar limiares elevados de RRS, e isso nos permitiu avaliar o papel potencial da hipofunção de recompensa no desenvolvimento de compulsivo comer (veja abaixo). Em segundo lugar, os limiares de BSR permaneceram estáveis ​​e inalterados nos ratos knockdown que tinham acesso apenas a ração. Isto indica que a expressão reduzida de D2R no estriado não foi suficiente para induzir hipossensibilidade de recompensa; em vez disso, pareceu interagir com o consumo excessivo de alimentos palatáveis ​​para acelerar o surgimento desse estado de sensibilidade à recompensa reduzida. Outras respostas adaptativas em circuitos de recompensa do cérebro podem, portanto, desencadear hipossensibilidade de recompensa em ratos com acesso prolongado à dieta da cafeteria. Com isso em mente, notamos que a bromocriptina agonista D2R reduz os níveis circulantes de leptina39, e a leptina inibe a alimentação pelo menos em parte pela inibição das regiões estriadas que controlam as respostas hedônicas aos alimentos3, 30, 31. Assim, é possível que a regulação negativa do D2R do estriado em resposta ao aumento do peso corporal aumente a sinalização da leptina e, assim, aumente os efeitos inibidores desta adipocina nos sistemas de recompensa do cérebro. Finalmente, notamos que direcionamos nossos vetores de lentivírus para o estriado dorsolateral. Isso ocorreu principalmente por razões técnicas, pois a colocação lateral de cânulas para a liberação de vírus no estriado também nos permitiu acomodar o eletrodo de estimulação hipotalâmico para determinação do limiar BSR. Assim, é possível que o direcionamento de D2Rs para knockdown em outras áreas do corpo estriado, particularmente as áreas dorsomedial e ventral (núcleus accumbens core e shell), possa ter elevados limiares de BSR mesmo na ausência da dieta palatável.

O estriado dorsolateral tem sido fortemente implicado na aprendizagem do tipo de hábito estímulo-resposta, conforme refletido no desenvolvimento de comportamento consumatório que é insensível à desvalorização por alimentação prévia à saciedade ou por emparelhamento com estímulos nocivos40. Ao visar predominantemente o estriado dorsolateral, poderíamos ter derrubado as populações de D2Rs que regulam a vulnerabilidade do rato ao desenvolvimento de comer compulsivo. De acordo com o papel dos D2Rs estriados em comportamentos compulsivos, o alelo TaqIA do locus do gene DRD2-ANKK1 humano - que resulta em baixa densidade D2R estriatal5, embota a ativação estriatal em resposta à comida palatável4 e aumenta a vulnerabilidade à obesidade4 - também está associado déficits em aprender a evitar ações com consequências negativas41. A perda do controle inibitório sobre o comportamento que pode ter um resultado negativo é uma característica tanto da obesidade quanto da dependência de drogas, em que os comportamentos consumadores persistem apesar das consequências negativas para a saúde, sociais ou financeiras. O comportamento de consumo de cocaína em ratos com histórico de ingestão extensiva de drogas pode se tornar inflexível e resistente à interrupção por um estímulo condicionado aversivo que prediz um resultado negativo (choque nas patas) 18. Da mesma forma, camundongos que já tinham acesso a uma dieta rica em gordura palatável passarão mais tempo em um ambiente aversivo (bem iluminado) para obter a comida palatável do que os ratos que não tiveram experiência com a dieta42. Descobrimos que o consumo de comida palatável em ratos com acesso prolongado à dieta de refeitório era igualmente insensível a um estímulo condicionado aversivo. Consistente com um papel para D2Rs estriatal neste efeito, comer compulsivo foi encontrado em ratos knockdown estriatal D2R que anteriormente tinham acesso estendido de 14 dias à dieta de refeitório, mas não nos grupos de controle. Do ponto de vista do neurocircuito, o acesso estendido a alimentos palatáveis ​​pode desencadear a plasticidade nas vias corticostriatais, tornando os animais mais vulneráveis ​​ao desenvolvimento de comportamentos semelhantes aos compulsivos, com déficits na sinalização D2R estriatal aumentando esse processo. De fato, a redução da densidade D2R estriatal em indivíduos obesos está correlacionada com o metabolismo reduzido em áreas corticais pré-frontais e orbitofrontais43 que exercem controle inibitório sobre o comportamento44.

Notavelmente, o consumo compulsivo de alimentos saborosos foi detectado apenas nos ratos knockdowns que anteriormente tinham acesso estendido à dieta do refeitório, não nos ratos controle que tinham ampliado o acesso à dieta da lanchonete no mesmo período de tempo, nem nos ratos knockdown que tinham acesso apenas para comida. A principal diferença entre os ratos knockdown com acesso estendido anterior e para os outros grupos foi o seu limiar BSR persistentemente elevado. Isso pode refletir origens neurobiológicas comuns da hipofunção da recompensa e o surgimento de uma alimentação compulsiva, que são fenômenos temporalmente coincidentes, embora independentes. Alternativamente, hipofunção de recompensa induzida por dieta pode servir como um substrato para o reforço negativo que facilita o desenvolvimento de compulsivos 14, 32, 33. Quaisquer que sejam os mecanismos subjacentes, nossas descobertas demonstram que respostas compulsivas como vício para alimentos palatáveis ​​podem surgir em ratos obesos e indicam que os déficits na sinalização do D2R estriado aumentam a vulnerabilidade ao desenvolvimento desse comportamento.

Em resumo, descobrimos que a estimulação excessiva dos sistemas de recompensa do cérebro através do consumo excessivo de alimentos palatáveis ​​e densos em energia induz um estado profundo de hipossensibilidade à recompensa e o desenvolvimento de uma alimentação compulsiva. Essas respostas comportamentais desadaptativas em ratos obesos provavelmente surgem de déficits induzidos pela dieta na sinalização D2R estriatal. O consumo excessivo de drogas de abuso diminui de maneira semelhante a densidade do D2R do estriado, induz um estado profundo de hipofunção de recompensa e desencadeia o surgimento de comportamentos compulsivos de consumo de drogas. Nossas descobertas, portanto, apóiam o trabalho anterior, 4, 19, 42, 45, 46 e 47, indicando que a obesidade e a dependência de drogas podem surgir de respostas neuroadaptativas similares nos circuitos de recompensa do cérebro.

De Depósito

Ratos

Ratos Wistar machos pesando 300-350g no inicio dos experimentos foram obtidos de Charles River. À chegada, os ratos foram alojados individualmente a temperatura constante num ciclo de luz-escuridão 12-h (luzes acesas no 2200 h). Permitiu-se aos ratos acesso ad libitum a ração padrão de laboratório e água durante a duração da experiência. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Scripps Florida, e os ratos foram tratados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde com relação aos princípios de cuidado com animais.

Procedimentos cirúrgicos.

Ratos preparados com eletrodos de estimulação BSR foram anestesiados pela primeira vez pela inalação de isoflurano 1-3 em oxigênio e posicionados em um quadro estereotáxico (Kopf). Eletrodos Bipolar BSR (11 mm long) foram implantados no hipotálamo lateral posterior (anteroposterior, −0.5 mm de bregma; mediolateral, ± 1.7 mm da linha média; dorsoventral, 8.3 mm da dura-máter; barra incisiva ajustada para 5 mm acima da linha interaural ) 47. Ratos recebendo injeções de vírus também foram preparados com cânula guia bilateral (23, 14 mm de comprimento) posicionada acima do estriado (anteroposterior, 2.8 mm de bregma; mediolateral, ± 3.1 mm da linha média; dorsoventral, −2.4 mm da dura) 48 e preenchida com estiletes 14-mm. Quatro parafusos de crânio e acrílico dental de aço inoxidável seguravam o eletrodo e as cânulas no lugar. A ferida cirúrgica foi tratada com antibiótico tópico uma vez a cada 12 h para 5 d após a cirurgia. Foi permitido aos ratos que 7-10 d se recuperassem da cirurgia e fossem treinados no procedimento de limiar BSR.

Procedimento BSR.

Os ratos foram treinados para responder à estimulação de BSR de acordo com um procedimento de limiar de corrente de teste discreto semelhante ao descrito em outro local10, 14. Resumidamente, os níveis atuais de BSR foram variados em séries descendentes e ascendentes alternadas em passos de 5-μA. Em cada sessão de testes, quatro séries descendente / ascendente alternadas foram apresentadas. O limiar para cada série foi definido como o ponto médio entre duas intensidades de corrente consecutivas para as quais os ratos responderam em pelo menos três dos cinco ensaios, e duas intensidades de corrente consecutivas para as quais os ratos não responderam em três ou mais dos cinco ensaios. O limite geral da sessão foi definido como a média dos limiares para as quatro séries individuais. Cada sessão de teste foi de aproximadamente 30 min de duração. Limiares BSR estáveis ​​foram definidos como ≤10% de variação nos limiares acima de 5 dias consecutivos, geralmente estabelecidos após 10 – 14 d de treinamento. A latência de resposta para cada sessão de teste foi definida como a latência de resposta média de todos os ensaios durante os quais ocorreu uma resposta positiva.

Embalagem viral e entrega.

O RNA em gancho curto foi distribuído e expresso constitutivamente usando o sistema de vetor pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). As partículas virais foram preparadas de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, células HEK 293FT foram transfectadas com vetor contendo a inserção shRNA (5′-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-3 ′) ou o vetor vazio, mais embalagem ViraPower 72 (Invitrogen) substituída por meio de mistura 24 (Invitrogen) para 76,755 (Invitrogen) substituído. O sobrenadante foi então coletado e concentrado por ultracentrifugação (32 g, rotor Beckman Coulter SW 90 TI, 4 min, 80 ° C) e o título viral foi determinado por classificação de células ativadas por fluorescência de acordo com as instruções do fabricante. O vírus foi aliquotado e armazenado em caixas protegidas da luz a -XNUMX ° C até o uso.

Ratos com limiares BSR estáveis ​​receberam injeções virais bilaterais em três locais no estriado de cada hemisfério cerebral (2 μl por injeção, 1 μl min − 1, 1 min entre injeções, um total de seis injeções por rato). Os ratos foram autorizados a recuperar pelo menos 2-3 d de injeções intraestriatais antes de a avaliação do limiar BSR foi retomada. A avaliação diária do limiar BSR continuou para 33 d após as injeções de vírus para assegurar que o knockdown máximo de D2R no estriado foi alcançado antes de permitir aos ratos o acesso à dieta da cafeteria. Não houve diferenças nos limiares de BSR entre os ratos Lenti-control e Lenti-D2Rsh durante estes 33 d (dados não mostrados).

Imunoblotting.

Os ratos foram mortos aproximadamente 1 h após o acesso regular à dieta da cafeteria e os cérebros foram rapidamente removidos. Cortes de cérebro de ~ 1-2 mm de espessura foram preparados usando uma matriz cerebral coronal (1-mm slice interval; Plastics One) em um bloco de gelo, e perfurocortantes de estriado dorsal (bregma: ~ 2.2 a -0.26 mm) foram tirados. Socos de tecido estriado foram rapidamente coletados, congelados e armazenados a –80 ° C até o uso. As amostras individuais foram descongeladas em gelo e foram reunidas quantidades iguais de tecido estriado com base numa divisão mediana dependente do peso dos grupos de acesso (ratos 7-10 por pool). O tecido foi ressuspenso em 500 mL de tamp RIPA gelado (Thermo Scientific) contendo ortovanadato de sio, inibidores de cocktail de fosfatase 1 e 2 (Sigma-Aldrich), leupeptina e pepstatina antes da homogeneizao. Os lisados ​​de tecido foram fervidos para 10 min em tampão de amostra e carregados em géis de 4% -20% ou 10% de Tris-glicina SDS (Invitrogen). A proteína foi transferida para membranas de nitrocelulose, bloqueada para 1 h em ~ 23-25 ° C (5% de leite seco magro e 0.2% Tween-20 em PBS, pH 7.4) e incubada em anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. Os seguintes anticorpos primários foram diluídos em solução de bloco: monoclonal de rato D2R de rato (Santa Cruz, 1: 100) ou monoclonal de ratinho de p-actina (Santa Cruz, 1: 200). O reagente ECL quimioluminescente foi adicionado após incubação com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (Amersham, 1: 2,000). A forma associada à membrana madura de D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 foi normalizada para um controle de carga de proteína (β-actina; 43 kDa) e quantificada por densitometria usando o software NIH Image J.

Análise imunoquímica.

Os ratos foram anestesiados e transcardialmente perfundidos com 4% paraformaldeído em PBS (pH 7.6). Os cérebros foram removidos, pós-fixados durante a noite e armazenados em sacarose (solução 30% em PBS, pH 7.4) durante pelo menos 72 h. Secções de tecido congelado (30 μm de espessura) foram recolhidas de um micrótomo e bloqueadas (3% BSA, 5% soro normal de cabra e 0.3% Triton X-100 em PBS) para 1 h a ~ 23-25 ° C. Os seguintes anticorpos primários foram adicionados à solução de bloco e incubados durante a noite a 4 ° C: policlonal de galinha para GFP (Abcam, 1: 1,000); monoclonal de coelho para GFAP (Millipore, 1: 1,000); monoclonal de rato para NeuN (Millipore, 1: 1,000). As secções foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente a ~ 23 – 25 ° C: corante anti-frango – 488-nm (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), corante anti-coelho – 594-nm (Invitrogen, 1: 1,000 ) e corante anti-mouse 594-nm (Invitrogen, 1: 1000). As seções foram montadas com mídia de montagem Vectashield contendo DAPI (Vector Labs) e coverlipped. As imagens foram tiradas usando um microscópio de fluorescência Olympus BX61 (objetiva × 2) ou um microscópio confocal Olympus (objetivas × 10 e × 100).

Procedimento de alimentação

Os ratos foram alojados individualmente em papel de cama (almofadas alfa; Shepherd Specialty Papers) para evitar que produtos alimentares sejam sujos com materiais de cama soltos. A dieta da cafeteria consistia em bacon, salsicha, cheesecake, bolo inglês, cobertura e chocolate, que eram pesados ​​individualmente antes de serem disponibilizados aos ratos. Os itens alimentares da dieta da cafeteria foram entregues em pequenos recipientes de metal. Todos os itens alimentares, incluindo ração de laboratório padrão, foram pesados ​​novamente após a conclusão da sessão de alimentação. A ingestão calórica dos vários macronutrientes foi calculada utilizando as informações nutricionais fornecidas pelo fabricante.

Supressão induzida por estímulo do comportamento alimentar.

Os procedimentos de alimentação ocorreram em câmaras operantes com atenuação de som idênticas em dimensões às usadas nos experimentos de BSR. Os ratos foram colocados em uma câmara operante e tiveram acesso à dieta de refeitório ou ração por 30 min. Os produtos alimentícios eram entregues em pequenos recipientes de metal. Todos os alimentos foram pesados ​​antes e após as sessões de alimentação, realizadas durante o período normal de alimentação dos ratos. O consumo de ração foi avaliado pelo consumo de rações de 45 mg com composição idêntica à ração fornecida nas gaiolas dos ratos. Os ratos tiveram então acesso à dieta de refeitório por 30 minutos por dia até que a ingestão estável fosse alcançada (definida como variação <10% na ingestão diária), exigindo 5–7 dias. Após a estabilização da ingestão de comida palatável durante este período da linha de base, os ratos em cada condição de acesso foram alocados em dois grupos: punidos (aqueles que receberam choque nas patas) e não punidos (não receberam choque nas patas). Os ratos foram então submetidos a quatro sessões de condicionamento em dias consecutivos na mesma câmara operante em que tiveram acesso ao alimento palatável. Durante as sessões de condicionamento de 30 min, uma luz indicadora (estímulo condicionado) foi ativada por 10 min, desligada por 10 min e, em seguida, ligada novamente por 10 min. Ratos punidos receberam choque nas patas apenas durante a apresentação da luz indicadora (0.5 mA por 1.0 s; 10 estímulos com intervalos de ~ 1 min). Os ratos impunes foram apresentados com a luz indicadora da mesma maneira, mas sem a aplicação de choque nas patas. No dia do teste, um dia após a sessão de condicionamento final, os ratos dos grupos punidos receberam choque intermitente nas patas (cinco estímulos no total) emparelhado com a ativação da luz indicadora por 5 min. Os ratos impunes foram novamente expostos à luz indicadora na ausência de choque nas patas. Após o período de punição de 5 minutos, todos os ratos tiveram acesso ao alimento palatável por uma sessão de 30 minutos com o estímulo condicionado ativado de forma intermitente (luz indicadora de 10 minutos acesa, luz indicadora de 10 minutos desligada, luz indicadora de 10 minutos acesa).

Análise estatística.

Os limiares de recompensa de linha de base foram definidos como o valor do limiar médio para o 5 d antes do acesso à dieta da cafeteria para cada sujeito. Os limites de recompensa foram expressos como a alteração percentual do valor do limiar da linha de base. Os dados sobre a porcentagem de valores iniciais de limiar de recompensa, ganho de peso, consumo calórico e consumo calórico de gordura foram analisados ​​por análise de variância de dois fatores, com acesso (somente acesso restrito, acesso restrito ou estendido), fonte de calorias ( dieta padrão de ração ou cafeteria), vírus (Lenti-control ou Lenti-D2Rsh) e sugestão (pareados ou não pareados com punição) como fatores entre os sujeitos e tempo como o fator dentro dos sujeitos. Quando apropriado, os efeitos principais nas análises de variância foram posteriormente analisados ​​pelos testes post hoc de Bonferroni. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism.

Referências

Referências

Correspondência para:

· Paul J Kenny ([email protegido])