Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Publicado on-line 2017 May 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Sumário
Objetivos / hipótese
O excesso de gorduras na dieta causa obesidade em humanos e roedores. Estudos recentes em humanos e roedores demonstraram que a dependência de gorduras compartilha um mecanismo comum de dependência de álcool, nicotina e narcóticos em termos de uma disfunção dos sistemas de recompensa do cérebro. Foi destacado que uma dieta rica em gordura (HFD) atenua a sinalização do receptor D2 (D2R) da dopamina no corpo estriado, um regulador essencial do sistema de recompensa do cérebro, resultando em excessos hedônicos. Relatamos anteriormente que o γ-orizanol bio-componente específico do arroz integral atenuou a preferência por uma DHG via controle hipotalâmico. Portanto, exploramos a possibilidade de que o γ-orizanol modulasse o funcionamento do sistema de recompensa do cérebro em camundongos.
De Depósito
Camundongos C57BL / 6J machos alimentados com um HFD foram tratados oralmente com γ-orizanol, e os níveis estriados de moléculas envolvidas na sinalização D2R foram avaliados. O impacto do γ-orizanol na metilação do DNA do promotor D2R e subsequentes mudanças nas preferências por gordura na dieta foi examinado. Além disso, os efeitos de 5-aza-2′-desoxicitidina, um potente inibidor de DNA metiltransferases (DNMTs), na preferência alimentar, na sinalização D2R e nos níveis de DNMTs no estriado foram investigados. Os efeitos inibitórios do γ-orizanol sobre a atividade das DNMTs foram avaliados enzimaticamente in vitro.
Resultados
No estriado de camundongos alimentados com um HFD, a produção de D2Rs foi diminuída através de um aumento na metilação do DNA da região promotora do D2R. A administração oral de γ-orizanol diminuiu a expressão e atividade de DNMTs, restaurando assim o nível de D2Rs no estriado. A inibição farmacológica de DNMTs pela 5-aza-2′-desoxicitidina também melhorou a preferência por gordura na dieta. Consistente com esses achados, ensaios enzimáticos in vitro demonstraram que γ-orizanol inibiu a atividade de DNMTs.
Conclusões / Interpretação
Nós demonstramos que o γ-orizanol melhora a hipermetilação de DNA induzida por HFD da região promotora de D2R no corpo estriado de camundongos. Nosso paradigma experimental destaca o γ-orizanol como uma substância antiobesidade promissora com a propriedade distinta de ser um novo modulador epigenético.
Material suplementar eletrônico
A versão on-line deste artigo (doi: 10.1007 / 00125-017-4305-4) contém material suplementar avaliado por pares, mas não editado, que está disponível para usuários autorizados.
Introdução
Comer em excesso em indivíduos obesos compartilha, pelo menos em parte, mecanismos comuns com dependência de álcool, nicotina e narcóticos [1]. Assim como a regulação hormonal e hipotalâmica do apetite, o sistema de recompensa do cérebro, em particular a sinalização do receptor da dopamina, está intimamente relacionado ao comportamento alimentar viciante ou hedônico [2]. Um estudo anterior em ratos mostrou que o knockdown do receptor D2 dopaminérgico estriado (D2R) por RNA interferente de gancho de cabelo curto mediado por lentivírus rapidamente induziu déficits de recompensa similares ao vício e compulsão por busca de alimentos [3]. Devido à densidade reduzida de D2R, o estriado dorsal é menos responsivo à recompensa alimentar em comparação com grupos de controle enxutos em humanos e roedores obesos [3-5]. De acordo com esta noção, o TaqAlelo IA do ANKK1 o locus gênico (que codifica a repetição DRD2 / anquirina e o domínio quinase contendo 1), que diminui a produção de D2R estriatal, está associado a um fenótipo obeso em humanos [6], enquanto os efeitos da perda de peso após a cirurgia bariátrica estão associados à densidade elevada do D2R no estriado [7]. Estes dados sugerem fortemente a importância do D2R estriatal como um novo alvo terapêutico para o tratamento da obesidade. No entanto, algumas drogas que foram desenvolvidas e agiram no sistema de recompensa cerebral causaram efeitos adversos consideráveis, incluindo sérios problemas psiquiátricos, resultando na sua retirada das clínicas [8].
As modificações epigenéticas são críticas não apenas para o desenvolvimento e a diferenciação, mas também porque surgem como resultado de mudanças ambientais, inclusive na dieta e no estilo de vida [9]. A metilação do DNA é um evento epigenético principal para a estabilidade da expressão gênica [9]. Em ratos, a exposição materna a uma dieta rica em gordura (HFD) intergenericamente altera a metilação do DNA dentro do sistema de recompensa central na prole, levando ao consumo excessivo de HFD pelos filhotes [10]. Em particular, as DNA metiltransferases (DNMTs) desempenham papéis críticos na regulação do comportamento alimentar e da atividade física [10, 11], sugerindo que as DNMTs podem ser alvos terapêuticos promissores para a terapia da síndrome da obesidade-diabetes. É importante ressaltar que algumas substâncias derivadas de alimentos naturais, incluindo ácido cafeico e epigalocatequina, são conhecidas por agirem como inibidores de DNMT [12, 13].
Recentemente, mostramos que o γ-orizanol orgânico, bioativo e específico para o arroz integral, uma mistura de éster de ácido ferúlico e vários fitoesteróis, atenua a preferência por gordura dietética através da diminuição do estresse do retículo endoplasmático (ER) do hipotálamo.14]. Em camundongos e coelhos, o γ-orizanol administrado por via oral foi rapidamente absorvido pelo intestino e distribuído principalmente ao cérebro [15, 16]. Tomando essas descobertas em conjunto, os produtos derivados de alimentos naturais que atuam no sistema nervoso central podem ser uma alternativa para melhorar com segurança o comportamento alimentar prejudicado na obesidade. Neste contexto, testamos a hipótese de que o γ-orizanol alteraria o status de metilação do DNA no sistema de recompensa do cérebro, resultando em uma atenuação da preferência por um HFD em camundongos.
De Depósito
Animais
Camundongos C57BL / 6J machos de sete semanas de idade obtidos de Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japão) foram alojados (3-4 por gaiola) em condições livres de patógenos específicos a 24 ° C sob uma luz de 12 h / 12 h / ciclo escuro. Após uma semana de aclimatação, camundongos de 8 semanas foram pareados por peso e divididos em dois ou três grupos para cada experimento. Os ratos tiveram livre acesso a comida e água. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos com Animais da Universidade de Ryukyus (Nos. 5352, 5718 e 5943).
Administração de γ-orizanol e 5-aza-2′-desoxicitidina
Para avaliar a preferência pelo HFD, o γ-orizanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japão) foi administrado a camundongos 8 com uma semana de idade por gavagem durante o teste de escolha alimentar, como descrito anteriormente [14, 17]. Para as outras experiências, um HFD (D12079B; Research Dietets, New Brunswick, NJ, EUA) contendo 0.4% y-orizanol foi fabricado como pastilhas. Os componentes da dieta são mostrados na tabela de material suplementar eletrônico (ESM) 1. Após 12 semanas de alimentação, o tecido foi coletado do estriado e hipotálamo. A ingestão diária de γ-orizanol, estimada a partir da ingestão alimentar média dos camundongos, foi de aproximadamente 320 μg / g de peso corporal. As doses de γ-orizanol foram determinadas conforme descrito anteriormente [14] A 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) foi injetada intraperitonealmente (0.25 μg / g de peso corporal) três vezes por semana durante 12 semanas [18].
Estimativa de preferência por gordura dietética
Para avaliar as preferências por gordura dietética, os testes de comida forneceram uma escolha entre ração e DH (D12450B e D12451; Dietas de Pesquisa) como descrito anteriormente [14]. Os componentes da dieta são mostrados na tabela ESM 1. Resumidamente, os camundongos tiveram acesso livre a ração e HFD. O consumo de ração e HFD foram medidos semanalmente e analisados para mudanças na preferência por gordura dietética. A preferência de HFD foi calculada de acordo com a fórmula: Preferência de HFD = [(ingestão de HFD / ingestão total de alimentos) × 100].
Sequenciação de bissulfito para metilação do DNA
O DNA foi purificado usando um DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tóquio, Japão). A solução de DNA foi misturada com NaOH 3 mol / l preparado de fresco, incubada a 37 ° C durante 15 min e adicionada a ureia 5.3 mol / l, bissulfito de sódio 1.7 mol / l e hidroquinona 4.9 mmol / l. A solução foi submetida a 15 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 30 se incubação a 50 ° C por 15 min [19]. O DNA tratado com bissulfito foi purificado usando MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) e amplificado por PCR usando um kit KAPA HiStart Uracil + ReadyMix PCR (KAPA Biosystems, Woburn, MA, EUA) e primers ao redor do sítio CpG da região promotora de D2R . As sequências iniciadoras foram as seguintes: iniciador directo, 52-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3; primer reverso, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. Em seguida, as sequências adaptadoras foram adicionadas e limpas usando Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA). As amostras foram então reunidas e carregadas em um GS Junior (Roche Diagnostics, Tóquio, Japão) para sequenciamento de acordo com o protocolo do fabricante. O nível de metilação foi expresso como a porcentagem de citosinas metiladas em todos os resíduos de citosinas.
Ensaio de atividade DNMT
O ensaio de actividade enzimica da DNMT foi realizado utilizando um kit de Ensaio de Inibio / Actividade de Metiltransferase de ADN EpiQuik (Epigentek Group, Brooklyn, NY, EUA) e kit de Ensaio de Metiltransferase EPIgeneous (Cisbio Japan, Chiba, Jap) de acordo com os protocolos do fabricante.
Para avaliar a atividade inibitória de cada composto na metilação do DNA, a formação de S-adenosil-L-homocisteína (SAH) foi medida na presença de cada composto (20 μmol / l para ensaios de triagem), S-adenosil metionina (SAM; 10 μmol / l) e substrato DNMT (4 ng / μl) a 37 ° C por 90 min. Para avaliar a cinética de Michaelis-Menten, DNMT1 (20 μmol / l) foi incubado com γ-orizanol, SAM (5 μmol / l) e a concentração indicada de poli dI-dC a 37 ° C por 90 min. DNMT3a (100 μmol / l) e DNMT3b (100 μmol / l) foram incubados com γ-orizanol, SAM (5 μmol / l) e a concentração indicada de poli dG · dC a 37 ° C por 120 min. Os ensaios foram realizados em quadruplicado. A proteína extraída (0.75 mg / ml) foi incubada com SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml) e poli dG · dC (5 μg / ml) a 40 ° C por 120 min, e A formação de SAH foi medida.
Ensaio de atividade do receptor relacionado ao estrogênio
A potencial atividade antagonista de γ-orizanol no receptor-γ relacionado ao estrogênio (ERRγ) foi avaliada usando o sistema de ensaio Gamma Reporter do receptor relacionado ao estrogênio humano (INDIGO Bioscience, State College, PA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, células repórter de mamífero não humano que expressam constitutivamente ERRγ ativo foram expostas às concentrações indicadas de cada composto por 24 h em triplicado.
Western blotting
Isso foi realizado conforme descrito anteriormente [20] com anticorpos contra D2R (1: 500, coelho), transportador de dopamina (DAT; 1: 500, coelho), tirosina hidroxilase (TH; 1: 1000, coelho) (AB5084P, AB1591P e AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, EUA), transdutor de sinal e ativador da transcrição 3α (STAT3α; 1: 1000, coelho), DNMT1 (1: 1000, coelho), DNMT3a (1: 1000, coelho) (nos. 8768, 5032 e 3598; Cell Signaling Technology, Tóquio, Japão), DNMT3b (1 μg / ml, coelho), ERRγ (1: 1000, coelho) e β-actina (1: 10,000, camundongo) (ab16049, ab128930 e ab6276; Abcam, Cambridge, MA, EUA).
PCR quantitativo em tempo real
A expressão gênica foi examinada como descrito anteriormente [14]. níveis de mRNA foram normalizados para Rn18s (18S rRNA). Os conjuntos de primers utilizados para as análises quantitativas de PCR em tempo real estão resumidos na tabela ESM. 2.
Análise estatística
Os dados são expressos como média ± SEM. ANOVA de uma via e ANOVA de medidas repetidas seguidas de testes de comparação múltipla (método de Bonferroni-Dunn) foram usados quando aplicável. Do aluno t O teste foi utilizado para analisar as diferenças entre os dois grupos. As diferenças foram consideradas significativas p <0.05.
Resultados
Inibição farmacológica de DNMTs por 5-aza-dC atenuou a preferência por gordura dietética em camundongos
Nos camundongos alimentados com a HFD, a metilação do DNA na região promotora do D2R no corpo estriado foi significativamente aumentada em comparação com camundongos alimentados com uma dieta padrão (Fig. (Fig.1a) .1uma). Por outro lado, a metilação do DNA hipotalâmico na região promotora de D2R foi aparentemente maior do que no estriado sob dieta de ração (p <0.01) (Fig. (Fig.1a, 1a, f) e não foi alterada pela DHF (Fig. (Fig.1f) .1f). Em camundongos alimentados com a HFD, a metilação aumentada de DNA na região promotora de D2R no estriado foi normalizada por tratamento com 5-aza-dC, um potente inibidor de DNMT (Fig. (Fig.1a) .1uma). Em contraste, a metilação do DNA na região promotora do D2R no hipotálamo não foi significativamente alterada pelo tratamento com 5-aza-dC (Fig. (Fig.1f) .1f). No estriado de camundongos machos de 20 semanas de idade alimentados com o HFD por 12 semanas, os níveis de mRNA e proteína de D2R foram significativamente diminuídos (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). Em contraste, os níveis de receptores D1 de dopamina (D1Rs, codificados por Drd1), que actuam de um modo oposto aos D2Rs na adenilil ciclase e na sinalizao intracelular mediada por cAMP, permaneceram inalterados (Fig. (Fig.1c) .1c). Além disso, não houve alteração nos níveis de outras moléculas relacionadas com a sinalização D2R, tais como TH e DAT ao nível do ARNm e / ou proteína (Fig. (Fig. 1d, 1d, e, k, m). Por outro lado, não foram observadas alterações aparentes no hipotálamo, incluindo no D2R (Fig. (Fig.1g-m) .1g-m). Notavelmente, os níveis de proteína de D2R e TH no hipotálamo eram muito mais baixos do que aqueles no estriado (Fig. (Fig.1l, 1l, m), possivelmente refletindo a importância relativa da sinalização do receptor de dopamina no sistema de recompensa do cérebro em comparação com o hipotálamo.
Para examinar se a metilação do DNA na região promotora do D2R alteraria a preferência pela gordura na dieta, o comportamento de alimentação dos camundongos tratados com 5-aza-dC foi analisado. Como esperado, 5-aza-dC aumentou significativamente os níveis de mRNA e proteína para D2R no estriado de camundongos alimentados com HFD (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). Por outro lado, não houve efeito nos níveis de Drd1, Th e Slc6a3 (codificação de DAT) no estriado ou nos níveis de Drd2, Drd1, Th e Slc6a3 no hipotálamo (Fig. (Fig.1c-e, 1c – e, g – m). Enquanto os camundongos tratados com veículo preferiram a HFD, a preferência pela HFD foi significativamente menor em camundongos tratados com 5-aza-dC (88% dos valores para camundongos tratados com veículo) (Fig. (Fig.1n) .1n). Consequentemente, o tratamento com 5-aza-dC reduziu o ganho de peso corporal (Fig. (Fig.11o).
γ-orizanol diminui os níveis de DNMTs no estriado de camundongos alimentados com HFD
Como já relatamos anteriormente [14], a administração oral de γ-orizanol a ratos machos por gavagem atenuou significativamente a preferência por uma HFD (93% dos valores para ratinhos tratados com veículo) (Fig. (Fig.2a), 2a), resultando em uma aparente atenuação do ganho de peso corporal (Fig. (Fig.2b) .2b). Portanto, exploramos o impacto potencial do γ-orizanol na modulação epigenética de D2Rs no estriado.
Nos mamíferos, existem três principais DNMTs - DNMT1, 3a e 3b. O DNMT1 funciona para manter a metilação do DNA, enquanto o DNMT3a e o 3b desempenham um papel na facilitação da metilação do DNA de novo [21]. Para explorar o potencial impacto do γ-orizanol em DNMTs in vivo, avaliamos os níveis de DNMTs nos cérebros de camundongos alimentados com HFD. Embora a HFD por si só não tenha efeito sobre os níveis de mRNA e proteína de DNMTs no estriado ou no hipotálamo, a suplementação com γ-orizanol reduziu significativamente os níveis de DNMTs no estriado, mas não no hipotálamo (Fig. (Fig.2c-e, 2c – e, g – i, k – n). Esses dados levantam a possibilidade de que o γ-orizanol possa regular os níveis de DNMTs de maneira específica para o corpo estriado. De maneira similar, 5-aza-dC diminuiu significativamente os níveis de mRNA de DNMT3a e 3b preferencialmente no estriado (ESM Fig. 1de Anúncios).
Com base em um estudo anterior, mostrando que o nível de mRNA de DNMT1 foi positivamente regulado, pelo menos parcialmente, pelo receptor nuclear ERRγ [22], examinamos o potencial efeito do γ-orizanol sobre a atividade do ERRγ. Em células de mamíferos não humanos expressando constitutivamente ERRγ ativo, 4-hidroxi tamoxifeno, um potente agonista inverso de ERRγ, diminuiu acentuadamente a atividade de ERRγ. É de notar que o γ-orizanol diminuiu parcialmente a atividade de ERRγ (uma redução de aproximadamente 40% do valor inato) (Fig. (Fig.3a) .3uma). Importante, ERRγ foi altamente expresso no estriado, mas não no hipotálamo (Fig. (Fig.3b-d) .3b-d). Ao contrário da situação do estriado, o γ-orizanol aumentou significativamente os níveis de proteína de DNMT1 apenas no hipotálamo (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Estes resultados podem ser explicados, pelo menos em parte, pela nossa descoberta de que STAT3α, um regulador positivo do nível DNMT1 [23], foi abundantemente expresso no hipotálamo, mas não no estriado (Fig. (Fig.33por exemplo).
Para avaliar ainda mais o impacto do γ-orizanol sobre a atividade de DNMTs in vivo, a formação de SAH, um subproduto da metilação do DNA e também um potente inibidor de DNMTs, foi avaliada em camundongos tratados com γ-orizanol alimentados com a HFD. Não houve alterações significativas na formação de SAH no estriado ou no hipotálamo entre camundongos alimentados com HFD e alimentados com ração (Fig. (Fig.2f, 2f, j). Notavelmente, o γ-orizanol diminuiu significativamente a formação de SAH no estriado (Fig. (Fig.2f) 2f) mas não no hipotálamo (Fig. (Fig.2j), 2j), sugerindo que o γ-orizanol pode suprimir a atividade de DNMTs de uma maneira específica do estriado em camundongos alimentados com HFD.
Análises enzimáticas sobre propriedades inibitórias de γ-orizanol para DNMTs in vitro
Em seguida, avaliamos o impacto do γ-orizanol sobre a atividade de DNMTs in vitro. As potências inibitórias de γ-orizanol, ácido ferúlico, 5-aza-dC, haloperidol (um antagonista representante de D2R), quinpirole (um agonista representante de D2R) e SAH contra DNMTs foram avaliadas. Como controlo positivo, a HAS atenuou fortemente as actividades de DNMTs de uma maneira dependente da dose (Fig. (Fig.4a-f) .4a – f). Como esperado, haloperidol e quinpirol não mostraram efeito sobre as atividades de DNMTs (ESM Fig. 2). O γ-orizanol inibiu significativamente as atividades do DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) e 3b (inibição máxima de 57%) (Fig. (Fig. 4d-f) .4d – f). Em contraste, a atividade inibitória do ácido ferúlico, um metabólito do γ-orizanol, era muito menor que a do γ-orizanol (Fig. (Fig.44d – f).
Investigamos ainda as propriedades inibitórias do γ-orizanol em DNMTs. A formação de SAH foi medida para avaliar a atividade inibitória de γ-orizanol em DNMTs in vitro. Os dados sobre a formação de SAH durante a metilação do DNA mediada por DNMT indicam um padrão saturável de cinética de Michaelis-Menten para a presença e ausência de γ-orizanol (Fig. (Fig. 4g-i) .4g i). Na metilação do ADN mediada por DNMT1, a análise de Eadie-Hofstee demonstrou que o γ-orizanol não apresentou efeitos na V max de formação de SAH (veículo, 597 pmol / min; γ-orizanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-orizanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), enquanto γ-orizanol aparentemente aumentou o K m (veículo, 0.47 μg / ml; γ-orizanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-orizanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Fig. (Fig.4j) .4j). Estes resultados sugerem que o γ-orizanol inibe DNMT1 pelo menos parcialmente de uma forma competitiva. Por outro lado, para a metilação do ADN mediada por DNMT3a- e 3b, o γ-orizanol diminuiu a V max de formação de SAH (DNMT3a: veículo, 85.3 pmol / min; γ-orizanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-orizanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: veículo, 42.3 pmol / min; γ -orizanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-orizanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) e, da mesma forma, o K m para esta reação (DNMT3a: veículo, 0.0086 μg / ml; γ-orizanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-orizanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: veículo, 0.0122 μg / ml; γ- orizanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-orizanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Fig. (Fig.4k, 4k, l). Estes resultados sugerem que o γ-orizanol inibe DNMT3a e 3b pelo menos parcialmente de uma forma não competitiva.
γ-orizanol aumenta os níveis de D2R no estriado de camundongos alimentados com HFD
Em seguida, testamos a possibilidade de que o γ-orizanol aumentaria o conteúdo de D2R do estriado por meio de uma inibição de DNMTs. Em ratinhos alimentados com HFD, a administração oral de y-orizanol diminuiu significativamente a metilação do ADN do estriado na região promotora dos D2Rs (Fig. (Fig.5a), 5a), enquanto que não fez isso no hipotálamo (Fig. (Fig.5f) .5f). De acordo com estes achados, os níveis de mRNA e proteína de D2R foram aumentados reciprocamente (Fig. (Fig.5b, 5b, g, k, l). Semelhante aos dados do tratamento com 5-aza-dC (Fig. (Fig.1), 1), não houve efeitos aparentes nos níveis de RNA e proteína de Drd1, Th e Slc6a3 (DAT) no corpo estriado e sem efeitos nos níveis de Drd1, Th e Slc6a3 no hipotálamo (Fig. (Fig.5c-e, 5c – e, h – k, m).
Estudos anteriores mostraram que os níveis de D2R e DNMT1 são regulados pelo estresse de ER e inflamação pelo menos parcialmente via NF-κB [17, 24, 25]. Por isso, examinamos os níveis de genes relacionados com o stress e relacionados com inflamação. Como demonstrado anteriormente [26], o HFD aumentou a expressão dos genes que codificam o TNF-α (Tnfa), proteína quimioatrativa de monócitos - 1 (MCP-1) (Ccl2), Proteína homóloga C / EBP (Picar) Localizado no ER DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) e a forma combinada da proteína de ligação X-box 1 (Xbp1s) no hipotálamo, mas não no estriado (Fig. (Fig.6) .6). Notavelmente, a suplementação do HFD com γ-orizanol diminuiu significativamente a expressão aumentada de Ccl2, Picar, Dnajb9 e Xbp1s exclusivamente no hipotálamo, mas não no estriado (Fig. (Fig.66).
Discussão
A principal descoberta no presente estudo é que o γ-orizanol atua como um potente inibidor de DNMT no estriado de camundongos, atenuando, ao menos parcialmente, a preferência por uma HFD através da modulação epigenética do D2R do estriado. No estriado de camundongos alimentados com HFD, os níveis de D2R foram significativamente diminuídos, enquanto que os de D1R, TH e DAT não foram alterados (Fig. (Fig.1b-e, 1b – e, k – m). Estes dados são consistentes com a noção de que a desregulação do D2R estriatal desempenha um papel crítico na percepção de recompensa alimentar quando em um DHA, levando ao consumo excessivo hedônico de DHA em animais obesos [3]. No presente estudo, o tratamento de camundongos alimentados com HFD com 5-aza-dC aumentou significativamente os níveis de D2R do estriado (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l) possivelmente através de uma redução no nível de metilação do DNA na região promotora de D2R (Fig. (Fig.1a), 1a), e conseqüentemente atenuou a preferência por gordura dietética (Fig. (Fig.1n) .1n). Este achado também suporta um papel crítico dos D2Rs estriados na percepção da recompensa alimentar quando em um HFD.
Nosso ensaio in vitro demonstrou que a atividade inibitória do γ-orizanol contra DNMTs era aparentemente mais forte que a do seu metabólito ácido ferúlico (Fig. (Fig. 4d-f), 4d – f), sugerindo a importância da estrutura completa do γ-orizanol para sua ação inibitória sobre DNMTs. Em camundongos alimentados com HFD, nossos estudos sugerem que, após a administração oral, o γ-orizanol alcança o cérebro como uma estrutura completa e diminui os níveis e atividades de DNMTs preferencialmente no estriado, com uma conseqüente diminuição na metilação do DNA na região promotora do D2R no estriado. Além disso, nossos estudos in vitro demonstraram que o γ-orizanol age como um antagonista parcial contra o ERRγ, que serve principalmente como um regulador positivo para a produção de DNMT1 [22], e consequentemente diminuiu a atividade de DNMT1 (Fig. (Fig.3a) .3uma). Digno de nota, ERRγ foi altamente expresso no estriado, mas não no hipotálamo em camundongos (Fig. (Fig.3b) .3b). Estes dados sugerem que o γ-orizanol tem o potencial de diminuir o nível de mRNA de DNMT1, pelo menos em parte, através da inibição de ERRγ. Em contraste com o estriado, o γ-orizanol não apresentou efeito sobre o nível de D2R no hipotálamo de camundongos alimentados com HFD (Fig. (Fig. 5g, 5g, k, l).
Por outro lado, demonstramos que o γ-orizanol aumenta significativamente os níveis de DNMT1 no hipotálamo, mas não no estriado (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Foi demonstrado que o STAT3 aumenta o conteúdo de DNMT1 em células malignas do linfoma T [23]. Notavelmente, nós demonstramos anteriormente que o γ-orizanol aumentou significativamente a fosforilação de STAT3 induzida pela leptina no hipotálamo de camundongos alimentados com HFD [14]. Também deve ser notado que STAT3α foi substancialmente expresso no hipotálamo, mas não no corpo estriado nos camundongos (Fig. (Fig.3e-g) .3por exemplo). Estes dados nos tentam a especular que a diferença aparente no efeito do γ-orizanol sobre os níveis de DNMT1 entre o hipotálamo e o estriado pode ser atribuída, pelo menos parcialmente, ao conteúdo específico da região de STAT3α e ERRγ no cérebro de camundongos ( FIG. (Fig.3b-g) .3b-g). Coletivamente, parece haver um padrão recíproco de expressão de ERRγ e STAT3α entre o corpo estriado e o hipotálamo em camundongos. Com base nos nossos resultados, é portanto razoável especular que no striatum, onde a produção de ERRγ é abundante, o γ-orizanol pode diminuir preferencialmente o nível de mRNA e a actividade enzimática de DNMT1 como um regulador negativo de ERRγ. Em contraste, no hipotálamo, onde a produção de STAT3α é dominante, o γ-orizanol pode preferencialmente aumentar os níveis de DNMT1.
Um estudo recente demonstrou que uma atenuação da sinalização D2R do estriado induzida por um HFD desregula o comportamento alimentar [3], sugerindo a importância potencial da inibição de DNMT estriatais para o tratamento da obesidade. Por outro lado, um estudo anterior demonstrou a possibilidade de que o status da metilação do DNA do gene 4 do receptor de melanocortina expresso em núcleos hipotalâmicos específicos pudesse modular formas transgeracionais de obesidade em camundongos amarelos resistentes à pressão [27]. Embora mais estudos sejam necessários para elucidar os mecanismos subjacentes, esses estudos sugerem a importância da metilação do DNA específica de tecidos, genes e seqüências na fisiopatologia da obesidade induzida pela DH.
Recentemente, relatamos que a HFD aumentou o nível de D2R nas ilhotas pancreáticas de camundongos [17, 24]. É provável que tal aumento seja mediado, pelo menos em parte, pelo estresse de ER e inflamação via NF-κB, porque existem vários elementos responsivos a NF-κB na região promotora de D2R [17, 24]. Além disso, um estudo recente mostrou que o TNF-α e o IL-1β aumentam o nível e a atividade da DNMT1 no tecido adiposo de camundongos alimentados com HFD [25]. É importante ressaltar que o presente estudo demonstrou que a DH induziu estresse e inflamação do RE preferencialmente no hipotálamo, mas não no estriado (Fig. (Fig.6) .6). Mecanismos detalhados de metilação e desmetilação do tecido, região e sítio específicos do DNA em nosso paradigma experimental devem aguardar investigação adicional.
Juntamente com o nosso relatório anterior mostrando que γ-orizanol atenua a preferência por um HFD via regulação hipotalâmica do estresse ER em camundongos [14], o γ-orizanol também representa uma propriedade única de melhorar a desregulação hedônica e metabólica do comportamento alimentar. Porque algumas drogas antiobesidade que foram desenvolvidas são conhecidas por causar efeitos adversos críticos [8], uma abordagem baseada em alimentos naturais para o sistema de recompensa do cérebro está prevista para tratar a síndrome da obesidade-diabetes com segurança [16]. Nesse paradigma, o γ-orizanol é um candidato promissor à antiobesidade, com uma propriedade distinta de ser um modulador epigenético.
Agradecimentos
Somos gratos a S. Okamoto (Universidade do Ryukyus, Japão) pela revisão do manuscrito. Agradecemos a M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato e C. Noguchi (Universidade do Ryukyus, Japão) pela assistência de secretaria.
Abreviaturas
| 5-aza-dC | 5-aza-2′-desoxicitidina |
| D1R | Receptor Dopamine D1 |
| D2R | Receptor Dopamine D2 |
| DAT | Transportador de dopamina |
| DNMT | DNA metiltransferase |
| ER | Retículo endoplasmático |
| ERR | Receptor relacionado ao estrogênio |
| HFD | Dieta rica em gordura |
| SAH | S-Adenosil-l-homocisteína |
| SAM | S-Adenosil metionina |
| STAT3α | Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3α |
| TH | A tirosina hidroxilase |
Notas
Disponibilidade de dados
Conjuntos de dados gerados e / ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis no autor correspondente em solicitações razoáveis.
Métodos
Este trabalho foi apoiado em parte por Bolsas de Ajuda da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS; Números de Doações KAKENHI 15K19520 e 24591338), o Conselho de Ciência, Tecnologia e Inovação (CSTI), Programa de Promoção de Inovação Estratégica Interministerial (SIP) "Tecnologias para a criação de agricultura, silvicultura e pescas da próxima geração", Lotte Foundation, Fundação para a Enzimologia Aplicada, Nova Energia e Organização de Desenvolvimento Tecnológico Industrial (NEDO), o Projeto para a Formação da Rede de Ciências da Vida ) (Prefeitura de Okinawa, Japão) e o Projeto de Promoção de Clustering Médico da Prefeitura de Okinawa, Japão, juntamente com uma concessão da Prefeitura de Okinawa para a promoção de medicina avançada (Prefeitura de Okinawa, Japão).
Dualidade de interesse
Os autores declaram que não há dualidade de interesse associada a este manuscrito.
Declaração de contribuição
CK e HM projetaram a pesquisa. CK e TK realizaram os experimentos e analisaram os dados. TK, CS-O, CT, MT, MM e KA contribuíram para a interpretação dos dados. CK e HM escreveram o manuscrito. Todos os autores contribuíram para a interpretação dos dados. Todos os autores se juntaram na revisão do manuscrito e aprovaram sua versão final. A HM é a fiadora deste trabalho, teve acesso total a todos os dados e assume total responsabilidade pela integridade dos dados e pela precisão da análise de dados.
Notas de rodapé
Material suplementar eletrônico
A versão on-line deste artigo (doi: 10.1007 / 00125-017-4305-4) contém material suplementar avaliado por pares, mas não editado, que está disponível para usuários autorizados.
Referências
;