A insulina ativa os receptores de insulina (InsRs) no hipotálamo para sinalizar a saciedade após uma refeição. No entanto, o aumento da incidência de obesidade, que resulta em níveis de insulina cronicamente elevados, implica que a insulina também pode atuar em centros cerebrais que regulam a motivação e a recompensa. Nós relatamos aqui que a insulina pode amplificar a liberação de dopamina (DA) dependente de potencial de ação no nucleus accumbens (NAc) e caudate-putamen através de um mecanismo indireto que envolve interneurônios estriatérgicos estriatais que expressam InsRs. Além disso, duas manipulações crônicas diferentes de dieta em ratos, restrição alimentar (FR) e uma dieta obesogênica (OB), alteraram a sensibilidade da liberação de DA estriatal à insulina, com maior responsividade em FR, mas perda de responsividade em OB. Estudos comportamentais mostram que os níveis de insulina intacta no invólucro de NAc são necessários para a aquisição da preferência pelo sabor de uma solução de glicose emparelhada. Juntos, esses dados indicam que a sinalização de insulina no estriado aumenta a liberação de DA para influenciar as escolhas alimentares.

Está bem estabelecido que um aumento sustentado da insulina plasmática durante e após uma refeição ativa receptores de insulina (InsRs) no hipotálamo, o que fornece um feedback negativo aos circuitos apetitivos que diminuem ainda mais a ingestão de alimentos.^{1, 2, 3}. A insulina no cérebro é derivada principalmente das células β pancreáticas, com transporte ativo do plasma para o cérebro na barreira hematoencefálica^{4, 5, 6, 7, 8}, embora haja evidências crescentes de síntese e liberação neuronal de insulina, bem^{1, 9}. Notavelmente, a expressão de InsRs não está confinada ao hipotálamo, embora a função dos InsRs extra-hipotalâmicos permaneça sem solução.^{1, 2, 3}. Dada a crescente incidência de obesidade e diabetes tipo II, em que os níveis circulantes de insulina estão perpetuamente elevados e o transporte de insulina no cérebro e a sensibilidade do receptor diminuem^{3, 8, 10, 11}É essencial entender a função da insulina nas regiões cerebrais que regulam a motivação e a recompensa. As regiões do cérebro de interesse particular incluem o nucleus accumbens (NAc), que medeia os efeitos recompensadores de alimentos e drogas.^{12, 13}e o caudate-putamen (CPu), que desempenha um papel em comportamentos baseados em hábitos e desejo¹³. Os InsRs são expressos em todas essas regiões, com a maior densidade ocorrendo no NAc^{3, 14}; Os InsRs também são expressos por neurônios dopaminérgicos (DA) no mesencéfalo, incluindo aqueles na área tegmental ventral (VTA) e substantia nigra pars compacta (SNc)¹⁵. Os níveis de insulina no cérebro são proporcionais às concentrações plasmáticas de insulina e à adiposidade corporal^{6, 7, 8}, levando à hipótese de que a insulina pode atuar em InsRs nessas regiões do cérebro para influenciar a recompensa alimentar^{3, 16, 17}.

Estudos prévios em sinaptossomas estriatais, células heterólogas, cortes cerebrais e in vivo demonstraram que a ativação da insulina de InsRs leva a um aumento na captação de DA pelo transportador DA (DAT)^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Este processo envolve a via de sinalização da PI3 quinase^{19, 20}e resulta na inserção de DAT na membrana plasmática¹⁹. Níveis circulantes de insulina modulam dinamicamente a atividade do DAT do estriado, com diminuição da captação de DA e a expressão da superfície do DAT observada em modelos animais de diabetes e após restrição alimentar (FR)^{20, 21}. Foi demonstrado que os aumentos da atividade da DAT que dependem da insulina diminuem a concentração de DA extracelular evocada ([DA]_o) na VTA²³, refletindo uma mudança no equilíbrio entre a liberação e a aceitação da DA. Consistente com o papel estabelecido da insulina na saciedade, a microinjecção aguda de insulina na VTA pode diminuir a recompensa alimentar^{23, 24}, enquanto camundongos sem InsRs em neurônios VTA e SNc DA mostram maior ingestão de alimentos e se tornam obesos²⁵. Embora a insulina possa induzir depressão de longo prazo da entrada excitatória em neurônios VTA DA²⁴, mais uma vez consistente com um papel na saciedade, a exposição à insulina também pode aumentar a taxa de disparo de neurônios DA, possivelmente diminuindo a liberação de DA e a inibição mediada por autoreceptores²⁵. O efeito líquido da insulina na liberação de DA no estriado é, portanto, difícil de prever. De fato, os resultados de estudos sobre a influência da insulina na liberação de DA no estriado ex vivo fatias¹⁹ e o efeito da microinjecção local de insulina no NAc na recompensa alimentar²⁶ parece ser contraditório. Para resolver isso, avaliamos a liberação e captação de DA axonal no microambiente intacto do NAc e CPu em ex vivo fatias do estriado utilizando voltametria cíclica de varredura rápida (FCV) e determinaram os efeitos da sinalização de insulina no NAc no comportamento de recompensa in vivo.

Nossos estudos mostram que o efeito primário da insulina em NAc e CPu é aumentar a liberação de DA, apesar de um aumento simultâneo na captação de DA. Esta regulação dinâmica da liberação de DA envolve um aumento dependente da insulina na excitabilidade dos interneurônios colinérgicos do estriado (ChIs), o que leva ao aumento da liberação de DA via ativação dos receptores nicotínicos de acetilcolina (ACh) (nAChRs). A influência da insulina nos ChIs e na liberação de DA é mediada por InsRs. Notavelmente, o efeito da insulina na liberação de DA é amplificado em fatias de ratos FR, mas embotados em ratos em uma dieta obesogênica (OB). Estes dados mostram amplificação da liberação DA em ex vivo Fatias de insulina levam à previsão de que a insulina pode atuar como um sinal de recompensa in vivo. De fato, estudos comportamentais paralelos demonstram um papel para a insulina na concha de NAc no condicionamento de preferência de sabor. Juntos, esses achados indicam um novo papel para a insulina como um sinal de recompensa que pode influenciar a escolha de alimentos

Insulina atuando no InsRs aumenta a liberação de DA estriada evocada

Exame inicial de evocado localmente [DA]_o monitorado com FCV em ex vivo fatias estriadas de ratos com ad libitum (AL) o acesso à comida e água revelou a descoberta inesperada de que a aplicação aguda de insulina através de uma gama de concentrações fisiologicamente relevantes^{1, 4} aumento de pulso único evocado [DA]_o (Fig. 1a-c), com insulina CE₅₀ valores (a concentração em que o efeito foi metade do máximo) de 2 – 12 nM (Fig. 1b). Aumento evocado [DA]_o foi particularmente surpreendente, dado que isso foi acompanhado por um aumento significativo na taxa máxima (V_max) para a absorção mediada por DAT em cada sub-região (tabela 1), o que levaria a uma diminuição concorrente no evocado [DA]_o, conforme relatado anteriormente^{22, 23}. Em vez disso, descobrimos que evoked [DA]_o foi amplificado ao máximo 20-55% pela insulina 30 nM; a região com maior efeito proporcional foi a concha de NAc, que é a sub-região do estriado com maior expressão de InsR^{1, 14}. As fatias expostas à insulina 30 nM em condições idênticas não mostraram alterações no conteúdo do DA estriado (Complementar Fig. 1a), implicando que a insulina altera a regulação da liberação dinâmica, ao invés de simplesmente regular a síntese de DA. Notavelmente, o efeito da insulina no evocado [DA]_o foi perdida em concentrações suprafisiológicas ≥100 nM (Fig. 1b). Este não foi o resultado de um aumento na liberação de atividade de DAT, já que o efeito da V_max também foi perdido nestas concentrações (tabela 1). No geral, esses dados mostram que, no microambiente estriado íntegro, o efeito predominante da insulina sobre o evocado [DA]_o é aumentar a liberação, apesar de um aumento simultâneo na captação de DA.

  

  

(a) Média evocada por pulso único [DA]_o na camada de NAc, núcleo NAc e CPu antes e depois da insulina (Ins) ilustrada para 30 nM; barras de erro omitidas, mas veja (b); setas indicam tempo de estímulo. Insulina aumentada evocada [DA]_o em casca (por 55 ± 10%), núcleo (por 37 ± 5%) e CPu (por 20 ± 4%) (***P<0.001). (b) O efeito da insulina foi dependente da concentração em toda a gama fisiológica (1 – 30 nM) na casca (n= 22 – 24, F_5,133= 14.471, P<0.001), núcleo (n= 36 – 76, F_5,308= 16.318, P<0.001) e CPu (n= 30 – 62, F_5,253= 13.763, P<0.001), mas perdeu em ≥100 nM. (c) Registros representativos de pico evocado [DA]_o versus tempo em um único local no núcleo de NAc na ausência de aplicação de droga (Con), durante aplicação de insulina (30 nM) ou quando insulina foi aplicada na presença de um inibidor de InsR HNMPA (5 μM). (dPico evocado médio [DA]_o dados que mostram a prevenção do efeito da insulina (30 nM) pelo HNMPA, o antagonista do InsR S961 (1 μM) e o inibidor PI3K LY294002 (1 μM), mas não pelo inibidor do IGF-1R PPP (1 μM) (n= 29 – 76; P> 0.9 versus insulina sozinha). Para Fig. 1a-d, n= número de locais por sub-região de ratos 3 – 6 para cada medicamento ou concentração de insulina; one-way ANOVA, teste de significância honesto de Tukey (HSD). Vejo Complementar Fig. 1b, c para dados de shell e CPu do NAc.

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Porque a insulina também pode atuar em receptores 1 do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1Rs), embora em concentrações excedendo 100 nM (ref. 1), procuramos confirmar que o efeito potenciador da insulina no evocado [DA]_o foi InsR dependente. Este provou ser o caso, pois o efeito foi prevenido por um inibidor intracelular de InsR, ácido hidroxi- 2-naftalenilmetilfosfônico (HNMPA), e por um antagonista InsR, S961, mas não por um inibidor seletivo de IGF-1Rs, picropodofilina.²⁴ (PPP; Fig. 1c, d e Complementar Fig. 1b, c). Em seguida, examinamos o envolvimento da PI3 quinase, que inicia a via de sinalização responsável pela regulação do DAT dependente de insulina.¹⁹. A uma concentração de 1 μM, o inibidor de P13K LY249002 sozinho não teve efeito sobre o pico evocado [DA]_o or V_max (n= Locais 29-76 (núcleo NAc) por droga, P> 0.05, análise de variância unilateral (ANOVA); dados não mostrados), mas evitou o efeito da insulina na [DA] evocada_o em todas as sub-regiões do corpo estriado (Fig. 1d e Complementar Fig. 1b, c).

Localização de InsRs em axons DA e ChIs

O aumento observado em V_max para a captação de DA com níveis fisiológicos de insulina implica a presença de InsRs nos axônios DA, assim como resultados anteriores em várias preparações do estriado^{18, 19, 20, 21, 22}. Embora a expressão funcional de InsRs em neurônios DA do mesencéfalo tenha sido demonstrada^{15, 23, 24, 25}, InsR expressão em axônios DA estriatais não foi relatada. Nós abordamos isso usando imuno-histoquímica. A imunorreatividade do InsR denso ao longo do estriado limitou a avaliação quantitativa da localização InsR nos axônios DA, que foram identificados por imunorreatividade para uma enzima sintetizadora DA, a tirosina hidroxilase (TH). Por isso, adotamos um protocolo previamente relatado²⁷, que envolveu a contagem de InsR puncta que se sobrepunham com perfis TH + na visualização de imagem normal e contando novamente após a imagem InsR ser girada apenas por 90 °. Se a sobreposição aparente dos perfis InsR e TH + não for específica, este procedimento deverá fornecer contagens estatisticamente semelhantes, quer sejam normais ou 90 ° desfasadas. No entanto, esta análise mostrou uma diminuição na sobreposição de InsR puncta com perfis TH + de 14 ± 9% (n= Campos 42, P<0.01, par de duas caudas t-teste; dados não mostrados), confirmando a presença de InsR nos axônios DA. Mais intrigantemente, no entanto, a inseminação do estriado pelo InsR revelou expressão InsR distinta em grandes corpos celulares que foram identificados como ChIs do estriado por co-immunolabelling para colina acetiltransferase (ChAT), a enzima primária necessária para a síntese de ACh. Usando critérios eletrofisiológicos²⁸ para identificar ChIs em estudos preliminares de registro de células completas, vários neurônios foram preenchidos com biocitina e processados ​​para imunohistoquímica; todos estes (4 / 4) foram imunopositivos para InsR e ChAT (Fig. 2a). A avaliação subseqüente da co-localização de InsR e ChAT no NAc confirmou que praticamente todos os neurônios ChAT + expressaram InsR (96%; n= Neurônios 27 / 28 em quatro seções de dois ratos).

  

  

(a) ChI preenchido com biocitina, depois imunocolorizado para ChAT e InsR (representante de ChN preenchidos com 4 / 4 com biocitina); imagem mesclada mostra co-localização; barra de escala, 10 μm. (b-e) Resposta dos ChIs do estriado a uma série de impulsos de corrente de despolarização (3-s duration; 200, 300 e 400 pA; intervalos 120-s) antes e depois da insulina (30 nM). (b) A adaptação de freqüência de pico em um ChI (superior) é vista na descarga de perda de potencial de ação (AP) durante a injeção de corrente, enquanto que o pico persiste ao longo do pulso de corrente em insulina (inferior); conjunto completo de dados mostrado em d. (c) Tempo representativo do aumento do número de AP induzido por insulina com cada passo atual para o ChI em b. (d) Resumo do número de AP durante os impulsos de corrente administrados antes e no efeito máximo da exposição à insulina (n= Estimulações pareadas 21, neurônios 7, ratos 5) (e) Respostas médias mostrando o efeito da insulina (+ Ins) sob condições de controle (Con; n= 21 estímulos pareados, neurônios 7, ***P<0.001, par de duas caudas t-test), na presença de HNMPA (5 μM) (n= Estimulações pareadas 12, neurônios 4, ratos 4, P>0.05, emparelhado com duas caudas t-test) e na presença de PPP (1 μM) (n= Estimulações pareadas 18, neurônios 6, ratos 6 **P<0.01, par de Wilcoxon emparelhado com teste de classificação assinada). (f) Média evocada por pulso único [DA]_o no núcleo NAc antes e depois da insulina (30 nM) em mecamilamina (Mec; 5 μM) ou DHβE (1 μM) normalizada para 100% pico de controle (n= Sites 20 – 40 por sub-região por condição de ratos 3 – 4, P> 0.05 versus controle, não emparelhado t-teste). (g) Média evocada por pulso único [DA]_o em fatias do prosencéfalo do controle heterozigoto (Het) e Bate-papo Camundongos KO antes e depois da insulina (30 nM), normalizados para 100% pico de controle. Insulina aumentada evocada [DA]_o em camundongos heterozigotos por 190 ± 23% em concha de NAc, 140 ± 8% em Núcleo NAc e 137 ± 12% em CPu (n= Sites 15 – 25 por sub-região de camundongos 3 – 4 por genótipo, **P<0.01, ***P<0.001 versus controle não pareado t-test), mas não teve efeito sobre o evocado [DA]_o em qualquer sub-região do estriado de Bate-papo Ratos KO (P> 0.1).

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Insulina aumenta a excitabilidade do ChI

Para testar a funcionalidade dos InsRs em ChIs do estriado, examinamos o efeito da insulina na excitabilidade de ChI usando o registro de clampagem de corrente de célula inteira. A excitabilidade de ChI foi avaliada usando uma série de pulsos de corrente despolarizante de 3-s para induzir um trem de potenciais de ação que exibissem com confiabilidade a adaptação de freqüência de pico (Fig. 2b), muitas vezes com perda de spiking até o final do pulso atual. Surpreendentemente, a insulina (30 nM) atenuou a adaptação da freqüência de pico, resultando em um aumento progressivo no número de potencial de ação ao longo do tempo (Fig. 2c), com um aumento máximo (Fig. 2d, e) tipicamente observada entre 20 e 50 min de exposição à insulina. Na ausência de insulina, os ChIs de controle não mostraram mudança no número de potenciais de ação evocados (P> 0.05, par de duas caudas t-teste; dados não mostrados); quando comparados com os neurônios de controle monitorados no mesmo intervalo de tempo, os neurônios expostos à insulina mostraram uma mudança significativamente maior no número de potenciais de ação evocados (controle n= Pares de estímulo 12 de quatro neurônios, insulina n= Pares de estímulo 21 de sete neurônios, F_1,25= 5.63, P<0.05, ANOVA de dois fatores de medidas mistas; dados não mostrados). O efeito da insulina no aumento do número do potencial de ação foi prevenido por HNMPA, mas não pelo inibidor seletivo de IGF-1R PPP (Fig. 2e), demonstrando que o aumento da excitabilidade do ChI pela insulina foi mediada pelo InsR.

Melhoria da insulina do evocado [DA]_o requer nAChRs e ACh

Estudos anteriores mostraram que ChIs e ACh regulam potentemente a liberação de DA estriatária via nAChRs em axônios DA^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. A abundante expressão do InsR nos ChIs e o aumento da excitabilidade do ChI observado com a exposição aguda à insulina sugeriram que esses neurônios podem ser novos alvos para a insulina, o que poderia levar a uma liberação aumentada de DA. Para testar isso, examinamos o efeito da insulina na presença de mecamilamina, um antagonista não seletivo de nAChR, ou diidro-β-eritroidina (DHβE), um antagonista seletivo para nAChRs contendo subunidades β2 (β2 *) que são enriquecidos em Axônios DA³⁵. Evocado [DA]_o foi prontamente detectada na presença desses antagonistas, apesar de ambos os fármacos terem diminuído a amplitude dos [EV] evocados por pulso único_o (por exemplo, por 13-26% no núcleo NAc), conforme relatado anteriormente^{29, 30, 31, 32}. Em apoio a um papel para ACh e nAChRs, o efeito da insulina no evocado [DA]_o foi prevenida por mecamilamina ou DHβE (Fig. 2f). Para confirmar o envolvimento da sinalização do estriado na liberação de DA, nós examinamos o efeito da insulina em ex vivo cortes estriatais de camundongos nos quais a expressão de ChAT foi geneticamente ablacionada em estruturas do prosencéfalo (prosencéfalo Bate-papo Ratos KO), incluindo striatum³². Embora os ChIs estejam intactos nesses camundongos, a síntese de ACh é abolida, o que leva à diminuição, mas ainda prontamente detectável, de um único pulso evocado [DA]_o, conforme descrito anteriormente³². Em casais heterozigotos de controle, insulina (30 nM) aumentou evocada [DA]_o no shell e no núcleo do NAc e no CPu por 37-90% (Fig. 2g), excedendo a amplificação observada no estriado de ratos (por exemplo, FIG. 1). No entanto, o efeito da insulina no evocado [DA]_o estava ausente em todo o complexo estriado em prosencéfalo Bate-papo Camundongos KO, demonstrando que o aumento da liberação DA mediado pela insulina requer ACHD do estriado, mas não transmissores co-liberados de ChIs, como o glutamato³⁶.

A influência da insulina no evocado [DA]_o é dependente de dieta

As concentrações de insulina no plasma e no cérebro são proporcionais à adiposidade corporal^{6, 7, 8}e pode levar a mudanças compensatórias na sensibilidade do cérebro à insulina. Portanto, testamos a hipótese de que a dieta influencia a capacidade da insulina de promover a liberação de DA, usando fatias de estriado de ratos mantidos em uma dieta FR ou OB crônica versus controles de AL. Como esperado, os níveis plasmáticos de insulina foram correlacionados com o peso corporal, com menor insulina na FR do que nos ratos AL ou OB (Fig. 3a e tabela 2). Apesar dessas diferenças na insulina circulante, o pico evocado [DA]_o no casco e no núcleo de NAc, e CPu foi significativamente menor ex vivo fatias estriadas de ambos os grupos de dieta em comparação com AL (Fig. 3b e Complementar Fig. 2 a, b), implicando que fatores além da insulina governam o evocado absoluto [DA]_o. O conteúdo de DA no estriado não diferiu entre os grupos de dieta, indicando uma alteração na regulação da liberação, e não na síntese de DA (Figura Complementar 2c). Consistente com uma mudança na regulação dinâmica, a sensibilidade da liberação da DA estriatal à insulina foi marcadamente dependente da dieta. Em ratos FR, concentrações de insulina ≤1 nM, que não tiveram efeito na AL (Fig. 1b), aumento evocado [DA]_o (Fig. 3c), refletindo o aumento da sensibilidade à insulina, com EC₅₀ valores no estriado FR (0.4 – 0.6 nM) que eram aproximadamente uma ordem de magnitude mais baixa que em AL (compare Figos 1b e 3c). Em contraste marcante, o efeito da insulina foi perdido no estriado OB; insulina 30 nM, que teve um efeito máximo no estriado AL (Fig. 1b), não teve efeito no OB (Fig. 3c).

  

  

(a) A concentração plasmática de insulina está positivamente correlacionada com o peso corporal nos grupos de alimentação (R= 0.76). (b) Média evocada por pulso único [DA]_o no núcleo NAc (ver Complementar Fig. 2a, b para shell NAc e CPu) foi menor em FR (38 ± 4%) e OB (25 ± 4%) versus AL (n= Locais 50 – 60 de ratos 5 – 6 por grupo de dieta, F_2,156= 23.337, one-way ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB versus FR (P<0.08). (c) Sensibilidade do evocado [DA]_o insulina foi aumentada em FR, mas perdeu em OB (n= Locais 21-49 por sub-região por concentração de ratos 2-4 por grupo de dieta, ANOVA unidirecional, HSD de Tukey, com maior sensibilidade em ratos FR versus AL em todas as sub-regiões (P<0.001 para cada região; ANOVA de duas vias; CPU: F_{(conc × diet; 3,286)}= 10.253; testemunho: F_{(conc × diet; 3,353)}= 6.166; Concha: F_{(conc × diet; 3,195)}= 10.735).

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Esses dados implicam uma relação inversa entre a sensibilidade do InsR do estriado e a adiposidade corporal. Alternativamente, no entanto, essas diferenças dependentes da dieta podem refletir a sensibilidade nAChR alterada. Portanto, determinamos a resposta de concentração à nicotina no núcleo NAc de cada grupo de dieta. A nicotina causa dessensibilização nAChR, que pode ser quantificada comparando-se a razão de [DA]_o evocado por um breve trem de cinco pulsos em 100 Hz para um pulso evocado [DA]_o (5 p: relação 1 p) como um índice de ativação / dessensibilização nAChR^{30, 31}. Usando esta abordagem, não encontramos diferenças entre os grupos de dieta na sensibilidade nAChR no núcleo NAc (Complementar Fig. 3a – c). Além disso, a relação controle 5 p: 1 p não diferiu entre os grupos de dieta no núcleo NAc (Complementar Fig. 3d) ou CPu (não ilustrado), implicando que a dieta não altera a regulação da liberação de DA dependente de nAChR. Assim, a sensibilidade do InsR do estriado parece ser aumentada em ratos FR versus AL, mas ausente em ratos OB, com perda de regulação da liberação de DA estriado em concentrações fisiológicas de insulina.

A insulina da casca NAc modula a preferência do sabor condicionado

As preferências alimentares são geradas por fatores pré e pós-ingestão; os mecanismos para cada um não são completamente resolvidos, mas evidências atuais implicam na sinalização NAc DA em ambos^{37, 38}. Dado que os níveis de insulina no plasma e no líquido cefalorraquidiano (CSF) aumentam rapidamente após a elevação da glicose periférica⁶, e que um aumento na insulina no estriado pode ser detectado dentro de 5 min de elevação de insulina no plasma⁷É lógico supor que a liberação periférica de insulina durante uma refeição pode aumentar a liberação do NAc DA e contribuir para mecanismos de recompensa pós-ingestão. Nós adaptamos um protocolo de preferência de sabor previamente descrito³⁷ com soluções de glicose adoçadas com sacarina em ratos para testar a hipótese de que o bloqueio do efeito da insulina endógena através da aplicação local de um anticorpo de insulina (InsAb) no NAc diminuiria a preferência pelo sabor emparelhado. A eficácia do InsAB no bloqueio dos efeitos da insulina foi testada numa in vitro ensaio de captação de DA em sinaptossomas estriados. A insulina (30 nM) causou um aumento significativo V_max em sinaptossomas de NAc ou CPu (Figura Complementar 4), consistente com o nosso V_max dados de fatias do estriado (tabela 1) e com estudos anteriores^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Na ausência de insulina, nem o InsAb nem o anticorpo de controlo imunoglobulina G (IgG) alteraram a V_max para captação de DA versus controle. Na presença de IgG, a insulina ainda causou um aumento significativo V_max; no entanto, o efeito da insulina sobre V_max foi perdida na presença de InsAB (Figura Complementar 4).

Para minimizar o dano tecidual e preservar a sensibilidade do alvo tecidual, dois grupos de indivíduos foram testados, nos quais alternamos a microinjeção intra-NAc com um procedimento de microinjecção simulada, em vez de usar um único grupo de pacientes e emparelhar uma solução com sabor com InsAb e outro veículo. Consequentemente, durante as sessões de condicionamento de um frasco, o grupo experimental recebeu microinjeções InsAb emparelhadas com um dos dois sabores e, em sessões alternadas, microinjeções simuladas combinadas com o outro sabor (Fig. 4a, esquerda). O grupo controle recebeu microinjeções simuladas alternadas com microinjeções de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou IgG. Ambas as soluções aromatizadas continham glicose durante o condicionamento. Nenhuma preferência diferencial entre os sabores era esperada no grupo controle-microinjetado, enquanto a preferência era esperada para mudar para o sabor emparelhado microinjeção simulada no grupo micro-injectado InsAb.

  

  

(a) Diagrama ilustrando o condicionamento de uma garrafa (esquerda) e o teste de duas garrafas (direita). (b) Volume consumido (ml) durante as sessões de condicionamento de uma garrafa. Houve interação significativa entre a sessão de condicionamento de infusão e o tratamento com microinjeçãon= Ratos 19 – 20 por grupo, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, ANOVA mista 2 × 4 com medidas repetidas na sessão de condicionamento de infusão). A microinjeção de InsAb diminuiu significativamente o consumo em comparação com o controle durante a terceira (t(40) = 3.026, **P<0.01) e quarto (t(40) = 3.052, **P<0.01, unilateral protegido t-testes) infusões. Injeções simuladas não tiveram efeito sobre o consumo em nenhum dos grupos (F_3,111= ANOVA mista 1.110, 2 × 4 com medidas repetidas na sessão simulada de condicionamento). (c) Volume consumido durante o teste de preferência de sabor de duas garrafas. Houve uma interação significativa entre o tratamento com sabor e microinjeção durante o condicionamento (F_1,37= 5.36, P<0.05, ANOVA mista de duas vias com medidas repetidas de sabor). O grupo InsAb consumiu significativamente menos do sabor emparelhado com InsAb em comparação com o sabor emparelhado simulado (t(18) = 2.82, ** P<0.01, unilateral protegido t-teste); o grupo controle não mostrou preferência pelo sabor (t(19) = 0.803, P> 0.05, protegido t-teste). Comparando os grupos, os ratos InsAb beberam significativamente menos do sabor emparelhado por infusão (t(40) = 1.96, *P<0.05) e significativamente mais do sabor emparelhado simulado (t(40) = 1.77, *P<0.05, unilateral protegido t-teste) do que controles.

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Durante as sessões de condicionamento de um frasco, a microinjeção InsAb diminuiu significativamente o consumo em comparação com o veículo durante a terceira e quarta infusões (Fig. 4b). Em contraste, ambos os grupos consumiram o mesmo volume de solução durante as quatro sessões de injeção simulada (F_3,111= 0.127, P>0.05, ANOVA de duas vias mistas) (Fig. 4b). Após um total de oito sessões de condicionamento, a preferência de sabor foi avaliada em um teste de duas garrafas, no qual os ratos tiveram acesso a ambas as soluções aromatizadas simultaneamente (Fig. 4a). A análise estatística revelou uma interação significativa entre o sabor e o tratamento com microinjeção recebido durante o condicionamento (Fig. 4c). O grupo InsAb consumiu significativamente menos do sabor emparelhado com o InsAb em comparação com o sabor pareado simulado (Fig. 4c), enquanto que o grupo de veículos não revelou preferências de sabor (Fig. 4c), implicando que a sinalização intacta da insulina contribuiu para a seleção de uma solução calórica doce. Em comparação com o veículo, os ratos microinjetados com InsAb beberam significativamente menos do sabor de emparelhamento por infusão e significativamente mais do sabor emparelhado por injeção simulada (Fig. 4c). Microinjeção de IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, protegido t-testes) ou PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, protegido t-testes) não teve nenhum efeito na preferência de sabor (dados não mostrados), argumentando contra a possibilidade de que um efeito não-específico da microinjeção do InsAb diminuísse o consumo ou preferência de sabor. Também deve ser notado que a preferência do grupo InsAB no teste não é uma preferência pelo sabor menos novo, já que não houve interação entre a sessão e o tipo de sessão (infusão real versus infusão simulada) para o grupo InsAB (F_3,54= 1.584, P> 0.05, ANOVA de dois fatores). Ou seja, o grupo InsAb não consumiu mais do sabor pareado com infusão simulada em relação ao sabor pareado com infusão InsAb; em vez disso, as diferenças entre os grupos de tratamento só surgiram durante as sessões de condicionamento de infusão. No geral, esses dados indicam que a insulina no NAc desempenha um papel no reforço da preferência por um sabor que sinaliza uma carga glicêmica.

Relatamos aqui que a insulina amplifica a liberação de DA estriatal de maneira dependente de nAChR, modulando a excitabilidade de ChI via InsRs. Nossos resultados sugerem que a insulina pode servir como um sinal de recompensa, além de seu papel estabelecido na sinalização da saciedade. Notavelmente, o efeito da insulina na liberação de DA é modulado pela dieta, com sensibilidade marcadamente aumentada à insulina após FR, mas uma perda completa da regulação aumentada de insulina em uma dieta de OB. Essas alterações parecem refletir mudanças na sensibilidade do InsR que estão inversamente relacionadas aos níveis circulantes de insulina, uma vez que os níveis plasmáticos de insulina mostraram-se dependentes da dieta, mas a sensibilidade do nAChR não foi. Finalmente, nossos estudos de preferência de sabor em animais comportados implicam que a sinalização de insulina na concha NAc influencia a preferência alimentar, o que não apenas implica a insulina na aprendizagem relacionada ao alimento, mas também confirma seu papel como um sinal de recompensa.

Net [DA]_o reflete o equilíbrio entre o lançamento de DA e a captação de DA por meio do DAT. Evidência anterior mostrando que a insulina pode regular a atividade do DAT^{18, 19, 20, 21, 22, 23} levou à previsão de que um aumento na insulina deveria causar uma diminuição líquida no evocado [DA]_o via aumento da captação de DA. No entanto, descobrimos que no estriado, o efeito da insulina é mais complexo do que isso. Embora a exposição à insulina tenha aumentado V_max para o DAT, o efeito primário da insulina foi na liberação de DA, não na captação de DA, com um aumento consistente no evocado [DA]_o através de uma gama fisiológica de concentrações de insulina na camada e núcleo de NAc e na CPu. Embora o aumento no evocado [DA]_o voltou a controlar os níveis em uma concentração suprafisiológica de 100 nM, V_max também ficou inalterado em relação ao controle, eliminando um efeito predominante no DAT como explicação. Em vez disso, a perda do efeito na captação bem como na liberação implica a dessensibilização dos InsRs ou a regulação negativa das vias de sinalização a jusante em altas concentrações de insulina. De fato, os InsRs sofrem endocitose e degradação rápidas após a ligação da insulina nos tecidos periféricos¹, com evidências emergentes de perda de sensibilidade do InsR neuronal após a exposição a curto prazo a altos níveis de insulina ou dietas de alto teor calórico^{10, 11, 39}.

O efeito dominante da insulina para melhorar a liberação de DA no estriado, aqui reportado, contrasta com os resultados de outros dois recentes ex vivo estudos de fatia. No primeiro, a insulina causou uma diminuição no estouro eletricamente evocado de [³H] DA a partir de fatias do estriado, embora aumentada [³H] DA foi detectado quando o DAT foi inibido²². Dado que liberado [³O H] DA deve escapar da absorção mediada pelo DAT através do tecido a ser detectado na solução de superfusão, este protocolo é especialmente sensível à regulação do DAT. Nossos resultados mostrando que a insulina aumenta a liberação de DA via ChIs e a ativação de nAChR, além de aumentar a captação mediada por DAT, explicariam o aumento aparentemente paradoxal do aumento de insulina [³H] DA overflow visto quando efeitos concorrentes no DAT foram bloqueados²². O segundo estudo utilizou FCV para detecção direta de liberação de AD somatodendrítico na VTA, mas também encontrou um efeito predominante da insulina na captação de DA, refletido na diminuição evocada [DA]_o (ref. 23). Diferenças em vários fatores, desde microcircuitos locais até mecanismos de liberação de DA somatodendrítica versus axonal⁴⁰, poderia contribuir para essa diferença regional. Como discutido mais adiante, entretanto, os papéis regionais dependentes da insulina provavelmente serão complementares, e não contraditórios.

Anteriormente, qualquer papel da regulação dependente de insulina da sinalização DA era assumido como sendo mediada pela ativação direta de InsRs nos neurônios DA. Mostramos aqui que os InsRs também são expressos em ChIs do estriado e que a insulina modula a excitabilidade de ChI para amplificar a liberação de DA no estriado, que pode desempenhar um papel fundamental na influência da insulina na dieta. Os ChIs do estriado recebem projeções de neurônios dos núcleos intralaminares do tálamo, que exibem disparo contínuo em resposta a estímulos sensoriais salientes e ajudam a impulsionar padrões de pico de pausa-pausa nos ChIs que são importantes para direcionar a atenção, o reforço e o aprendizado associativo⁴¹. Portanto, a ação da insulina nos InsRs em ChI do estriatal pode aumentar o efeito dos estímulos sensoriais dos alimentos na responsividade do estriatal à descarga talâmica, contribuindo para aumentar a percepção do valor de recompensa de uma refeição ingerida. A promoção direta da liberação do DA do estriado pela ativação do ChI levou à sugestão de que os fatores que estimulam os ChIs terão um papel privilegiado como gatilhos de liberação do DA³³. Nossos dados fornecem a primeira evidência de apoio para isso, com a excitabilidade ChI intensificada com insulina e a sinalização de ACh impulsionando aumentos dinâmicos na liberação de DA.

A liberação elevada de DA na presença de insulina também argumenta contra um aumento na sinalização de ACh em uma extensão que causa a dessensibilização de nAChR ou ativação de receptor de ACh muscarínico (mAChR), qualquer um dos quais pode suprimir [DA] de pulso único_o (refs 29, 30, 31, 42). Assim, os mecanismos aqui relatados são distintos da ativação da ACh dos mAChRs, que tem sido associada à aversão e à saciedade⁴³.

Pulso evocado [DA]_o foi menor em ratos FR e OB do que em ratos AL; embora estes resultados estejam em consonância com relatórios anteriores^{44, 45, 46}, nossos estudos fornecem a primeira comparação sistemática de três sub-regiões estriatais nos dois grupos de dietas durante um período de tempo constante. Os mecanismos subjacentes às mudanças dependentes da dieta na liberação de DA não foram elucidados e estão além do escopo dos estudos atuais. No entanto, dado que os níveis de insulina no plasma são alterados de forma oposta pelas dietas FR e OB, é improvável que a diminuição evocada [DA]_o em ambos os grupos é uma consequência dos níveis de insulina dependentes da dieta.

Por outro lado, mudanças na sensibilidade InsR com dieta e consequentes níveis de insulina plasmática dependentes da dieta fornecem a explicação mais provável para o aumento da sensibilidade à insulina em FR e perda de resposta à insulina em OB. Não houve evidência para a explicação alternativa da sensibilidade nAChR alterada em ratos FR ou OB versus AL. Embora nossos achados estejam entre os primeiros a indicar aumento da sensibilidade do InsR do estriado com FR¹⁸, a perda de peso pode ser acompanhada pela diminuição dos níveis de insulina no LCR⁷, o que contribuiria para melhorar a sensibilidade da liberação de DA à insulina em FR. Por outro lado, a perda de resposta à insulina em ratos OB é consistente com evidências anteriores de diminuição da sensibilidade InsR cerebral induzida por ganho de peso ou dietas OB^{3, 10, 11}.

Os nossos ex vivo dados de fatia apoiam a hipótese de que a insulina pode sinalizar recompensa, bem como saciedade. Nós testamos essa hipótese bloqueando o efeito da insulina endógena com a microinjeção bilateral InsAb na concha NAc durante o condicionamento de preferência de sabor. Consistente com um papel na recompensa, o bloqueio do efeito da insulina diminuiu a preferência pelo sabor de uma solução contendo glicose pareada versus o sabor associado à sinalização de insulina intacta. Bloqueio de insulina na concha NAc também diminuiu o consumo de uma solução emparelhada durante o condicionamento de uma garrafa, enquanto que microinjeções simuladas ou de controle não tiveram efeito sobre o consumo. Estes dados sugerem que a insulina na concha NAc desempenha um papel na preferência alimentar. Estudos anteriores mostraram que a sinalização DA intacta na NAc é necessária para a aquisição de condicionamento de sabor^{37, 38}, confirmando o papel do NAc DA na mediação dos efeitos reforçadores das soluções nutritivas. Diante disso, a preferência pela solução de glicose emparelhada com a disponibilidade de insulina intacta argumenta contra um efeito primário da insulina sobre a captação de DA mediada por DAT na camada de NAc, já que isso poderia diminuir [DA]_o e, portanto, diminuir o consumo do sabor pareado de controle. Nossos resultados também são consistentes com os de um estudo anterior no qual a microinjeção de insulina na concha de NAc aumentou o tempo em que os animais se envolveram na autoadministração oral de sacarose, com um aumento limítrofe no consumo de sacarose.²⁶, que foi o oposto da consequência esperada de aumento da captação de DA. No geral, esses dados comportamentais são consistentes com a influência prevista da insulina nos ChIs do corpo estriado e com o aumento da liberação de DA. No entanto, esses resultados não excluem o envolvimento de outros elementos dos microcircuitos estriados nos comportamentos monitorados, dada a ampla disseminação da InsR ao longo do estriado.^{1, 14}.

Os estudos relatados aqui fornecem a primeira evidência de que a insulina desempenha um papel na comunicação do valor calórico e, portanto, dos efeitos recompensadores de uma refeição, o que tem implicações importantes para a influência da insulina em indivíduos com baixo peso e obesidade. Vários estudos indicam que os efeitos pós-ingestivos dos alimentos, independentemente de as vias de transdução de sabor estarem intactas⁴⁷, aumentar a liberação do NAc DA e o reforço positivo do comportamento^{37, 47}. Assim, a resposta insulínica pós-absortiva pode codificar o rendimento glicêmico de uma refeição e contribuir para o reforço das preferências e comportamentos alimentares que possibilitam o consumo. No entanto, mudanças extremas nos níveis circulantes de insulina e na sensibilidade central do InsR podem ter um papel no comportamento anormal e adaptativo. Por exemplo, a hipoinsulinemia e a regulação positiva compensatória da sensibilidade do InsR em indivíduos FR podem ser um fator em sua disposição para compulsão alimentar.⁴⁸. Por outro lado, a insensibilidade à insulina central na diabetes tipo II ou obesidade, espelhada aqui em ratos OB, poderia contribuir para uma menor sensação de recompensa após a ingestão, levando a ingestão de alimentos com alto índice glicêmico como compensação^{49, 50}. Portanto, um aumento ou uma diminuição na sensibilidade à insulina estriatal poderia contribuir para a alimentação patológica, resultando em compulsão alimentar e / ou obesidade.

No geral, nossas descobertas revelam um novo papel para a insulina como um sinal de recompensa. Tal papel contrasta com sua função conhecida como um sinal de saciedade, incluindo descobertas recentes de que a insulina microinjetada na VTA pode diminuir a alimentação hedônica e a preferência por sinais associados à recompensa alimentar^{23, 24}. Isso levanta a questão de como papéis aparentemente opostos para a insulina nessas funções dependentes da DA podem ser reconciliados. A resposta pode ser que esses efeitos são complementares e não contraditórios. Os presentes resultados indicam que a insulina no estriado comunica o valor de recompensa de uma refeição ingerida. Um duplo papel na sinalização da saciedade pode simplesmente permitir que a insulina sirva ao importante propósito de terminar uma refeição, ao mesmo tempo em que estabelece uma memória de suas qualidades nutricionais e, portanto, recompensadoras, reforçando assim a repetição do comportamento ingestivo.

Manipulação de animais

Os procedimentos em animais estavam de acordo com as diretrizes do NIH e aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados com Animais da Faculdade de Medicina da NYU. Todos os animais estavam no ciclo 12 h light: dark, com luzes ligadas de 06: 00 para 18: 00; ex vivo fatias foram preparadas entre 08: 00 e 12: 00. Estudos mecanísticos em ratos AL e camundongos foram conduzidos em ex vivo fatias de animais alojados em pares, enquanto ratos foram alojados individualmente para todas as comparaes de grupos de dieta e para estudos comportamentais.

Regimes de dieta de ratos

Ratos Sprague – Dawley machos adultos (Taconic) tiveram 8 – 10 semanas de idade no início de regimes alimentares com duração de 21 – 30 dias. Os ratos foram distribuídos de forma semi-aleatória para os grupos de dieta: os indivíduos foram classificados por peso inicial, depois cada trio sucessivo de ratos foi distribuído aleatoriamente entre os grupos de dieta. Os ratos AL tiveram livre acesso à ração para ratos pelo mesmo período que os ratos pareados nas dietas FR ou OB. Todos os ratos tiveram acesso livre a água. A restrição alimentar foi implementada como anteriormente⁵¹; brevemente, os ratos receberam 40-50% de ingestão de AL da ração padrão para ratos diariamente até que o peso corporal foi reduzido em 20%, após o qual os alimentos foram titulados para manter este peso. Os ratos OB tiveram livre acesso a ração de rato e chocolate. Garantir um líquido altamente palatável com gordura moderadamente alta e açúcar⁵².

Antebraço Bate-papo camundongos knockout

Camundongos com um alelo floxeado condicional Bate-papo (Bate-papo^flox) foram cruzados com Nkx2.1^Cre linhagem transgênica para produzir camundongos nos quais a ablação da síntese de ACh é restrita ao prosencéfalo³². Os ninhadas transgênicas não mutantes foram controles; seus genótipos Cre⁺;Bate-papo^{flox / +} e Cre^-;Bate-papo^{flox / flox} são referidos como "heterozigotos". Camundongos machos adultos utilizados para estudos de ad libitum acesso a comida e água.

Ex vivo preparação de fatias e soluções fisiológicas

Ratos ou ratos foram profundamente anestesiados com 50 mg kg^-1 pentobarbital (intraperitoneal (ip)) e decapitado. Para voltametria, cortes do prosencéfalo coronal (300-400-μm de espessura) foram cortados em micrótomo de lâmina vibratória Leica VT1200S (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) em CSF artificial tamponado com HEPES (aCSF) contendo gelo (em mM): NaCl (120); NaHCO₃ (20); glucose (10); Ï¿½ido HEPES (6.7); KCl (5); Sal de sódio HEPES (3.3); CaCl₂ (2); e MgSO₄ (2), equilibrado com 95% O₂/ 5% CO₂. As fatias foram então mantidas nesta solução à temperatura ambiente para 1 h antes da experimentação^{30, 32, 53}. Para eletrofisiologia, após anestesia, os ratos foram perfundidos transcardialmente com solução gelada contendo (em mM): sacarose (225); KCl (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); NaH₂PO₄ (1.25); glucose (7); ascorbato (1); e piruvato (3), e equilibrado com 95% O₂/ 5% CO₂. As fatias foram cortadas nesta solução, depois transferidas para uma câmara de recuperação em aCSF modificado contendo (em mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); glucose (25); ascorbato (1); piruvato (3); e mio-inositol (4), equilibrado com 95% O₂/ 5% CO₂; esta solução foi inicialmente a 34 ° C, depois deixada a arrefecer gradualmente até à temperatura ambiente⁵⁴. Todos os experimentos de voltametria e fisiologia foram conduzidos em uma câmara de submersão a 32 ° C, que foi superfusada em 1.5 ml min.^-1 com aCSF contendo (em mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); e glucose (10) e albumina sérica bovina (BSA, 0.05-0.1 mg ml^-1) equilibrado com 95% O₂/ 5% CO₂; as fatias foram deixadas equilibrar neste ambiente por 30 min antes da experimentação.

Voltametria cíclica de varredura rápida

Estudos evocados de liberação de DA foram realizados utilizando o FCV em fatias do cérebro^{32, 53} preparado a partir de ratos machos ou Bate-papo camundongos knockout para o prosencéfalo e controles heterozigotos (semanas 5 – 8). Estudos em Bate-papo camundongos knockout foram cegados, mas os grupos de dieta de ratos tinham fenótipos óbvios que impediam o cegamento. As medições voltamétricas foram feitas com um voltímetro Millar (disponível por solicitação especial ao Dr. Julian Miller em St. Bartholomew's e na Royal London School of Medicine and Dentistry, Universidade de Londres). Uma forma de onda triangular convencional foi usada para FCV, com um intervalo de varredura de −0.7 para + 1.3 V (versus Ag / AgCl), taxa de varredura de 800 V s^-1e intervalo de amostragem de 100 ms^{30, 32, 53}. Os dados foram adquiridos utilizando uma placa DigiData 1200B A / D controlada pelo software Clampex 7.0 (Molecular Devices). A liberação de DA foi evocada usando um eletrodo estimulante concêntrico; A amplitude do impulso de impulso foi 0.4-0.6 mA e a duração foi de 100 μs^{30, 32, 53}. Estimulação local de pulso único foi usada no núcleo NAc e CPu; no entanto, um breve trem de pulsos de alta frequência (cinco pulsos a 100 Hz) foi usado para amplificar [DA] evocado._o na concha de NAc. Ambos os paradigmas de estímulo evocam liberação DA que é potencial de ação e Ca²⁺ dependente, não afetado pelo glutamato lançado simultaneamente e GABA^{42, 55}e facilitado pelo lançamento simultâneo de ACh^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Para quantificar evocado [DA]_o, os eletrodos foram calibrados com concentrações conhecidas de DA a 32 ° C após cada experimento em aCSF e na presença de cada droga usada durante uma dada experiência⁵³.

Experimentos voltamétricos para avaliar o efeito da insulina no evocado [DA]_o foram obtidos usando um dos dois protocolos. Experimentos iniciais para determinar o curso de tempo para o efeito da insulina (Sigma, I5523) foram realizados por monitoramento evocado [DA]_o cada 5 min em um único site. Insulina foi aplicada após consistência evocada [DA]_o foi obtida (tipicamente medições 4-5); o efeito da insulina foi máximo após 50-60 min e, em seguida, evocado [DA]_o permaneceu neste nível durante a duração da experiência (tipicamente 90 min total de exposição à insulina; Fig. 1c). Posteriormente, o efeito da insulina foi avaliado pelo registro evocado [DA]_o em 4-5 locais discretos em fatias (+ 1.5 mm de bregma) em cada uma das três sub-regiões do corpo estriado sob condições de controle (aCSF ou aCSF mais droga) e novamente no momento do efeito máximo de insulina (amostragem sobre 60-80 min) estas amostras foram calculadas em média para cada sub-região. O efeito da insulina diminuiu com o tempo após a preparação da fatia; para minimizar o tempo ex vivo e para otimizar o uso de animais, tipicamente, duas fatias de um dado animal foram testadas na câmara de gravação ao mesmo tempo. Os fármacos usados ​​para desafiar o efeito da insulina foram aplicados 15 min antes da insulina através da superfusão de aCSF, incluindo o éster trisacetoximetílico HNMPA (HNMPA-AM_3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodofilotoxina (PPP; Tocris), mecamilamina (Tocris) e DHβE (Tocris). Conforme descrito em Resultados, a possível sensibilidade alterada dos receptores nicotínicos de ACh entre os grupos de dieta foi testada comparando-se a relação entre pico [DA]_o evocado por 5 p (100 Hz) com aquele evocado por 1 p evocado (relação 5 p: 1 p)^{30, 31} no núcleo de NAc na presença de 0 – 500 nM nicotina (Sigma).

Determinação de V _max de evocado [DA]_o transientes em fatias do estriado

Para avaliar as alterações induzidas pela insulina na captação de DA mediada por DAT, a porção inicial da fase de queda do evocado [DA]_o curvas foi ajustado para a equação de Michaelis-Menten para extrair V_max (máxima taxa de absorção constante)⁵⁶. K_m (que está inversamente relacionado à afinidade do DAT por DA) foi fixado em 0.2 μM e é conhecido por ser semelhante entre as sub-regiões do estriado⁵⁷ e não afetado pela insulina (ver Figura Complementar 4 rubrica).

Gravação de célula inteira

Prepararam-se fatias de cebro de ratos machos 29- para 35 com um dia de idade; as condições de gravação foram idênticas àquelas usadas nos estudos de liberação de DA. Gravações de braçadeira de corrente de célula inteira usaram métodos convencionais⁵⁴. Os ChIs do estriado foram visualizados usando um microscópio Olympus BX51WI (Olympus America, Center Valley, PA) com lentes de contraste infravermelho-diferencial de infravermelho e uma objetiva de imersão em água × 40. A solução de pipeta continha (em mM): K-gluconato (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl₂ (2); EGTA (1); N / D₂-ATP (2); N / D₃-GTP (0.3); e ajustado para pH 7.2 – 7.3 com KOH. Para os neurônios gravados serem avaliados quanto à imunorreatividade do ChAT, 0.3% de biocitina foi incluída na solução da pipeta e os neurônios foram gravados brevemente (~ 5 min) para minimizar a diluição do conteúdo intracelular. A resistência da pipeta era ~ 3 – 5 MΩ. As gravações foram obtidas usando um amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale CA) e filtro low-pass a 2 kHz. Os ChIs foram identificados por critérios eletrofisiológicos estabelecidos²⁸; a maioria era tonicamente ativa inicialmente, mas a atividade diminuía de forma variável após a aplicação do adesivo. No entanto, a capacidade de resposta à injeção atual foi geralmente robusta e consistente ao longo do tempo e, portanto, foi usada para investigar o efeito da insulina na excitabilidade do ChI (ver Resultados). Em experimentos para examinar o papel de InsRs e IGF-1Rs nesta resposta, HNMPA ou PPP foi aplicado por pelo menos 20 min antes que um ChI fosse corrigido. Os efeitos máximos da insulina isoladamente foram tipicamente observados após ~ 16 min de exposição, embora em algumas células, o aumento não fosse máximo até 50 min ou mais. Além disso, em quatro dos seis neurônios registrados em PPP, a insulina causou uma diminuição inicial no número da espiga antes de recuperar e exceder o número inicial de espículas. Consequentemente, em todas as experiências, o efeito da insulina foi quantificado comparando o efeito máximo no número da espícula com o número de espículas evocadas imediatamente antes da aplicação da insulina. A diferença aparente no tempo para atingir o efeito de pico pode refletir vários fatores, incluindo a profundidade da célula gravada na fatia. Potenciais de ação evocados também foram registrados em ChIs na ausência de insulina em momentos comparáveis.

Cromatografia líquida de alto desempenho

O teor de DA das fatias de estriado de ratos (400-μm de espessura) foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica⁵⁸. Os pares de fatias foram equilibrados para 30 min a 32 ° C em aCSF, e então uma fatia por par foi incubada por mais 60 min a 32 ° C em aCSF enquanto a outra foi incubada em aCSF com 10 ou 30 nM insulina. Para as comparações entre grupos de dieta, o tecido estriado foi coletado entre 30-60 min pós-recuperação. Após a incubação, o excesso de aCSF foi cuidadosamente removido das fatias, uma amostra de tecido estriado (7-10 mg) foi pesada, congelada em gelo seco e depois armazenada em seguida armazenada a −80 ° C. No dia da análise, as amostras foram sonicadas em gelo, eluente, desoxigenadas com argônio⁵⁸fiado em microcentrífuga para 2 min e o sobrenadante injetado diretamente na coluna de HPLC (BAS, West Lafayette, IN); o detector era um eletrodo de carbono vítreo ajustado em 0.7 V versus Ag / AgCl.

Imunohistoquímica

Para marcação imuno-histoquímica, os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg kg^-1, ip), perfundido transcardialmente com PBS (154 mM NaCl em tampão de fosfato 10 mM, pH 7.2) seguido de 4% paraformaldeído neste PBS; os cérebros foram removidos e secções coronais (20 μm) foram cortadas e processadas convencionalmente^{27, 59}. Imagens de imunofluorescência foram obtidas com um microscópio confocal Nikon PM 800 equipado com uma câmera digital controlada pelo software Spot (Diagnostic Instruments Inc.) e usando uma objetiva × 100 (abertura numérica = 1.4) ou com um microscópio confocal Zeiss LSM 510 usando um 63 × objetivo (abertura numérica = 1.2). Os lasers foram Argônio (488 nm), He / Ne (543 nm) e He / Ne (633 nm). Filtros apropriados para cada laser foram selecionados pelo software de microscópio confocal. O tamanho do orifício variou com o objetivo usado e a espessura da seção selecionada zgeração de pilhas; Escolhemos o valor ideal indicado pelo software (normalmente 30 μm). Os arquivos digitais foram analisados ​​com software de deconvolução (AutoQuant Imaging), com imagens finais processadas no Adobe Photoshop 7.0. Todas as imagens foram ajustadas para brilho e contraste; tais ajustes foram feitos uniformemente em todas as partes da imagem. Os axônios DA estriatais foram identificados usando dois anticorpos TH: policlonal AB152 coelho anti-TH (1: 800) e monoclonal MAB318 anti-TH de camundongo (1: 500) (ambos da Chemicon). Foram utilizados três anticorpos InsR: sc-57342 e sc-09 (1: 100; Santa Cruz) e PP5 (um presente da Pfizer). A especificidade de cada um foi demonstrada anteriormente^{60, 61}e foi confirmado nos presentes estudos pela ausência de imunocoloração com os anticorpos sc-57342 ou PP5 na presença do péptido de bloqueio correspondente. O anticorpo ChAT era AB144 (1: 200; Millipore) e a biotina era Vector (1: 200). Os anticorpos secund�ios utilizados foram Alexa 488 de burro anti-coelho (Invitrogen) ou Cy2 de burro anti-coelho (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), burro anti-cabra Cy3 (Jackson) e anti-murganho Cy5 (Jackson).

Para avaliar a co-localização de InsRs em axônios TH +, usamos métodos descritos anteriormente para identificar a presença de Kir6.2, a subunidade formadora de poros de K sensível a ATP.⁺ canais em axônios DA²⁷. Os puncta representando os InsRs foram distribuídos em todas as imagens ajustadas, indicando que a sobreposição com a imunorreatividade do TH pode ocorrer em algum grau por acaso. Para testar essa hipótese, contamos sobreposições do InsR / TH em campos independentes de 42 em três seções com marcação imunológica de NAc de dois ratos. Os arquivos digitais InsR foram então girados 90 ° no sentido horário e as contagens repetidas; A rotação diminuiu o número de pontos do InsR que co-localizaram com TH na maioria dos campos (veja Resultados). A diminuição do número de superposições com rotação²⁷ indicaram a proporção de InsR puncta em cada campo estriado associado aos axônios DA.

Glicose no sangue e insulina ELISA

Tronco sangue foi coletado no momento da decapitação para estudos de fatia. A glicose no sangue foi determinada imediatamente com um monitor padrão de glicose no sangue. Para insulina, sangue adicional foi coletado em tubos contendo EDTA e centrifugado em 1,500g para 15 min; O sobrenadante (plasma) foi coletado e armazenado a −80 ° C até o processamento com um kit ELPCO Rat Insulin ELISA.

Colocação da cânula e verificação histológica

Quarenta e um ratos Sprague-Dawley machos adultos (Taconic e Charles River) pesando inicialmente 350-425 g foram anestesiados com cetamina (100 mg kg^-1, ip) e xilazina (10 mg kg^-1, ip) e implantados estereotaxicamente com duas cânulas guia cronicamente fixas (calibre 26) colocadas bilateralmente 2.0 mm dorsais aos locais de infusão na concha medial NAc⁶² (1.6 mm anterior ao bregma; 2.1 mm lateral à sutura sagital, pontas anguladas 8 ° em direção à linha média, 5.8 mm ventral à superfície do crânio). Os ratos receberam banamina (2.0 mg kg^-1, subcutânea) como analgésico pós-cirúrgico após recuperação da anestesia e na manhã seguinte. Uma semana após a cirurgia, os ratos foram colocados em FR (descrito acima) e mantidos a 80% do seu peso de recuperação pós-cirúrgico durante o restante do estudo. A colocação da cânula foi determinada histologicamente após a conclusão do teste comportamental. Cada rato foi morto com CO₂, decapitado e o cérebro removido e fixado em formalina tamponada a 10% por> 48 h. Seções coronais congeladas (espessura de 40 µm) foram cortadas em um criostato Reichert-Jung, descongeladas em lâminas de vidro revestidas com gelatina e coradas com violeta cresil. Os dados de um determinado rato foram usados ​​apenas se ambas as cânulas estivessem dentro do escudo NAc medial⁶² (incluindo a borda do tubérculo da casca / núcleo ou concha / olfato) (Figura Complementar 5); com base nesses critérios, dois ratos foram excluídos da análise final.

Pré-exposição ao condicionamento de preferências de sabor

Os ratos receberam uma noite (em casa gaiola) e seis 30-min-por-dia sessões de pré-exposição (em câmaras de ensaio) para 0.2% sacarina de sódio (Sigma) em água com um intervalo 48-h entre as sessões. Os ratos receberam então duas sessões de 5-min por dia de exposição a 0.2% de sacarina sódica em 0.05% de Kool-Aid (Kraft Foods) de uva sem açúcar ou de cereja em água. Para a primeira sessão de pré-exposição do Kool-Aid, metade dos ratos recebeu uma solução com sabor de cereja, e a outra metade recebeu uma solução com sabor de uva. Os sabores foram revertidos na segunda sessão de pré-exposição do Kool-Aid para garantir que todos os ratos amostrassem cada sabor. A ingestão foi medida para todas as sessões de pré-exposição. Câmaras de teste eram gaiolas de plástico transparentes com cama nova. Para todas as sessões de pré-exposição, os ratos tiveram acesso à mesma solução em ambos os lados da câmara. Com exceção da sessão de pré-exposição noturna, todas as sessões foram conduzidas em uma sala de procedimentos comportamentais, com um período de habituação 30-min antes de qualquer treinamento ou teste.

Condicionamento de uma garrafa

Estudos anteriores mostraram que a microinjeção do InsAb no hipotálamo ventromedial pode bloquear o efeito da insulina no comportamento alimentar e na secreção de glucagon^{63, 64}. Aqui usamos essa abordagem para avaliar um possível papel da insulina no reforço da escolha alimentar. Os ratos foram distribuídos de forma semi-aleatória com base no volume médio de ingestão pré-exposição em dois grupos, controle ou experimental (InsAb). No grupo de controlo, os ratos receberam veículo (microinjecção PBS; 137 mM NaCl e 2.7 mM KCl em tampão fosfato 10 mM) ou IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl^-1 em PBS, como foi recebido) microinjeção na concha de NAc antes de consumir uma das duas soluções com sabor, e uma microinjeção simulada antes de consumir a outra solução com sabor. No grupo experimental, os ratos receberam microinjeção da camada de NAC do InsAb (Abcam ab46707; 0.5 μl de 1 μg μl^-1 em PBS, conforme recebido) antes da exposição a uma solução com sabor, e uma simulação de microinjeção antes da exposição ao outro. Dois conjuntos de indivíduos com alternância entre microinjeção de fluido e microinjeção simulada foram usados, de modo que o número total de microinjeções foi limitado a quatro, minimizando assim possíveis danos nos tecidos e perda de sensibilidade no local da microinjeção⁶⁵. Para microinjeção de fluido, solução de controle ou InsAb foi carregada em dois comprimentos 30-cm de tubulação PE-50 presos em uma extremidade a 5 μl seringas Hamilton preenchidas com água destilada e na outra extremidade à cânula injetora de calibre 31, que estendeu 2.0 mm além dos guias implantados. Os volumes de infusão de 0.5 μl foram entregues em 90 s a uma taxa de 0.005 μl s^-1; o injetor foi deixado no lugar para ~ 60 s para permitir tempo para difusão, então o injetor foi substituído pelo estilete.

Os ratos foram transferidos directamente para as câmaras comportamentais dentro de 2 min da conclusão da microinjecção ou microinjecção simulada. As soluções de condicionamento continham 0.2% sacarina sódica, 0.05% uva sem açúcar ou Kool-Aid de cereja e 0.8% glicose. O acesso da solução foi limitado a 30 min por sessão. O sabor emparelhado e o lado da câmara com acesso para beber foram distribuídos de forma semi-aleatória e contrabalançados em cada grupo. O intervalo entre as microinjeções foi de pelo menos 72 h, alternando entre as sessões de infusão e simulada para um total de oito sessões de condicionamento.

Teste de preferência de duas garrafas

Quarenta e oito horas após a última sessão de condicionamento, os ratos foram colocados em câmaras de teste com acesso simultâneo a ambos os sabores condicionantes; soluções foram 0.2% sacarina de sódio em 0.05% uva ou Kool-Aid de cereja, sem glicose. Os testes ocorreram ao longo de 2 dias (60 min por dia). A posição do tubo de bebida contendo solução emparelhada simulada ou emparelhada por infusão foi alternada para assegurar que cada rato foi testado quanto ao consumo de cada solução em ambos os lados da gaiola. A ingestão de cada solução aromatizada foi calculada pela média dos dois dias de teste para determinar a preferência.

[³H] DA em sinaptossomas estriatais para avaliar a eficácia do InsAB

Sinaptossomas estriatais^{21, 66} foram preparados a partir de ratos AL (machos, 350-400g), com NAc (casca e core) e CPu dissecados e preparados separadamente. O tecido de cada região foi homogeneizado em volumes 15 de uma solução de sacarose 0.32 M gelada num homogeneizador de vidro com um almofariz de Teflon motorizado; após a lavagem e centrifugação, o sedimento final foi ressuspenso em 0.32 M sacarose gelada^{21, 66}. Antes de iniciar o [³Ensaio de captação H] DA⁶⁶alíquotas sinaptossómicas num volume total de 180 μl de tampão de captação foram incubadas num agitador para 15 min a 30 ° C na presença ou ausência de insulina 30 nM, em veículo (PBS) ou em InsAb (diluição final 1: 500) , em IgG (diluição final 1: 500) ou em veículo. Tampão de absorção contido (em mM): NaCl (122); N / D₂HPO₄ (3); NaH₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); glucose (10), CaCl₂ (1); nialamida (0.01); tropolona (0.1); e ácido ascórbico (0.001), pH 7.4. Captação de [³H] DA foi iniciado distribuindo rapidamente 20 μl de cada suspensão sinaptosomal para as placas 96-poço com concentrações variáveis ​​de DA (0.003-1.0 μM) e [³H] DA (5 nM); após 5 min num agitador a 25 ° C, a absorção foi terminada por filtração a vácuo rápida e a frio⁶⁶. As contagens por poço foram convertidas em pmoles e depois corrigidas para mg de proteína total por minuto. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e repetidos pelo menos quatro vezes; V_max e K_m foram calculados usando o software Biosoft Kell Radlig (Cambridge, UK).

Análise estatística

Os dados são dados como médias ± sem; a significância foi avaliada usando Student's pareados ou não t-testes ou ANOVA, a menos que indicado de outra forma. Para dados de voltametria, n é o número de locais de registro, dado que a variabilidade de site para site dentro de uma sub-região do estriatal é maior do que a variabilidade inter-animal ou inter-slice^{30, 32, 55, 56}; o número de animais é anotado para cada conjunto de dados. O CE₅₀ para o efeito da insulina e nicotina no pico evocado [DA]_o foi calculado utilizando Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Para dados eletrofisiológicos, a significância estatística foi avaliada por meio de t-testes ou um teste de Wilcoxon em Prism 6.0, ou uma ANOVA mista de duas vias em SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Para avaliação do envolvimento de insulina no condicionamento de preferência de sabor, dois estudos completos foram completados usando protocolos que eram idênticos com a exceção do tratamento de veículo usado. No primeiro estudo, os ratos 10 receberam infusões de veículo de PBS e 9 recebeu infusões de InsAB. No segundo estudo, os ratos 10 receberam infusões de veículo de IgG e 10 recebeu infusões de InsAB. Não houve diferença significativa entre os dois grupos de veículos (PBS ou IgG) durante as sessões de condicionamento da infusão (F₁₉= 0.619, ANOVA de duas vias mistas) com medidas repetidas na sessão de condicionamento da infusão) ou no teste (F₁₉= 0.012, ANOVA misturada de duas vias com medidas repetidas no sabor). Consequentemente, os dois experimentos foram combinados para análise. Para esta análise, uma ANOVA mista 2 × 4 (com medidas repetidas no dia de condicionamento da infusão) foi usada para determinar os efeitos do tratamento com microinjeção durante o condicionamento, seguido por t-testes (uma cauda para determinar em quais sessões de condicionamento o tratamento com microinjeção diminuiu o volume de ingestão). A mesma análise foi concluída para sessões simuladas de condicionamento. Para determinar o efeito do tratamento de condicionamento durante um teste de preferência de sabor de duas garrafas, os dados foram analisados ​​usando uma ANOVA mista de duas vias (com medidas repetidas de sabor), seguida por t-tests (uma cauda para testar a hipótese de que o InsAb diminuiria a preferência).

Como citar este artigo: Stouffer, MA et al. A insulina aumenta a liberação de dopamina no estriado pela ativação de interneurônios colinérgicos e, assim, sinaliza recompensa. Nat. comum. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

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Estes estudos foram apoiados pelo NIH concede DA033811 (MER, KDC e MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) e um NARSAD Independent Investigator Award (KDC). S961 foi um presente generoso do Dr. Lauge Schaffer, Novo Nordisk. O anticorpo PP5 foi um presente generoso da Pfizer. Agradecemos ao Dr. Charles Nicholson, da Faculdade de Medicina da NYU pelo software para extrair V_max valores de dados FCV.