PLoS One. 2011; 6(9): e24992.
Albino J. Oliveira-Maia,1,*¤a¤b Craig D. Roberts,1 P. David Walker,2 Brooke Luo,1 Cynthia Kuhn,2 Sidney A. Simon,1,3,5 e Miguel AL Nicolelis1,3,4,5,6
Sumário
O consumo de açúcares contendo calorias provoca respostas comportamentais apetitivas e liberação de dopamina no estriado ventral, mesmo na ausência de maquinaria de transdução do sabor doce. No entanto, não está claro se tais efeitos pós-ingestivos relacionados à recompensa refletem eventos pré-absortivos ou pós-absortivos. Em apoio à importância da detecção pós-absortiva de glicose, descobrimos que, em testes comportamentais em ratos, soluções de glicose em alta concentração administradas na veia jugular foram suficientes para condicionar um viés lateral. Além disso, uma solução de glicose em menor concentração condicionou respostas comportamentais robustas quando administrada na veia porta hepática, mas não na veia jugular. Além disso, a administração entérica de glicose em uma concentração suficiente para provocar condicionamento comportamental resultou em um perfil glicêmico semelhante ao observado após a administração da solução de glicose em baixa concentração na veia porta hepática, mas não na veia jugular. Finalmente, utilizando voltametria cíclica de varredura rápida, constatamos que, de acordo com achados comportamentais, uma solução de glicose em baixa concentração causou um aumento nos eventos de liberação espontânea de dopamina na concha do núcleo accumbens quando administrada na veia porta-hepática, mas não na veia jugular. Esses achados demonstram que os efeitos pós-absortivos da glicose são suficientes para as respostas comportamentais pós-ingestivas e as respostas dopaminérgicas relacionadas à recompensa que resultam do consumo de açúcar. Além disso, os níveis de glicemia no sistema venoso porta-hepático contribuem de forma mais significativa para esse efeito do que a glicemia sistêmica, o que sugere a participação de um sensor visceral intra-abdominal para glicose.
Introdução
As consequências pós-ingestivas positivas do consumo de alimentos são um determinante crítico do comportamento alimentar . Na verdade, descobrimos recentemente que, em um paradigma comportamental de duas garrafas, mesmo em animais nos quais as vias funcionais de transdução do sabor doce estão ausentes, o consumo oral de sacarose (um sacarídeo que contém calorias), mas não de sucralose (um adoçante artificial não calórico), foi suficiente para o condicionamento de preferências secundárias robustas Além disso, quando esses animais ingeriram sacarose, foram encontrados aumentos na liberação de dopamina e na ativação neuronal no núcleo accumbens (NAcc). A estimulação pós-ingestão dependente do sistema dopaminérgico também foi sugerida em um estudo de imagem funcional em humanos, no qual a sucralose e a sacarose foram apresentadas em concentrações pareadas por intensidade gustativa, e apenas esta última ativou áreas dopaminérgicas do mesencéfalo. . A relevância da ativação dopaminérgica para a aprendizagem pós-ingestão-dependente foi confirmada em experimentos conduzidos em ratos, nos quais o antagonismo do receptor de dopamina no NAcc inibiu o desenvolvimento de associações entre sabores não calóricos e glicose injetada diretamente no duodeno. .
Em relação aos mecanismos que levam aos efeitos comportamentais de recompensa relacionados à estimulação pós-ingestão por açúcares como a sacarose, os dados disponíveis não são totalmente consistentes. Um estudo indicou que a estimulação direta da mucosa intestinal é necessária. , enquanto outros demonstraram a importância dos efeitos pós-absortivos pela injeção intravenosa de nutrientes , . Mais recentemente, também foi sugerido que, independentemente do paladar, a utilização da glicose pelo tecido é necessária para que o consumo de glicose cause a liberação de dopamina no estriado . Em qualquer caso, as vias de sinalização pós-ingestivas que levam ao condicionamento comportamental e à liberação de dopamina permanecem controversas.
Aqui, estávamos interessados em esclarecer a participação de mecanismos pré-absortivos e pós-absortivos nos efeitos relacionados à recompensa de um açúcar contendo calorias, independentemente de seu sabor. Para esse efeito, usamos ratos para testar as respostas comportamentais e dopaminérgicas à administração intravenosa de glicose na veia jugular (JV) e na veia porta-hepática (HPV). Inicialmente, testamos se várias concentrações diferentes de glicose (5%, 22.5% e 50%), administradas na JV, eram suficientes para condicionar um viés lateral em um teste de preferência de duas garrafas. Neste experimento, a sacarina foi usada como controle para potencial estimulação gustativa intravascular. Em outro experimento, dados os efeitos glicêmicos dos diferentes estímulos de glicose administrados na JV, os efeitos da glicose a 5% administrada na HPV foram testados no mesmo paradigma comportamental. Nesse experimento, o manitol foi usado como controle para efeitos osmóticos. Posteriormente, os efeitos glicêmicos dos diferentes estímulos de glicose utilizados nesses experimentos foram medidos simultaneamente no sangue da cauda e do HPV, para avaliar a relevância das alterações em cada um desses locais para os efeitos comportamentais observados anteriormente. Por fim, utilizando voltametria cíclica, a frequência transitória da dopamina foi medida no NAcc e os efeitos da infusão de uma solução de glicose a 5% no HPV e na VJ foram testados.
Consistentes
Para esclarecer a participação dos mecanismos mucosos (intestinais) vs. pós-absortivos no condicionamento independente do paladar por efeitos pós-ingestivos em ratos, conduzimos experimentos para testar a reversão do viés lateral em um paradigma comportamental de duas garrafas. Resumidamente, os animais foram testados quanto à polarização lateral em um teste de água versus água com duas garrafas, sob água e restrição alimentar moderada. Para condicionar a reversão da polarização lateral, os animais foram então expostos a um protocolo de condicionamento de 4 dias com livre acesso à água fornecida diariamente em lados alternados da caixa comportamental. Nos 2 dias em que os animais foram expostos ao lado oposto à polarização original, 3 mL de solução de glicose foram administrados simultaneamente ao consumo de água e condicionados ao comportamento de lamber (3 µL/lambedura para as primeiras 1000 lambidas de água). Nos 2 dias restantes, quando os animais foram expostos ao lado da polarização original, o veículo foi administrado nas mesmas condições. Em alguns animais, previamente implantados com cateteres vasculares, os estímulos de condicionamento (glicose ou veículo) foram infundidos intravenosamente, enquanto em outros foram administrados oralmente através de uma cânula independente no tubo sipper usado para a administração de água (ver Métodos). No último dia de teste, a reversão da polarização lateral foi testada em todos os animais usando um teste de água versus água com duas garrafas (ver Métodos e tabela 1 para mais detalhes).
Dois grupos de animais foram condicionados usando 5% (n
=6) ou 15% (n=5) soluções de glicose administradas por via oral. No geral, os animais nesses grupos apresentaram níveis de consumo mais elevados durante as sessões de condicionamento com veículo do que durante as sessões de glicose, um efeito que pode ser devido aos efeitos saciantes da administração de glicose ou ao uso de altos níveis de privação de água (Fig. S1A). A reversão do viés lateral foi testada comparando a preferência pelo lado oposto ao viés original de cada animal nas sessões de duas garrafas antes e depois do condicionamento. Encontramos efeitos significativos para o estímulo de condicionamento (5% vs. 15%, F=9.3, p=0.014) e sessão de teste (pré vs. pós-condicionamento, F=7.9, p=0.021) e uma interação quase significativa entre os dois fatores (F=4.2, p=0.071; ANOVA bidirecional de medidas repetidas). No entanto, aumentos significativos na preferência pré-condicionamento em relação ao pós-condicionamento para o lado associado à administração de glicose foram encontrados apenas em animais condicionados com 15% de glicose (0.11 ± 0.06 vs. 0.8 ± 0.2, t=3.3, p<0.05), mas não aqueles condicionados com 5% de glicose (0.07±0.04 vs. 0.18±0.15, t=0.6, p>0.05; testes t de Bonferroni post-hoc; Fig. 1A).
Utilizando o mesmo protocolo comportamental, testamos os efeitos das infusões JV de baixo (5%, n=10), intermediário (22.5%, n=7) e alta (50%, n=11) soluções de glicose. Sacarina sódica (NaSacc; 3.16%, que demonstrou ser a concentração ideal para estimulação intravascular do paladar doce ) foi usado como controle para potencial estimulação intravascular do paladar (n=5). Semelhantemente ao que foi encontrado em animais condicionados oralmente, no geral esses ratos apresentaram níveis de consumo mais elevados durante as sessões de condicionamento com veículo do que durante as sessões de glicose ou sacarina (Figura S1B). Em relação à reversão do viés lateral, encontramos efeitos significativos para o estímulo de condicionamento (glicose baixa vs. intermediária vs. alta vs. NaSacc, F=7.8, p<0.001), sessão de teste (pré vs. pós-condicionamento, F=45.3, p<0.001) e a interação entre esses fatores (F=15.8, p < 0.001; ANOVA bidirecional de medidas repetidas). A reversão do viés lateral foi encontrada em animais condicionados com infusões JV de 22.5% (0.18 ± 0.05 vs. 0.63 ± 0.10, t=4.7, p<0.001) e 50% de glicose (0.13±0.05 vs. 0.82±0.07, t=9.1, p<0.001), mas não aqueles condicionados com 5% de glicose (0.14±0.05 vs. 0.12±0.05, t=0.3, p>0.05) ou NaSacc (0.19±0.09 vs. 0.3±0.19, t=1, p>0.05; testes t de Bonferroni post-hoc; Fig. 1B). Em resumo, enquanto as duas soluções de glicose com concentração mais alta resultaram na reversão do viés lateral, nenhum efeito foi encontrado para NaSacc, eliminando assim o sabor intravascular como sinal para essas mudanças comportamentais.
Para melhor compreender o impacto glicêmico dos diferentes estímulos de glicose, grupos separados de animais tiveram livre acesso à água em sessões comportamentais de 10 minutos de duração, enquanto 3 mL de cada uma das soluções de glicose usadas para condicionamento foram administradas simultaneamente ao consumo de água e condicionadas à lambida (3 µL/lambedura para as primeiras 1000 lambidas de água; 5% oral, n=3; 15% oral, n=4; 5% JV, n=6; 22.5% JV, n=4; 50% JV, n=6). A glicemia foi medida no sangue da cauda antes (linha de base) e em vários momentos após a administração de glicose (0′–40′). Com exceção da glicose oral a 5%, todos os estímulos causaram um aumento significativo da glicemia periférica (Fig. 2A, Ver Tabela S1 para dados). Este efeito também foi verificado para a glicose JV a 5%, que não condicionou a reversão do viés lateral, mostrando que a elevação da glicemia periférica é insuficiente para induzir alterações no viés lateral. Para esclarecer melhor o perfil glicêmico de cada estímulo, as medidas absolutas (mg/dL) e relativas (% da linha de base) da glicemia foram analisadas em termos de glicemia média e de pico. Em animais nos quais a glicose foi administrada por via oral, não foram encontradas diferenças para o pico de glicemia relativa (% da linha de base) após a exposição a 5% e 15% de glicose (117 ± 8 vs. 131 ± 9, respectivamente, t=1.1, p=0.33, teste t não pareado; Fig. 2B). Quando a glicemia após 15% de glicose oral, que foi eficaz no condicionamento da reversão do viés lateral, foi comparada àquela resultante da administração JV de glicose, um efeito principal significativo foi encontrado (F=37.7, p < 0.0001, ANOVA unidirecional). As comparações pareadas revelaram diferenças em relação à JV 22.5% (428 ± 34, t=5.8, p<0.001) e 50% de glicose (536±48, t=8.6, p<0.001), mas não em relação à glicose a 5% (170±10, t=0.8, p>0.05; testes t de Bonferroni post-hoc; Fig. 2C). Resultados semelhantes foram encontrados para a glicemia absoluta máxima e média (Figuras S2A, B, D e E) e glicemia relativa média (Figuras S3A e B).
Nossos resultados sugerem que, embora a glicose intravenosa tenha sido suficiente para condicionar a reversão do viés lateral em um teste de duas garrafas de água versus água, isso só foi possível quando níveis de glicemia muito superiores aos resultantes da glicose oral foram induzidos. Assim, levantamos a hipótese de que a hiperglicemia sistêmica decorrente da administração de glicose por via intravenosa (VJ) foi necessária para acionar um sensor periférico que é ativado após a administração gastrointestinal de glicose. TO sistema HPV tem uma localização ideal para tal sensor, uma vez que transporta a maior parte do sangue rico em nutrientes do sistema gastrointestinal, antes de ser liberado na circulação sistêmica. Para testar esta hipótese, o mesmo protocolo de condicionamento foi realizado com glicose a 5% administrada através de cateteres de HPV (n=10), em vez de oralmente ou através da VJ. Como controle osmótico, outro monossacarídeo (de sabor doce) (5% de manitol ) foi aplicado como estímulo condicionador em um grupo alternativo de animais (n=5 Figura S1C). Neste experimento, não foram encontradas diferenças no consumo durante as sessões de condicionamento com veículo versus glicose ou manitol. Em vez disso, os animais condicionados com glicose apresentaram níveis de consumo geral mais elevados do que aqueles condicionados com manitol (Figura S1C). Ao considerar os efeitos comportamentais em outras sessões de condicionamento (Figuras S1A e S1B) isso sugere que, nessas condições, o manitol produziu um efeito aversivo contextual que se generalizou para as sessões com veículo. Em relação à reversão do viés lateral, foram encontrados efeitos significativos para o estímulo de condicionamento (glicose vs. manitol, F=10.2, p=0.007), sessão de teste (pré vs. pós-condicionamento, F=5.2, p=0.04) e a interação entre esses fatores (F=9.5, p=0.009; ANOVA bidirecional de medidas repetidas). Além disso, em apoio à nossa hipótese, foi encontrado um aumento significativo na preferência pré-condicionamento em relação ao pós-condicionamento para o lado associado à glicose (0.17 ± 0.05 vs. 0.69 ± 0.12, t=4.7, p < 0.001), mas não a infusão de manitol durante o condicionamento (0.14 ± 0.04 vs. 0.06 ± 0.06, t=0.5, p>0.05; testes t de Bonferroni post-hoc, Fig. 3A). Assim, 5% de glicose foi eficaz no condicionamento da reversão do viés lateral quando administrado no HPV (Fig. 3A), mas não a JV (Fig. 1B). Essa variação nos efeitos comportamentais da glicose a 5% não resultou de diferenças na glicemia sistêmica dependendo do local de administração, uma vez que o pico de glicemia sanguínea da cauda (% basal) após a administração de HPV (171±13) e JV (Fig. 1D) não foram significativamente diferentes (t=0.07, p=0.9, teste t não pareado; Fig. 3B; Vejo tabela S1 para dados). Também não foram encontradas diferenças para a glicemia absoluta máxima e média (Figuras S2C e F) e glicemia relativa média (Figura S3D).
No geral, esses achados indicam fortemente que um aumento na glicemia por HPV, em vez da glicemia sistêmica, é um estímulo crítico que resulta na reversão do viés lateral independente do paladar. Para testar ainda mais essa hipótese, grupos separados de animais anestesiados foram injetados com veículo ou com as diferentes soluções de glicose usadas para condicionamento, por meio de cateteres inseridos no duodeno (água, n=5; 5% glicose, n=4; 15% glicose, n=6), JV (solução salina, n=5; 5% glicose, n=6; 22.5% glicose, n=4; 50% glicose, n=4) ou HPV (solução salina, n=4; 5% glicose, n=7). A glicemia foi medida tanto no sangue da cauda quanto no sangue do HPV no início (linha de base) e no final (0′) da perfusão do estímulo, e a cada 10 minutos subsequentemente (10′–50′). Os dados brutos foram analisados separadamente para as injeções de veículo e glicose, e para a glicemia da cauda e do HPV no sangue (FIG. 4, Ver Tabela S2 para dados). Conforme explicado para a glicemia em animais acordados, os valores de pico e média da glicemia foram então comparados (ver dados em Tabelas S3 e S4). Para o pico de glicemia relativa (% da linha de base), foi encontrada uma interação significativa entre o estímulo (JV vs. HPV vs. glicose duodenal 5% vs. glicose duodenal 15% vs. JV 22.5% glicose vs. JV 50% glicose vs. veículo) e o local da coleta de sangue (cauda vs. HPV; F=11.4, p<0.001), permitindo análises separadas da glicemia da cauda e do HPV (ver Tabela S4 para detalhes). Em ambos os casos, a glicemia após JV 5% de glicose, considerada como um estímulo de controle que não condicionou a reversão do viés lateral (ver Fig. 1B), foi comparado ao observado após os estímulos restantes. Fou medições de sangue na cauda, apenas JV 22.5% e 50% de glicose e veículo, mas não HPV 5% e duodenal 5% e 15% de glicose, diferiram significativamente de JV 5% de glicose (Fig. 4C). Para as medições sanguíneas do HPV, no entanto, a glicose duodenal a 5%, o único outro estímulo de glicose que não condicionou a reversão do viés lateral (ver Fig. 1A), também foi o único estímulo que não diferiu significativamente da glicose JV 5% (Fig. 4D). Assim, de acordo com nossos achados anteriores, o HPV, mas não a glicemia sistêmica, medida em ratos anestesiados, reflete com precisão a reversão do viés lateral observada após o condicionamento em animais acordados. Essa semelhança entre os efeitos comportamentais e a resposta glicêmica máxima do HPV não foi encontrada para a glicemia média (Tabela S4), sugerindo que os efeitos comportamentais relevantes da administração de glicose resultam de níveis elevados episódicos de glicemia, e não dos efeitos de alterações glicêmicas sustentadas. Resultados semelhantes foram encontrados quando os níveis absolutos de glicemia (mg/dL) foram comparados. (Tabela S3).
Estudos anteriores demonstraram que a liberação de dopamina pode ser evocada no núcleo accumbens, em resposta à administração gastrointestinal de açúcares, independentemente do seu sabor. , , . Portanto, estávamos interessados em entender se a liberação de dopamina nessa área seria afetada diferencialmente pela administração de glicose a 5% por JV e HPV. FA voltametria cíclica ast-scan foi usada para identificar eventos espontâneos de liberação de dopamina ou “transitórios” , , , na concha do núcleo accumbens de ratos anestesiados (n=12) (ver métodos). Após a obtenção dos registros basais por 6 a 8 minutos, os ratos foram infundidos na veia jugular com glicose a 5% ou na veia cava superior com glicose a 5% ou veículo. A frequência transitória basal (3.4 ± 0.7 transientes/min), a duração (520 ± 68 ms) e a amplitude (30 ± 3 nM) foram semelhantes às descritas em animais acordados. , , (Vejo Figs. 5A e B para gravações representativas). Além disso, após as alterações induzidas pela glicose serem medidas, cocaína (15 mg/kg) foi administrada a todos os animais para demonstrar os efeitos da inibição da recaptação de dopamina nessas condições. Descobrimos que a cocaína aumentou a frequência e a duração dos transientes, sem afetar a amplitude (Fig. S5).
Em relação às alterações na frequência transitória após a administração de glicose, a ANOVA bidirecional de medidas repetidas revelou um efeito principal significativo para o tempo (linha de base vs. 1–5 min vs. 6–10 min vs. 11–15 min vs. 16–20 min; F=2.7, p=0.044), mas não para o grupo de tratamento (glicose JV vs. glicose HPV vs. solução salina HPV; F=1.6, p=0.26) e uma interação significativa entre fatores (F=2.4, p=0.036, Fig. 5C). Dada a interação significativa entre os fatores, comparações adicionais para o efeito do tempo foram realizadas separadamente para cada grupo de tratamento. Para os grupos HPV salina e JV glicose, o efeito do tempo não foi significativo (F=0.5, p=0.75 e F=0.61, p=0.66 respectivamente) e a comparação em cada período de tempo em relação à respectiva linha de base também não foi significativa (t<1.1 e t<1.5 respectivamente, p>0.05 para todos). No entanto, para o grupo de glicose do HPV, foi encontrado um efeito significativo do tempo (F=3.9, p=0.031; ANOVA unidirecional de medidas repetidas) e, quando comparado à linha de base, a frequência transitória foi maior nos primeiros 5 minutos após o início da infusão (t=3, p<0.05), mas não nos períodos de tempo restantes (t<1.7, p>0.05 para todos; testes t de Bonferroni post-hoc; ver Tabela S5 para detalhes). Não foram encontrados efeitos para o tempo, grupo de tratamento ou sua interação com relação à duração ou amplitude transitória (Fig. S4). Nestes animais, a glicemia sanguínea da cauda também foi determinada antes e 20 minutos após o início das infusões de JV ou HPV, mostrando, como esperado, que as diferenças observadas na frequência transitória após a infusão de glicose não são devidas a diferenças na glicemia sistêmica (Fig. 5D). Assim, de acordo com os dados comportamentais e de glicemia apresentados, em uma concentração menor (5%), a glicose aumentou significativamente a frequência transitória de dopamina quando infundida no HPV, mas não na JV.
Discussão
Neste estudo, demonstramos que mecanismos pós-absortivos participam dos efeitos comportamentais e dopaminérgicos da glicose relacionados à recompensa, independentemente dos aspectos hedonicamente positivos de seu sabor. Descobrimos inicialmente que, em ratos, soluções de glicose em alta concentração administradas na VJ foram suficientes para condicionar um viés lateral (Fig. 1B). No entanto, isso só foi possível em concentrações de glicose que resultaram em glicemia muito mais elevada do que a resultante do consumo oral de glicose, em concentrações que também foram suficientes para condicionar vieses colaterais (FIG. 2). Para esclarecer essa inconsistência, foram conduzidos experimentos adicionais para comparar os efeitos da glicose administrada na JV e no HPV, uma vez que este último é o primeiro local de acúmulo de glicose após a absorção no intestino . Nesse sentido, constatamos que, em menor concentração, as soluções de glicose condicionaram vieses laterais robustos quando administradas no HPV, mas não no JV (Fig. 3A). Em apoio a esta descoberta, a administração entérica de glicose em uma concentração suficiente para provocar condicionamento comportamental (Fig. 1A) resultou em um perfil glicêmico semelhante ao observado após a administração da solução de glicose de baixa concentração no HPV, mas não no JV (FIG. 4). Finalmente, a administração de uma solução de glicose de baixa concentração no HPV, mas não no JV, causou um aumento na frequência de transientes de dopamina na camada do núcleo accumbens, conforme medido por voltametria cíclica de varredura rápida (FIG. 5). No geral, essas descobertas sustentam que os efeitos pós-absortivos da glicose são suficientes para as respostas comportamentais pós-ingestivas e as respostas dopaminérgicas relacionadas à recompensa resultantes do consumo de açúcar, e os níveis de glicemia no sistema HPV contribuem mais significativamente para esse efeito do que a glicemia sistêmica.
A participação diferencial de fatores orais e pós-ingestivos no controle do comportamento alimentar tem sido bem caracterizada . Os controles pós-ingestivos da ingestão de alimentos foram reconhecidos principalmente como influências inibitórias (ou seja, saciedade), mas menos pesquisas foram dedicadas aos efeitos pós-ingestivos positivos da ingestão de alimentos . Embora vários autores iniciais tenham demonstrado que a injeção intragástrica de nutrientes pode servir como um reforço comportamental adequado , , esse achado foi controverso e atribuído a vazamentos no sistema de canulação gástrica , . De fato, a maioria dos autores desenvolveu trabalhos mostrando que nutrientes injetados diretamente no estômago condicionarão uma preferência por um sabor associado , , , , , , e só recentemente descobrimos que, em ratos sem transdução funcional do sabor doce nas células receptoras do paladar, o consumo oral de sacarose foi suficiente para o condicionamento de preferências laterais robustas, independentemente de quaisquer pistas orais . Aqui, o procedimento comportamental desenvolvido anteriormente em camundongos foi adaptado para uso em ratos e demonstramos que ele poderia ser usado para medir o condicionamento comportamental resultante do consumo entérico de glicose (Fig. 1A).
Embora a literatura sobre os controlos pós-ingestivos positivos da ingestão alimentar tenha agora quase 60 anos, os sinais periféricos subjacentes a estes efeitos, particularmente os da glicose, permanecem controversos. . Experimentos com administração parenteral de soluções de glicose em ratos ou coelhos, para testar seus efeitos como um sinal de condicionamento pós-ingestivo positivo, tiveram resultados positivos , , , , e resultados negativos , , . Aqui demonstramos um efeito dose-resposta na capacidade da glicose de condicionar o comportamento, quando administrada na JV (Fig. 1B). Esses resultados fornecem uma explicação razoável para discrepâncias anteriores com a administração de glicose JV, uma vez que resultados positivos foram obtidos com concentrações mais altas de glicose (30%) do que aqueles usados em experimentos com resultados negativos (10%) , .
Em ratos, o HPV foi proposto anteriormente como um local importante para a detecção de sinais pós-absortivos que apoiam o condicionamento pós-ingestivo apetitivo . Em um estudo posterior conduzido em ratos privados de alimentos, as injeções de glicose do HPV não condicionaram as preferências de sabor, levando à proposta de que a estimulação intestinal por nutrientes é necessária para que as infusões de HPV condicionem o comportamento . Aqui descobrimos que, mesmo em ratos privados de alimentos, a infusão de glicose do HPV foi suficiente para condicionar um viés lateral (Fig. 3A). Quando comparado com os experimentos negativos mencionados acima , esses resultados não podem ser explicados pelo uso de concentrações mais elevadas de glicose (5% utilizadas aqui vs. 10%), mas podem ser consequência de diferenças na taxa de infusão (não menos que 0.3 mL/min aqui vs. 0.083 mL/min). Além disso, de acordo com achados anteriores , a infusão da mesma concentração de glicose na JV não teve tais efeitos (Fig. 1B). Assim, embora nossos dados não possam excluir a importância da estimulação de nutrientes intestinais para o condicionamento pós-ingestivo apetitivo, eles mostram claramente que isso não é necessário e que fatores pós-absortivos, agindo perifericamente no sistema HPV, são suficientes para tais efeitos comportamentais.
É importante observar que a glicose e outros nutrientes presentes no intestino serão absorvidos, resultando em um maior aumento nos níveis de nutrientes no sangue do HPV do que na circulação sistêmica. . Este efeito será presumivelmente aditivo ao da injeção de nutrientes no HPV, apresentando uma explicação razoável para a associação previamente observada entre a presença de nutrientes no intestino e a capacidade das infusões de HPV de condicionar o comportamento , Assim, ao comparar os efeitos comportamentais de infusões de nutrientes entéricos, de JV e/ou de HPV, é importante medir diretamente os níveis sanguíneos de nutrientes resultantes dessas infusões. No entanto, apenas alguns dos estudos que investigaram os efeitos positivos do condicionamento da administração intravenosa de glicose incluíram medições da glicemia sanguínea sistêmica, com resultados mistos. , , , e nenhuma delas incluiu essas medições no sangue de ratos infectados pelo HPV. Aqui, mostramos, tanto em ratos acordados quanto anestesiados, que as medições da glicemia sanguínea da cauda não explicaram inteiramente os efeitos comportamentais diferenciais das infusões de glicose entérica, JV e HPV (Figs. 2, ,3B,3B, 4A, 4C, S2 e S3; Tabelas S1, S2, S3 e S4). No entanto, quando as medições foram realizadas no sangue do HPV de animais anestesiados, o pico de glicemia foi considerado um bom correlato da capacidade das soluções de glicose de condicionar vieses laterais (Figuras 4B e 4D; Tabelas S2, S3 e S4). Isso não se verificou para a glicemia média, refletindo o fato de que a injeção intravenosa de glicose não resultou em um perfil glicêmico inteiramente fisiológico, e também sugerindo que os efeitos comportamentais observados da administração de glicose foram mais dependentes dos níveis mais altos de glicemia do que de elevações sustentadas da glicemia. De qualquer forma, esses achados reforçam ainda mais a importância da carga de glicose pós-absortiva no HPV para o condicionamento apetitivo pós-ingestivo, demonstrando, de forma importante, que isso é verdadeiro mesmo quando os nutrientes são administrados no intestino, em vez de diretamente na VJ ou no HPV.
Experimentos realizados para investigar os efeitos negativos (ou seja, saciantes) dos nutrientes injetados no HPV também foram realizados em diversas espécies. Conforme descrito para o condicionamento positivo, resultados inconsistentes foram observados (ver , para revisões). A razão para essas diferenças tem sido atribuída de várias maneiras ao estado nutricional do animal, ao protocolo de infusão de HPV e aos diferentes paradigmas de teste . De fato, a maioria desses fatores provavelmente impactará o nível de nutrientes no HPV, sugerindo que esse fator pode estar por trás dos efeitos saciantes das infusões intravenosas de nutrientes, conforme descrito aqui para o condicionamento comportamental positivo.
Nos experimentos comportamentais com infusões de glicose na VJ ou HPV, soluções de controle também foram utilizadas para diferenciar os efeitos devidos ao caráter nutricional da glicose daqueles que poderiam resultar da estimulação do paladar ou de alterações na osmolalidade. Para os experimentos de infusão na VJ, foi utilizada uma solução de sacarina sódica, em uma concentração que já havia se mostrado ideal para a estimulação intravascular do paladar doce. . Para infusões de HPV, o manitol foi usado, pois, em concentrações iguais à glicose, esse monossacarídeo de sabor adocicado causa alterações semelhantes na osmolalidade plasmática, mas tem efeitos metabólicos mínimos . Ao contrário da glicose, tanto a sacarina quanto o manitol não condicionaram mudanças de viés lateral após a infusão na JV ou HPV, respectivamente, eliminando o sabor e a osmolalidade plasmática como mecanismos subjacentes a esses efeitos comportamentais (Figuras 1B e e3A).3A). Esses controles importantes corroboraram nossas descobertas anteriores de condicionamento comportamental independente do paladar com sacarose em camundongos , e também os primeiros relatos de condicionamento instrumental e de preferência de lugar resultantes da administração intragástrica e intravenosa de nutrientes, na ausência de pistas orossensoriais ou olfativas , , , .
O papel da dopamina na mediação das características apetitivas dos alimentos já foi bem estabelecido . A elevação dos níveis de dopamina no núcleo accumbens (NAcc) ocorre com o consumo de açúcares que contêm calorias, como a sacarose , , e tanto o sabor doce quanto a estimulação pós-ingestiva demonstraram ser suficientes para esse efeito , , No entanto, os mecanismos pós-ingestão que levam à liberação de dopamina no NAcc após o consumo de açúcares permanecem obscuros. Argumentando a importância da estimulação pré-absortiva, o hormônio derivado do intestino, grelina, demonstrou estimular a liberação de dopamina no mesoacumbente. . Evidências de controles pós-absortivos da liberação de dopamina estriatal também foram apresentadas, mas as descobertas relatadas são um tanto ambíguas , , . É importante ressaltar que os efeitos da glicemia na homeostase da dopamina estriatal foram atribuídos aos neurônios glicosensores no cérebro , em particular porque se descobriu que ocorrem aumentos nos níveis de dopamina no estriado dorsal quando a glicose é infundida diretamente na substância negra . Aqui, usando voltametria cíclica, descobrimos que 5% de glicose infundida no HPV, mas não na JV, resultou em um aumento de eventos transitórios de dopamina (Figuras 5A–C), enquanto causa um aumento semelhante e fisiologicamente relevante na glicemia periférica em ambos os casos (Figuras 3B, 4A, 4C e e5D).5D). Esta descoberta confirma que os sinais pós-absortivos de glicose são suficientes para induzir a liberação de dopamina no NAcc, demonstrando também, até onde sabemos pela primeira vez, que esses efeitos pós-absortivos dependem do aumento da glicemia no HPV, e não da detecção direta no cérebro ou de mecanismos alternativos, como o paladar intravascular. Os efeitos dopaminérgicos diferenciais da administração de glicose a 5% na JV e no HPV são particularmente relevantes, visto que são paralelos aos efeitos diferenciais desses tratamentos no comportamento (Figuras 1B e e3A)3A) e glicemia do HPV (Figuras 4B e 4D), sugerindo que este último pode ser o fator explicativo subjacente aos efeitos comportamentais e neuroquímicos da administração de glicose.
Embora tenham sido relatados transientes espontâneos de dopamina em ratos acordados , , notamos que, até onde sabemos, este é o primeiro relato em ratos anestesiados (Figura 5A e 5B). No entanto, descobrimos que todas as três características usadas para descrever os transientes (frequência, duração e amplitude) são bastante semelhantes às relatadas em ratos acordados , , , , . Além disso, mesmo em ratos anestesiados, a frequência transitória foi responsiva à infusão de glicose no HPV (Fig. 5C) e à administração ip de cocaína (Fig. S5A). Experimentos anteriores usando voltametria cíclica descreveram respostas dopaminérgicas do NAcc à sacarose intraoral ou sacarina infusão. Em comparação com esses estudos voltamétricos anteriores, relatamos aumentos sustentados na frequência transitória ao longo de minutos após a infusão intravenosa de glicose, em vez das respostas ao longo de alguns segundos que ocorrem após a apresentação do estímulo oral. , . Semelhantemente ao que foi descrito anteriormente para a nomifenina e cocaína administração, também descobrimos que a injeção de 15 mg/kg de cocaína causou um aumento na frequência transitória de dopamina NAcc (Fig. S5A) e duração (Figura S5B). No entanto, não encontramos efeitos para a amplitude transitória (Figura S5C). Assim, os efeitos dos psicoestimulantes são semelhantes em ratos acordados e anestesiados. Investigar os efeitos sobre transientes em roedores anestesiados pode ser mais apropriado em contextos nos quais o ambiente e o condicionamento são fatores de confusão indesejados.
O NAcc, onde medimos os transientes de dopamina, não é uma estrutura homogênea. Existem duas subdivisões principais, o núcleo do Nacc e a camada do Nacc, para as quais foram relatadas diferenças funcionais no processamento de recompensas e na cinética de liberação de dopamina. , Os dados de voltametria relatados aqui foram medidos com eletrodos implantados na sub-região da concha. De fato, os efeitos que observamos após a injeção de cocaína (Fig. S5A) estão de acordo com descobertas anteriores, mostrando que a cocaína aumenta a frequência transitória nesta sub-região, mas não o núcleo NAcc . A transmissão de dopamina dentro da camada NAcc foi proposta para participar do processamento de recompensa primária em resposta a psicoestimulantes , e estímulos ingestivos orais , enquanto a liberação de dopamina no núcleo do NAcc é considerada como tendo um papel mais específico na resposta a pistas de previsão de recompensa no contexto de associações aprendidas , . Agora mostramos que a infusão de glicose do HPV causa um aumento da frequência transitória de dopamina na camada NAcc, um efeito que, como sugerido pelos efeitos do antagonismo do receptor de dopamina na mesma área, pode ser relevante para o aprendizado da preferência de sabor induzida pelas consequências pós-orais dos carboidratos. . Em qualquer caso, mais pesquisas são necessárias para explorar a participação do núcleo NAcc nas respostas pós-absortivas aos açúcares.
Pesquisas anteriores sugeriram que os mecanismos de detecção e transdução de doce encontrados nas células gustativas da língua também estão presentes no intestino e são um regulador pós-ingestão crítico do apetite por açúcares. . No entanto, nós e outros demonstramos que os adoçantes não nutritivos, que também irão ativar esses mecanismos , não condicione o lado ou sabor preferências. Além disso, embora os mecanismos de detecção e transdução de sabor sejam defeituosos, tanto o Trpm5 KO e T1R3 KO Camundongos desenvolverão preferências condicionadas por açúcares nutritivos. Os resultados aqui descritos corroboram que um fator pós-absortivo, dependente de alterações glicêmicas no HPV, e não sistemicamente, contribui para os efeitos comportamentais positivos e os efeitos dopaminérgicos do NAcc resultantes do consumo de açúcares. Embora esses resultados contrariem um papel importante para a participação de um mecanismo pré-absortivo, tal mecanismo não pode ser excluído e, de fato, há evidências de que fatores mucosos e pós-absortivos podem cooperar no condicionamento pós-ingestão. De qualquer forma, a natureza dos fatores pós-absortivos do HPV dependentes de glicose ainda precisa ser determinada. Uma possibilidade é a participação da insulina, especialmente porque esse hormônio demonstrou ser relevante para a resposta dopaminérgica à hiperglicemia. . Outro mecanismo de intervenção candidato é a captação hepática líquida de glicose, uma vez que depende dos níveis de insulina e aumenta quando a glicose é administrada no HPV, em comparação com a infusão periférica . Também foi demonstrada uma relação entre o estado energético do fígado, medido em termos de concentração de ATP nos hepatócitos, e a ingestão de alimentos. . Em última análise, esses fatores também podem explicar descobertas recentes, mostrando que a utilização da glicose é necessária para o condicionamento comportamental e os efeitos dopaminérgicos do consumo de glicose O mecanismo de transmissão de sinais do fígado para o cérebro também não é claro. Uma hipótese é a transmissão neural, possivelmente via neurônios aferentes vagais sensíveis à glicose. . No entanto, a lesão dos aferentes neurais vagais e não vagais abdominais não demonstrou bloquear as preferências de sabor condicionadas pela administração enteral de polímeros de glicose , , . Outra alternativa, que tem sido menos explorada , é que fatores humorais, possivelmente produzidos pelo fígado e/ou pâncreas, são liberados na corrente sanguínea e atuam diretamente no cérebro para modular a ingestão de alimentos .
Em resumo, esses achados corroboram a alegação de que os efeitos pós-absortivos da glicose são suficientes para induzir respostas comportamentais apetitivas ao consumo de açúcar, e que os níveis de glicemia no sistema HPV contribuem mais significativamente para esse efeito do que a glicemia sistêmica. Além disso, esses efeitos ocorrem independentemente do paladar, da estimulação pós-ingestão da mucosa e da osmolalidade plasmática. Além disso, esta é a primeira demonstração de que a administração de glicose pelo HPV é suficiente para induzir transientes de dopamina no estriado, um efeito que pode estar subjacente aos efeitos comportamentais positivos desse tratamento. Considerando os efeitos comportamentais dramáticos da cirurgia de bypass gastrointestinal para redução de peso , , com efeitos potenciais nos níveis de nutrientes do HPV, acreditamos que os mecanismos descritos aqui podem desempenhar um papel na etiologia e no tratamento da obesidade humana, merecendo, portanto, pesquisas mais extensas e adicionais em modelos animais e humanos.
Materiais e Métodos
Declaração de ética
Todos os procedimentos foram realizados em estrita conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Duke University (número do protocolo A329-07-12).
Assuntos
Cento e quarenta e quatro ratos machos Long-Evans e 12 ratos machos Sprague-Dawley foram obtidos dos Laboratórios Charles Rivers (Raleigh, Carolina do Norte) e alojados individualmente em gaiolas de acrílico. Todos os animais foram mantidos em um esquema de 12 horas de claro/escuro, e os experimentos foram realizados na parte clara do ciclo. No momento de cada experimento, os animais tinham entre 3 e 6 meses de idade e não eram sensíveis aos estímulos utilizados. Experimentos preliminares demonstraram que, nas condições necessárias para a realização de experimentos com injeções intravenosas, taxas estáveis de lambedura só puderam ser obtidas quando o acesso oral à água foi restrito a sessões comportamentais. Assim, ração e água para roedores Purina estavam disponíveis. ad libitum, exceto durante o teste comportamental, quando os animais ficaram privados de alimento durante a noite e tiveram acesso à água apenas durante a tarefa comportamental. Em experimentos conduzidos com animais anestesiados, eles foram submetidos à restrição alimentar e hídrica aproximadamente 24 horas antes do experimento. Nos animais cujo peso corporal caiu abaixo de 85% do valor basal, a restrição alimentar e hídrica foi descontinuada e os animais foram excluídos do experimento.
Estímulos
Todas as soluções infundidas (d-glicose – 5%, 15%, 22.5% e 50%; d-manitol – 5%; sacarina sódica – 3.16%) foram preparadas diariamente em água deionizada ou NaCl a 0.9% e mantidas à temperatura ambiente. Água deionizada e solução de NaCl a 0.9% também foram utilizadas e são designadas como 'veículo'. Água deionizada também foi administrada oralmente, assim como, em outro conjunto de experimentos, soluções de glicose a 5% e 15% preparadas em água deionizada. d-glicose, d-manitol, sacarina sódica, água deionizada e NaCl são denominados no artigo como glicose, manitol, sacarina, água e solução salina, respectivamente. Todos os produtos químicos foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e eram de grau reagente.
Cateterismo da veia porta jugular e hepática (HPV)
Cateteres de poliuretano (Strategic Applications, Inc., Libertyville, IL) foram implantados na veia jugular direita em 75 ratos e na veia porta hepática em 35 ratos. Alguns animais foram cateterizados externamente (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA), enquanto outros foram cateterizados internamente usando o mesmo procedimento. Resumidamente, os animais foram anestesiados com halotano a 5%, seguido por injeção intraperitoneal ou intramuscular de xilazina (5–20 mg/kg) e cetamina (75–100 mg/kg). Doses suplementares foram administradas sempre que necessário. Para o cateterismo jugular, uma pequena incisão foi realizada para expor a veia jugular direita. A extremidade cranial da veia foi ligada e uma ligadura frouxa foi colocada caudalmente para isolar uma seção de 5 mm do vaso. Para o cateterismo portal, uma incisão na linha média abdominal foi feita, o ceco foi removido e a veia mesentérica foi identificada. Da mesma forma, a extremidade distal da veia foi ligada e uma ligadura frouxa foi colocada proximalmente para isolar uma seção do vaso. Em ambos os casos, um cateter foi inserido em uma incisão feita entre as ligaduras e fixado no lugar amarrando a ligadura frouxa ao redor do vaso cateterizado. Uma pequena incisão foi então feita na região escapular e o cateter foi tunelizado subcutaneamente e exteriorizado através desta incisão. A permeabilidade foi testada e o cateter foi preenchido com uma "solução de bloqueio" (500 UI/mL de heparina em 50% de glicose) e selado com um tampão. Uma bolsa de pele subcutânea foi feita cranialmente e o excesso de comprimento do cateter foi inserido na bolsa. Finalmente, o local da incisão do vaso e a incisão da pele da área escapular foram fechados com clipes de ferida. Os animais foram deixados em recuperação por 3 a 5 dias após a cirurgia antes do início de procedimentos experimentais adicionais. Antes desses procedimentos, a solução de bloqueio do cateter foi substituída por 50 UI/mL de heparina em solução de NaCl a 0.9%, que também foi usada para manter a permeabilidade em experimentos comportamentais conduzidos ao longo de vários dias.
Configuração comportamental
Todos os testes comportamentais foram conduzidos em caixas de comportamento da Med Associates (Med Associates Inc., St. Albans, VT), cada uma delas fechada em uma câmara ventilada e atenuadora de som, conforme descrito anteriormente. . Resumidamente, as câmaras foram equipadas com duas ranhuras para tubos sipper em uma das paredes. O acesso aos tubos sipper podia ser bloqueado por portas controladas por computador e as ranhuras sipper eram equipadas com lambedores de feixe usados para detecção de lambidas (Med Associates Inc., St. Albans, VT). Cada tubo sipper continha duas cânulas de aço inoxidável de calibre 20 que eram conectadas a colunas de cromatografia de 50 ml (Kontes Flex-Columns; Fisher Scientific, Hampton, NH) onde as soluções de estímulo eram contidas. Os recipientes de solução eram alojados fora das câmaras de atenuação de som e mantidos em uma posição elevada para promover o fluxo de líquido por gravidade. Solenoides controlados por computador (Parker Hannifin Corporation, Fairfield, NJ) regulavam o fluxo de fluido de tal forma que dentro de 10 ms após uma lambida ser detectada, uma das válvulas abria e liberava aproximadamente 3 µL de fluido. Uma bomba de seringa (Med Associates Inc., St. Albans, VT) foi utilizada para permitir a injeção intravascular de soluções durante tarefas comportamentais. A bomba foi ativada 10 ms após a detecção de uma lambida, resultando em uma injeção de aproximadamente 3 µL da solução contida na seringa acoplada à bomba. Assim, a taxa de infusão foi ajustada à taxa de lambidas (aproximadamente 7 Hz) e o volume de fluido ingerido foi aproximadamente igual à quantidade infundida.
Condicionamento para efeitos pós-ingestivos
Protocolo Geral
Para testar se os ratos desenvolvem vieses laterais condicionados pela glicose em um paradigma de duas garrafas, 72 animais foram expostos a um protocolo de condicionamento semelhante ao que usamos anteriormente em camundongos . Para cada animal, o viés lateral foi determinado em um 10 minutos de duração teste com água distribuída em ambos os lados da caixa comportamental (teste de água com duas garrafas vs. água). Uma vez estabelecido um claro viés lateral, os animais foram expostos por 4 dias a 30 minutos de duração sessões de livre acesso à água, apresentadas diariamente em lados alternados da caixa (sessões de treinamento de escolha forçada com uma garrafa). No primeiro e terceiro dias, a água foi apresentada no lado oposto ao lado de viés inicial e 3 mL de um estímulo de condicionamento foram administrados simultaneamente à água durante as primeiras 1000 lambidas (ou seja, 1000 × 3 µL).=3 mL). No segundo e quarto dias, a água foi apresentada no viés lateral inicial e 3 mL de veículo (solução salina ou água, veja detalhes abaixo) foram administrados simultaneamente à água durante as primeiras 1000 lambidas. Normalmente, as primeiras 1000 lambidas ocorriam em até 8 minutos. Após o treinamento, a reversão do viés lateral foi testada em 10 minutos de duração Testes com duas garrafas de água vs. testes com água. Nestes experimentos, 8 animais não completaram o protocolo de condicionamento devido a doença ou perda excessiva de peso, e em outros 5 houve um erro no protocolo de condicionamento. Os dados desses 13 animais foram excluídos da análise.
Estímulos de condicionamento
Em 11 animais, o condicionamento foi realizado com veículo (água) e soluções de glicose (6 ratos com 5% e 5 ratos com 15%), administrados por via oral durante a lambida para obtenção de água. Em 33 animais, o condicionamento foi realizado com infusões de veículo (água ou solução salina – não foram encontradas diferenças de acordo com o subtipo de veículo, dados não apresentados) e soluções de sacarina (5 ratos) ou glicose (10 ratos com 5%, 7 ratos com 22.5% e 11 ratos com 50%), administradas por via oral. veia jugular cateteres. Em 15 animais o condicionamento foi realizado com infusões de 5% de manitol (5 ratos) ou 5% de glicose (10 ratos) administradas através veia porta Cateteres. Nos animais em que o condicionamento foi realizado com cateteres venosos, antes das sessões de teste e condicionamento, o animal foi anestesiado com isoflurano a 5% e o cateter foi conectado a uma seringa colocada na bomba de infusão.
Medições de Glicemia
Animais Despertos
Os ratos foram inicialmente treinados para beber água em sessões diárias de 10 minutos de duração, com livre acesso a ela. Uma vez que os níveis de consumo estáveis foram obtidos, uma sessão de teste foi conduzida onde, para as primeiras 1000 lambidas de água, um estímulo específico (∼3 mL) foi administrado por via oral ou infundido, simultaneamente à lambida. Em 7 animais, soluções de glicose (3 ratos com 5% e 4 ratos com 15%) foram administradas por via oral. Em 20 animais, soluções de glicose foram administradas por meio de cateteres na veia jugular (6 ratos com 5%, 4 ratos com 22.5% e 6 ratos com 50%) ou cateteres na veia porta (4 ratos com 5%). No dia do teste, o sangue da cauda foi coletado para determinação da glicemia antes e imediatamente após a exposição à câmara de teste (respectivamente, linha de base e 0'), e também em intervalos de 10 minutos após o animal retornar à sua gaiola (10', 20', 30', 40'). A glicemia foi medida com um glicosímetro portátil (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, EUA; nível máximo de detecção de 500 mg/dL).
Animais Anestesiados
Ratos ingênuos foram anestesiados com 5% de halotano seguido de injeção intramuscular de 50 mg/kg de pentobarbital, o que demonstrou ser uma das estratégias anestésicas com pequenos efeitos na glicemia . Doses suplementares foram administradas sempre que necessário. Uma incisão na linha média abdominal foi feita. Em 15 ratos, que não haviam sido submetidos a nenhuma cirurgia prévia, a parede do estômago foi perfurada e um cateter de polietileno foi inserido de forma que sua extremidade ficasse no duodeno, a aproximadamente 2 cm do piloro. Os 30 ratos restantes haviam sido previamente implantados com cateteres de veia jugular ou porta. Os níveis de glicose no sangue da cauda foram medidos em intervalos de 5 a 10 minutos. Uma vez que a glicemia no sangue da cauda se estabilizou, uma medição da glicemia basal (0′) foi registrada para o sangue da cauda e da veia porta. Para a coleta de sangue portal, a veia porta hepática foi identificada próxima ao hilo hepático e uma agulha de calibre 31 foi usada para coletar 0.05 a 0.1 mL de sangue. 3 mL de um estímulo específico foram então injetados continuamente ao longo de 8 minutos usando uma bomba de seringa (Med Associates Inc., St. Albans, VT), para emular as condições durante as sessões de treinamento comportamental. Dos animais com cateteres duodenais, 5 ratos foram injetados com veículo (água), 4 com 5% de glicose e 6 com 15% de glicose. Nos 11 ratos com cateteres na veia porta, o veículo (solução salina;=4) ou 5% de glicose foi administrado (n=7). Os 19 ratos restantes tinham cateteres na veia jugular e receberam veículo (solução salina; n=5) ou soluções de glicose (5%, n=6; 22.5%, n=4; 50%, n=4). Sangue da cauda e sangue da veia porta foram posteriormente coletados em intervalos de 10 minutos por até 1 hora, iniciando 10 minutos após o início das infusões (10, 20, 30, 40, 50, 60 e XNUMX minutos). A glicemia no sangue da cauda e da veia porta foi medida conforme descrito acima.
Voltametria cíclica de varredura rápida
Eletrodos
Microeletrodos de fibra de carbono foram preparados a partir de fibras de carbono T-7 de 300 µm de diâmetro (Amoco, Greenville, SC) conforme descrito anteriormente Quando necessário, epóxi foi adicionado à interface vidro/fibra para melhorar a vedação. Aproximadamente 50–100 µm de fibra foram deixados expostos após a vedação vidro/carbono. Todos os eletrodos foram embebidos em 2-propanol com carvão ativado Norit-A por pelo menos 10 minutos antes do uso. Após abaixarem até a profundidade inicial no núcleo accumbens, os eletrodos foram condicionados por ciclagem por 15 minutos a 60 Hz com forma de onda triangular (-0.4 V a 1.3 V vs Ag/AgCl a 400 V/seg) e, em seguida, por mais 15 minutos na frequência usada para coleta de dados, 10 Hz. Fios de prata clorada foram usados como eletrodos de referência e todos os potenciais foram relatados vs Ag/AgCl.
Eletroquímica
Para a voltametria cíclica de varredura rápida (FSCV), utilizamos um instrumento eletroquímico da UEI (University of North Carolina Department of Chemistry Electronics Facility, Chapel Hill, NC). Placas da National Instruments (PCI-6052 e PCI-6711E) e o software TH-1 (ESA, Chelmsford, MA) foram utilizados para geração de formas de onda, coleta de dados, filtragem digital e detecção e análise de transientes de dopamina. Para detectar a dopamina extracelular, uma forma de onda triangular (-0.4 V a 1.3 V vs. Ag/AgCl a 400 V/seg) foi aplicada ao microeletrodo de fibra de carbono a 10 Hz. As alterações na dopamina extracelular foram determinadas monitorando a corrente em uma janela de 100 mV no pico do potencial de oxidação da dopamina (cerca de 0.65 V). Correntes de dopamina in vivo foram convertidas em concentrações de dopamina pela calibração dos eletrodos após o uso experimental com duas soluções padrão de dopamina em um sistema de injeção em fluxo. A composição do tampão utilizado para a pós-calibração foi (em mM): 126 NaCl, 2.5 KCl, 2.4 CaCl21.2 MgCl22.0 Na2SO41.2 NaH2PO4, 15 TRIS HCl, pH=7.4.
Métodos in vivo
Doze ratos foram submetidos à recuperação após o implante do cateter por pelo menos 3 dias completos antes da privação noturna de alimento e água. Na manhã seguinte à privação, os ratos foram anestesiados com uretana (1.5 g/kg ip) e posicionados em um aparelho estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). A temperatura corporal foi mantida a 37 °C com uma almofada isotérmica Deltaphase (Braintree Scientific, Braintree, MA). O couro cabeludo e a fáscia subjacente foram ressecados e foram perfurados orifícios para os eletrodos de trabalho, estimulação e referência. As coordenadas estereotáxicas são dadas em mm (anteroposteriores - AP) e mediolaterais - ML) a partir do bregma, e dorsoventral - DV a partir da dura-máter. Um eletrodo estimulador bipolar (Plastics One Inc., Roanoke, VA) foi posicionado na área tegmentar ventral (ATV): −5.2 AP, +1.0 ML, −7.5 a −9.0 DV. Um microeletrodo de fibra de carbono foi colocado na concha do núcleo accumbens ipsilateral (+1.7 AP, 0.8 ML, −6.4 a −7.4 DV). Um fio de referência Ag/AgCl foi colocado no córtex contralateral. As concentrações extracelulares de dopamina resultantes de 24 sequências de estimulação de pulso de 60 Hz (bifásicas, 2 ms cada fase e 130 µA) da ATV foram registradas. As localizações dos eletrodos estimuladores e de trabalho foram otimizadas para encontrar locais que suportassem a liberação de dopamina estimulada eletricamente e transientes espontâneos de dopamina. Moldes de dopamina para identificação transiente subsequente foram feitos a partir de voltamogramas cíclicos obtidos da liberação estimulada. Todos os locais selecionados para análise transiente suportaram liberação estimulada de dopamina com uma relação sinal-ruído de 30 ou mais. A glicemia sanguínea da cauda foi determinada, conforme descrito acima, e os dados basais foram registrados por 6 a 10 minutos sem estimulação adicional. Imediatamente após a coleta final dos dados basais, a bomba de infusão foi ligada. Glicose (5% em solução salina) foi infundida (3 mL/5 min) na veia porta hepática ou jugular. Para o grupo controle, solução salina foi infundida na veia porta. Arquivos de um minuto foram registrados continuamente por 20 minutos, após os quais a glicemia sanguínea da cauda foi determinada novamente e a manutenção da liberação estimulada foi verificada. A medição da glicemia não pôde ser realizada em 2 animais devido a mau funcionamento do glicosímetro. Para determinar se o local de liberação de dopamina registrado era responsivo à inibição da captação de dopamina, uma injeção intraperitoneal de 15 mg/kg de cocaína foi administrada uma hora após a infusão. Os dados foram registrados por 25 minutos após a administração da cocaína e a liberação estimulada foi reavaliada. Em 4 animais, a frequência transitória havia se degradado ou era instável no momento da administração da cocaína.
Análise de Dados
Os resultados das análises de dados foram expressos como média ± erro padrão da média e 'n' é o número de ratos. As análises foram realizadas com o software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, Califórnia) ou NCSS 2000 (NCSS, Kaysville, UT), utilizando ANOVAs bidirecionais ou unidirecionais (com testes post-hoc de Bonferroni) e testes t para duas ou uma amostra. A correção sequencial de Bonferroni para comparações múltiplas foi realizada com o método de Holm. sempre que vários testes t independentes foram usados no mesmo conjunto de dados.
Medidas de Preferência Comportamental
Os testes de preferência de duas garrafas foram analisados calculando as taxas de preferência como
onde n(.) denota o número total de lambidas detectadas em um determinado bebedor durante uma sessão. Os testes de significância foram baseados em testes t de uma amostra contra 0.5, que é o valor de referência que significa indiferença em relação a qualquer um dos bebedores.
Medidas de glicemia sanguínea
A glicemia basal foi definida para cada local de coleta de sangue em cada animal por meio de uma única medição realizada imediatamente antes do início do consumo ou administração do estímulo. Os níveis de glicemia sanguínea foram analisados como valores absolutos (mg/dL) ou como % de variação em relação à linha de base. A glicemia média após o consumo ou administração do estímulo foi calculada e o maior valor de glicemia nesse período (pico glicêmico) também foi identificado.
Transientes de dopamina
Os transientes espontâneos de dopamina foram identificados usando um procedimento publicado que determinou a correspondência de picos putativos de dopamina com um voltamograma de modelo conhecido por ser dopamina Um voltamograma cíclico de dopamina resultante da liberação de dopamina estimulada eletricamente serviu como modelo. Os voltamogramas cíclicos basais foram subtraídos daqueles em cada ponto individual usando um algoritmo no software TH-1. Para cada arquivo de dados, essa análise incluiu quatro passagens usando durações basais de 0.5 a 1.5 segundos, iniciadas 0.5, 1.0, 1.5 ou 2.5 segundos antes do ponto de dados testado. Os critérios para determinar os transientes de dopamina foram extraídos de métodos publicados e incluíram dois pontos consecutivos (resolução de 0.1 segundo) que apresentaram alta correspondência com o modelo (r≥0.86). , , , Um programa Matlab personalizado tabulou o número de transientes e suas durações (em pontos de 0.1 s) e amplitudes, combinando os resultados de todas as passagens. Um transiente resultou de pelo menos dois pontos consecutivos identificados como dopamina. As amplitudes foram determinadas como o pico de corrente de dopamina do transiente menos a linha de base próxima ao início do pico do transiente e convertidas em concentração de dopamina após o in vitro pós-calibração . O número de pontos transientes consecutivos (0.1 seg) foi usado como duração do transiente .
Informações de Apoio
Figura S1
Consumo de água durante sessões de condicionamento. O consumo geral de água durante as sessões de condicionamento foi comparado usando ANOVA bidirecional de medidas repetidas. A. Animais condicionados com estímulos orais lamberam mais durante a administração do veículo do que durante a administração da glicose (F=8.3, p=0.02), mas não foram encontrados efeitos para o estímulo de condicionamento (5% vs. 15% de glicose, F=0.2, p=0.65) ou a interação entre esses fatores (F=0.05, p=0.82). Este efeito da redução da lambedura durante a disponibilidade de glicose foi, no entanto, menor, uma vez que não encontramos diferenças nas comparações pareadas entre o consumo em sessões de glicose vs. veículo para animais condicionados com 5% (4933 ± 117 vs. 5460 ± 141, t=2.3, p>0.05) e 15% de glicose (5136±259 vs. 5585±502, t=1.8, p>0.05; testes t de Bonferroni post-hoc). B. Semelhante aos achados durante o condicionamento oral, os animais condicionados com estímulos administrados na VJ lamberam mais durante a administração do veículo do que durante a administração de glicose ou sacarina (F=4.5, p=0.04), mas nenhum efeito foi encontrado para o estímulo de condicionamento (5% glicose vs. 22.5% glicose vs. 50% glicose vs. 3.16% sacarina, F=1.5, p=0.23) ou a interação entre esses fatores (F=1.4, p=0.27). Novamente, não foram encontradas diferenças nas comparações pareadas entre o consumo de glicose ou sacarina versus sessões de veículo para animais condicionados com 5% de glicose (6614±356 vs. 6466±334, t=0.3, p>0.05), 22.5% de glicose (5092±650 vs. 6157±245, t=1.7,p>0.05), 50% de glicose (4824±592 vs. 6062±763, t=2.5,p>0.05) e 3.16% de sacarina (4826±802 vs. 5250±512, t=0.6, p>0.05; testes t de Bonferroni post-hoc). C. Em animais com cateteres de veia porta-hepática (HPV), houve, em geral, mais lambidas naqueles condicionados com glicose em relação ao grupo manitol (F=259, p<0.0001), mas sem efeito para veículo vs. administração de glicose ou manitol (F=0.7, p=0.41) ou a interação entre esses fatores (F=0.1, p=0.73). Além disso, não encontramos diferenças nas comparações pareadas entre o consumo em sessões de glicose vs. veículo para animais condicionados com 5% de glicose (7314±148 vs. 7758±139, t=0.4, p>0.05) e 5% de manitol (3887±183 vs. 4244±574, t=0.8, p>0.05; testes t de Bonferroni post-hoc).
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Figura S2
Medições de glicemia sanguínea média e máxima (mg/dL) em animais acordados. A. Em animais condicionados oralmente, não foram encontradas diferenças para a glicemia média após 5% e 15% de glicose (84±7.4 vs. 94±3 respectivamente, t=1.4, p=0.23, teste t não pareado). B. A glicemia média após a administração oral de glicose a 15%, que foi eficaz no condicionamento da reversão do viés lateral, também foi comparada à resultante da administração intravenosa de glicose. Um efeito geral significativo foi encontrado (F=27.6, p < 0.0001, ANOVA unidirecional) e comparações pareadas em relação à glicose oral a 15% revelaram diferenças para JV 22.5% (220 ± 19.2, t=3.6, p<0.001) e 50% de glicose (315±33.6, t=7, p<0.001), mas não em relação à glicose a 5% (84±1.8, t=0.3, p>0.05; testes t de Bonferroni post-hoc). C. A glicemia média após a administração de HPV (93±5.9) e JV de 5% de glicose não foi significativamente diferente (t=1.7, p=0.13, teste t não pareado). D–F. Resultados semelhantes foram encontrados quando se comparou a glicemia de pico, em vez da glicemia média. Não foram encontradas diferenças entre os níveis de glicose de 5% e 15% (97 ± 2.5 vs. 102 ± 4.3, respectivamente, t=0.87, p=0.42, teste t não pareado; D). Nas comparações entre a glicose oral a 15% e a administração de glicose por via intravenosa, foi encontrado um efeito global significativo (F=34.4, p < 0.0001, ANOVA unidirecional) e comparações pareadas revelaram diferenças em relação ao JV 22.5% (319 ± 26.3, t=4.9, p<0.001) e 50% de glicose (424±42.1, t=8, p<0.001), mas não em relação à glicose a 5% (110±6.5, t=0.2, p>0.05; testes t de Bonferroni post-hoc; E). Finalmente, o pico de glicemia após a administração de HPV (93±5.9) e JV de 5% de glicose não foi significativamente diferente (t=2, p=0.08, teste t não pareado, F).
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Figura S3
Medições médias de glicemia sanguínea na cauda (% linha de base) em animais acordados. Dados de glicemia mostrados acima (Fig. S2), também foi analisado após normalização para a linha de base (% linha de base; veja também Figuras 2B, 2C e e3B3B para valores de pico) A. Em animais condicionados oralmente, não foram encontradas diferenças para a glicemia média após 5% e 15% de glicose (100±4.2 vs. 121±7.3, t=2.3, p=0.07, teste t não pareado). B. A glicemia média após a administração oral de glicose a 15%, que foi eficaz no condicionamento da reversão do viés lateral, também foi comparada à resultante da administração intravenosa de glicose. Um efeito geral significativo foi encontrado (F=20.8, p < 0.0001, ANOVA unidirecional) e comparações pareadas em relação à glicose oral a 15% revelaram diferenças para JV 22.5% (296 ± 29.4, t=3.6, p<0.01) e 50% de glicose (402±46.2, t=6.3, p<0.001), mas não em relação à glicose a 5% (130±6.4, t=0.2, p>0.05; testes t de Bonferroni post-hoc). C. A glicemia média após a administração de HPV (121±6.6) e JV de 5% de glicose não foi significativamente diferente (t=1, p=0.33, teste t não pareado).
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Figura S4
Duração e amplitude do transiente de dopamina no núcleo accumbens de ratos anestesiados, após administração de glicose ou veículo na veia porta-hepática ou jugular. A voltametria cíclica de varredura rápida foi utilizada para identificar eventos espontâneos de liberação de dopamina (transitórios) na concha do núcleo accumbens de ratos anestesiados. As medições foram realizadas durante um período basal e também durante e após a infusão de glicose a 5% na VJ (n=4) ou HPV (n=4), ou veículo neste último (n=4). A infusão de glicose no HPV, mas não na JV, demonstrou causar um aumento na frequência transitória de dopamina, quando comparada ao efeito da infusão de veículo no HPV (ver FIG. 5). A. Aqui mostramos a duração transitória (mseg.) antes da infusão (linha de base) e em intervalos de 5 minutos após o início da infusão, para o veículo HPV (linha de base, 464±204; 5 minutos, 371±117; 10 minutos, 316±29; 15 minutos, 350±74; 20 minutos, 402±82; quadrados azuis), glicose HPV (linha de base, 548±79; 5 minutos, 437±48; 10 minutos, 416±34; 15 minutos, 434±61; 20 minutos, 474±61; quadrados vermelhos) e glicose JV (linha de base, 534±120; 5 minutos, 507±142; 10 minutos, 464±41; 15 minutos, 396±108; 20 minutos, 493±97; quadrados pretos). A ANOVA bidirecional revelou a ausência de quaisquer efeitos significativos para o tratamento (F=1.6, p=0.21), tempo (F=0.9, p=0.49) e a interação entre esses fatores (F=0.08, p= B. Para amplitude transitória (nM), os valores para veículo HPV (linha de base, 35.9±7.4; 5 minutos, 32.8±7.1; 10 minutos, 29.7±7; 15 minutos, 26.5±5.3; 20 minutos, 24.4±3.3), glicose HPV (linha de base, 29.3±7.7; 5 minutos, 26.6±4.4; 10 minutos, 30.2±4.8; 15 minutos, 26.5±3.7; 20 minutos, 23.1±3.4) e glicose JV (linha de base, 26.3±1.2; 5 minutos, 21.7±1.8; 10 minutos, 24.9±1.8; 15 minutos, 25.9±1.2; 20 minutos, 25.8±3.4) também foram comparados usando ANOVA bidirecional, e nenhum efeito foi encontrado para o tratamento (F=1.4, p=0.25), tempo (F=0.7, p=0.58) e a interação entre esses fatores (F=0.4, p=
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Figura S5
Frequência, duração e amplitude transitórias de dopamina no núcleo accumbens de ratos anestesiados, após administração sistêmica de cocaína. Para determinar se o local de liberação de dopamina selecionado era responsivo à inibição da captação de dopamina, após a medição dos efeitos da administração de glicose sobre os transientes de dopamina no núcleo accumbens, 15 mg/kg de cocaína foram administrados por injeção intraperitoneal. Em 4 animais, a frequência dos transientes havia se degradado ou era instável. Os dados dos 8 ratos restantes são apresentados em conjunto, independentemente do grupo de tratamento. ANOVA unidirecional para medidas repetidas foi utilizada para investigar possíveis alterações na frequência, duração e amplitude dos transientes em intervalos de 5 minutos após a injeção ip, em comparação com o período basal imediatamente anterior à injeção de cocaína. A. A cocaína teve um efeito geral de aumento da frequência transitória (F=3.8, p=0.007) com efeito significativo em comparação à linha de base (2.2±0.7 transientes/min) em 20 minutos (7±2.1, t=3.3, p<0.05), mas não os demais pontos de tempo (5 minutos, 2.2±0.7, t=0.004; 10 minutos, 4.5±1.3, t=1.5; 15 minutos, 5.9±1.8, t=2.5; 25 minutos, 5.9±1.6, t=2.5; p>0.05 para todos; testes t de Bonferroni post-hoc). B. Durante um período transitório, a cocaína também teve um efeito global significativo (F=4, p=0.006), com efeitos significativos adicionais em comparação com a linha de base (423±32 ms) em 10 minutos (711±122, t=3.4, p<0.01), 15 minutos (736±126, t=3.7, p<0.01), 20 minutos (700±65, t=3.3, p<0.05) e 25 minutos, 705±76, t=3.4, p<0.01), mas não em 5 minutos (600±84, t=2.1; p>0.05; testes t de Bonferroni post-hoc). C. Os efeitos da cocaína na amplitude transitória não foram significativos, tanto no geral (F=1.3, p=0.31) e quando cada ponto de tempo foi comparado à linha de base (21.2±2.4 nM; 5 minutos, 23.7±1.9, t=1.1; 10 minutos, 25.5±3.8, t=1.9; 15 minutos, 26.5±3.2, t=2.3; 20 minutos, 23.9±1.8, t=1.2; 25 minutos, 23.6±2, t=1.1; p>0.05 para todos; testes t de Bonferroni post-hoc).
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Tabela S1
Medições de glicemia sanguínea (mg/dL) na cauda de animais acordados. Os ratos foram autorizados a beber água com a administração simultânea de uma das soluções de glicose usadas para condicionamento (5% ou 15% por via oral, 5%, 22.5% ou 50% no JV ou 5% no HPV). A glicemia foi medida a partir do sangue da cauda no início (linha de base) e no final (0′) da sessão comportamental de 10 minutos de duração, e a cada 10 minutos subsequentemente (10′–40′). A glicemia (mg/dL) foi comparada usando ANOVA bidirecional de medidas repetidas, revelando efeitos globais significativos para o estímulo (JV vs. HPV vs. glicose oral a 5% vs. glicose oral a 15% vs. glicose JV a 22.5% vs. glicose JV a 50%; F=25.4, p<0.0001), tempo (linha de base vs. 0′ vs. 10′ vs. 20′ vs. 30′ vs. 40′; F=42.24, p<0.0001) e a interação entre esses fatores (F=12.5, p < 0.0001). Comparações adicionais foram realizadas em cada momento entre a glicemia após a administração de glicose a 5% (JV), considerada como um estímulo de controle que não condicionou a reversão do viés lateral, e a glicemia medida após cada um dos estímulos de glicose restantes (ver detalhes nesta tabela). Dada a interação significativa, os dados também foram analisados separadamente para cada estímulo, mostrando um efeito significativo para o tempo em todos os casos (JV glicose a 5%, F=14.48, p<0.0001; JV 22.5% glicose, F=19.98, p<0.0001; JV 50% glicose, F=28.04, p<0.0001; glicose oral 15%, F=3.212, p=0.036; HPV 5% glicose, F=26.7, p<0.0001) com exceção da glicose oral a 5% (F=2.68, p=0.087; ANOVA unidirecional para medidas repetidas). Por fim, a glicemia em cada momento foi comparada com a respectiva medida basal (veja detalhes nesta tabela). Comparações significativas são destacadas em negrito. (basel. – baseline).
(DOC)
Tabela S2
Medições de glicemia sanguínea (mg/dL) em animais anestesiados. Os ratos foram anestesiados e então injetados com veículo ou uma das diferentes soluções de glicose usadas para condicionamento através do duodeno (água, n=5; 5% glicose, n=4; 15% glicose, n=6), JV (solução salina, n=5; 5% glicose, n=6; 22.5% glicose, n=4; 50% glicose, n=4) ou HPV (solução salina, n=4; 5% glicose, n=7) cateteres. A glicemia foi medida tanto no sangue da cauda quanto no sangue do HPV no início (linha de base) e no final (0′) da perfusão do estímulo, e a cada 10 minutos subsequentemente (10′–50′). Inicialmente, os dados foram analisados separadamente para as injeções de veículo e glicose, e para a glicemia da cauda e do HPV no sangue. A. Para as medições de glicemia sanguínea da cauda após as injeções do veículo, foi encontrado um efeito geral significativo para o tempo (linha de base vs. 0′ vs. 10′ vs. 20′ vs. 30′ vs. 40′ vs. 50′; F=2.6, p=0.02), mas não para o local da injeção (JV vs. duodenal vs. HPV; F=0.3, p=0.78) ou a interação entre esses fatores (F=1.1, p=0.4; ANOVA bidirecional de medidas repetidas). Comparações adicionais foram realizadas em cada momento entre a glicemia após solução salina JV e a observada após água duodenal ou solução salina para HPV (veja detalhes nesta tabela). B. Com as medições de glicemia sanguínea do HPV após injeções de veículo, não foram encontrados efeitos globais significativos para o tempo (F=1, p=0.41), local da injeção (F=1.3, p=0.31) nem a interação entre esses fatores (F=1.9, p=0.05; ANOVA bidirecional de medidas repetidas). Novamente, foram realizadas comparações em cada momento entre a glicemia após a administração salina JV e a observada após outras vias de administração do veículo (ver detalhes nesta tabela). C. Em relação às medições de glicemia sanguínea na cauda após injeções de glicose, um efeito geral significativo foi encontrado para o tempo (F=129.3, p<0.0001), estímulo (JV vs. HPV vs. glicose oral 5% vs. glicose oral 15% vs. JV 22.5% glicose vs. JV 50% glicose; F=45.5, p<0.0001) e a interação entre esses fatores (F=30.7, p < 0.0001; ANOVA bidirecional para medidas repetidas). Comparações adicionais foram realizadas em cada momento entre a glicemia após a administração de glicose a 5% (JV), considerada um estímulo de controle que não condicionou a reversão do viés lateral, e a observada após os demais estímulos de glicose (ver detalhes nesta tabela). D. Em termos de medições de glicemia sanguínea de HPV após injeções de glicose, um efeito geral significativo foi encontrado para o tempo (F=132, p<0.0001), estímulo (F=15.5, p<0.0001) e a interação entre esses fatores (F=27.5, p < 0.0001; ANOVA bidirecional para medidas repetidas). Novamente, comparações adicionais foram realizadas em cada momento entre as medições de glicemia após a administração de glicose a 5% e aquelas observadas após os estímulos de glicose restantes (ver detalhes nesta tabela). Comparações significativas são destacadas em negrito. (basel. – linha de base; dd. – duodenal; sal. – salina; wat. – água).
(DOC)
Tabela S3
Glicemia sanguínea média e máxima (mg/dL) em animais anestesiados. Medições de glicemia sanguínea de cauda e HPV em ratos anestesiados (ver Tabela S2) também foram analisados de acordo com os valores médios e máximos após a administração de glicose ou veículo (ou seja, 0′–50′). Como, como descrito acima, não foram encontradas diferenças gerais na glicemia de acordo com as diferentes vias de administração do veículo, os dados para o veículo foram incluídos como uma única categoria. Os estímulos de glicose que anteriormente não se mostraram eficazes no condicionamento da reversão do viés lateral são destacados em negrito. A. A glicemia média foi comparada usando ANOVA bidirecional de medidas repetidas, revelando efeitos globais significativos para o estímulo (JV vs. HPV vs. glicose duodenal 5% vs. glicose duodenal 15% vs. JV 22.5% glicose vs. JV 50% glicose vs. veículo; F=47.56, p<0.0001), território sanguíneo (cauda vs. HPV; F=13.44, p=0.0007) e a interação entre esses fatores (F=25.2, p < 0.0001). Diferenças significativas entre a glicemia de cauda e a glicemia de HPV também foram encontradas para vários estímulos individuais (veja detalhes nesta tabela). Dada a interação significativa entre os fatores, a glicemia de cauda e a glicemia de HPV foram analisadas separadamente e, em ambos os casos, diferenças significativas gerais foram encontradas (respectivamente: F=66.26, p<0.0001; F=31.84, p < 0.0001; ANOVA unidirecional). Comparações pareadas adicionais também foram realizadas separadamente para o sangue da cauda e do HPV entre as medidas de glicemia após a glicemia de 5% na VJ, considerada como um estímulo de controle que não condicionou a reversão do viés lateral, e aquelas observadas após os estímulos de glicose restantes. Para as medidas de sangue da cauda, tais diferenças foram encontradas para a glicose de 22.5% e 50% na VJ e o veículo, enquanto para as medidas de sangue do HPV, diferenças foram encontradas para a glicose duodenal de 15% e para a glicose de 22.5% e 50% na VJ (ver detalhes nesta tabela). B. A glicemia de pico foi comparada usando as mesmas metodologias. Encontramos efeitos globais significativos para o estímulo (F=160.1, p<0.0001), território sanguíneo (F=32.22, p<0.0001) e a interação entre esses fatores (F=10.46, p < 0.0001; ANOVA bidirecional de medidas repetidas), e também diferenças significativas entre a glicemia da cauda e a glicemia do HPV para vários estímulos (ver tabela). Novamente, tanto para a glicemia da cauda quanto para a glicemia do HPV, diferenças significativas foram encontradas em geral (respectivamente: F=154.8, p<0.0001; F=93.98, p < 0.0001; ANOVA unidirecional). Para as medições no sangue da cauda, a glicose duodenal a 5%, a glicose JV a 22.5% e 50% e o veículo diferiram significativamente da glicose JV a 5%, enquanto para as medições no sangue do HPV, foram encontradas diferenças para o veículo, a glicose HPV a 5%, a glicose duodenal a 15% e a glicose JV a 22.5% e 50%. Neste último caso, a glicose duodenal a 5%, o único outro estímulo de glicose que não condicionou a reversão do viés lateral em animais acordados, foi o único estímulo testado que não diferiu significativamente da glicose JV a 5% (ver detalhes nesta tabela). Comparações significativas são enfatizadas em negrito. (dd. – duodenal).
(DOC)
Tabela S4
Glicemia sanguínea média e máxima (% basal) em animais anestesiados. A glicemia média e máxima da cauda e do HPV no sangue também foram comparadas usando valores normalizados para medidas basais (% da linha de base; ver Tabelas S2 e S3). Novamente, os estímulos de glicose que anteriormente não demonstraram ser eficazes no condicionamento da reversão do viés lateral são enfatizados com texto em negrito. A. Para a glicemia relativa média, encontramos efeitos globais significativos para o estímulo (F=61.8, p<0.0001), território sanguíneo (F=10.98, p=0.002) e a interação entre esses fatores (F=21.45, p < 0.0001; ANOVA bidirecional para medidas repetidas), e diferenças significativas entre a glicemia da cauda e a glicemia do HPV foram encontradas para vários estímulos específicos (veja detalhes nesta tabela). Dada a interação significativa entre os fatores, a glicemia da cauda e a glicemia do HPV também foram analisadas separadamente, e efeitos globais significativos foram encontrados tanto para o sangue da cauda (F=78.37, p<0.0001) e dosagens sanguíneas de HPV (F=39.95, p < 0.0001; ANOVA unidirecional para medidas repetidas). Como feito anteriormente, comparações pareadas adicionais foram realizadas entre as medidas de glicemia após a glicemia de 5% na VJ, considerada como um estímulo de controle que não condicionou a reversão do viés lateral, e aquelas observadas após os estímulos de glicose restantes. Para o sangue da cauda, as glicemias de 22.5% e 50% na VJ foram significativamente diferentes, enquanto para o sangue do HPV, diferenças foram encontradas para a glicemia de 5% na VJ, glicemia duodenal de 5% e 15% e VJ de 22.5% e 50% (ver tabela). B. Para o pico de glicemia relativa, foram encontrados efeitos principais significativos para o estímulo (F=112.2, p<0.001), território sanguíneo (F=29.6, p<0.001) e a interação entre esses fatores (F=11.4, p < 0.001; ANOVA bidirecional para medidas repetidas), e também para vários estímulos específicos entre a glicemia da cauda e a glicemia do HPV (ver detalhes nesta tabela). Dada a interação significativa entre os fatores, a glicemia da cauda e a glicemia do HPV foram analisadas separadamente e, em ambos os casos, foram encontradas diferenças significativas (respectivamente: F=85.92, p<0.001 e F=92.8, p < 0.001; ANOVA unidirecional para medidas repetidas). Além disso, para as medições sanguíneas na cauda, apenas a glicose JV 22.5% e 50% e o veículo diferiram significativamente da glicose JV 5%, enquanto para as medições sanguíneas do HPV foram encontradas diferenças para todos os estímulos, exceto para a glicose duodenal 5%, o único outro estímulo de glicose que não resultou em reversão do viés lateral (ver detalhes nesta tabela). Comparações significativas são destacadas em negrito. (dd. – duodenal).
(DOC)
Tabela S5
Frequência transitória de dopamina no núcleo accumbens de ratos anestesiados, após administração de glicose ou veículo na veia porta-hepática ou jugular. A voltametria cíclica de varredura rápida foi utilizada para identificar eventos espontâneos de liberação de dopamina ou "transitórios" na concha do núcleo accumbens de ratos anestesiados. As medições foram realizadas durante um período basal e também durante e após a infusão de glicose a 5% na VJ (n=4) ou HPV (n=4), ou veículo neste último (n=4). A infusão de glicose no HPV, mas não na JV, demonstrou causar um aumento na frequência transitória de dopamina, quando comparada ao efeito da infusão do veículo no HPV e também aos respectivos valores basais (ver também FIG. 5). As comparações significativas são destacadas em negrito. (sal. – solução salina).
(DOC)
Agradecimentos
Agradecemos a Teresa Maia, Jim Meloy e Gary Lehew pelo suporte técnico, e a Susan Halkiotis pela revisão do manuscrito.
Notas de rodapé
Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Financiamento: Este trabalho foi apoiado pela Subvenção nº R01DC001065 concedida a Sidney Simon pelo Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação (NIDCD). Os financiadores não tiveram qualquer papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito. O conteúdo é de exclusiva responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIDCD ou dos Institutos Nacionais de Saúde.
Referências