Dieta rica em gordura aumenta a autoadministração de sacarose em ratos jovens (2013)

Dianne P. Figlewicz,^1,2 Jennifer L. Jay,² Molly A. Acheson, Irwin J. Magrisso,⁴ Constance H. West,¹ Aryana Zavosh,² Stephen C. Benoit,³ e Jon F. Davis³

Nós relatamos anteriormente que uma dieta moderadamente rica em gordura aumenta a motivação para a sacarose em ratos adultos. Neste estudo, testamos os efeitos motivacionais, neuroquímicos e metabólicos da dieta rica em gordura em ratos machos em transição durante a puberdade, durante as semanas 5-8 de idade. Observamos que a dieta rica em gordura aumentou a resposta motivada para a sacarose, que era independente de alterações metabólicas ou alterações nos metabólitos de neurotransmissores de catecolaminas no nucleus accumbens. No entanto, os níveis de RNAm AGRP no hipotálamo foram significativamente elevados. Nós demonstramos que a ativação aumentada de neurônios AGRP está associada com o comportamento motivado, e que a administração de AGRP exógena (terceiro cerebroventricular) resultou em motivação significativamente aumentada para a sacarose. Essas observações sugerem que o aumento da expressão e da atividade da AGRP no hipotálamo medial pode estar por trás do aumento da resposta à sacarose causada pela intervenção da dieta hiperlipídica. Finalmente, comparamos a motivação para a sacarose em ratos puberais versus adultos e observamos maior motivação para a sacarose nos ratos da puberdade, o que é consistente com relatos anteriores de que animais jovens e humanos têm uma preferência crescente pelo sabor doce, em comparação com adultos. Juntos, nossos estudos sugerem que a dieta de base exerce um forte papel modulador na motivação para o sabor adocicado em animais adolescentes.

Assuntos

Os sujeitos eram ratos albinos machos de Simonsen (Gilroy, CA). Os ratos foram mantidos com ração (Laboratory Rodent Diet 5001, LabDiet) ou dieta moderada com alto teor de gordura (31.8%; Research Diets Inc) ad libitum. As dietas são combinadas para o conteúdo geral de carboidratos (58% kcal vs. 51% kcal para baixo teor de gordura vs. alto teor de gordura, respectivamente). A ração com baixo teor de gordura tem 6.23 gm% de açúcares livres e a dieta rica em gordura tem 29 gm% de sacarose. Eles foram mantidos em um ciclo 12: 12 h claro-escuro com luzes acesas no 6 AM. Salvo indicação em contrário, os ratos foram trazidos para a 3 semanas de idade, imediatamente após o desmame, e foram alojados para aclimatação até 5 semanas de idade. Nessa idade, a dieta e / ou treinamento comportamental e testes foram iniciados. Os protocolos específicos são descritos em detalhes abaixo e resumidos em tabela 1. Porque ratos machos passam pela puberdade no 6^th-7^th na semana de idade, o tempo dos estudos foi projetado para estudar ratos à medida que eles atravessam esse estágio de desenvolvimento. Todos os procedimentos realizados nos ratos seguiram as diretrizes do NIH para cuidados com os animais e foram aprovados pelo Subcomitê de Cuidados e Uso de Animais do Comitê de Pesquisa e Desenvolvimento do Sistema de Assistência à Saúde VA Puget Sound.

  

tabela 1

Protocolos Experimentais

Autoadministração de sacarose

Protocolo Geral. Os procedimentos foram baseados em nossa metodologia publicada (Figlewicz et al., 2008; Figlewicz et al., 2006). Todos os procedimentos de treinamento e teste foram realizados entre 0700 e 1200 hr. O experimento incluiu fases 2-3: formação automática e relação fixa (FR); cirurgia e recuperação em coortes especificadas (ver tabela 1); e treinamento de relações progressivas (PR) usando o algoritmo PR de Richardson e Roberts (Richardson & Roberts, 1996). O algoritmo PR requer 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437 ( etc) alavanca pressiona para entregas de recompensa sucessivas dentro de uma sessão e é um teste rigoroso para motivação e recompensa (575). Os ratos foram treinados para auto-administrar 759% de sacarose (999 ml de recompensa) entregue em um recipiente de gota líquida. As caixas operantes, controladas por um sistema da Med Associates (Georgia, VT), tinham duas alavancas, mas apenas uma alavanca (uma alavanca ativa e retrátil) ativava a bomba de infusão. Prensas na outra alavanca (uma alavanca inativa, estacionária) também foram gravadas. A solução de sacarose foi entregue em um recipiente de gota líquida para consumo oral (Med Associates). O treinamento inicial foi conduzido durante sessões de uma hora para 999 dias sob um esquema de reforço contínuo (FR27: cada alavanca foi reforçada), com um máximo possível de recompensas 5 de sacarose entregues por sessão. Cada sessão começou com a inserção da alavanca ativa e a iluminação de uma luz branca que permaneceu ligada durante toda a sessão. Um tom 0.5-s (10 Hz, 1 dB acima do fundo) + luz (50 W luz branca acima da alavanca ativa) sinal composto discreto acompanhou cada entrega de recompensa, seguido por um tempo 5-sec após cada entrega de sacarose. O treinamento de RP foi realizado para um máximo possível de 2900 h / dia por dez dias. As sessões diárias terminaram depois de 20 min sem resposta ativa da alavanca, momento em que a luz da casa foi desligada e a alavanca ativa retraída.

Efeito da AGRP na autoadministração de sacarose

Como nossos resultados mostraram um aumento da expressão de AGRP mRNA em ratos da puberdade alimentados com a dieta rica em gordura, queríamos confirmar que a AGRP poderia aumentar a auto-administração da sacarose. Ratos velhos alimentados com ração 5-wk foram tomados através de treinamento FR, então receberam cânulas no terceiro ventrículo cerebral (ICV). Após uma semana de recuperação, a confirmação da colocação com um teste de resposta à ingestão de angiotensina II Figlewicz et al., [2006]), e uma sessão de FR de re-treinamento, ratos foram iniciados no paradigma de auto-administração PR. Após o PR Day 1, os ratos foram atribuídos a um dos dois grupos de modo que o desempenho médio do Dia X PRUM não diferiu entre os dois grupos (veículo artificial do LCR, aCSF; ou AGRP, 1 μl de 2 nmol). Eles receberam injeções de aCSF (n = 0.01) ou AGRP (n = 8) nos dias PR 7, 2 e 5. A ingestão diária total de alimentos foi quantificada durante o tempo de treinamento de RP.

Efeito da idade na autoadministração de sacarose

Nós comparamos o comportamento de auto-administração entre os ratos da puberdade e adultos jovens, alimentados com ração ou a dieta 31.8% de gordura. Os ratos tiveram duas semanas de aclimatação ao biotério VAPSHCS (3 - 5wk ou 8 - 10 wk). Eles então receberam a dieta durante todo o período de teste / treinamento (4 semana). Assim, tal como na experiência inicial, os ratos da puberdade foram estudados com 5-8 semanas de idade. Os adultos jovens foram estudados com 10-13 semanas de idade.

Determinação da composição corporal

A composição corporal foi medida por espectroscopia de ressonância magnética quantitativa (QMRNixon e outros, 2010]) para determinar o teor de água corporal de ratos individuais, a partir dos quais é calculada a gordura corporal relativa. Os animais foram colocados em suportes cilíndricos não anestesiados e, em seguida, os suportes são inseridos na máquina QMR para uma varredura de minutos 2, que realiza medições triplicadas. Os dados são salvos em um computador integrado (EchoMRI, Echo Medical Systems, Houston, TX) para o cálculo imediato da água corporal, gordura e massa magra.

Teste de tolerância à glicose intravenosa (IVGTT)

IVGTTs Conscientes foram realizados em ratos com cânulas IV implantadas cronicamente, que foram jejuados durante a noite antes do estudo, utilizando metodologia baseada em Frangioudakis, Gyte, Loxham, & Poucher (2008). As cânulas intravenosas bilaterais foram implantadas duas semanas antes do estudo, conforme nossa metodologia estabelecida (Figlewicz et al., 2009). As amostras de base foram colhidas em t-10 min (0.5 ml para determinação de insulina e glicose, em todos os momentos) e t0 min. Os ratos receberam uma infusão de 1 gm glucose / 2ml / kg ao longo de 15-20 segundos seguidos por 0.5 ml de lavagem de solução salina. Amostras de sangue foram coletadas em 5, 15, 30, 60, 90 e 120 min. Devido à obstrução de um cateter durante o procedimento (portanto, incapacidade de obter amostras de sangue), os resultados finais para o baseline / IVGTT apresentados são 7-8 para ratos alimentados com ração e 8 para ratos alimentados com 31.8% de gordura (tabela 3). A insulina no plasma foi determinada utilizando kits RIA de insulina de rato Linco (# RI-13K e SRI-13K, Linco) e a glucose no plasma foi determinada num YSI Glucose Analyzer). A área sob a curva (AUC) para a resposta da linha de base foi calculada em 5 min e 120 min. O índice HOMA foi calculado em jejum (glicose [mM] × insulinm [U / L]) / 22.5 e foi calculado utilizando amostras de jejum terminal medidas para insulina e glicose.

  

tabela 3

Parâmetros Metabólicos¹

Parâmetros metabólicos de jejum

Os ratos da Experiência 1 foram submetidos a jejum durante a noite antes da eutanásia, alguns dias após a conclusão do IVGTT. Os ratos foram profundamente anestesiados com inalação de isoflurano e exsanguinação. Cérebros foram rapidamente removidos e congelados em nitrogênio líquido para a mensuração de mRNA do peptídeo hipotalâmico e catecolaminas do nucleus accumbens. Plasma ou soro terminal foram utilizados para medição de insulina, glicose, leptina e triglicerídeos em jejum. Para os triglicerídeos, foi utilizado o kit Point Scientific Triglyceride GPO # T7531-400 (Fisher # 23-666-418) e os padrões KIT # 7531-STD (Fisher 23-666-422) e 3 de soro foi ensaiado em duplicata. A leptina no plasma foi medida com o Kit Millipore Linco RIA # RL 83K.

Métodos de HPLC de catecolaminas [Davis et al., 2008]

Os ratos foram eutanasiados com anestesia com isoflurano e os cérebros foram rapidamente removidos, congelados e armazenados a -80 ° C. Micro-punções bilaterais do nucleus accumbens (NAcc) foram isoladas de cada animal. Embora tenham sido tomados cuidados substanciais para minimizar a contaminação por regiões cerebrais vizinhas, devido à natureza e tamanho de cada micro-perfuração, nosso método não nos permitiu distinguir sub-regiões (isto é, núcleo NAcc vs. casca) dentro do NAcc. Para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), uma solução antioxidante (0.4 N perclorato, 1.343 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 0.526 mM metabissulfito de sódio foi adicionada às amostras, seguida de homogeneização usando um homogeneizador de tecido ultrassônico (Biologics; Gainesville, VA). Uma pequena porção do homogenato de tecido foi dissolvida em 2% dodecil sulfato de sódio (SDS) (w / v) para determinação de proteínas (Kit de Reação Proteica Pierce BCA; Rockford, IL) .A suspensão restante foi centrifugada em 14,000 g para 20 min em uma centrífuga refrigerada O sobrenadante foi reservado para HPLC.

As amostras foram separadas em coluna Microsorb MV C-18 (5 Am, 4.6_250 mm, Varian; Walnut Creek, CA) e examinadas simultaneamente para DA, ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA), ambos marcadores de degradação da dopamina, 5-HT e 5-HIAA. Os compostos foram detectados utilizando um detector de arranjo coulométrico de canal 12 (CoulArray 5200, ESA; Chelmsford, MA) ligado a um Sistema de Distribuição de Solvente Waters 2695 (Waters; Milford, MA) nas seguintes condições: caudal de 1 ml / min; potenciais de detecção de 50, 175, 350, 400 e 525 mV, e; potencial de lavagem de 650 mV. A fase móvel consistiu de uma solução de metanol 10% em H destilado₂O contendo 21 g / l (0.1M) ácido cítrico, 10.65g / l (0.075M) Na2HPO4, 176 mg / l (0.8M) ácido heptanossulfónico e 36 mg / l (0.097 mM) EDTA a um pH de 4.1. Amostras desconhecidas foram quantificadas contra uma curva padrão 6 com um mínimo de R² de 0.97. Amostras de controle de qualidade foram intercaladas com cada execução para garantir a calibração de HPLC.

Peptídeos orexigênicos mRNA qPCR

Medimos a expressão de peptídeos hipotalâmicos que estimulam a alimentação e têm sido implicados em comportamentos de motivação e recompensa (Figlewicz & Sipols, 2010): neuropéptido Y (NPY [ Hahn, Breininger, Baskin, & Schwartz, 1998; Jewett et al., 1995; Kelley, Nannini, Bratt, & Hodge, 2001]); peptídeo relacionado à cutia (AGRP [Aponte, Atasoy, & Sternson, 2011; Barnes, Argyropoulos e Bray, 2010; Broberger et al., 1998; Hagan e outros, 2000; Hahn, Breininger, Baskin, & Schwartz, 1998; Kaushik et al., 2011; Krashes et al., 2011; Rossi et al., 1998; Tracy et al., 2008]); e orexina (Cason e outros, 2010; Choi, Davis, Fitzgerald e Benoit, 2010) Os ratos foram sacrificados com anestesia com isoflurano e os cérebros foram rapidamente removidos, congelados e armazenados a -80 ° C até o processamento. O hipotálamo medial e lateral foram microdissecados como um bloco usando um plano de congelamento AHP-1200CPV (Thermoelectric Cooling America, Chicago, Il) que manteve uma temperatura constante de 12 ° C durante todo o processo de dissecção. O RNA total de tecido microdissecado foi isolado pelo reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e purificado usando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total foi tratado para remover qualquer contaminação de DNA genômico potencial usando DNase livre de RNase (Promega, Madison, WI) e foi quantificado usando um espectrofotômetro NanoVue (GE Healthcare, Cambridge, UK). A qualidade do RNA foi confirmada por eletroforese em gel de agarose padrão. O DNA complementar (cDNA) foi então retrotranscrito (RT) de 1-2 μg de RNA total por uma mistura de hexâmeros aleatórios e iniciação de oligo DT usando o kit de síntese de cDNA iScript (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Reações não retrotranscritas (sem RT) também foram preparadas a partir de cada amostra para controlar a potencial contaminação do DNA genômico. O cDNA e os controles sem RT foram diluídos, e 5-10 ng de cDNA modelo de cada amostra foi usado para medir a expressão de mRNA de genes selecionados por PCR quantitativo em tempo real utilizando o sistema de detecção de PCR em tempo real MyIQ (Bio-Rad, Hercules , CA). Medições triplicadas para cada amostra foram executadas em placas de 96 poços iCycler padrão, juntamente com nenhum controle de modelo (NTC) para detectar potencial contaminação cruzada, em volumes de reação de 20 μl consistindo em 10 μl 2 × iQ Sybr Green Supermix (Bio- Rad, Hercules, CA), 2 μl de 0.2-0.5 μM cada iniciador, 3 μl de água DEPC e 5 μl de modelo. Todas as reações qPCR incluíram uma análise da curva de fusão para garantir a especificidade do sinal. A expressão relativa para cada gene de interesse foi calculada por extrapolação para uma curva padrão executada individualmente em cada placa e derivada de diluições em série de uma amostra combinada de cDNA de referência e normalizada para a expressão relativa de genes de referência (fosfoproteína ribossômica ácida 36B4 para expressão gênica em tecido hipotalâmico e proteína ribossomal mitocondrial L32 para expressão no núcleo accumbens). As seguintes sequências de iniciadores (IDT, San Diego, CA) foram usadas para amplificar a prepro-orexina, NPY e AGRP de rato: Prepro-orexina, Forward: 5′-TTCCTTCTACAAAGGTTCCCT-3 ′, 5′-GCAACAGTTCGTAGAGACGGCAG-3 ′; NPY: Forward, 5- TACTCCGCTCTGCGACACTACATC-3 ′; Reverso: 5′-CACATGGAAGGGTCTTCAAGCC-3 ′; AGRP, Encaminhar: 5′-GCAGAAGGCAGAAGCTTTGGC-3 ′; Reverso: 5′-CCCAAGCAGGACTCGTGCAG-3 ′.

Imunocitoquímica cFos (ICC) e quantificação

Fluorescência O CCI foi utilizado para identificar corpos celulares neuronais FO positivos e AGRP-positivos no hipotálamo medial, de acordo com nossa metodologia estabelecida (Figlewicz et al., 2011) No último dia (PR Dia 10), os ratos foram colocados em suas câmaras de auto-administração, como de costume, por 90 min. Imediatamente após a última sessão de 90 minutos, os ratos foram profundamente anestesiados com inalação de isoflurano e perfundidos com NaCl a 0.9% seguido de solução fria de paraformaldeído a 4%. O tempo para anestesia e eutanásia foi baseado no tempo conhecido do pico de expressão da proteína cFos em 90-120 minutos após o evento. Assim, a expressão de cFos refletiria a ativação do SNC no início da tarefa comportamental, em vez de ser o resultado dos animais experimentando a tarefa. Os cérebros foram removidos e pós-fixados em paraformaldeído por vários dias e, posteriormente, colocados em solução de sacarose-PBS a 20% e, em seguida, em solução de PBS de sacarose a 30%. Os cérebros foram seccionados em um criostato (criostato Leica CM 3050S) para imuno-histoquímica. Usamos nossa metodologia estabelecida para quantificar a proteína cFos imunorreativa em seções do cérebro (Figlewicz et al., 2011). Secções coronais inteiras de cérebros 12 μm montados em lâminas foram lavadas três vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS, OXOID, Hampshire, Inglaterra). As secções foram lavadas durante 20 min com 100% de etanol / DI água (50%, v / v) seguido de uma lavagem com PBS, depois bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente em PBS contendo 5% de cabra normal ou soro de burro. As secções foram então lavadas várias vezes em PBS e incubadas durante a noite a 4 ° C em soluções de anticorpo primário formadas em PBS. As secções foram lavadas três vezes em PBS e depois incubadas no escuro à temperatura ambiente numa solução de anticorpo secundário preparada em PBS durante 1 hora. As secções foram subsequentemente lavadas de novo em PBS, e montadas e cobertas com deslizamento em meio de montagem de meio duro de montagem Vectashield (Vector; Burlingame, CA). As imagens digitais das seções foram adquiridas usando um microscópio de fluorescência Nikon Eclipse E-800 conectado a uma câmera de captura digital Qimaging Retiga usando o software NIS Elements (Nikon).

Com base em estudos de PCR demonstrando níveis aumentados de RNAm de AGRP, focalizamos as regiões hipotalâmicas mediais, particularmente o núcleo ventromedial e o núcleo arqueado (ARC)). As secções 12 μm combinadas com Atlas foram avaliadas quanto à expressão e quantificação de cFos em secções e regiões correspondentes, com base no atlas de Paxinos e Watson [2005]. Para quantificação (em 40 × ampliação), as regiões correspondidas pelo atlas foram selecionadas. O software NIS Elements (Nikon) foi utilizado para capturar uma imagem da área desejada. Uma área foi delineada para contagem e o limiar para contagens celulares positivas foi estabelecido. A área idêntica e fundo (limiar) foram utilizados para seções dos respectivos grupos experimentais, e a contagem de software de células positivas (quantificação) foi realizada na mesma sessão para todos os grupos experimentais, para evitar mudanças entre as sessões no cenário de fundo. Para análise estatística, as contagens foram feitas a partir de um rato individual somente se seções correspondentes ou completas em cada área estivessem disponíveis; dados para uma área específica não foram retirados de um rato se houvesse representação bilateral incompleta para aquela área.

Além da quantificação de cFos, foi realizada imuno-histoquímica de duplo marcador quantitativo para cFos e AGRP. Como não desejamos atrapalhar o desempenho comportamental dos animais, eles não foram pré-tratados com colchicina para otimizar a visualização da AGRP. Portanto, a visualização de neurônios AGRP-positivos pode estar subestimada. O procedimento de coloração dupla para AGRP foi comparável ao ensaio de imunorreatividade cFos por conta própria, exceto que as seções foram bloqueadas por uma hora em temperatura ambiente em PBS-5% de soro de burro. Depois, uma mistura de fos-Ab e anticorpos primários AGRP foi usada para incubação durante a noite a 4 ° C; da mesma forma, ambos os anticorpos secundários estavam na mesma solução e incubados por uma hora no escuro em temperatura ambiente. Os ensaios de otimização iniciais foram realizados para determinar uma diluição apropriada dos anticorpos primários. Os anticorpos primários usados ​​foram anti-cFos de coelho (1: 500) (sc-52) e anti-AGRP de cabra (1: 100) (18634) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Os anticorpos secundários usados ​​foram anti-coelho de burro conjugado com Cy3 (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA) e IgG anti-cabra de burro Alexa fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR); todos os anticorpos secundários foram diluídos a 1: 500.

análise estatística

Os dados do grupo são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM) no texto, tabelas e figuras. A significância é definida como p ≤ 0.05. As comparações estatísticas são feitas entre grupos experimentais, conforme apresentado em “Resultados” usando o teste de Student não pareado (por exemplo, dieta, idade ou comparação de tratamento). A 'normalização' dos dados é definida à medida que são usados.

Efeito da dieta hiperlipídica moderada na motivação peri-puberal para a sacarose

Os ratos alimentados com a dieta 31.8% de gordura durante as semanas 5-8, enquanto nas sessões de auto-administração, tiveram uma motivação significativamente elevada para a sacarose, em comparação com os ratos alimentados com ração. Como mostrado em Figura 1a, não houve diferença no desempenho durante o treinamento FR inicial (médias pressões de alavancas ativas FRNays 1-10, 38 ± 5 vs. 39 ± 2 para ração vs. 31.8% de gordura, respectivamente). No entanto, quando os ratos foram transferidos para a tarefa de RP mais rigorosa, houve um aumento significativo do número de pressões de alavanca ativas e do número de recompensas de sacarose obtidas, mas não na duração total da sessão (Figura 1b). Não houve efeito do tratamento com dieta crónica no número de prensas de alavanca inativas. Quando os ratos foram alimentados com a dieta rica em gorduras durante as semanas 5-8, mas posteriormente retornaram a uma dieta através do treinamento FR e PR durante as semanas 9-12, houve uma tendência, mas nenhuma diferença significativa nas pressões ativas de alavanca. Assim, parece não haver nenhum efeito de carry-over comportamental de uma dieta moderadamente rica em gordura consumida durante o período peri-púbere. Os dados dos parâmetros de PR para essas coortes são resumidos em tabela 2. A fim de começar a elucidar o (s) mecanismo (s) contribuinte (s) para o aumento induzido pela dieta na motivação da sacarose, realizamos uma série de medidas metabólicas e do SNC.

  

Figura 1

A resposta motivada pela RP para recompensas de sacarose é aumentada em ratos peripubérter alimentados com uma dieta 31.8% de gordura (n = 8). 1a. Nas sessões de FR, não houve efeito da dieta, mas o efeito da dieta é manifesto quando os ratos são transferidos para o paradigma da RP. 1b. Os dados são ...

  

tabela 2

Efeito da dieta hiperlipídica hiperpiperídica sobre o desempenho das taxas progressivas para a sacarose

Efeito da dieta moderada rica em gordura nos parâmetros metabólicos

Imediatamente após a conclusão do teste comportamental, a composição da gordura corporal foi determinada em ratos que tiveram a intervenção da dieta e o paradigma comportamental durante as semanas 5-8. Os ratos receberam então cânulas intravenosas crónicas para testes (conscientes) de tolerância à glucose IV (IVGTT). Subsequentemente, plasma e soro em jejum terminal foram obtidos para medidas metabólicas adicionais. Como mostrado em tabela 3, não houve diferenças na composição corporal, peso corporal, medidas de glicose ou insulina em jejum, sensibilidade à insulina (cálculo de HOMA) ou respostas ao IVGTT, entre os ratos alimentados com dieta e com alto teor de gordura. As medições de leptina e triglicerídeos em jejum terminal não diferiram entre os dois grupos. Assim, embora o tratamento com dieta tenha um efeito significativo sobre a motivação para a sacarose, ela reflete uma resposta comportamental em ratos com alto teor de gordura que são pré-obesos.

Efeito da dieta hiperlipídica moderada sobre a neuroquímica homeostática e recompensadora do sistema nervoso central

Para além das medições metabólicas terminais, os cérebros da coorte que tiveram tanto a intervenção na dieta como o treino comportamental durante as semanas 5-8 foram medidos para os perfis de aminas do núcleo accumbens (n ​​= 4 por grupo de dieta) ou os níveis de ARNm dos péptidos hipotalâmicos orexigénicos. Como mostrado em tabela 4, não houve efeito significativo da dieta hiperlipídica sobre os metabólitos da dopamina, noradrenalina ou serotonina no nucleus accumbens, um local central de recompensa e atividade motivacional (Ikemoto e Panksepp, 1996; Kelley & Berridge, 2002) em que cada um desses sistemas de neurotransmissores desempenha um papel regulador fundamental. Dentro dos extratos hipotalâmicos, os níveis de mRNA dos peptídeos orexigênicos, NPY, AGRP e orexina foram medidos. Uma tendência forte, mas não significativa, de aumento de AGRP em ratos alimentados com gordura foi observada nesta coorte (n = 8 para qualquer dieta); portanto, repetimos o paradigma de treinamento dietético / comportamental em uma coorte adicional e medimos o mRNA do NPY, AGRP e orexina no hipotálamo. Nas coortes combinadas, observamos um aumento significativo (p <0.05) no mRNA de AGRP em ratos alimentados com dieta rica em gordura vs. controles de ração (Figura 2), mas sem alteração significativa na expressão de NPY ou orexina. Para avaliar possíveis conexões entre expressão de AGRP e comportamento de autoadministração, medimos os neurônios imunopositivos cFos e AGRP no hipotálamo mediobasal. Grupos de ratos foram alimentados com ração ou dieta com 31.8% de gordura; alguns foram tomados através do protocolo de auto-administração (semanas 5-8) e outros foram tratados como controles comportamentais. Figura 3a mostra um exemplo de co-localização de cFos e AGRP em um neurônio núcleo arqueado. Como resumido em tabela 5, a ativação de neurônios AGRP (co-expressão de cFos-ICC e AGRP-ICC dentro das mesmas células) foi associada à atividade de auto-administração. Isso é demonstrado em Figura 3b, onde o número de neurônios ativados (cFos positivos) é mostrado como a contagem de células neuronais, ou como porcentagem de neurônios AGRP-positivos totais: há ativação significativa de neurônios AGRP nos ratos auto-administrando sacarose, contra os controles de manipulação , nos grupos de dieta combinada. Uma comparação de tratamento dentro da dieta para o número de neurônios AGRP ativados no grupo de auto-administração vs. controles de manipulação mostrou uma tendência que não alcançou significância estatística (comida, p = .078; 31.8% dieta gorda, p = .073) . É importante ressaltar que esses dados não apenas vinculam a ativação neuronal da AGRP com o comportamento de autoadministração, mas devido ao tempo para a medição de cFos (90 minutos após os ratos serem colocados em suas câmaras de autoadministração), a expressão de cFos reflete a atividade dos neurônios AGRP. antecipação ou no início da actividade de auto-administração. Houve uma tendência não significativa para aumento de neurônios AGRP-positivos totais no grupo de auto-administração (vs. controles de manipulação, p = 0.16). Naqueles ratos, onde a pressão de alavanca foi combinada entre os grupos de dieta, o número de neurônios positivos para AGRP também foi combinado. Não houve efeito do tratamento da dieta sozinho no número de neurônios AGRP-positivos nos ratos controle comportamentais.

  

Figura 2

Efeito da dieta com 31.8% de gordura na expressão do mRNA do peptídeo hipotalâmico medial. Os dados são normalizados para ratos alimentados com alto teor de gordura (n = 17) em comparação com os controles de ração (n = 16). O mRNA de AGRP está significativamente elevado (p <0.05).

  

Figura 3

Ativação de neurônios AGRP no início da autoadministração de sacarose. 3a. Co-localização de cFos e AGRP em neurônios nucleares arqueados, ampliação de 60x. 3b. Número de neurônios imunopositivos AGRP ativados (cFos-imunopositivos) no hipotálamo mediobasal ...

  

tabela 4

Nucleus Accumbens Amine Metabolites

  

tabela 5

Ativação Agrp Neuron: Dieta e Tratamento Comportamental

Efeito da administração de AGRP na motivação da sacarose

Nossa interpretação deste achado é que a expressão de AGRP nos ratos da puberdade é um mecanismo chave subjacente à auto-administração aumentada de sacarose dos ratos alimentados com dieta rica em gordura. Para confirmar a eficácia da AGRP para aumentar a motivação para a sacarose, a AGRP foi administrada através do terceiro ventrículo a ratos peri-púberes alimentados com ração durante a porção PR do paradigma comportamental. Este regime de dose de AGRP foi sub-limiar para a estimulação da ingestão de ração ao longo das duas semanas do paradigma PR, mas resultou no aumento significativo da auto-administração de sacarose, como mostrado na Figura 4. (Observe que cada recompensa de sacarose tem um conteúdo calórico de 0.1 kcal, portanto, a atividade de autoadministração de sacarose contribui com calorias insignificantes para a ingestão diária total.) tabela 6 mostra dados de parâmetros de autoadministração em todo o paradigma de PR de dia 9, com ICV injetado AGRP ou aCSF nos dias 2, 5 e 8. Em ratos tratados com AGRP, o número de pressões de alavancas ativas foi significativamente aumentado em todos os dias PR 2-10 (p = 0.03), e nos dias sem injeção (p = 0.048) com uma tendência de aumento (em média) dias de injeção. Além disso, o tempo de parada (que reflete o tempo total gasto na tarefa de autoadministração) aumentou significativamente nos dias sem injeção (p = 0.02), com tendência a um aumento geral e nos dias de injeção. O número de recompensas de sacarose foi aumentado globalmente nos dias PR 2-10 (p = 0.03). Não houve efeito do tratamento AGRP na pressão de alavanca inativa, em comparação com os controles tratados com aCSF, ou entre os dias de injeção e não injeção. Os resultados apóiam uma interpretação de um efeito sustentado da AGRP para aumentar a autoadministração da sacarose: os ratos pressionavam mais a alavanca de recompensa, recebiam mais recompensas de sacarose e passavam mais tempo envolvidos na tarefa.

  

Figura 4

AGRP do terceiro ventrículo (ICV) (0.01 nmol) estimula a autoadministração de sacarose no paradigma PR, mas não tem efeito sobre a ingestão diária de alimentos durante o período do estudo (PR Dias 2 - 10, com injeções nos Dias 2, 5 e 8) . Os dados AGRP (n = 9) são expressos ...

  

tabela 6

Efeito do ICV AGRP vs. aCSF no desempenho das taxas progressivas para a sacarose

Efeito do estágio da vida na preferência e motivação para a sacarose

No experimento final, avaliamos se a motivação para sacarose difere entre ratos puberais e adultos. Inicialmente, ratos velhos 5 e 10-wk receberam um teste de preferência de sacarose com opções de soluções que variaram de 0 a 20% de sacarose, antes do início do teste de auto-administração e treinamento. Como mostrado em Figura 5ae consistente com os achados relatados na literatura, os ratos pré-púberes parecem preferir uma solução mais doce do que os ratos adultos jovens: a maioria dos ratos pré-púberes teve um pico de ingestão de 20% de sacarose, enquanto os ratos adultos apresentaram pico de ingestão de 15% de sacarose. Posteriormente, ambos os grupos etários foram divididos entre ração de ratos e dieta rica em gordura durante o treinamento de auto-administração e testes. Houve um aumento pequeno, mas estatisticamente significativo no número de pressões de alavanca ativas pelos ratos peri-púberes vs. adultos (45 ± 3 vs. 37 ± 2, p = 0.05) em média ao longo das sessões FR, sem diferença no número de recompensas de sacarose ou número de prensas na alavanca inativa. Como mostrado em Figura 5b, houve um efeito global altamente significativo da idade, ao longo das sessões de RP, com aumento significativo da pressão de alavanca ativa para os ratos pubertais (n = 15) vs. adultos jovens (n ​​= 14) (2-way ANOVA, PRDay × idade; efeito da idade, p = 0.017, nenhum efeito independente do PRDay, nenhuma interação significativa). Houve uma tendência para um efeito maior da idade na dieta rica em gordura, mas isso não alcançou significância estatística (p = .13). tabela 7 lista os parâmetros comportamentais de PR: além do aumento das pressões de alavancas ativas, os ratos peri-púberes receberam significativamente mais recompensas de sacarose e mostraram uma tendência para o aumento do tempo de parada. Além disso, os ratos peri-púberes tiveram um aumento pequeno, mas significativo, nas prensas da alavanca inativa (ou seja, não recompensadora), embora para ambos os ratos peri-púberes e adultos, o número de prensas inativas fosse aproximadamente 10% do número de alavancas ativas. Estes resultados sugerem que os ratos peri-púberes preferem e procurarão com mais avidez alimentos com sabor adocicado, e o efeito pode ser amplificado com uma dieta rica em gorduras.

  

Figura 5

Ratos juvenis aumentaram a motivação para recompensas de sacarose em comparação com ratos adultos. 5a. Testes de preferência de sacarose para ratos jovens (peri-púberes, n = 15) e adultos jovens (n ​​= 14). Os ratos tinham 30 min para beber do intervalo de concentrações (0-20% de sacarose). ...

  

tabela 7

Efeito da idade no desempenho de relações progressivas^a para sacarose

Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH grant DK40963. Dianne Figlewicz Lattemann é Cientista de Carreira de Pesquisa Sênior, Programa de Pesquisa de Laboratório Biomédico, Departamento de Assuntos de Veteranos Puget Sound Health Care System, Seattle, Washington. Stephen Benoit foi apoiado por NIH DK066223 e Ethicon Endosurgery Inc. Os autores agradecem ao Dr. Tami Wolden-Hanson pelo apoio às medições de composição corporal; Dr. William Banks e Lucy Dillman, pelo apoio às medições de triglicerídeos; e Amalie Alver, e Samantha Thomas-Nadler, por assistência nos estudos comportamentais.

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