Frente Endocrinol (Lausanne). 2017; 8: 216.
Publicado on-line 2017 Aug 29. doi: 10.3389 / fendo.2017.00216
PMCID: PMC5581815
Julie Paradis,1 Pierre Boureau,1 Thomas Moyon,1 Sophie Nicklaus,2 Patricia Parnet,1,*† e Vincent Paillé1,*†
Sumário
O consumo materno perinatal de alimentos densos em energia aumenta o risco de obesidade em crianças. Isso está associado a um consumo excessivo de alimentos palatáveis consumidos por sua propriedade hedônica. O mecanismo subjacente que liga a dieta materna perinatal e a preferência da prole por gordura ainda é pouco compreendido. Neste estudo, objetivamos estudar a influência da alimentação materna com dieta hiperlipídica / rica em açúcares (dieta ocidental) durante a gestação e a lactação nas vias de recompensa controlando a alimentação na prole do rato desde o nascimento até a maturidade sexual. Realizamos um acompanhamento longitudinal dos descendentes de WD e Controle em três períodos críticos (infância, adolescência e idade adulta) e nos concentramos na investigação da influência da exposição perinatal a dieta palatável sobre (i) preferência por gordura, (ii) perfil de expressão gênica. e (iii) alterações neuroanatômicas / arquiteturais das redes dopaminérgicas mesolímbicas. Nós mostramos que a dieta WD restrita ao período perinatal tem uma influência clara e duradoura na organização dos circuitos cerebrais homeostáticos e hedônicos, mas não na preferência por gordura. Nós demonstramos uma evolução específica do período da preferência por gordura que nós correlacionamos com assinaturas moleculares cerebrais específicas. Nas crias de vacas alimentadas com WD, observamos durante a infância a existência de preferência por gordura associada a uma maior expressão do gene chave envolvido nos sistemas de dopamina (DA); na adolescência, uma preferência de alto teor de gordura para ambos os grupos, progressivamente reduzida durante o teste 3 dias para o grupo WD e associada com uma expressão reduzida do gene chave envolvido nos sistemas DA para o grupo WD que poderia sugerir um mecanismo compensatório para protegê-los de maior exposição a gordura alta; e finalmente na idade adulta, uma preferência por gordura que era idêntica a ratos controle, mas associada à profunda modificação em genes-chave envolvidos na rede de ácido γ-aminobutírico, receptores de serotonina e remodelamento do hipotálamo dependente de ácido polissialico-NCAM. Em conjunto, esses dados revelam que o HD materno, restrito ao período perinatal, não tem impacto sustentado na homeostase energética e na preferência por gordura mais tarde, embora tenha ocorrido uma forte remodelação da via homeostática e recompensadora do hipotálamo envolvida no comportamento alimentar. Outros experimentos funcionais seriam necessários para entender a relevância da remodelação desses circuitos.
Introdução
O ambiente e os eventos da primeira infância são agora reconhecidos por contribuir para a predisposição para a saúde e para a doença mais tarde na vida (1-3). O conceito de imprinting metabólico foi proposto para descrever como mudanças no ambiente nutricional e hormonal durante o período perinatal podem predispor os filhos à obesidade e suas patologias associadas mais tarde. Uma questão importante do nosso modo de vida ocidental é a supernutrição como consequência do consumo de alimentos densos em energia. De fato, os indivíduos que estão expostos à ingestão materna deste tipo de alimento estão em maior risco de desenvolver obesidade e síndrome metabólica (4, 5). Muitos estudos demonstraram que a dieta hiperlipídica materna (DH) através da gestação e aleitamento tem um efeito a longo prazo no metabolismo da prole (6-8). Além das vias implicadas na regulação metabólica, os sistemas de recompensa do cérebro também desempenham um papel importante no comportamento alimentar (9, 10). A neurotransmissão de dopamina mesolímbica (DA), intensamente estudada no contexto de recompensa e dependência, está alterada na obesidade induzida por dieta em ambos os seres humanos (11-13) e animais (14-16). As projeções de DA desenvolvem-se, em grande parte, após o nascimento (17) e, portanto, seu desenvolvimento pode ser afetado pela dieta precoce. Nos últimos anos, experimentos com roedores evidenciaram que a ingestão materna de HFD aumenta a alimentação hedônica na prole (18, 19). Embora esta observação envolvesse algumas mudanças na função do sistema DA (20-22), dados limitados estão disponíveis sobre a ontogenia ea remodelação das vias de recompensa durante o início da vida (21). Além disso, se e como a parte de sinalização não-DA do sistema de recompensa, como o sistema GABA (ácido γ-aminobutírico), pode ser afetado pelo estresse nutricional perinatal não é documentado. De fato, os neurônios GABA parecem desempenhar um papel fundamental na recompensa e aversão. A área tegmentar ventral (VTA) neurônios GABA recebem padrão similar de entrada de diferentes áreas do cérebro (23), e estudos comportamentais baseados em optogenética recentes destacam o papel principal da VTA GABA na aversão ao local condicionado (24) e no comportamento consumado recompensador (25). O Nucleus accumbens (NAc) é constituído principalmente pela projeção dos neurônios espinosos GABAérgicos médios e atua como uma interface límbico-motora integrando os sinais provenientes do sistema límbico e os transformando em ação. via saída para o pallidum ventral (VP) e outros efetores do motor (26). E finalmente, o hipotálamo que é constituído por numerosas conexões GABA em LH (27) e núcleo arqueado, integra sinais de fome e saciedade (10).
Este estudo tem como objetivo identificar a influência da ingestão de dieta ocidental materna (WD) na prole de ratos desde o nascimento até a maturidade sexual (i) na preferência de gordura (ii) no perfil de expressão gênica do sistema DA, no sistema GABAérgico e na plasticidade do hipotálamo e (iii) nas alterações neuroanatômicas / arquiteturais das redes dopaminérgicas mesolímbicas para o mesmo período. Portanto, avaliamos, em um estudo longitudinal (do desmame, P25, maturidade sexual, P45 e idade adulta, P95), o efeito do WD materno no crescimento do peso corporal e no desenvolvimento do tecido adiposo de filhos mantidos sob dieta regular após o desmame. Concomitantemente, realizamos um teste de preferência de gordura, seguido por uma análise transcriptômica dedicada e subsequente análise de componentes principais (PCA) de uma seleção de marcadores para sistemas reguladores de ingestão, escolha e motivação de alimentos. Nossos resultados enriqueceram significativamente os resultados recentes com foco na programação nutricional do sistema DA.
Materiais e Métodos
Declaração de ética
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do comitê local de bem-estar animal, a UE (diretiva 2010 / 63 / EU), o Institut National de la Recherche Agronomique (Paris, França) e o Departamento de Veterinária da França (A44276). O protocolo experimental foi aprovado pelo comitê de ética institucional e registrado sob a referência APAFIS 8666. Todas as precauções foram tomadas para minimizar o estresse e o número de animais usados em cada série de experimentos.
Animais e Dietas
Os animais foram mantidos num ciclo de luz / escuridão 12 h / 12 h em 22 ± 2 ° C com alimentos e água ad libitum. Trinta e dois ratos Sprague-Dawley fêmeas (peso corporal: 240-290g) no dia da gestação 1 (G1) foram comprados diretamente de Janvier (Le Genest Saint Isle, França). Foram alojados individualmente e alimentados com uma dieta controle (X) (5% gordura bovina e 0% sacarose) para 16 ou WD (21% carne bovina e 30% sacarose) para 16 durante os períodos de gestação e lactação (veja a tabela Table1: 1: composição da dieta em porcentagem de kcal de ABdiet Woerden, Holanda. No nascimento, o tamanho da ninhada foi ajustado para oito filhotes por ninhada com uma relação 1: 1 de macho para fêmea. Mantivemos 12 fora das barragens 16 com uma ninhada composta por machos 4 e fêmeas 4 para cada grupo. Ao desmame (P21), os filhotes nascidos de CD e as mães WD foram mantidos em dieta padrão até o final do experimento (Figuras (Figures1A, B) .1A, B). O peso corporal do filhote foi registado no nascimento e depois todos os dias a 10: 00 am até ao P21 (desmame). Após o desmame e até o final do experimento, os ratos foram pesados a cada 3 dias. Apresentamos dados apenas sobre descendentes do sexo masculino. Ratas foram utilizadas para outro estudo (Figura (Figure11).
Comportamento (teste de escolha de duas garrafas)
Três períodos críticos de desenvolvimento foram estudados (P21 para P25: juvenil, P41 para P45: adolescência e P91 para P95: adulto jovem). 24 filhotes machos (n = 12 por grupo) foram selecionados aleatoriamente e colocados em uma gaiola individual para realizar um teste de escolha gratuita de duas garrafas (Figuras (Figures1A, B) 1A, B) (28-30). Este teste foi utilizado para estudar especificamente a atratividade para o gosto de gordura, dissociando-o do sabor doce e, tanto quanto possível, do efeito metabólico da ingestão de calorias. De facto, o consumo de 1% de óleo de milho está associado a uma ingestão de 0.09 kcal / ml apenas. Após um dia de habituação à presença de duas garrafas, o teste foi realizado ao longo de 2 dias em P25 e ao longo de 4 dias em P41 e P91 (Figura (Figure1A) .1UMA). Em detalhes, no desmame (P21), os filhotes 24 foram alojados individualmente por 2 dias (Figura (Figure1A): 1A): dia 1, fase de habituação, dia 2, os ratos receberam uma escolha livre de duas garrafas entre uma emulsão de 1% de óleo de milho em 0.3% goma xantana (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, França) e solução de goma xantana ( 0.3%). Em P41 e P91, foram utilizados filhotes 24 e proposta de duas mamadeiras foi proposta por três dias consecutivos. O consumo de solução de goma xantana e solução de sabor (óleo de milho 1%) foi registado diariamente em 11: 00 por 3 dias (P45 e P95). A posição das duas garrafas foi invertida diariamente para evitar viés de preferência de posição. O escore de preferência de gordura foi calculado como a razão do volume de “solução de gordura” consumida para o volume total consumido em 24 h. Todos os ratos foram mantidos sob dieta padrão durante todo o teste comportamental.
Coleta de Tecidos e Amostragem de Sangue
No dia seguinte ao último dia do teste de escolha de duas garrafas, metade dos ratos (n = 6 por grupo) foram rapidamente sacrificados entre 09:00 e 12:00 por CO2 inalação. O sangue foi coletado em tubos com EDTA (Laboratoires Léo SA, St Quentin en Yvelines, França) e centrifugado a 2,500 g para 15 min a 4 ° C. O plasma foi congelado a –20 ° C. Órgãos e depósito de gordura retroperitoneal foram dissecados e pesados. O cérebro foi rapidamente removido e colocado em uma matriz cerebral (WPI, Sarasota, FL, EUA rato 300-600 g). Primeiro o hipotálamo foi dissecado [de acordo com as coordenadas atlas de Paxinos: −1.0 para −4.5 mm de Bregma (31)] então, para cada rato, foram obtidas duas fatias coronais de 2 mm de espessura ao nível de NAc e outra ao nível do VTA. Amostras de NA direita e esquerda e VTA direita e esquerda (quatro amostras no total por animal) foram rapidamente obtidas usando dois punções de biópsia diferentes (Stiefel Laboratories, Nanterre, França) (diâmetro de 4 mm para o NAc e 3 mm para o mesencéfalo ventral). As amostras foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a −80 ° C para posterior determinação da expressão gênica pela matriz de baixa densidade TaqMan (TLDA).
Os outros ratos (n = 6 por grupo) foram profundamente anestesiados com pentobarbital (150 mg / kg ip) e perfundidos com uma perfusão salina fisiológica transcardial seguida por paraformaldeído gelado a 4% em tampão fosfato (PB), pH 7.4. Os cérebros foram removidos rapidamente, imersos no mesmo fixador por 1 h a 4 ° C e, finalmente, armazenados em sacarose PB 25% por 24-48 h. Os cérebros foram então congelados em isopentano a −60 ° C e, finalmente, armazenados a −80 ° C até o uso. O NAc, o hipotálamo e o VTA foram cortados em cortes coronais seriados de 20 µm com um criostato (Microm, Microtech, Francheville, França). Duas ou três séries de 10 lâminas de vidro contendo 4-6 seções foram realizadas para cada área do cérebro. Para cada lâmina de vidro, as seções seriais são espaçadas de 200 µm (Figura (Figure66).
Análises Bioquímicas de Plasma
O plasma de EDTA coletado em ratos P25, P45 e P95 foi usado para medir a glicose plasmática, NEFA (ácidos graxos não-esterificados), insulina e leptina. Glicose e NEFA foram medidos usando reações enzimáticas colorimétricas com kits específicos (kits de glicose e NEFA PAP 150, BioMérieux, Marcy-l'Etoile, França). Os hormônios foram testados com kits ELISA específicos seguindo as instruções do fabricante para insulina e leptina (kit ELISA de insulina de rato / camundongo, kit ELISA de leptina de rato, Linco Research, St. Charles, MO, EUA).
Imunohistoquímica
As lâminas de vidro contendo secções VTA e NAc em série foram primeiro bloqueadas para 3-4 h e depois incubadas durante a noite a 4 ° C com uma mistura dos seguintes anticorpos: anti-NeuN de ratinho (1: 500; IgM; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, EUA) e anti-TH de coelho (1: 1,000; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, EUA). Após incubação com anticorpos primários e subsequente lavagem com PB, as secções foram incubadas numa mistura de anticorpos secundários: IgM anti-murganho de burro conjugada com Alexa 488 e IgG anti-coelho de burro conjugada com Alexa 568 (1: 500; Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham , MA, EUA) para 2 h. As seções foram montadas em superfrost e lâminas de ouro (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA), secas ao ar e cobertas com reagente antifade ProLong ™ Gold (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA).
Contagem de Neurônios TH em VTA
Para cada rato, as células positivas para TH foram contadas como descrito anteriormente (32) em três diferentes níveis rostrocaudais da VTA: ao nível da saída do terceiro nervo (distância relativa a Bregma: −5.3 mm), 200 µm rostral e 200 µm caudal a este nível (Figuras (Figures6A) .6UMA). Para os lados esquerdo e direito, uma imagem digitalizada compreendendo todo o VTA do trato terminal acessório medialmente à borda lateral do mesencéfalo foi obtida usando ampliação × 40 de um escâner de slides NanoZoomer-XR Digital C12000 (Hamamatsu, Japão). Uma linha foi desenhada em torno do perímetro do VTA para cada seção. Os limites foram escolhidos examinando a forma das células e referindo-se ao atlas de Paxinos e Watson. Um neurônio dopaminérgico foi definido como um corpo celular imunorreactivo NeuN (+) / TH (+) com núcleo claramente visível. Usando o software NIH Image J (plugin de contador de células), as células NeuN (+) / TH (+) foram contadas por duas pessoas diferentes sem conhecimento dos grupos de animais. Os erros de contagem de células divididas foram corrigidos usando a fórmula de Abercrombie (32), Onde N = n[t/(t + d)] (N = número total de células; n = número de células contadas; t = espessura da seção; e d = diâmetro da célula), e este fator de correção foi de 0.65. Os dados são expressos como média [NeuN (+) / TH (+) em VTA esquerdo e direito] ± SEM.
Densidade de Fibra TH em NAc
O teor de proteína TH nas terminações nervosas dopaminérgicas do NAc foi estimado por análise densitométrica anatômica das seções imunomarcadas com TH. A densidade de fibras TH foi quantificada em três níveis arbitrários ao longo do eixo rostrocaudal do NAc (Bregma 2.20, 1.70 e 1.20 mm) (Figura (Figure6B) .6B). Resumidamente, imagem digitalizada compreendendo todo o estriado e o NAc obtido usando ampliação × 40 de um scanner de slides NanoZoomer-XR Digital C12000 (Hamamatsu, Japão) foram obtidos. Para um dado NAc, foi traçada uma linha ao redor de todo o núcleo para definir a área de medição da densidade óptica (DO) (Figura (Figure6B) .6B). O valor obtido foi normalizado com o valor de DO medido a partir de uma zona circular desenhada no corpo caloso (uma região não corada para imunoquímica com TH) da mesma secção utilizando o software NIH Image J. Os dados são expressos como uma média do índice OD (valor de OD no valor de NAc / OD no corpo caloso das três seções) ± SEM.
Expressão Gênica por TLDA e TaqMan
O ARN foi isolado a partir de amostras enriquecidas com NAc, VTA, e hipotálamo, utilizando o estojo de ARN / proteína NucleoSpin (Macherey-Nagel, Hoerdt, França). O RNA total foi submetido à digestão da DNase seguindo as instruções do fabricante, a quantidade foi estimada pela absorbância 260 / 280 nm UV, e a qualidade foi avaliada usando o Agilent 2100 Bioanalyzer System, o número de integridade do RNA (RIN) foi então calculado. Amostras com um RIN abaixo de 8 foram descartadas. Um micrograma de ARN total foi transcrito inversamente em ADNc utilizando um kit RT de alta capacidade (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) num volume total de 10.
Como descrito anteriormente (33), o TLDA é uma placa micro-fluídica de poço 384 na qual podem ser realizadas PCRs simultâneas em tempo real 384 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Utilizamos um TLDA projetado especificamente para cobrir diferentes famílias de genes relevantes para a plasticidade e a regulação da ingestão de alimentos. Cada cartão personalizado foi configurado como linhas de carregamento de amostras 2 × 4 contendo câmaras de reação 2 × 48 (referência: 96a). Um conjunto de genes 92 (Tabela S1 em Material Complementar) e quatro genes de manutenção (18S, Gapdh, Polr2a e Ppia) foram estudados. A PCR em tempo real foi realizada utilizando reagentes Life Technologies TaqMan e executada no sistema de detecção de sequências ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Dados de fluorescência bruta foram coletados através da PCR usando o software SDS 2.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), que gerou ciclos limiares Ct com determinação automática tanto da linha de base quanto do limiar. Após a filtragem usando o ThermoFisher Cloud App (ThermoFisher, EUA) para discriminar execuções de PCR aberrantes, os ensaios por amostra foram n = 6 (n = 5 para o grupo WD em P25). Os dados foram então analisados com ThermoFisher Cloud App (ThermoFisher, EUA) para quantificação relativa. A quantificação relativa da expressão gênica (RQ) foi baseada no método Ct comparativo usando a equação RQ = 2ΔΔCt, onde ΔΔCt para um gene alvo foi sua própria variação de Ct subtraída de uma amostra de calibrador e normalizada com um controle endógeno. Precisamente, determinamos o gene de limpeza mais estável usando o algoritmo geNorm (ThermoFisher Cloud App RQ, ThermoFisher, EUA). Entre os quatro genes de manutenção, Gapdh foi definido como o controle endógeno para NAc e hipotálamo, e Ppia para VTA e isso foi verdadeiro para todas as amostras dos três períodos de tempo analisados. A representação gráfica da expressão gênica foi projetada manualmente para atribuir uma cor para um incremento de 10% da expressão gênica em relação ao grupo CD. Variação significativa, usando o teste não paramétrico de postos sinalizados de Wilcoxon, foi anotada com um asterisco.
Análise Estatística
Os resultados são expressos como média ± SEM em tabelas e figuras. O teste não paramétrico de Mann ‐ Whitney foi utilizado para a análise do peso corporal em diferentes momentos, preferências de gordura e relação OD obtida da imunohistoquímica.
Para avaliar a significância das preferências de gordura dos dias 3, realizamos uma análise estatística de coluna para cada dia. Para cada grupo, o consumo de solução de gordura e solução de controle foi testado usando o teste não-paramétrico de postos sinalizados de Wilcoxon. Comparamos o valor médio da preferência com o valor hipotético de 50% (linha vermelha pontilhada). Variação significativa foi observada com um asterisco vermelho. Usamos o mesmo teste para a análise do valor qPCR RQ; nós comparamos o valor médio de RQ com o valor hipotético de 1. Variação significativa foi observada com um asterisco (Figura (Figure44).
Para a análise da amostra de plasma, foi realizado um teste não paramétrico de Mann e Whitney. O número de células positivas para TH foi analisado com uma ANOVA de duas vias e p valor foi calculado. Devido à multiplicidade dos testes implementados, um Bonferroni post hoc correção foi aplicada somente após este teste. A anise estattica foi realizada utilizando o software Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA).
Uma PCA não supervisionada foi realizada primeiramente nos parâmetros 130 (dados TLDA, comportamento e plasma) em diferentes momentos para cada punção de biópsia cerebral (VTA, NAc e hipotálamo) para visualizar a estrutura geral do conjunto de dados (ou seja, três PCA globais). por ponto de tempo). O PCA pode ser definido como a projeção ortogonal dos dados em um espaço linear dimensional inferior, de tal forma que a variância dos dados projetados seja maximizada no subespaço. Primeiramente filtramos genes que não são expressos ou levemente expressos (Figura (Figure5) .5). Os valores para os descendentes de barragens alimentadas com CD e de barragens alimentadas com WD apareceram em cores diferentes em gráficos de PCA individuais para visualizar se estes dois grupos experimentais estão bem separados pelos componentes de PCA não supervisionados. Esta análise segrega os grupos de genes que são diferencialmente expressos entre os dois grupos de descendentes. Subsequentemente, os PCAs focalizados foram realizados em diferentes grupos de marcadores de ARNm: plasticidade (adesão celular, citoesqueleto, fator neurotrófico, sinaptogênese e regulação da transcrição), via DA, via GABAérgica, moduladores epigenéticos (histona desacetilase e histona acetil transferase). Esses PCAs focados permitem visualizar simultaneamente a correlação entre as dietas maternas e alguns marcadores e correlações entre genes familiares específicos. Uma escala qualitativa foi utilizada para a análise do PCA e PCA focada: +++: muito boa separação; ++: boa separação com um rato no lado errado da separação do PCA; +: separação muito boa com dois ratos (um de cada grupo) do lado errado, -: sem separação clara.
Consistentes
Peso Corporal e Crescimento
A ingestão de WD materna durante a gestação (de G1 para G21) não afetou o peso corporal dos filhotes ao nascer (Figura (Figure2) 2) (CD: 6.55 ± 0.07 g vs WD: 6.54 ± 0.05 g p = 0.9232) (Figuras (Figures2A, B) .2A, B). O ganho de peso corporal desde o nascimento até o desmame foi 21% maior em filhotes nascidos de mães WD que os filhos de mães com peso corporal significantemente maior ao desmame em filhos de mães WD (36.19 ± 0.90 vs 47.32 ± 1.48 g p <0.001) (Figura (Figure2C) .2C). Desde o desmame até o final do experimento (P95), os ratos foram alimentados com ração padrão e o peso corporal permaneceu mais alto para os descendentes das mães WD do que dos filhos de mães barradas. Em detalhes: durante a adolescência (P39) (Figuras (Figures2A, D), 2A, D), CD: 176.8 ± 3.3 g vs WD: 192.2 ± 3.3 g p = 0.0016 e em P93 (adulto jovem) (Figuras (Figures2A, E) 2A, E) CD: 478 ± 9.9 g vs WD: 508.6 ± 10.3 g p = 0.0452.
Hormônios e Marcadores Metabólicos em Diferentes Períodos de Tempo
As concentrações plasmáticas de leptina, insulina, glicose e AGNE foram medidas em P25, P45 e P95. Em todas as idades, os níveis de glicose plasmática, NEFA e leptina da prole WD não foram estatisticamente diferentes da prole de CD (Tabela (Table2,2, n = 6 por grupo). Observamos um aumento significativo na deposição de gordura (taxa de massa gorda retroperitoneal) em descendentes de mães alimentadas com WD apenas no P25 (p = 0.0327, teste de Mann e Whitney).
Impacto do DM Perinatal na Preferência da Gordura do Desmame para a Idade Adulta
Para explorar o impacto da WD na preferência por gordura, usamos um paradigma de escolha de duas garrafas em três momentos diferentes durante o crescimento. Este teste foi usado para estudar especificamente a preferência pelo gosto gordo, evitando, tanto quanto possível, o efeito metabólico de sua ingestão. Mostramos que as diferenças na ingestão de calorias "extra" da garrafa (em P25, P45 e P95) não são estatisticamente significantes entre grupos (Figuras S1A – C em Material Suplementar). Além disso, a diferença no consumo de 1% de solução de óleo de milho resulta em um aumento de calorias de 1% para ratos WD em P25 (4.9% vs CD: 3.9% de calorias ingeridas) e 0.5% para ratos CD em P45 (WD: 2% vs CD: 2.5% de calorias ingeridas) (Figuras S1D – F em material suplementar). No P25, os filhotes de barragens de CD não têm preferência por gordura (44.87 ± 9.8%, p = 0.339); no oposto WD, os ratos apresentam uma preferência por gordura (75.12 ± 8.04%, p = 0.039 seguindo o teste dos postos sinalizados de Wilcoxon, asterisco vermelho). Além disso, há uma diferença estatística entre os dois grupos com p = 0.0347 (teste de Mann e Whitney, hash tag preta) (Figura (Figure33UMA).
Em P45 e P95, os dois grupos têm uma preferência significativa por gordura, ou seja, significativamente diferente do valor teórico de 50% (em P45, CD: 80.68 ± 2.2% p = 0.0005 e WD: 78.07 ± 3.25% p = 0.0005; em P95, CD: 74.84 ± 8.4% p = 0.0425 e WD: 69.42 ± 8.9% p = 0.109 seguindo o teste dos postos sinalizados de Wilcoxon, asterisco vermelho) (Figura (Figure3A) .3UMA). Os valores para os dois grupos foram indistinguíveis após um dia de apresentação do sabor (em P45 p = 0.7857 e em P95 p = 0.9171 Teste de Mann-Whitney) (Figura (Figure33UMA).
Para saber como os ratos regulam o consumo de gordura ao longo do tempo, repetimos a apresentação da gordura por três dias consecutivos em P45 e P95 (Figuras (Figures3B, C) .3B, C). Curiosamente, no P45, apenas os machos das barragens WD perderam progressivamente a preferência pela solução de gordura (Figura (Figure3B) 3B) (terceiro dia: 53.12 ± 8.36% p = 0.851 seguindo o teste dos postos sinalizados de Wilcoxon). Porém, no P95 (idade adulta) todos os animais preferiram a gordura sem evolução durante o teste de 3 dias (Figura (Figure33C).
Em resumo, neste modelo, observamos, na fase inicial (infância), uma preferência por gordura em ratos alimentados por barragens WD, com um desinteresse progressivo ao longo do tempo durante a adolescência. Não observamos diferença entre os dois grupos de ratos na idade adulta.
Assinatura Molecular da Plasticidade do Cérebro e Remodelação dos Circuitos GABA no Hipotálamo e nas Vias de Recompensa
Para determinar se a ingestão de WD materna durante a gestação e lactação tem um impacto sobre o hipotálamo e recompensa percursos da prole, medimos a expressão relativa de vários fatores-chave de plasticidade cerebral, modelagem cerebral e marcadores de circuitos neuronais implicados na ingestão alimentar e epigenética reguladores. Usamos o TLDA para analisar sua abundância em diferentes áreas do cérebro (isto é, hipotálamo, VTA e NAc) S1 Material Complementar) nos três períodos de tempo. A triagem foi realizada após os testes de escolha de duas garrafas em P25, P45 e P95 (Figura (Figure1) 1) em seis machos nascidos da WD alimentados com fêmeas e seis machos nascidos de mães alimentadas com CD.
No P25 no hipotálamo, cinco genes de treze categorias diferentes apresentaram um nível significativamente mais baixo de expressão de mRNA principalmente em marcadores de plasticidade e GABA variando entre −20% (Gfap) e −40% (Gabra5) em filhotes de WD alimentados com ratos CD alimentado com barragens. Em biópsias de vias de recompensa (VTA e NAc), dois genes exibiram níveis mais altos de expressão de mRNA (D2R e Gabra1), ou seja, receptores DA e receptores GABA e um gene de expressão mais baixa (Hcrtr2) , enquanto quatro genes exibiram um nível de expressão de mRNA significativamente maior (Map2, Gabara2, Hcrtr1 e Hcrtr1) (isto é, marcadores de plasticidade, receptores GABA e receptores serotoninérgicos) na VTA (Figura (Figure44).
No P45 no hipotálamo, cinco genes de treze categorias diferentes exibiram um nível mais baixo de expressão de mRNA variando entre −20% (Fos) e −50% (FosB) em filhotes de matrizes alimentadas com WD em comparação com ratos de mães alimentadas com CD. No P45 em biópsias por vias de recompensa, quatro genes exibiram um maior nível de expressão de mRNA (Gfap, Dat, Cck2r e Kat5) e dois genes de expressão mais baixa (Fos e FosB) em NAc, enquanto três genes apresentaram um nível mais baixo de expressão de mRNA (Arc, FosB e Th) e um gene de nível superior (Gabrg2) em VTA.
No P95 no hipotálamo, os genes 20 de treze categorias diferentes exibiram um maior nível de expressão de mRNA variando entre + 20 e + 40% (Syt4 a Gjd2) e os genes 3 exibiram uma menor expressão de mRNA (FosB, D1r e Gabarb1) em filhotes da WD alimentaram represas em comparação com ratos de barragens alimentadas com CD. No P95 em biópsias da via de recompensa, os genes 12 exibiram um maior nível de expressão de mRNA variando entre + 20 e + 40% (Syn1 para Hcrt1) e o gene 1 uma expressão mais baixa (Th) em NAc, genes 6 exibiram um maior nível de expressão de mRNA (Ncam1 , Gja1, Gjd2, Gabra5, Htr1a e Htr1b), e os genes 6 exibiram um nível mais baixo de expressão de mRNA (Cntf, Igf1, Fos, Socs3, Gabrb2 e Hdac3) em VTA.
Em seguida, realizamos três PCA não supervisionadas correspondentes às três biópsias cerebrais usando todos os parâmetros quantificados (isto é, dosagem plasmática, dados comportamentais e variações de expressão de RNAm). Uma clara separação dos dois grupos foi obtida apenas no P95 para NAc e VTA (Table33).
De acordo com o círculo de correlação do PCA e os dados do TLDA (representando a maioria das variáveis incluídas neste PCA), definimos as famílias de genes que poderiam ser responsáveis pela segregação e realizamos um PCA focalizado (Figuras (Figuras 5A, B, 5A, B, por exemplo). O PCA focalizado revelou que nos marcadores P25 DA no NAc e marcadores de plasticidade no hipotálamo poderiam separar os dois grupos de descendentes (Tabela (Table33 para resumo). Nenhuma discriminação foi então obtida no P45. No entanto, a mesma análise no P95 revelou que os diferentes marcadores do sistema GABA no NAc e no hipotálamo, mais os marcadores de plasticidade (no hipotálamo, NAc e VTA) e reguladores epigenéticos (apenas no NAc) contribuem para separar os dois grupos de animais ( Figura (Figure5; 5; Mesa Table33).
Esta análise revela a influência duradoura da dieta perinatal nos marcadores GABAérgicos, bem como a plasticidade e os marcadores epigenéticos, tanto na via homeostática como na via de recompensa, implicados no comportamento alimentar.
Imuno-histoquímica da análise do transcrito confirmado das células TH
Como observamos alguma variação no mRNA de TH em NAc e VTA nos vários períodos de desenvolvimento, procuramos correlacionar esses resultados com a imunomarcação de TH. O número de células TH / NeuN positivas foi analisado na ATV onde os corpos celulares dopaminérgicos estão localizados e a marcação de OD da TH foi quantificada nas terminações nervosas localizadas no NAc. As células TH (+) foram menos abundantes no VTA da WD em comparação com os ratos CD apenas no P45 (Figuras (Figuras 6A, C, E; 6ÁS; Figura S2A em Material Suplementar). Não houve interação significativa entre o nível de seção e a quantificação TH / NeuN nos três períodos (P25 p = 0.9991, P45 p = 0.9026 e P95 p = 0.9170). Em P45 apenas, uma diferença estatística foi obtida entre os dois grupos de prole (p = 0.0002) (Figura (Figure6E) .6E) Além disso, não observamos diferença na marcação do OD da TH no NAc em P25 e P45 entre os dois grupos (valores da razão OD em P25: 1.314 ± 0.022 em CD vs 1.351 ± 0.026 em WD, p = 0.2681; Valores de proporção de OD em P45: 1.589 ± 0.033 em CD vs 1.651 ± 0.027 em WD, p = 0.1542). No entanto, uma diminuição significativa da DO das terminações nervosas TH foi encontrada no NAc do grupo WD no P95 (valores da razão DO no p95: 1.752 ± 0.041 no CD vs 1.550 ± 0.046 no WD, p = 0.0037) (Figuras (Figuras 6B, D, F; 6B, D, F; Figura S2B em Material Suplementar).
Discussão
Neste estudo, nós hipotetizamos que a supernutrição materna perinatal influenciará o programa de desenvolvimento de vias de recompensa envolvidas na homeostase energética, escolha alimentar e ingestão alimentar da prole. Examinamos extensivamente o impacto da ingestão de WD materna do nascimento ao desmame nas vias GABA, serotonina e DA de áreas cerebrais específicas (VTA, NAc e hipotálamo) na prole, desde a infância até a idade adulta. Nossos resultados sugerem que o uso de uma dieta rica em gordura e doce, estritamente restrita ao período perinatal, tem um impacto na preferência precoce de gordura (infância) na prole correlacionada com a mudança no perfil de expressão gênica e alterações neuroanatômicas / arquitetônicas da mesolímbica. redes dopaminérgicas. No entanto, quando os descendentes foram mantidos sob dieta de ração, observamos em ratos alimentados com WD uma perda progressiva de atratividade em relação à gordura que foi correlacionada com uma expressão reduzida de genes do sistema DA e uma ligeira redução de neurônios TH-positivos na VTA . Mais tarde na vida, a preferência por gordura não foi diferente entre os grupos, embora uma importante plasticidade das redes GABAérgicas e da rede de homeostase energética do hipotálamo tenha sido identificada em ratos de barragens alimentadas com WD (Figura (Figure77).
O primeiro impacto da ingestão perinatal-WD que observamos neste estudo é o aumento do peso corporal da prole ao desmame, mas não há diferença no nascimento. De fato, os animais do grupo WD ganham 21% mais peso que o CD no final do período de sucção. Estudos anteriores forneceram resultados conflitantes em relação à mudança no peso ao nascer para os filhos de mães alimentadas com WD: um maior peso corporal (19, 34), um peso corporal mais baixo (18, 21, 35) ou nenhuma diferença (6, 22). Nossos dados estão de acordo com uma recente análise de meta-regressão (36) realizado em publicações experimentais 171 que concluíram que a exposição materna à DH não afectou o peso à nascença, mas induziu um aumento do peso corporal no final do período de lactação. O maior peso corporal da prole WD provavelmente reflete uma mudança na composição do leite e / ou produção de leite que foi ilustrada em publicações anteriores (37, 38). De acordo com o maior peso corporal, a proporção de gordura retroperitoneal da prole WD foi significativamente maior do que a da prole CD no final do período de amamentação (P25, Tabela Table2), 2), que também é consistente com estudos anteriores (18, 21). No entanto, a maior adiposidade não persistiu em P45 e P95, e outros parâmetros metabólicos como insulina, NEFA e glicose plasmática não foram diferentes entre os grupos. Nossos resultados demonstraram que, sem uma clara obesidade materna durante a gestação e lactação, a dieta por si só não é suficiente para induzir efeitos metabólicos duradouros na prole (22, 39, 40).
Tem sido relatado que a ingestão perinatal de HFD correlaciona-se positivamente com a preferência da prole por alimentos saborosos (41). Em nosso estudo, realizamos um estudo longitudinal com o objetivo de testar a preferência por gordura nos descendentes que são desmamados na ração normal.
Impacto do DM Perinatal na Infância (após o Desmame)
Os filhotes de roedores comem alimentos sólidos 19-20 dias após o nascimento (42) quando seus caminhos de recompensa cerebral ainda não estão maduros (17). Portanto, foi muito interessante estudar sua preferência precoce por gordura e correlacionar essa preferência precoce com a análise de transcritos cerebrais. Logo após o desmame, observamos uma preferência por gordura na prole WD que não foi evidenciada em ratos CD. Isto está de acordo com outros relatos mostrando uma ligação entre a desnutrição perinatal e a preferência alimentar apetecível e uma baixa preferência por gordura em idade precoce para ratos controle (43).
A PCA global não permitiu discriminar o grupo de filhotes em relação à dieta materna nessa idade. No entanto, quando um PCA alvo, restrito aos marcadores DA, foi realizado, obtivemos uma boa segregação dos grupos. De fato, há um aumento acentuado na expressão dos mRNAs do receptor D2 no NAc em filhotes WD. Essa superexpressão pós-sináptica D2 no NAc pode estar parcialmente envolvida em uma maior motivação para a gordura (44). Poucas outras transcrições são modificadas em filhotes da WD em comparação com filhotes CD, como um aumento da subunidade alfa 1 GABAA em NAc e VTA e uma diminuição da subunidade alfa 5 GABAA no hipotálamo que sugere uma reorganização dos receptores GABAA nesses núcleos.
Impacto do DM perinatal na adolescência
No P45, observamos uma preferência de alto teor de gordura semelhante para ambos os grupos no primeiro dia de apresentação, mas, curiosamente, os ratos WD perderam progressivamente o interesse pela gordura após apresentação repetida. A adolescência é um período crítico de reorganização neurocomportamental necessário para o processamento cognitivo ao longo da vida (45), e vários estudos mostraram uma acentuada vulnerabilidade ao efeito cognitivo prejudicial de uma dieta gorda (46-48). Este resultado está em aparente contradição com o trabalho anterior do grupo de Muhlhausler (21, 35) em que ratos jovens (semanas 6) mostraram uma clara preferência por junk food. No entanto, em suas publicações, o paradigma experimental era diferente, uma vez que os ratos tinham livre acesso a ração padrão e junk food, desde o desmame até o sacrifício (semanas 6).
Concomitantemente, medimos um aumento do RNAm de Dat no NAc e uma diminuição do RNAm de Th no VTA que foi confirmado pela imuno-histoquímica que mostrou um número reduzido de células TH (+) no VTA de ratos WD. Após uma atividade transcriptômica elevada para o sistema DA ao desmame, a atividade reduzida no P45 pode explicar o baixo interesse pelo alimento palatável observado em nossos ratos WD. Também deve ser notado que a diminuição sistemática da expressão de RNAm de Fos e FosB nos vários núcleos que analisamos poderia ser uma marca de redução da atividade cerebral após a exposição materna à WD.
Ratos WD adolescentes mostraram um desinteresse mais rápido por gordura que é oposto ao seu comportamento anterior. O uso de uma dieta “normal” durante a infância parece “protegê-los” para uma preferência exagerada de gordura na adolescência. Pelo contrário, quando os ratos têm livre acesso a junk food após o desmame, como na Ref. (21, 35), demonstram na adolescência uma forte preferência pela gordura. Este resultado sugere que as semanas de dieta 3 após o desmame poderiam ter reprogramado os circuitos e tornar os descendentes adolescentes menos sensíveis a um desafio de gordura aguda.
Impacto do WD perinatal em adultos
Ratos adultos não mais apresentaram diferença de preferência por gordura, mesmo após apresentação repetida de gordura como já descrito (22, 35). Concomitantemente, observamos uma diminuição no mRNA Th e proteína no NAc, e uma tendência para uma expressão reduzida de Dat mRNA na VTA. Naef e colega de trabalho (20) já relataram uma baixa atividade do sistema DA em ratos adultos alimentados no período perinatal com um HFD, com uma resposta embotada a anfetamina medida com microdiálise e um aumento na motivação para recompensa de gordura (ver tabela que resumiu dados recentes de qPCR neste modelo, Mesa S2 em material suplementar). Uma limitação da quantificação de TH (mRNA e imuno-histoquímica) no NAc vem do fato de que as células NAc também poderiam expressar Th mRNA e proteína e então poderiam enviesar a quantificação de fibras DA (49, 50). No entanto, o uso da imunomarcação de TH no NAc revelou principalmente os terminais de axônio denso provenientes dos neurônios DA do mesencéfalo (VTA e SNc). Geralmente, os neurônios que expressam TH no corpo estriado e NAc podiam ser discernidos apenas em animais altamente lesionados por DA (51) e, portanto, dificilmente poderia ser detectado em nossas imuno-seções. Neste estudo, também observamos um forte aumento no receptor opióide mu no NAc, quando outros grupos, com diferentes modelos, mostraram uma diminuição da expressão no estriado ventral de ratos expostos precocemente à DH (durante a lactação e a gestação) (19, 21) ou sem alteração (35). Essas modificações, medidas apenas no nível de mRNA, poderiam refletir uma leve atividade hipo dos circuitos DA associada a uma maior sensibilidade aos opioides (52) que provavelmente não são suficientes para causar impacto no teste comportamental que realizamos. Essas suposições precisam ser confirmadas usando abordagens funcionais. Em um artigo recente, com um modelo similar, Romani-Perez et al. Não foram capazes de observar um aumento significativo de motivação em caixas de condicionamento operante para os descendentes de HFD, mas observaram uma latência mais curta para alcançar uma caixa de meta em um paradigma de teste de pista22). Apesar da ausência de preferência duradoura por gordura em nossas condições experimentais, descobrimos que a ingestão materna perinatal de WD tem um efeito duradouro em outros circuitos cerebrais, mediada principalmente pela remodelação do GABA em NAc e Hipotálamo. NAc é considerado como um “sentinela sensorial” para comportamento consumatório (52). Estudos recentes demonstraram que a ingestão de alimentos foi suprimida pela inibição dos neurônios LH liberadores de GABA (53). O'Connor et al. mostraram que os neurônios NAc D1R (neurônios projetantes GABAergic) seletivamente inibem os neurônios LH VGAT para parar a ingestão de alimentos (54). Esses experimentos revelam um circuito GABA (NAc / Hypothalamus) que pode ser responsável pelo controle da resposta comportamental. Esse sistema estriado-hipotálamo ventral complementa outro circuito que envolve o núcleo do leito, estria terminal e neurônio que projeta VGAT liberador de GABA para os neurônios Vglut LH que liberam glutamato e a inibição direta de LH vglut2 provoca a alimentação (55). Outro componente importante do circuito regulador do apetite que envolve o invólucro de NAc é uma projeção inibitória de liberação de GABA para o VP (56). Esses dados destacam o papel crucial da sinalização do GABA na interação entre o hipotálamo e o NAc para promover a alimentação. Em nosso estudo, não fomos capazes de discriminar a população de neurônios envolvidos na remodelação do GABA e como essas modificações poderiam alterar as redes. No entanto, o papel central dos circuitos GABA merece mais interesse. Em particular, seria muito interessante realizar mais experiências funcionais destes circuitos GABA usando abordagens eletrofisiológicas (57). Também observamos uma regulação positiva global do transcrito de mRNA para os receptores 5HT1a e 5HT1b nos três núcleos estudados. A maioria das fibras de serotonina projetadas provém do núcleo dorsal da rafe (NDR) e do núcleo mediano da rafe (NRM). Dados recentes de in vivo gravações e estudos de imagem mostraram um papel positivo do 5HT na recompensa (58). As fibras 5HT da DRN estão envolvidas no controle da impulsividade (59). Aumentar 5HT1a em VTA e NAc poderia ser um mecanismo compensatório que poderia controlar a impulsividade. No hipotálamo, estudos farmacológicos sugerem que os subtipos do receptor 5HT1a podem suprimir o comportamento alimentar induzido pela estimulação da serotonina (60, 61). O aumento dos receptores 5HT1a e b no hipotálamo poderia potencializar a ação supressora da serotonina e, portanto, poderia constituir um mecanismo compensatório. Essas suposições precisam ser verificadas através da realização de experimentos funcionais adequados.
Essas mudanças de redes estão associadas a modificações de marcadores de plasticidade como o mRNA da Ncam. No hipotálamo de ratos adultos, observamos um aumento nos transcritos de Ncam1 e St8sia4 sugerindo e aumentando a sinalização do ácido polissialico (PSA). O PSA é um glicano da superfície celular que modula as interações célula-a-célula. A polissialilação de proteínas de adesão celular está envolvida em vários processos dependentes de plasticidade sináptica no sistema nervoso central e tem sido relatada como sendo necessária para a plasticidade sináptica adaptativa de circuitos de alimentação durante o balanço de energia positiva aguda (33, 62). Além disso, outros reguladores da interação celular e da sinaptogênese podem estar envolvidos nessa plasticidade hipotalâmica.
Em conclusão (Figura (Figure7), 7), o consumo materno de bebidas destiladas tem uma influência duradoura na organização dos circuitos homeostáticos e hedônicos que regulam o comportamento alimentar na prole. Pela análise de três períodos críticos, pudemos mostrar uma clara evolução para a preferência de gordura correlacionada com assinaturas moleculares específicas do cérebro. Durante a infância, a preferência por gordura pode estar correlacionada com uma maior atividade do sistema DA. A adolescência, caracterizada pela inversão da preferência por gordura, associou-se à menor expressão de marcadores do sistema DA, sugerindo um mecanismo compensatório. Um ponto muito interessante a ser notificado é que, neste modelo, uma dieta balanceada após o desmame poderia proteger o rato adolescente dos hábitos alimentares deletérios, reduzindo seu desejo por gordura. Embora na idade adulta os dois grupos tenham uma alta preferência semelhante pela gordura, os ratos das barragens alimentadas com WD mostraram uma profunda remodelação dos circuitos GABA. Quais são as conseqüências dessa plasticidade duradoura? Uma ingestão exagerada de dieta obesogênica durante a adolescência reativará esse sistema de recompensa embotado? Tais questões podem ser relevantes no acompanhamento nutricional de recém-nascidos e crianças nascidas em países ocidentalizados.
Declaração de ética
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do comitê local de bem-estar animal, a UE (diretiva 2010 / 63 / EU), o Institut National de la Recherche Agronomique (Paris, França) e o Departamento de Veterinária da França (A44276). O protocolo experimental foi aprovado pelo comitê de ética institucional e registrado sob a referência APAFIS 8666. Todas as precauções foram tomadas para minimizar o estresse e o número de animais usados em cada série de experimentos.
Contribuições do autor
JP e PB realizaram experimentos e participaram da discussão e redação. TM realizou o PCA e participou de discussões e redações. SN contribuiu para o desenho do experimento e participou da discussão. PP contribuiu para o desenho do experimento, participou das discussões e escreveu o manuscrito. VP projetou e executou os experimentos, analisou os dados e escreveu o manuscrito.
Declaração de conflito de interesse
Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer Guillaume Poupeau e Blandine Castellano por cuidar dos animais durante todo o estudo, Anthony Pagniez por sua ajuda na extração de mRNA e TLDA, Isabelle Grit por sua ajuda na análise de amostras de plasma, e Alexandre Benani e Marie-Chantal Canivenc para sua discussão útil e design TLDA.
Notas de rodapé
Financiamento. Esta pesquisa foi financiada pela bolsa regional Parc des Lois de la Loire PARIMAD (VP), bolsa de fundação LCL (VP e PP), fundação SanteDige (VP) e Metaprograma INRA DIDIT (SN, VP, PP).
Material suplementar
O Material Complementar deste artigo pode ser encontrado on-line em http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fendo.2017.00216/full#supplementary-material.
Figura S1
Ingestão total de energia do frasco contendo óleo de milho. (UMA) Ingestão de calorias da mamadeira de óleo de milho para 24 h em P25 em filhotes de dieta ocidental alimentados por mães e filhotes de dieta controle (CD) alimentados com mães. (B) Ingestão de calorias da garrafa de óleo de milho para 24 h em P45 (o terceiro dia do teste de garrafa). (C) Ingestão de calorias da garrafa de óleo de milho para 24 h em P95 (o terceiro dia do teste de garrafa). Para painéis (A – C), os dados são expressos como média ± EPM, sem diferença estatística (p > 0.05) foi observada, seguindo o teste não paramétrico de Mann e Whitney, em todas as idades. (D) A porcentagem de ingestão de calorias do frasco de óleo de milho se compara à ingestão total de calorias (garrafa de óleo de milho + dieta padrão) para 24 h em P25 em filhotes WD e filhotes CD. Integridade e Excelência A porcentagem de ingestão de calorias da garrafa de óleo de milho se compara à ingestão total de calorias (garrafa de óleo de milho + dieta padrão) para 24 h em P45 (o terceiro dia de teste de garrafa) em filhotes WD e filhotes CD. (F) A porcentagem de ingestão de calorias do frasco de óleo de milho se compara à ingestão total de calorias (garrafa de óleo de milho + dieta padrão) para 24 h em P95 (o terceiro dia de teste de garrafa) em filhotes WD e filhotes CD. Para painéis (D, E), os dados são expressos em percentagem do consumo total de calorias sem diferença estatística (p > 0.05) foi observada, seguindo o qui-quadrado com correção de Yates, em todas as idades.
Figura S2
Fotomicrografias representativas da imunomarcação de TH em nucleus accumbens (NAc) e área tegmentar ventral (VTA) em três momentos diferentes. (UMA) Fotomicrografia de imunomarcação TH / NeuN ao nível da VTA, −5.30 mm da Bregma. A rotulagem vermelha é para NeuN e verde para TH. A seta branca mostra a saída do terceiro nervo. (B) Fotomicrografia de imunomarcação de TH ao nível do NAc, + 1.70 mm de Bregma. A rotulagem verde é para TH. A seta branca mostra a comissura anterior.
Tabela S1
Lista de genes de matriz de baixa densidade TaqMan com os códigos inventariados de tecnologias de vida correspondentes.
Tabela S2
Resumo dos dados publicados referentes à expressão dos transcritos da via da dopamina. Os caracteres vermelhos correspondem ao período da infância, os azuis à adolescência e os pretos ao adulto. =: corresponde a uma expressão de transcrito similar entre grupos, +: corresponde a uma maior expressão de transcrito em filhotes de dieta rica em dieta calórica [junk food, dieta ocidental (WD) ou dieta rica em gordura (DH)], e -: corresponde a uma expressão transcrita mais baixa em filhotes de dieta rica em calorias (junk food, WD ou HFD) alimentados por barragens.
Referências