Dieta rica em gordura prolongada reduz a recaptação de dopamina sem alterar a expressão do gene DAT (2013)

  • Jackson J. Cone,
  • Elena H. Chartoff,
  • David N. Potter,
  • Stephanie R. Ebner,
  • Mitchell F. Roitman

Sumário

O desenvolvimento da obesidade induzida por dieta (DIO) pode alterar potencialmente vários aspectos da sinalização da dopamina, incluindo a expressão do transportador de dopamina (DAT) e a recaptação da dopamina. No entanto, o tempo de evolução induzida por dieta na expressão e função do DAT e se essas mudanças dependem do desenvolvimento de DIO permanece sem solução. Aqui, nós alimentamos ratos com uma dieta gorda alta (HFD) ou baixa (LFD) para as semanas 2 ou 6. Após a exposição à dieta, os ratos foram anestesiados com uretano e a função DAT do estriado foi avaliada estimulando eletricamente os corpos celulares de dopamina na área tegmentar ventral (VTA) e registrando as mudanças resultantes na concentração de dopamina no estriado ventral usando voltametria cíclica de varredura rápida. Nós também quantificamos o efeito de HFD em DAT associado a membrana em frações de células do estriado de um grupo separado de ratos após a exposição ao mesmo protocolo de dieta. Notavelmente, nenhum dos nossos grupos de tratamento diferiu no peso corporal. Encontramos um déficit na taxa de recaptação de dopamina em ratos DH em relação aos ratos LFD após 6, mas não 2 semanas de exposição à dieta. Adicionalmente, o aumento da dopamina evocada após um desafio farmacológico de cocaína foi significativamente atenuado em DHA em relação a ratos LFD. Análises de Western blot revelaram que não houve efeito da dieta na proteína DAT total. No entanto, semanas 6 de exposição a HFD reduziram significativamente a isoforma 50 kDa DAT em uma fração associada à membrana sinaptossomal, mas não em uma fração associada à reciclagem de endossomos. Nossos dados fornecem evidências adicionais de alterações induzidas por dieta na recaptação de dopamina independente de mudanças na produção de DAT e demonstra que tais mudanças podem se manifestar sem o desenvolvimento de DIO. 

Citação: Cone JJ, Chartoff EH, DN Potter, Ebner SR, Roitman MF (2013) Dieta rica em gordura prolongada reduz a recaptação de dopamina sem alterar a expressão do gene DAT. PLoS ONE 8 (3): e58251. doi: 10.1371 / journal.pone.0058251

Editor: Sidney Arthur Simon, Centro Médico da Universidade Duke, Estados Unidos da América

Recebido: Outubro 26, 2012; Aceitaram: Fevereiro 5, 2013; Publicado em: 13 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cone et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença de Atribuição da Creative Commons, que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor e a fonte originais sejam creditados.

Financiamento: O projeto descrito foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) concede DA025634 (MFR) e T32-MH067631 do Biomedical Neuroscience Training Program (JJC). Apoio adicional foi fornecido pelo Centro Nacional de Recursos de Pesquisa e pelo Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais, NIH, através da concessão UL1RR029877 (JJC) e pelo Consórcio Biomédico de Chicago com o apoio dos Fundos Searle no The Chicago Community Trust (JJC). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH ou do Chicago Biomedical Consortium. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.

Introdução

O excesso de peso e obesidade representam uma porcentagem cada vez maior dos Estados Unidos e das populações mundiais , . Embora existam muitos caminhos para a obesidade, talvez uma das maiores ameaças ao peso corporal saudável seja a prevalência e o consumo de alimentos altamente palatáveis ​​e densamente calóricos. . De fato, a densidade de energia (kcal / g) de alimentos contribui para o excesso de peso e a obesidade em adultos , . Alimentos apetitosos evocam a liberação de dopamina no corpo estriado tanto de humanos quanto de animais não humanos , , , e avaliações subjetivas de fatalidade nos alimentos estão positivamente correlacionadas com a força das respostas neurais no estriado ventral . Assim, a dopamina e o corpo estriado parecem contribuir para as preferências por alimentos densos em energia. Recentemente, foi demonstrado que diferenças na dieta podem causar mudanças simultâneas nos circuitos estriatais e no comportamento direcionado aos alimentos. . No entanto, talvez menos apreciado seja a crescente evidência de que as diferenças nos alimentos ingeridos, especialmente no que diz respeito à gordura, podem retroalimentar e alterar a sinalização da dopamina estriatal.

A sinalização da dopamina estriatal é regulada por vários fatores, incluindo a produção de dopamina pela enzima tirosina hidroxilase, receptores de dopamina pré e pós-sinápticos e transportadores de dopamina pré-sinápticos (DATs), todos implicados na obesidade. , . Alterações no número ou função do DAT podem alterar a esfera de influência da dopamina liberada e consequentemente a função do estriado , . A insulina, liberada em resposta ao alimento ingerido, mostrou influenciar a função do DAT , . Assim, o DAT é um dos prováveis ​​candidatos aos efeitos da dieta.

Recentemente, correlações entre obesidade e disponibilidade de DAT, bem como alterações da função DAT induzidas por dieta têm sido exploradas. Índice de massa corporal (IMC) correlaciona-se negativamente com a disponibilidade de DAT no corpo estriado humano . A ligação do DAT e, portanto, a disponibilidade, é reduzida em camundongos alimentados com dieta rica em gordura (HFD) . A obesidade induzida por DHA (DIO) está associada a uma taxa reduzida de recaptação de dopamina pelo DAT em ratos . Em conjunto, esses estudos sugerem que a obesidade estabelecida pelo consumo de DH pode influenciar de forma potente os reguladores pré-sinápticos críticos da sinalização da dopamina - especialmente o DAT. No entanto, o curso do tempo de alterações induzidas por dieta na sinalização da dopamina e se o desenvolvimento de DIO é necessário para que as mudanças se manifestem permanece desconhecido. Testamos a função do DAT evocando a liberação de dopamina no estriado ventral e quantificando sua taxa de recaptação em ratos usando voltametria cíclica de varredura rápida. Para determinar se a diminuição da recaptação de dopamina foi causada pela redução da expressão do gene DAT, medimos o ARNm de DAT na área tegmentar ventral e substantia nigra usando qRT-PCR em tempo real. Além disso, utilizamos um procedimento de fracionamento bioquímico e análise de Western blot para avaliar os níveis de DAT do estriado em membranas sinaptossômicas e endossomais brutas. Os ratos tiveram 2 ou 6 semanas de dieta rica em gorduras, mas todas as medições foram feitas na ausência de DIO. Nossos resultados sugerem que o consumo prolongado de DH, independente da DIO, diminui a taxa de recaptação de dopamina no estriado ventral sem diminuir a expressão de DAT.

Materiais e Métodos

Declaração de ética

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Animal Care Committee da University of Illinois, Chicago. Toda a cirurgia foi realizada sob anestesia com uretano, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Assuntos

Foram utilizados ratos Sprague-Dawley machos Standard (n = 67), aproximadamente 2 meses de idade e pesando 225-275g à chegada. Os animais foram alojados individualmente em jaulas plásticas (26.5 × 50 × 20 cm) num ambiente controlado de temperatura (22 ° C) e humidade (30%) num ciclo de luz 12∶12 h: escuro (luzes ligadas a 07∶00 h). Ratos acostumados à instalação por uma semana com ad libitum acesso a ração padrão de laboratório e água.

Medidas de ingestão de alimentos e peso corporal

Após a aclimatação, os ratos foram pesados ​​e aleatoriamente designados para 1 dos grupos 4 que foram contrabalanceados para o peso corporal inicial. Dois grupos foram mantidos com dieta pobre em gorduras (LFD; Research Dietets, New Brunswick, New Jersey; D12450B; 10% quilocalorias de gordura (3.85 kcal / g)). Os outros grupos 2 foram mantidos em HFD (Research Dietets; D12492; 60% quilocalorias de gordura (5.24 kcal / g)). Para cada dieta, os ratos foram mantidos por semanas 2 ou 6 (semanas). Assim, os grupos 4 foram: LFD-2 wk (n = 18), HFD-2 wk (n = 16), LFD-6 wk (n = 16) e HFD-6 wk (n = 17). Todos os grupos tinham ad libitum acesso a água. As medições da ingestão alimentar e do peso corporal foram feitas três vezes por semana e os dados foram reportados separadamente para ratos submetidos a gravações voltamétricas ou análise de proteína / mensagem DAT.

Procedimentos Cirúrgicos e Medições de Dopamina

Após a exposição à dieta, um subconjunto de ratos que não diferiu no peso corporal foi preparado para registros voltamétricos (LFD-2 sem (n = 8), HFD-2 sem (n = 6), LFD-6 sem (n = 6) e HFD-6 sem (n = 7)) sob anestesia com uretano (1.5 g / kg) [como em 9,21]. Uma cânula guia (Bioanalytical Systems, West Lafayette, IL) foi posicionada acima do estriado ventral (1.3 mm anterior, 1.5 mm lateral do bregma), um eletrodo de referência de fio de prata clorado (Ag / AgCl) foi implantado no córtex contralateral e ambos foram preso ao crânio com parafusos de aço inoxidável e cimento dentário. Um micromanipulador contendo um eletrodo de fibra de carbono (CFE) foi inserido na cânula guia e o eletrodo foi baixado para o estriado ventral. O CFE e o eletrodo de referência foram conectados a um palco e o potencial do CFE foi varrido de -0.4 a +1.3 V (vs. Ag / AgCl) e de volta (400 V / s; 10 Hz). Um eletrodo estimulador bipolar (Plastics One, Roanoke, VA) foi então gradualmente abaixado na área tegmental ventral / substância negra pars compacta (VTA / SNpc; 5.2 mm posterior, 1.0 mm lateral e inicialmente 7.0 mm ventral de bregma) em incrementos de 0.2 mm . A cada incremento, um trem de pulsos de corrente (60 pulsos, 4 ms por pulso, 60 Hz, 400 µA) foi entregue. Quando o eletrodo estimulador é posicionado no VTA / SNpc e o CFE está no corpo estriado, a estimulação evoca a liberação de dopamina de forma confiável - extraída dos dados voltamétricos usando análise de componente principal , ; e convertido em concentração após cada CFE é calibrado em um sistema de injeção de fluxo após cada experimento . A posição do eletrodo estimulante foi otimizada para liberação máxima. O CFE foi então deixado equilibrar por 10 min antes de iniciar a experiência. A liberação de dopamina foi evocada por estimulação elétrica do VTA / SNpc (mesmos parâmetros como acima), e as mudanças resultantes na concentração de dopamina foram calculadas de −5 s para 10 s em relação à estimulação. Imediatamente após a estimulação, os ratos foram injectados com cloridrato de cocaína dissolvido em solução salina 0.9% (10 mg / kg ip) e, 10 min depois, a estimulação foi repetida. Tensões aplicadas, aquisição de dados e análise foram realizadas usando software escrito em LabVIEW (National Instruments, Austin, TX, EUA) .

Recaptação de dopamina

A recaptação de dopamina foi modelada usando o Software de Análise de Voltametria Demoníaca (24; Universidade Wake Forest, Winston-Salem NC). Aqui nós relatamos a constante de decaimento tau como nossa medida da taxa de recaptação de dopamina. Tau é derivada de um ajuste de curva exponencial que engloba a maioria da curva de depuração de dopamina e é altamente correlacionada (r = .9899) com Km, a aparente afinidade da dopamina para o DAT . Para determinar o efeito da cocaína no pico da concentração de dopamina, comparamos os valores obtidos antes e depois da administração (variação%).

Histologia

Após cada gravação, um eletrodo de aço inoxidável (AM Systems # 571500, Sequim, WA) foi abaixado até a mesma profundidade que o CFE e uma lesão (10 µA, 4 s) foi feita para marcar o local de gravação. Os cérebros foram removidos e armazenados em formalina 10%. A microscopia de luz foi utilizada para identificar a localização da lesão nas secções coronais (50 µm) através do estriado. Todas as gravações relatadas aqui foram feitas no estriado ventral .

Fracionamento subcelular do tecido estriado

Os ratos (LFD-2 wk, HFD-2w, LFD-6wk e HFD-6wk; n = 10 / grupo; sem diferença no peso corporal) foram mortos por decapitação. O fracionamento bioquímico foi realizado utilizando o protocolo descrito , com pequenas modificações. Os cérebros foram removidos rapidamente, congelados em isopentano e cortados em um criostato (HM505E, Microm, Walldorf, Alemanha, −20 ° C) até atingir o estriado. Bilateral 1-mm3 perfuradores através do estriado ventral (peso médio do tecido: 15.2 mg) foram homogeneizados para 20 s em 0.8 ml de TEVP gelado (10 mM Tris base, 5 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 7.4) + 320 mM tampão de sacarose. Uma alíquota de 100 de homogenato total (H) foi guardada. O restante de H foi centrifugado a 800 × g para 10 min a 4 ° C. O sedimento (P1, núcleos e grandes detritos) foi ressuspenso em 0.2 ml de tampão TEVP e guardado. O sobrenadante (S1) foi removido e colocado em um tubo limpo em gelo. O S1 foi centrifugado a 9200 × g para 15 min a 4 ° C para gerar um sedimento (P2, membranas sinaptosomais brutas) e um sobrenadante (S2). P2 foi enxaguado uma vez em tampão de sacarose TEVP + 35.6 mM e depois ressuspenso em 0.25 ml de tampão de sacarose TEVP + 35.6 mM, submetido a vórtex suavemente para 3 se lisado hiposmoticamente mantendo a amostra em gelo durante 30 min. O sobrenadante (S2) foi recolhido e centrifugado a 165,000 × g para 2 h para gerar um sedimento (P3, membranas leves, endossomos de reciclagem) que foi ressuspenso em TEVP (0.1 ml) e guardado. Todas as amostras foram mantidas a –80 ° C até a eletroforese em gel de poliacrilamida.

Eletroforese em Gel e Western Blotting

O conteúdo de proteína foi determinado usando o kit Bio-Rad DC Protein Assay (Hercules, CA), e a concentração de cada amostra foi ajustada para 0.3 mg / ml de proteína. NuPAGE LDS (dodecil sulfato de lítio) tampão de amostra (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 50 mM ditiotreitol foram adicionados a cada amostra antes do aquecimento a 70 ° C por 10 min. Para carregar quantidades equivalentes de proteína para cada fração, 3 µg de cada amostra foram carregados em géis NuPAGE Novex 4–12% Bis-Tris (Invitrogen) para separação por eletroforese em gel. As proteínas foram subsequentemente transferidas para membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA). Os locais de ligação não específicos foram bloqueados durante 2 horas à temperatura ambiente em tampão de bloqueio (5% de leite em pó desnatado em PBS e 0.02% de Tween 20 [PBS-T]). Os blots foram então incubados em anticorpo primário (1∶3000 anti-NR2B monoclonal de camundongo [# 05–920, Millipore], 1∶5000 anti-DAT de coelho [# AB2231, Millipore] e 1∶1000 receptor monoclonal de anti-transferrina de camundongo ( TfR) [# 13-6800, Invitrogen]. Os blots foram cortados em 3 partes: alto (> 97 kDa), médio (46-97 kDa) e baixo (<46 kDa) pesos e cada parte testada com um anticorpo que reconheceu uma proteína dentro dessa faixa de peso. Pesos moleculares aparentes para os anticorpos usados ​​são: NR2B, 180 kDa; DAT, 75, 64 e 50 kDa; TrfR, 95 kDa. Após sondar manchas de faixa de peso médio para DAT, os anticorpos foram removidos por incubação com tampão de separação (Tris 62.5 mM, SDS a 2%, β-mercaptoetanol 100 mM, pH 6.8) por 15 min a 50 ° C. Os blots foram subsequentemente bloqueados novamente e sondados com anti-TfR. SeeBlue Plus 2 (Invitrogen) pré- padrões corados foram executados para estimativa de peso molecular.

Os immunoblots de proteínas foram analisados ​​utilizando o software 5.0 da Carestream Molecular Imaging. A intensidade da rede (a soma dos pixels dentro da faixa de interesse menos a soma dos pixels de fundo) foi determinada para cada banda. Para permitir comparações entre blots, os dados foram normalizados para os controles LFD no 2 e 6 wks. Os dados são expressos como a indução da dobra média em comparação com LFD ± SEM.

Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa em tempo real (qRT-PCR)

Após a coleta de punções estriatais para análise de Western blot, os cérebros congelados foram seccionados coronariamente no micrótomo até atingir o VTA / SN. Bilateral 1-mm3 perfuraram-se tecidos de VTA e SN (peso médio do tecido = 15.0 mg) e extraiu-se o ARN utilizando o PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen). A qualidade e a quantidade de RNA foram avaliadas usando um Nano Chip de RNA 6000 (Agilent, Santa Clara, CA) em um Agilent Bioanalyzer 2100. O número de integridade do RNA (RIN) excedeu 7 para todas as amostras, indicando alta qualidade. Utilizou-se um micrograma de ARN total para sintetizar o ADNc utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (BioRad) numa ThermoHybaid iCycler (Thermo Scientific). Os iniciadores específicos para o DAT (Slc6a3; Iniciador directo: GGAAGCTGGTCAGCCCCTGCTT, Iniciador inverso: GAATTGGCGCACCTCCCCTCTG), β-actina (NBA; Iniciador directo: AGGGAAATCGTGCGTGACAT; iniciador inverso: AAGGAAGGCTGGAAGAGAGC), e protea de ligao caixa TATA (TBP; Iniciador directo: ACCTAAAGACCATTGCACTTCGTGCC; iniciador reverso : GCTCCTGTGCACACCATTTTCCC) (números de acesso do Genbank NM_012694, NM_031144 e NM_001004198) foram desenhados utilizando NCBI Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) e adquiridos da Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). A análise da curva de fusão e a eletroforese em gel de poliacrilamida confirmaram a especificidade dos primers. Os amplicons DAT, β-actina e Tbp são pares de bases 266, 182 e 136, respectivamente.

Um kit Q-PCR (iQ SybrGreen Supermix, BioRad) foi usado. A reacção foi realizada num sistema de detecção de PCR em tempo real MyiQ de cor única (BioRad) num volume de 20, com 2 de 3 e primers reversos e 4 de amostra de cDNA dilua com 1XUMUM. As condições de ciclo de PCR foram 10 ° C para 95 min; O 5 circula a 40 ° C para 94 s, 15 ° para 60 s, 15 ° C para 72 s. Os dados foram recolhidos a uma temperatura de leitura de 15 ° C para 84 s com base nas temperaturas de fusão do amplicon. Foram geradas curvas de diluição padrão para cada conjunto de iniciadores diluindo em série (15, 1.00, 0.2 e 0.04 vezes) um stock de ADNc principal compreendendo uma mistura igual de ADNc de todos os grupos de tratamento. O registro10 dos valores de diluição foi traçada contra os valores do ciclo de limiar para as curvas padrão. O software MyiQ Optical System (BioRad) foi usado para analisar os dados. Amostras contendo nenhum molde de cDNA e amostras de reações de cDNA que não continham transcriptase reversa foram analisadas como controles para contaminação e amplificação de DNA genômico, respectivamente. Os valores reportados foram normalizados para os valores médios dos padrões internos ß-actina e Tbp para cada amostra. Os dados são expressos como níveis relativos médios de DAT / padrões internos mRNA ± SEM.

Análise estatística

A expressão DAT muda dinamicamente durante o ciclo de vida em ambos os seres humanos e ratos , . Além disso, a resposta dopaminérgica e comportamental à cocaína também muda à medida que os ratos jovens amadurecem . Assim, as medições de DAT poderiam co-variar com a idade e proibir comparações significativas entre os grupos wLN 2 e 6 wk. Por conseguinte, as médias dos grupos para ingestão de alimentos, peso corporal, concentração máxima de dopamina, tau,% de alteração e expressão génica relativa foram comparadas separadamente para os grupos 2 e 6 wk utilizando o teste t não pareado de Student. Para an�ise de Western blot, as diferen�s dos grupos na intensidade de banda DAT normalizada foram comparadas separadamente para os grupos de 2 e 6 wk utilizando ANOVA de medidas repetidas de duas vias (dietXfraction). Todas as análises estatísticas foram realizadas em Graph Pad 5 (Prism Inc.).

Resultados

HFD promove aumento do consumo de gordura

Antes do início da exposição à dieta, não houve diferenças no peso corporal inicial na semana 2 (LFD: 275.22 +/− 4.1 g; HFD: 280.87 +/− 4.8 g; p = 0.37), ou 6 semanas (LFD: 287.31 +/− 4.9 g; HFD: 289.44 +/− 5.1 g; 6 semanas p = 0.97) grupos. Apesar de consumir dietas de composição drasticamente diferente, não encontramos diferenças no peso corporal entre os grupos de dieta após 2 ou 6 semanas (Fig. 1a – b; ambos ns). Também não houve diferença no total de kcals consumidos entre os grupos após a ingestão de 2 e 6 semanas de exposição à dieta (Fig. 1c-d; ns). No entanto, os ratos HFD consumiram significativamente mais kcals de gordura (Fig. 1e-f; 2 wks: t (32) = 25.59; 6 wks: t (31) = 27.54; p<0.0001 para ambas as durações da dieta).

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Figura 1. Medidas de ingestão de alimentos e peso corporal.

Não houve diferenças entre DFF e DML no peso corporal final (a – b) ou quilocalorias totais consumidas (CD) após 2 ou 6 semanas de exposição à dieta. (e-f) Os ratos HFD consumiram significativamente mais quilocalorias de gordura do que os ratos LFD nas condições de semana 2 e semanas 6 (***p

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g001

HFD prolongado reduz a taxa de recaptação de DA

As gravações voltamétricas foram feitas no estriado ventral (Figura 2). Figura 3 mostra mudanças eletricamente evocadas representativas na concentração de dopamina adquirida de ratos após dieta 6. No início do estudo, a magnitude da dopamina evocada não diferiu entre os grupos de dieta e durante a duração da dieta (Fig. 4a – b, ambos ns). Contudo, a inspecção de exemplos individuais sugeriu que a taxa de decaimento após a concentração máxima de dopamina diferiu entre os grupos de dieta após as semanas de exposição à dieta (Figura 3 a – b para exemplos). A taxa de decaimento é devida principalmente à depuração de dopamina pelo DAT , que modelamos como exponencial de fase única para determinar tau. Não houve diferenças entre os grupos alimentares após 2 semanas de exposição à dieta (Fig. 4c). No entanto, após 6 semanas de exposição à dieta, a tau foi significativamente maior em ratos com HFD-6 em relação à LFD-6 wk (Fig. 4d; t (11) = 2.668; p<0.05). Assim, 6 semanas de HFD reduz a taxa de depuração de dopamina no estriado ventral em comparação com animais que consumiram um LFD.

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Figura 2. Verificação histológica de locais de registro para análise de recaptação.

Locais de gravação para ratos alimentados com LFD são codificados por triângulos cinza e para ratos HFD por círculos pretos. Os números indicam a distância em mm anterior a Bregma. Figura adaptada de Paxinos e Watson 2006.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g002

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Figura 3. A estimulação elétrica do VTA / SNc evoca um pico fásico na concentração de dopamina.

Exemplos representativos de dados adquiridos após 6 semanas de exposição à dieta. a) Gráfico de cores subtraindo fundo mostra as mudanças de corrente em diferentes potenciais do eletrodo antes (5 para 0 s em relação ao início) e depois (0.1 para 10 s em relação ao início) de estimulação elétrica (STIM) da VTA / SNc. O tempo é a abscissa, o potencial do eletrodo é a ordenada e as mudanças atuais são codificadas em cores falsas. A dopamina [identificada por suas características de oxidação (+ 0.6 V; verde) e de redução (−0.2 V; azul)] aumentou transitoriamente em resposta à estimulação neste rato com LFD-6. b) O mesmo que em a), exceto de um rato com HFD-6 wk. c) A concentração de dopamina em função do tempo é extraída do gráfico colorido em a) e a tau é identificada através do ajuste da curva. Dois pontos vermelhos marcam o pico e a concentração de dopamina no momento em que tau é atingido. Tau é indicado à direita. d) O mesmo que em c), mas os dados são extraídos de b).

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g003

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Figura 4. Seis semanas de dieta rica em gordura reduz a taxa de recaptação de dopamina e atenua a resposta da dopamina à cocaína.

O pico médio de concentração de dopamina evocado pela estimulação VTA / SNpc após 2 (a) ou semanas 6 (b) da exposição à dieta antes da injeção de cocaína. CD) Tau médio após 2 (c) wks ou 6 wks (d) da exposição à dieta. Tau foi significativamente maior para ratos HFD-6 em relação aos ratos LFD-6 wk (*p e-f) Variação percentual da concentração máxima de dopamina evocada após a injecção de cocaína no 2 (e) e 6 (f) semanas de exposição à dieta. A alteração percentual foi significativamente menor em ratos HFD-6 em relação aos ratos LFD-6 wk (**p

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g004

HFD prolongado diminui a resposta da DA à cocaína

Para investigar ainda mais as alterações induzidas pela dieta no DAT, injetamos ratos com a cocaína bloqueadora de DAT. O pico de concentração de dopamina após a estimulação elétrica é causado pela liberação de dopamina, mas também é limitado pela remoção simultânea de dopamina pelo DAT. . Nós caracterizamos o efeito da cocaína na transmissão da dopamina calculando a mudança na magnitude da dopamina evocada em relação aos valores pré-droga (variação%). Duas semanas de DH não afectaram a alteração percentual em relação ao LFD (Fig. 4e; ns). No entanto, após 6 semanas de exposição à dieta, a alteração percentual foi significativamente diminuída na DH em relação à LFD (Fig. 4f; t (10) = 4.014; p<0.01). Nossos resultados sugerem que 6, mas não 2 semanas, de exposição a HFD reduz a resposta da dopamina à cocaína.

Exposição prolongada à HFD reduz a expressão da proteína DAT em membranas sinaptossomais

Para determinar se os efeitos da DHG prolongada foram devidos a alterações no número DAT, os níveis de proteína DAT foram quantificados em homogeneizados de tecido total (fração H), membranas sinaptossomais (fração P2) e endossomos de reciclagem intracelular (fração P3). DAT é um N-ligetada com um peso molecular aparente entre 50 e 80 kDa devido ao aumento dos níveis de glicosilação à medida que a proteína amadurece . O fraccionamento foi confirmado pela expressão enriquecida da subunidade NR2B do receptor NMDA na fracção membranar sinaptossómica e do receptor da transferrina na fracção endossomal (por exemplo, Fig. 5b). Não encontramos diferenças na proteína DAT total após a ingestão de 2 e 6 da dieta (dados não mostrados). Para testar as diferenças específicas da fração na proteína DAT, usamos medidas repetidas de duas vias ANOVA (dietXfraction). Consistente com os experimentos de voltametria, 2 semanas de exposição à dieta foi insuficiente para alterar os níveis de qualquer uma das isoformas do DAT nas frações P2 ou P3 (FIG. 5. c, e, g; todos ns). No entanto, após 6 semanas de exposição à dieta, houve uma interação significativa de dietXfraction (F(1,18) = 8.361, p<0.01); Fig. 5d) para a isoforma 50 kD do DAT. Assim, o prolongado HFD reduziu significativamente a isoforma 50 kD do DAT na fração P2 e causou uma tendência para um aumento na fração P3. Não encontramos nenhum efeito de dieta ou fração no 64 kD (Fig. 5f; ns) ou o 70 kD (Fig. 5h; ns) isoformas DAT.

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Figura 5. O consumo de uma dieta rica em gordura diminui a proteína DAT associada à membrana no estriado ventral.

a) Imagem representativa mostrando os punhos de tecido (2) 1 × 1 mm retirados do estriado ventral que foram combinados para análise de proteína DAT. VStr = Striatum Ventral; DStr = estriado dorsal; cc = corpo caloso; ac = comissura anterior. b) Western blots representativos dos dados apresentados em c – h. L = LFD; H = HFD; TfR = receptor de transferrina; NR2B = Subunidade NR2B do receptor NMDA. c) Não houve diferenças na proteína 50 kD DAT para as fracções P2 ou P3 após semanas 2 de exposição à dieta. d) A proteína DAT de 50 kD é significativamente reduzida no P2 (* = p<05), mas não a fração P3 do tecido estriado ventral em HFD-6 semanas em relação a ratos LFD-6 semanas. Não houve diferenças na proteína DAT de 64 kD após 2 (e) ou semanas 6 (f) da exposição à dieta. Não houve diferenças na proteína 70 kD DAT após 2 (g) ou semanas 6 (h) da exposição à dieta.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g005

Para determinar se os níveis diminuídos de proteína DAT na fração P2 eram devidos, em parte, a uma redução na transcrição de DAT, os níveis de mRNA de VTA / SNc DAT foram medidos nos mesmos ratos que acima (Fig. 6a por exemplo). Não observamos diferenças entre os grupos dietéticos no mRNA DAT do mesencéfalo após a ingestão de 2 ou 6 da dieta (Fig. 6b-c; ambos ns). Assim, é improvável que as diferenças nos níveis de proteína DAT dentro do estriado ventral sejam devidas a déficits na produção de DAT.

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Figura 6. O consumo de dieta rica em gordura não altera os níveis de mRNA do DAT. a)

Imagem representativa mostrando punções de tecido 1 × 1 mm retiradas do VTA / SN e combinadas para análise de mRNA DAT. cp = pendúnculo cerebral; pc = comissura posterior; MM = núcleo mamilar medial. Não houve diferenças nos níveis relativos de ARNm de DAT após as semanas 2 (b) ou 6 semanas de exposição à dieta (c).

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g006

Discussão

O consumo prolongado de HFD pode levar à DIO e à plasticidade no sistema nervoso central. Neurônios dopaminérgicos e receptores dopaminérgicos estriatais parecem ser um conjunto de alvos do SNC que são afetados por uma DHG e em indivíduos obesos , , . Aqui nós relatamos que uma DHF reduziu a taxa de recaptação de dopamina no estriado ventral e este efeito foi dependente da duração da exposição. Importante, o efeito do HFD na função DAT ocorreu na ausência de DIO. Embora não tenhamos medido diretamente os marcadores de adiposidade corporal neste estudo, os animais têm sido tradicionalmente classificados como DIO ou resistentes à dieta, baseando-se unicamente no ganho de peso corporal após exposição a um HFD. . A HFD prolongada atenuou significativamente a capacidade da cocaína, que interfere com o DAT, para potencializar a magnitude da liberação de dopamina. Nós quantificamos os níveis de proteína DAT no estriado ventral usando análise de Western blotting - distinguindo entre DAT localizado dentro de frações subcelulares enriquecidas para a membrana plasmática ou endossomos de reciclagem. Encontramos uma redução significativa em uma isoforma imatura do DAT associado à membrana plasmática. Assim, o prolongado HFD parece reduzir a taxa de recaptação da dopamina através do DAT, provavelmente por interferir com o tráfico ou a maturação do DAT, mas não diminuindo a expressão do gene DAT ou a estabilidade do mRNA do DAT. Além disso, um período entre duas e seis semanas de exposição a um HFD parece ser o primeiro ponto de inflexão da plasticidade induzida pela dieta em relação ao DAT.

A obesidade está correlacionada com múltiplos aspectos da sinalização da dopamina do estriado, incluindo a disponibilidade de DAT em ambos os seres humanos e ratos . No entanto, apenas recentemente foi demonstrado que o desenvolvimento de DIO altera a taxa de recaptação de dopamina em ratos . Enquanto este estudo demonstrou a recaptura da dopamina prejudicada após a aplicação de dopamina exogenamente após apenas 4 semanas de DHA, os animais que foram mantidos em uma DFF foram selecionados com base no ganho de peso inicial e, portanto, poderia representar uma população única. Consistente com essa visão, os animais com HFD continuaram a ingerir mais calorias e ganhar mais peso em comparação com os controles LFD. Outro estudo recente relatou recaptura de dopamina prejudicada após semanas de 12 de HFD em ratos fora de raça . No entanto, houve diferenças significativas no peso corporal entre os animais alimentados com um DFF versus uma dieta padrão de laboratório quando as medições da recaptura foram feitas. Portanto, não ficou claro se as deficiências na recaptação da dopamina surgem como resultado direto ou precedem o desenvolvimento da DIO. Em contraste com estes relatórios recentes, não encontramos diferenças no peso corporal ou consumo total de kcal entre os nossos grupos de dieta quando foram feitas medições de recaptura. O fato de termos encontrado diferenças na recaptação da dopamina após 6, mas não 2, semanas de DH sugere que alterações induzidas por dieta na recaptação de dopamina são uma resposta às mudanças crônicas, mas não agudas, na composição da dieta. Além disso, nossos resultados sugerem que, em vez de serem resultado da obesidade, as alterações induzidas pela dieta no DAT poderiam contribuir para o desenvolvimento da doença. Estudos futuros deverão abordar se as populações de animais que são diferencialmente suscetíveis a DIO têm diferenças preexistentes na expressão / função do DAT ou são diferencialmente suscetíveis a mudanças induzidas por dieta no DAT.

Até onde sabemos, este é o primeiro estudo que demonstra que a DH reduz a resposta da dopamina à cocaína. Dado o papel da dopamina na recompensa de medicamentos, nossos resultados são consistentes com trabalhos anteriores demonstrando que ratos alimentados com DHF por aproximadamente 6 semanas são mais lentos para adquirir autoadministração de cocaína do que animais alimentados com uma dieta controle. . É importante ressaltar que esse efeito também foi independente do desenvolvimento do DIO. Além disso, ratos criados seletivamente para suscetibilidade à DIO mostram uma redução na preferência por cocaína, sugerindo que as propriedades recompensadoras da cocaína são atenuadas nesses animais. . A diminuição da resposta à cocaína que observamos em ratos com HFD-6 pode ser devido à redução da disponibilidade de DAT no estriado. No entanto, a cocaína também aumenta a sinalização da dopamina através de mecanismos não dependentes do DAT. Especificamente, a HFD poderia ter comprometido a mobilização induzida por cocaína de vesículas de reserva de dopamina . A cocaína também atenua a transmissão de GABA em neurônios dopaminérgicos dentro da VTA e induz oscilações na taxa de queima de corpos celulares de dopamina . Qualquer um ou todos esses processos também podem ter sido afetados por um HFD. Pesquisas futuras precisarão abordar os mecanismos subjacentes de como uma DH modifica os aspectos recompensadores da cocaína e / ou o potencial para adaptações neurais induzidas por drogas . O consumo de um HFD atenua tanto o comportamento e resposta de dopamina , à anfetamina, que também interfere com o DAT. É importante ressaltar que os ratos cuja ingestão de uma DHF foi caloricamente igual à dos ratos alimentados com uma dieta controle não desenvolvem DIO, mas ainda assim não desenvolvem uma preferência de lugar condicionada por anfetamina. . Juntamente com os dados apresentados aqui, parece que o consumo de um DFF enfraquece a resposta aos psicoestimulantes. Todas as drogas de abuso influenciam o sistema de dopamina, e o aumento da sinalização de dopamina induzido por drogas é considerado crítico para o desenvolvimento do vício. . Assim, a resposta reduzida à cocaína em ratos com DHF é consistente com relatos de que humanos obesos têm um risco vitalício significativamente menor de desenvolver um distúrbio de abuso de substâncias. . O trabalho futuro terá que abordar se a avaliação subjetiva da recompensa de cocaína difere em indivíduos obesos em comparação com controles de peso normal.

Nossa análise de western blot sugere que o consumo prolongado de uma HFD não afeta a proteína DAT total estriatal, mas reduz a integração da isoforma 50 kDa DAT não glicosilada em membranas sinaptossômicas. Enquanto a glicosilação DAT melhora a taxa de transporte de dopamina e aumenta a estabilidade da superfície da membrana , , DAT não glicosilado de humanos , bem como ratos prontamente transporta dopamina. Além disso, experimentos de rotulagem imune revelam que os níveis de DAT não glicosilados são mais altos no ventral em comparação ao estriado dorsal em macacos e humanos. . Em conjunto, estes estudos sugerem que os níveis diminuídos de membrana de 50 kDa DAT podem contribuir para o défice de recaptação observado em ratos 6 wk HFD. Nossos dados são consistentes com um estudo anterior mostrando que o consumo de HFD reduz a disponibilidade de DAT no estriado ventral de camundongos . No entanto, este estudo não mediu a localização do DAT em diferentes compartimentos intracelulares. Além disso, nossos achados são consistentes com um estudo mostrando reduções no DAT da superfície celular no estriado de ratos DIO . Este estudo também relatou que os níveis totais de proteína DAT não foram afetados pela dieta no modelo DIO. Nós expandimos este achado para mostrar que a proteína DAT total também não é afetada por uma DHA em ratos fora da raça. Portanto, o consumo prolongado de uma DH não altera a expressão do DAT, mas pode interferir no tráfico ou maturação do DAT.

A falta de diferenças nos níveis de ARNm de VTA / SNpc DAT após exposição a 2 ou 6 da exposição a HFD apoia ainda mais a noção de que os níveis globais de DAT não foram afectados pelas manipulações da nossa dieta. Este resultado contrasta com um relatório anterior mostrando redução do ARNm de DAT na VTA de rato após 17 semanas de consumo de HFD . No entanto, neste estudo, os níveis de ARNm de DAT foram medidos após os grupos de dieta terem diferido no peso corporal durante as semanas 12. Assim, seus resultados provavelmente representam adaptações tardias ao DIO. Em resumo, nossos dados fornecem fortes evidências de que a exposição a uma DH leva a alterações funcionais na recaptação da dopamina do estriado, diminuindo as DATs associadas à membrana, sem alterar a expressão total da DAT. É importante ressaltar que relatamos que rupturas induzidas por dieta no DAT podem ocorrer antes do início do DIO, sugerindo que essas alterações poderiam contribuir para o desenvolvimento da obesidade.

Nossos dados contribuem para uma crescente literatura implicando a dieta na regulação da função da dopamina, e fornecem evidências adicionais de que mudanças induzidas pela dieta na expressão de DAT levam a mudanças funcionalmente relevantes na sinalização da dopamina. As alterações induzidas pela dieta na dinâmica da sinalização da dopamina do estriado através do DAT podem ter consequências no comportamento alimentar. Estímulos relacionados à comida evocam aumentos fásicos na dopamina estriada , , , o que provavelmente reforçará e fortalecerá ações direcionadas aos alimentos . Aqui mostramos que 6 semanas de consumo de HFD prolonga a duração da liberação de dopamina fásica pela diminuição de DATs associadas à membrana em uma região do estriado onde a função da dopamina é essencial para a ingestão de alimentos . As alterações dependentes da dieta no DAT podem promover um mecanismo de alimentação por meio do qual os sinais prolongados de dopamina evocados por estímulos alimentares aumentam a ativação dos receptores D1 de dopamina de baixa afinidade no estriado, que são críticos para os comportamentos de abordagem , , . Com o tempo, a elevação prolongada da dopamina estriatal poderia promover adaptações, como a regulação negativa dos receptores D2 da dopamina (D2R), o que foi demonstrado em modelos de obesidade em humanos e em roedores. , . Nosso estudo sugere que o desenvolvimento da obesidade não é um requisito para alterar a recaptação da dopamina. Assim, os decréscimos relacionados com a dieta no DAT da membrana poderiam preceder e contribuir para o aparecimento de downregulation D2R, obesidade e comportamento alimentar compulsivo que se desenvolve ao longo do curso do consumo de HFD .

Agradecimentos

Queremos agradecer aos Drs. Jamie D. Roitman e James E. McCutcheon por comentários úteis sobre versões anteriores do manuscrito. O conteúdo deste artigo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH ou do Consórcio Biomédico de Chicago.

Contribuições do autor

Concebeu e desenhou as experiências: JJC EHC MFR. Realizou os experimentos: JJC DNP SRE. Analisou os dados: JJC EHC SRE MFR. Escreveu o artigo: JJC EHC MFR.

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