Sou J Physiol Regulam Integr Comp Physiol. 2011 Apr; 300 (4): R876 - R884.
Publicado on-line 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Sumário
Nós relatamos anteriormente que a administração de insulina no núcleo arqueado do hipotálamo diminui a motivação para a sacarose, avaliada por uma tarefa de auto-administração, em ratos. Como o padrão de ativação do sistema nervoso central (SNC) em associação com a autoadministração de sacarose não foi avaliado, no presente estudo, medimos a expressão de c-Fos como um índice de ativação neuronal. Nós treinamos ratos para barrar a sacarose, de acordo com um rácio de taxa fixa (FR) ou progressiva (PR) e mapeou a expressão de imunorreactividade de c-Fos no SNC, em comparação com a expressão de c-Fos em controlos manipulados. Observamos uma expressão única de c-Fos no hipotálamo medial (os núcleos arqueado, paraventricular, retrochiasmático, dorsomedial e ventromedial) em associação com o início do desempenho de RP e a expressão de c-Fos no hipotálamo lateral e no núcleo do leito da estria terminal em associação com o início do desempenho FR. A expressão de c-Fos foi aumentada no nucleus accumbens de ambos os ratos FR e PR. Nosso estudo enfatiza a importância dos circuitos de homeostase da energia hipotalâmica e dos circuitos límbicos no desempenho de uma tarefa de recompensa alimentar. Dado o papel do hipotálamo medial na regulação do balanço energético, nosso estudo sugere que esse circuito pode contribuir para recompensar a regulação dentro do contexto mais amplo da homeostase energética.
os circuitos dopaminérgicos mesolímbicos (DA), incluindo a área tegmentar ventral (VTA) e projeções para os locais estriado e cortical, foram identificados como desempenhando um papel crítico nos aspectos motivadores ou recompensadores de inúmeras classes de drogas de abuso (13, 22-24, 26, 48). Pesquisas recentes de nosso laboratório e de outros pesquisadores sugerem que esse circuito também desempenha um papel importante nos aspectos motivadores ou recompensadores dos alimentos. A interação funcional e anatômica com os circuitos que regulam a homeostase energética é sugerida por relatos da modulação da recompensa alimentar pelo estado nutricional dos animais (10, 14, 16, 43). A modulação da recompensa, incluindo recompensa alimentar, por estado nutricional ou metabólico, é fortemente influenciada por sinais neurais e endócrinos, incluindo a insulina (15), leptina (11, 18, 21, 30, 32), grelina (35), hormona concentradora de melanina (MCH) (45) e orexina (5, 7): a presença de receptores, a eficácia bioquímica e celular e a eficácia in vivo ou comportamental destes sinais no sistema nervoso central (SNC) têm sido abundantemente demonstrados nos últimos anos.
Os circuitos límbicos estendidos também mostraram desempenhar um papel na alimentação e recompensa alimentar (2, 19, 28). No entanto, existem outros sites do CNS que contribuem. Notavelmente, o hipotálamo lateral (LH) é conhecido há muito tempo como um local que media os comportamentos de alimentação e autoestimulação (4, 31). Os neurónios orexinérgicos e a sinalização da leptina no LH foram identificados como importantes para a alimentação e recompensa alimentar (5, 29, 30). Recentemente, observamos que a insulina administrada no terceiro ventrículo cerebral ou no núcleo arqueado do hipotálamo (ARC) poderia diminuir a autoadministração de sacarose, mas a administração de insulina na VTA ou no nucleus accumbens não teve efeito sobre esse paradigma específico de recompensa (15). Assim, parece que múltiplos sítios hipotalâmicos podem desempenhar um papel significativo na procura e aquisição de alimentos motivados, e consistente com isto, seria hipotetizado que as regiões hipotalâmicas são substancialmente ativadas em associação com a auto-administração de alimentos. Para começar a testar essa hipótese, mapeamos a expressão de c-Fos no SNC de ratos treinados em um paradigma de autoadministração de sacarose, após um treinamento com taxas fixas (FR) ou após um treinamento com relações progressivas (RP), uma tarefa mais rigorosa. para avaliar a motivação (20).
MATERIAIS E MÉTODOS
Assuntos.
Os indivíduos eram ratos Albino machos (325–425 g) de Simonsen (Gilroy, CA). Os ratos foram mantidos com ração ad libitum. Eles foram mantidos em ciclo claro-escuro de 12: 12h com as luzes acesas às 6h e foram treinados e testados entre 7h e meio-dia, na condição pós-prandial e pós-absortiva. Todos os procedimentos realizados nos ratos seguiram as diretrizes do National Institutes of Health para cuidados com os animais e foram aprovados pelo Animal Care and Use Subcom Committee do Research and Development Committee do VA Puget Sound Health Care System.
Autoadministração de sacarose.
Os procedimentos foram baseados em nossa metodologia publicada (15) e foram realizadas em ratos alimentados. O experimento incluiu três fases: autoformação para iniciar o treinamento, treinamento de FR e treinamento de relações progressivas (RP) usando o algoritmo de Richardson e Roberts (38). O algoritmo PR requer 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437 ( etc) alavanca pressiona para entregas de recompensas sucessivas dentro de uma sessão (38). Os ratos foram treinados para auto-administrar 5% de sacarose (0.5 ml de recompensa) entregue em um recipiente de gota líquida. As caixas operantes, controladas por um sistema da Med Associates (Georgia, VT), tinham duas alavancas, mas apenas uma alavanca (uma alavanca ativa e retrátil) ativava a bomba de infusão. Prensas na outra alavanca (uma alavanca inativa, estacionária) também foram gravadas. Como observamos anteriormente, o número de prensas na alavanca inativa foi muito baixo (menos de 10 prensas / sessão). A solução de sacarose foi entregue a um recipiente de gotas líquidas para consumo oral (Med Associates, St. Albans, VT). O treinamento inicial foi conduzido durante as sessões 1-h sob um esquema de reforço contínuo (FR1: cada alavanca foi reforçada). Cada sessão começou com a inserção da alavanca ativa e a iluminação de uma luz branca que permaneceu acesa durante toda a sessão. Um tom 5-s (2900 Hz, 20 dB acima do fundo) e luz (7.5 W luz branca acima da alavanca ativa) sinal composto discreto acompanhou cada entrega de recompensa, com um tempo limite de 20-s começando com a entrega de sacarose. FR treinamento foi realizado por 10 dias; resposta estável é alcançada pela quinta sessão. O treinamento de RP foi realizado para um máximo possível de 3 h / dia por 10 dias. As sessões de RP terminaram depois de 30 min sem resposta ativa da alavanca, em cujo ponto a luz da casa foi desligada automaticamente e a alavanca ativa foi retraída; os ratos foram retirados das câmaras e retornados às suas gaiolas. "Stop time" relatado em tabela 2 representa a hora em que o sistema foi desligado; portanto, a última pressão da alavanca ativa teria ocorrido 30 min antes do tempo de parada. Dados comportamentais (tabela 2) representam médias de sessões 6-10 para treinamento de FR, e sessões 1-9 para treinamento de RP. Ratos manipulados com o controle foram retirados da sala de alojamento e colocados em uma câmara operante limpa com luz interna acesa por 60 min, dentro da sala de procedimentos, para simular as experiências de manipulação e espaço dos ratos auto-administrando sacarose. Eles não recebiam nada para comer ou beber enquanto estivessem nas caixas dos operários e não tinham acesso a alavancas.
No último dia, os ratos foram colocados nas câmaras conforme os dias de treinamento e permaneceram nas câmaras por 90 min, após os quais foram retirados, para anestesia, perfusão e posterior imunohistoquímica. Da mesma forma, ratos controle foram levados para a sala de procedimento e mantidos em câmara operatória limpa, conforme os dias de treinamento, por 90 minutos, após o que foram anestesiados e perfundidos. Imediatamente após a última sessão de 90 minutos, os ratos foram profundamente anestesiados com inalação de isoflurano e perfundidos com NaCl a 0.9% seguido de solução fria de paraformaldeído a 4%. O tempo para anestesia e eutanásia foi baseado no curso de tempo conhecido do pico de expressão da proteína c-Fos 90-120 minutos após o evento. Assim, a expressão de c-Fos refletiria a ativação do SNC no início da tarefa comportamental, em vez de ser o resultado de os animais experimentarem a tarefa e ingerirem sacarose. Os cérebros foram removidos e pós-fixados em paraformaldeído por vários dias; em seguida, foram posteriormente colocados em sacarose-PBS a 20%, após o que foram colocados em solução de PBS-sacarose a 30%. Os cérebros foram seccionados em um criostato (criostato Leica CM 3050S) para imuno-histoquímica.
Imuno-histoquímica e quantificação de c-Fos.
Utilizamos nossa metodologia estabelecida para quantificar a proteína imunorreativa c-Fos em secções do cérebro (12). A triagem qualitativa inicial de todo o cérebro foi conduzida para a expressão de c-Fos. Secções coronais inteiras de cérebros 12-μm montados em lâminas foram lavadas 3 vezes em PBS (Oxoid, Hampshire, UK). As secções foram então bloqueadas para 1 h à temperatura ambiente em PBS contendo 5% de cabra normal ou soro de burro. As secções foram então lavadas várias vezes em PBS e incubadas durante a noite a 4 ° C em soluções de anticorpo primário formadas em PBS. As secções foram lavadas três vezes em PBS e depois incubadas no escuro à temperatura ambiente numa solução de anticorpo secundário preparada em PBS para 1 h. As secções foram subsequentemente lavadas de novo em PBS e montadas e a tampa escorregou em meio de montagem de meio de montagem de conjunto rígido Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Imagens digitais de seções foram adquiridas usando um microscópio de fluorescência Nikon Eclipse E-800 conectado a uma câmera Optiphot e usando o software Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Posteriormente, nos concentramos em um número limitado de áreas que mostram uma diferença aparente entre condições, para quantificação e para fenotipagem neuronal. Especificamente, nos concentramos no núcleo e no núcleo do nucleus accumbens (NAc); núcleo anterior e posterior do leito da estria terminal (aBNST, pBNST); regiões hipotalâmicas mediais [núcleo ventromedial (VMH), hipotálamo dorsomedial (DMH), núcleo paraventricular (PVN), área retroquiasmática (RCh) e ARC]; hipotálamo lateral (LH), incluindo as regiões dorsal e ventral e a área perifornical (peF); VTA; tronco cerebral [núcleo inferior de oliva, hipoglosso (nXII) do trato solitário, núcleo reticular lateral e núcleos de adrenalina / noradrenalina C1 / A1]. As secções 12-μm correspondentes a Atlas foram avaliadas quanto à expressão e quantificação de c-Fos em secções e regiões correspondentes, com base no atlas de Paxinos e Watson (34). Por favor, veja tabela 1 para coordenadas estereotáxicas específicas. O foco primário dos ensaios foi comparar cada tarefa comportamental com seu respectivo controle (PR vs. PRC; FR vs. FRC). Para otimizar possíveis diferenças com base no comportamento versus condições de controle, os executores de pico dos grupos PR e FR foram selecionados para análise. Assim, os ratos 4 / 12 PR e 3 / 12 FR foram analisados: estes ratos tinham um número ativo de pressão na alavanca (o ponto final primário comportamental) que era maior do que um desvio padrão acima da média para seu respectivo grupo comportamental. Um subcoorte dos ratos de controlo (ratos 5 PRC e 3 FRC, presentes na sala de procedimentos ao mesmo tempo que os ratos FR ou PR) foi também analisado. Um grupo adicional de três ratos foi submetido ao procedimento FR (“FRext”) para imitar a duração adicional do procedimento PR (ie, para um total de 20 dias, quando os ratos PR são tomados através de FR e PR) para avaliar se diferenças entre FR e PR foram devidas à tarefa comportamental ou à duração do procedimento. Os cérebros de FRext não foram analisados e analisados sistematicamente, mas as regiões específicas de interesse foram analisadas com os outros quatro grupos, para permitir a quantificação comparativa, como indicado especificamente nos resultados.
Para quantificação (em 40 × ampliação), as regiões correspondidas pelo atlas foram selecionadas. O software ImagePro Plus (Media Cybernetics) foi utilizado para capturar uma imagem da área desejada. Uma área foi delineada para contagem e um limiar para contagens celulares positivas foi estabelecido. A área idêntica e fundo (limiar) foram utilizados para seções dos respectivos grupos experimentais, e a contagem de software de células positivas (quantificação) foi realizada na mesma sessão para todos os grupos experimentais, para evitar mudanças entre as sessões no cenário de fundo. Para análise estatística, as contagens foram feitas a partir de um rato individual somente se seções correspondentes ou completas através de cada área (como definido em tabela 1) estavam disponíveis; dados para uma área específica não foram retirados de um rato se houvesse representação bilateral incompleta para aquela área.
Análise qualitativa de imunofluorescência duplamente marcada.
Secções do cérebro foram retiradas dos ratos em que c-Fos foi quantificado, para imuno-histoquímica duplamente marcada. Por não desejarmos atrapalhar o desempenho comportamental dos animais, eles não foram pré-tratados com colchicina para otimizar a visualização dos neurotransmissores peptídicos. Portanto, a visualização de fenótipos neuronais ativados em associação com a tarefa de autoadministração foi limitada. No entanto, para começar a avaliação dos fenótipos de neurônios ativados em uma série de locais do SNC, imagens digitais (adquiridas conforme descrito na seção acima) foram obtidas com ampliação de 20 ×, 40 × ou 60 × (como indicado nas legendas das figuras) . O procedimento de coloração dupla para glutamato descarboxilase (GAD), tirosina hidroxilase (TH), CRF, neuropeptídeo Y (NPY), peptídeo relacionado a Agouti (AgRP) e triptofano hidroxilase foi comparável ao ensaio de c-Fos-imunorreatividade em seu próprios, exceto que uma mistura de c-Fos-Ab e um dos outros anticorpos primários foi usada para incubação durante a noite a 4 ° C; da mesma forma, ambos os anticorpos secundários estavam na mesma solução e incubados por 1 h no escuro em temperatura ambiente. Uma lavagem com etanol a 20% de 50 minutos antes da etapa de bloqueio foi utilizada para o ensaio de orexina. Os ensaios de otimização iniciais foram realizados para determinar uma diluição apropriada dos anticorpos primários. Os anticorpos primários usados foram anti-c-Fos de coelho (1: 500) (sc-52) e anti-c-Fos de camundongo (1: 800) (ambos da Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-GAD de murganho (1: 1,000), anti-tirosina hidroxilase de murganho (1: 500) e anti-triptofano hidroxilase de ovelha (todos de Chemicon, Temecula, CA); anti-CRF de coelho (1: 500) (presente do Dr. Wylie Vale, Salk Institute, CA); anti-NPY de coelho (1: 1,000), anti-AGRP de coelho (1: 1,000) e anti-orexina A de cabra (1: 5,000), todos da Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). Os anticorpos secundários usados foram anti-coelho ou anti-camundongo de cabra conjugado com Cy3 (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), IgG de cabra anti-camundongo ou anti-coelho ou de burro anti-ovelha Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) ; todos os anticorpos secundários foram diluídos a 1: 500. A imunocoloração dupla c-Fos / MCH foi ensaiada em série; primeiro, para MCH (anticorpo primário 1: 2,500, Millipore) com anticorpo secundário Alexa-488-cabra anti-coelho (1: 500). As lâminas foram bloqueadas novamente com 5% de soro de cabra normal e coradas para anti-c-Fos (1: 500) e anti-coelho de cabra cy3 como anticorpo secundário. Uma lavagem com etanol a 20% de 50 minutos antes da etapa de bloqueio foi utilizada para o ensaio de MCH.
Análise estatística.
Os dados do grupo são apresentados como médias ± SE no texto, tabelas e figuras. Significância é definida como P ≤ 0.05. As comparações estatísticas são feitas entre grupos experimentais (FR vs. PR) ou entre grupos experimentais e os controles correspondentes (PR vs. PRC; FR vs. FRC) usando Student's desemparelhados t-teste. Os coeficientes de correlação de Pearson entre pressionamentos de alavanca ativa e expressão de c-Fos em diferentes regiões do cérebro, bem como a correlação da expressão de c-Fos entre várias regiões do cérebro sob condições experimentais idênticas, foram calculados usando o programa de análise estatística StatPlus: mac LE para Mac OS versão 2009 por AnalystSoft. Testamos as correlações lineares (Pearson's R estatística) entre a expressão de c-Fos em diferentes regiões do SNC. Nós também examinamos as correlações entre a expressão de c-Fos em diferentes regiões ativadas do SNC e comportamento. FR e PR dados de ratos, para os quais a quantificação de c-Fos foi realizada, foram usados para estas correlações.
PREÇO/ RESULTADOS
Quantificação de c-Fos.
Como já observamos anteriormente, o número de pressões de alavancas ativas foi significativamente maior para o desempenho de RP vs. FR (tabela 2), e o número de recompensas de sacarose foi maior durante o desempenho do FR. A duração da sessão para os ratos PR foi de cerca de 90 min (tempo de parada - 30). tabela 3 lista contagens de células imunorreativas c-Fos em todas as regiões do SNC onde a quantificação foi realizada. O padrão de expressão de c-Fos para os ratos FR e PR está resumido em FIG. 1. Houve ativação significativa do hipotálamo medial (MHmorto, um composto de ARC, PVN, RCh, DMH e VMH) de ratos engajados em pressões de alavanca PR para sacarose, mas nenhuma ativação geral em ratos engajados em pressão de alavanca FR para sacarose, comparados com os respectivos controles. Dentro do hipotálamo medial de ratos PR, esta ativação ocorreu no PVN, ARC e VMH (FIG. 2). A pressão da manete FR, mas não a pressão da manete PR, foi associada com ativação significativa dentro da LH (baseada predominantemente na ativação dentro da área perifornical). Ambas as pressões de alavanca ativa e expressão hipotalâmica de c-Fos foram comparáveis entre os grupos FRext e FR (MHmorto, 946 ± 26 e 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 e 186 ± 10; LHmorto, 468 ± 79 e 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 e 173 ± 15, respectivamente), sugerindo que a diferença no padrão de expressão entre os grupos FR e PR está relacionada não com a duração do treinamento / experiência, mas com a natureza da tarefa instrumental. Para o grupo FR, houve um aumento significativo na expressão de c-Fos no NLET, observado tanto no aBNST quanto no pBNST. Tanto PR quanto PR foram associadas com aumento de neurônios imunopositivos para c-Fos na concha de NAc; As contagens de c-Fos foram significativamente aumentadas no n�cleo NAc de ratos envolvidos na prensagem com alavanca FR, com uma tend�ncia n�o significativa para o aumento da express�o de c-Fos em ratos engajados na press�o com alavanca PR. c-Fos não foi aumentado na VTA com a tarefa PR, embora uma tendência não significativa para um aumento foi observada com a tarefa FR. Finalmente, o c-Fos foi significativamente aumentado no núcleo do nervo hipoglosso (XII) no tronco encefálico de ratos treinados para PR, mas não para FR.
A expressão de c-Fos foi observada em outras regiões do SNC, incluindo a amígdala e o córtex cerebral (FIG. 3). No entanto, a expressão foi observada em ambas as condições de controle, bem como em associação com as tarefas PR e FR, sugerindo que os aspectos não específicos do procedimento (manuseio, movimento para a sala de procedimentos) podem ter resultado nessa ativação. A quantificação nestas regiões não foi realizada. Da mesma forma, a ativação dentro das regiões do tronco encefálico diferente de nXII foi observada, mas ocorreu em associação tanto com o controle quanto com as condições relacionadas à tarefa, sugerindo também um papel na excitação não específica ou na ativação comportamental.
Testamos as correlações entre a expressão de c-Fos em diferentes regiões do SNC. Combinando os dados dos grupos de pressão de alavanca, encontramos uma correlação negativa entre a expressão de c-Fos no LH e no VMH; assim, a ativação do VMH foi associada à diminuição da ativação geral do LH (Pearson's R, −0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Além disso, observamos uma correlação positiva significativa entre a expressão de c-Fos na região perifornical do LH e do VTA (Pearson's R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), consistente com a conectividade monossináptica conhecida entre essas duas regiões (ver discussão em Refs. 2 e 13) Encontramos uma correlação negativa significativa entre a expressão de c-Fos no VTA versus o NAc-shell, testado separadamente para desempenho de FR (Pearson's R, −0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) ou para desempenho de RP (Pearson's R, −0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), consistente com entradas recíprocas conhecidas entre as regiões do estriado para a substância negra e VTA (2, 13) Também testamos as correlações entre a expressão de c-Fos em diferentes regiões do SNC e o comportamento. Combinando dados de grupos de pressão de alavanca, observamos uma correlação positiva significativa entre c-Fos no ARC e pressão de alavanca ativa (Pearson's R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Identificação de neurônios ativados com ingestão de sacarose e motivação para sacarose.
No tronco encefálico, os neurônios positivos para c-Fos não apresentaram imunocoloração positiva para HT, a enzima limitante da velocidade de epinefrina e norepinefrina (e dopamina); Assim, esses neurônios catecolaminérgicos não parecem ser ativados pelas tarefas FR ou PR. No entanto, alguns neurônios positivos para c-Fos mostraram imunocoloração positiva para triptofano hidroxilase, indicando que uma população de neurônios de serotonina foi ativada. Como mostrado em FIG. 4no ARC, os corpos celulares positivos para c-Fos foram rodeados por fibras coradas com AGRP, e foi observado um padrão semelhante para imunocoloração com fibra de NPY / c-Fos (não mostrado). No PVN, neurônios positivos para c-Fos pareciam cercar os neurônios positivos para CRF, mas nenhuma colocalização foi observada (dados não mostrados). FIG. 5 mostra imunocoloração para orexina e MCH no LH. Neurônios Orexin foram encontrados tanto no dLH quanto no peLH. Embora tenhamos observado neurônios positivos para MCH no peLH, não houve essencialmente colocalização com c-Fos naquela região do LH. No entanto, observamos a co-localização de c-fos em neurônios positivos à orexina dentro do peLH (FIG. 6, topo) e co-localização muito limitada de c-fos com MCH na vLH (FIG. 6, fundo). Deve-se ressaltar que tanto a localização quanto a colocalização com c-Fos podem estar subestimadas para os neurotransmissores peptídicos, como o CRH, porque os ratos não foram pré-tratados com colchicina. Finalmente, dentro do núcleo accumbens core e shell (FIG. 7), observou-se a co-imunocoloração de c-Fos com GAD, a enzima sintética para o neurotransmissor GABA, tanto para ratos FR como para PR. Houve coloração robusta para TH dentro do VTA; no entanto, os neurônios positivos para c-Fos foram raramente observados e não pareciam ser colocalizados exclusivamente com TH.
DISCUSSÃO
No presente estudo, utilizamos a expressão do gene precoce imediato, c-Fos, para avaliar o padrão de ativação aguda do SNC associada ao início da atividade de pressão de autoadministração de sacarose, seja como uma tarefa relativamente pouco exigente (FR) ou tarefa progressivamente mais desafiadora pensada para refletir a busca motivada de uma recompensa, como a sacarose, e envolver fortemente os circuitos límbicos (22, 24, 49) (PR). O padrão hipotalâmico de ativação diferiu entre as duas tarefas, com ativação LH / limbica predominante na tarefa FR e ativação hipotalâmica mediana / límbica predominante na tarefa de RP. FIG. 1). Há várias razões possíveis para isto. Primeiro, esses paradigmas podem “mapear” como experiências qualitativamente diferentes no SNC. Ratos treinados em desempenho de FR estariam esperando uma atividade fácil e de alta recompensa. A antecipação de um alimento recompensador deve influenciar fortemente o padrão de c-Fos observado nos ratos FR. A diferença qualitativa aparente no padrão de ativação sugere que uma segunda possibilidade - que os animais PR simplesmente têm mais experiência com a tarefa - é menos provável, e isso foi apoiado por nossa medida de c-Fos no hipotálamo de ratos que receberam sessões 20 FR , que mostrou atividade semelhante ao grupo FR, não ao grupo PR. Ambas as possibilidades podem ser testadas aumentando-se sistematicamente a dificuldade do treinamento FR e avaliando mudanças na ativação do SNC, caso em que se poderia prever uma mudança qualitativa no padrão de ativação. No entanto, enquanto o número de experiências de treinamento pode não explicar o padrão de ativação do SNC, o número médio de recompensas de sacarose em uma sessão pode: a tarefa de RP pode ser simplesmente aprendida como uma experiência “menos gratificante”, e isso pode estar funcionalmente ligado à falta de ativação de LH. Assim, o padrão de ativação do SNC no início da sessão pode refletir um estado interoceptivo, como o paradigma do lugar condicionado: a força de ativação dentro dos circuitos límbicos está ligada à aprendizagem e à motivação. Nós observamos a variabilidade da expressão de c-Fos no hipotálamo medial dos animais FRC. Particularmente dentro do PVN, esta variabilidade pode estar mascarando a ativação nos ratos FR, para os quais foi observada uma tendência de aumento de ratos c-Fos vs.tabela 3). No entanto, a ativação hipotalâmica medial global não diferiu entre os animais FR e FRC.
Deve-se notar que, embora nosso objetivo fosse identificar os locais do SNC que contribuem para o início do comportamento, a resolução temporal é um pouco de consideração. Como discutido abaixo, é agora apreciado que diferentes subcomponentes de comportamentos instrumentais ou operantes são mediados pela ativação de diferentes populações de neurônios (13, 23, 33, 49). Não podemos descartar completamente que a ativação devido a prensagem muito imediata ou a lamber as recompensas pode ter contribuído um pouco para os padrões de ativação que observamos. Nossas descobertas fornecem a base para investigações adicionais sobre os papéis de locais específicos do SNC em diferentes aspectos ou componentes da tarefa de autoadministração, e para tais estudos, a mensuração de outros genes precoces imediatos com diferentes temporais “on” e “off” (36) será muito útil.
As correlações encontradas na expressão de c-Fos entre diferentes regiões cerebrais suportam a conectividade funcional conhecida das regiões hipotalâmica e límbica primária para esta tarefa de recompensa particular, como entre o LH e o VMH, e entre a região perifornical do LH e o VTA (veja a discussão em Refs. 2 e 13). Nós também examinamos as correlações entre a expressão de c-Fos em diferentes regiões ativadas e o comportamento. A correlação entre c-Fos na ARC e alavancas ativas se encaixa no papel bem definido da atividade da ARC na ingestão de alimentos (1); com a nossa observação anterior de que a injeção de insulina especificamente no ARC diminuiu a auto-administração de sacarose (15); com relatórios prévios do papel crítico do ARC, e dos seus neurónios endorfinérgicos, na aquisição e desempenho da auto-administração de cocaína (40-42); e com as projeções identificadas do ARC para o NAc (17). Assim, o ARC provavelmente desempenha um papel fundamental no comportamento motivado para buscar e obter muitos tipos de estímulos recompensadores, incluindo, mas não se limitando a, comida. Finalmente, observou-se ativação significativa do PVN e VMH com o início da procura de sacarose PR. Isso é consistente com os papéis bem caracterizados desses núcleos hipotalâmicos mediais na regulação da ingestão de alimentos, na conectividade sináptica direta com o ARC e nas conexões identificadas com o circuito límbico (1, 27, 37).
Encontramos uma correlação negativa significativa entre a expressão de c-Fos na VTA versus a concha de NAc, seja ela testada para o desempenho de FR ou PR. Foi um tanto surpreendente que não tenha sido observada uma activação mais forte de VTA em associação com autoadministração de sacarose PR ou FR (vs. controlos respectivos). Talvez esse achado reflita o momento de nossa mensuração, focalizando potenciais locais do SNC ativos no início da tarefa, para os quais esses animais foram bem treinados. Isto seria consistente com as observações e teses de Schultz (44), que a ativação neuronal da dopamina serve como um marcador de estímulos inesperados ou recompensas, e essa ativação diminui em associação com o treinamento. No entanto, a liberação de dopamina no estriado durante a tomada de sacarose em animais treinados mostrou-se como um evento muito preciso e temporalmente discreto (39). Assim, é possível que as tendências que observamos sejam fortemente significativas com um grupo de estudo maior (ou seja, mais poder estatístico). Nós observamos a ativação do NAc em associação com o início da ingestão de sacarose FR e PR. Tanto a ativação quanto a inibição dos neurônios NAc foram relatadas em associação com o desempenho da recompensa instrumental, e o padrão de ativação / atividade depende do treinamento e do ambiente e está associado a diferentes componentes do comportamento (por exemplo, orientação, abordagem, ingestão).6, 33, 50). Como discutido acima, a medição de c-Fos não capturaria tal atividade específica. Carlezon propôs que a "recompensa" está predominantemente associada a uma diminuição na atividade dos neurônios NAc, isto é, neurônios espinhosos médios (3). Isso não é consistente com nossas observações - NAc c-Fos substancialmente melhorada em comparação com controles de manipulação e neurônios c-Fos positivos colocalizados com GAD, consistente com ativação de neurônios espinhosos médios (GABAergic) - mas não avaliamos especificamente a “inibição neuronal NAc” " A ativação e a inibição do NAc podem ocorrer durante as tarefas instrumentais, com especificidade anatômica e temporal. Do ponto de vista deste estudo, pode-se concluir que o NAc está envolvido no início da tomada de sacarose instrumental, com o núcleo NAc contribuindo para a ativação motora e a camada NAc contribuindo para os aspectos motores e motivacionais da tarefa.
Observamos também a ativação de ambas as principais regiões do NLET (anterior e posterior) em ratos FR. O BNST é uma parte do circuito límbico que modula as respostas neuroendócrinas a experiências repetidas de estímulo (8, 9), e em um sentido mais amplo, está associado ao aprendizado sobre estímulos recorrentes. Embora seu papel tenha sido elucidado de forma mais abrangente em relação às experiências estressoras repetidas, nossa descoberta sugere um papel mais amplo para o NLET: o NECT pode modular respostas do SNC a estímulos recorrentes positivos, bem como negativos ou estressantes. Desde que observamos esta ativação no início do FR, mas não o PR, o desempenho, o recrutamento do BNST pode estar ligado ao aumento das recompensas de sacarose do treinamento FR. Nossa observação de nenhuma ativação direta dos neurônios do CRF sugere que a resposta instrumental para a sacarose não é um estressor importante; no entanto, a expressão de c-Fos em outros neurônios PVN é consistente com a modulação do circuito de estresse (46). De fato, Ulrich-Lai e colegas relataram que, usando um paradigma diferente de dieta / alimentação, a ingestão de sacarose modula a função do PVN (47). Finalmente, observamos a ativação do núcleo do nervo hipoglosso em associação com RP, mas não com FR. O significado disso só pode ser especulado; Uma possibilidade é que a relevância do sabor da sacarose possa ser aumentada em ratos que ingerem menos recompensas de sacarose.
A busca por sacarose e a tomada de sacarose devem ser consideradas como uma experiência multimodalidade, dinâmica no tempo, já que a ingestão resultaria em sinais periféricos relacionados ao conteúdo calórico da sacarose, bem como na aliestesia habitual e dentro da sessão (25). Embora nossa pesquisa tenha focado na influência dos sinais endócrinos periféricos, ou seja, insulina e leptina, para modular a recompensa alimentar, seus efeitos podem, por sua vez, ser diretamente mediados centralmente por transmissores e neuropeptídeos que desempenham um papel em curto ou longo prazo. alimentação ou recompensa alimentar (ver discussão na 14). O presente estudo fornece algumas dicas sobre isso; observamos alguma ativação de neurônios que expressam MCH ou orexina, dois neuropeptídeos que são orexígenos. Estes resultados podem, de facto, subestimar o papel da MCH ou da orexina na recompensa alimentar, uma vez que a imunocitoquica em ratos tratados com n colchicina limitou, sem duvida, a visualizao de ambos estes neuroptidos. A identificação de neurônios de orexina ativados no LH é consistente em geral com os numerosos estudos que implicam os neurônios da orexina na alimentação, recompensa alimentar e recompensa de estímulo mais generalizada (por exemplo, 5, 7, 29). Observamos ativação de neurônios peFLH orexina. Aston-Jones e colegas (5) dissecaram os papéis de diferentes populações de neurônios LH orexina no comportamento das recompensas e implicaram os neurônios pefol-orexina na excitação, em oposição à recompensa per se. Nosso achado, portanto, sugere um papel para a orexina LH na excitação, e talvez a orientação para a alavanca ativa ou pistas para a tomada de sacarose.
Digna de consideração futura é a singularidade ou generalização da sacarose como um estímulo recompensador. Se o padrão de ativação precoce do SNC que relatamos aqui é específico para alimentos como um estímulo, ou generaliza para outros estímulos recompensadores, ainda precisa ser determinado. Como aludido acima, particularmente na tarefa FR, a ingestão de um número de recompensas de sacarose teria conseqüências metabólicas, com modulação da liberação de hormônio (por exemplo, colecistocinina, grelina, insulina) e mudanças na ativação neural periférica e do SNC. Não se espera que essas mudanças desempenhem um papel direto nos padrões iniciais de ativação do SNC que medimos, mas podem desempenhar um papel no aprendizado sobre a recompensa de sacarose durante o treinamento. Mais uma vez, os neuropéptidos como a orexina podem estar criticamente implicados.
Nosso estudo representa, até onde sabemos, a primeira demonstração de ativação de núcleos hipotalâmicos mediais específicos no início da autoadministração da sacarose, incluindo tanto o PVN, implicado na homeostase e responsividade ao estresse, quanto o ARC, que é crítico para a homeostase energética. detecção de nutrientes e regulação da ingestão de alimentos. É importante ressaltar que observamos ativação do hipotálamo medial e do NAc, em associação com o início da RP, sugerindo que tanto os sítios homeostáticos como alguns locais límbicos desempenham um papel no início da autoadministração da sacarose. Locais de circuitos límbicos adicionais podem ser recrutados em um momento posterior na tarefa.
Perspectivas e Significância
Enquanto, historicamente, os estudos de comportamentos motivacionais e de recompensa implicariam mais fortemente nos circuitos límbicos do SNC, um grande conjunto de evidências que enfatiza a interação funcional crítica entre os circuitos de homeostase límbica e energética. O presente estudo sugere agora a provável importância de núcleos hipotalâmicos mediais específicos no trabalho motivado para a sacarose. Extrapolando a partir deste estudo, estudos futuros podem avaliar se o papel do hipotálamo medial é necessário e se sua ativação está implicada na busca motivada de outras recompensas, como drogas de abuso. Além disso, os achados deste estudo fornecem a justificativa para o estudo de alterações de comportamentos motivados em circunstâncias concomitantes à fisiologia hipotalâmica medial alterada, como na obesidade.
SUBVENÇÕES
Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health Grant DK40963. Dra. Dianne Figlewicz Lattemann é pesquisadora sênior de carreira, programa de pesquisa em laboratório biomédico, Departamento de Assuntos de Veteranos do Sistema de Saúde Puget Sound, em Seattle, Washington. O Dr. Sipols é apoiado pelo Conselho de Ciência da Letônia 04.1116.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos ao Drs. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius e JE Blevins para aconselhamento e discussões úteis.
REFERÊNCIAS
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