Antagonista do receptor da grelina (GHS-R1A) atenua as propriedades recompensadoras da morfina e aumenta os níveis de peptídeo opióide nas áreas de recompensa em camundongos (2015)

A exposição aguda e crônica de drogas viciantes influencia profundamente o sistema de dopamina mesolímbica, um importante circuito chave dos sistemas de recompensa do cérebro (Nestler, 2005). Estes efeitos foram propostos para fundamentar, pelo menos em parte, o desenvolvimento da toxicodependência (Wise, 2004). A toxicodependência causa uma vasta gama de efeitos nocivos para o indivíduo, bem como para a sociedade e novas intervenções farmacológicas, tratando este importante problema de saúde pública, são necessárias (Koob e Le Moal, 2001). Esclarecendo os sistemas de sinalização que medeiam a capacidade de drogas aditivas para ativar o sistema dopaminérgico mesolímbico, estratégias únicas de tratamento para transtornos por uso de substâncias podem ser identificadas.

Pesquisas demonstraram que mecanismos neurobiológicos comuns regulam a ingestão e a recompensa induzidas por alimentos e drogas viciantes (Morganstern et al., 2011), propondo que o papel dos peptídeos intestinais-cérebro reguladores de alimentos, como a grelina, inclui a mediação de recompensa. Inicialmente, foi demonstrado que a grelina causa a liberação do hormônio do crescimento (Kojima et al., 1999) e induz a adiposidade em ratos (Tschop et al., 2000). Até à data, é sabido que a grelina aumenta a ingestão de alimentos, a fome, bem como estimula o apetite via circuitos hipotalâmicos (para revisão ver Egecioglu et al. (2011)). Além do hipotálamo, os receptores de grelina (GHS-R1A) são expressos em áreas relacionadas à recompensa, como a amígdala, estriado, córtex pré-frontal, área tegmental ventral (VTA) e hipocampo (para revisão ver Engel e Jerlhag (2014)), implicando que o papel fisiológico da grelina vai além da regulação da homeostase energética. De fato, o peptídeo orexigênico grelina mostrou ser um ativador do sistema dopaminérgico mesolímbico, bem como um regulador da recompensa, motivação e ingestão de álcool, nicotina, anfetamina e cocaína em camundongos (para revisão, ver Engel e Jerlhag (2014)).

Os opióides, como outras drogas que causam dependência, ativam o sistema de dopamina mesolímbico, causando liberação de dopamina via ativação de receptores opióides μ e / ou δ no nucleus accumbens (NAc) (Hirose e outros, 2005, Murakawa e outros, 2004, Yoshida e outros, 1999) e no VTA, presumivelmente diminuindo o GABA -inibição de neurônios dopaminérgicos (Johnson e North, 1992). Além disso, os receptores-opioides reguladores regulam a atividade do sistema dopaminérgico mesolímbico (Chefer et al., 2005, Spanagel e outros, 1992). A exposição repetida a opioides produz alterações adaptativas de vários neurotransmissores, incluindo peptídeos opióides, em áreas de recompensa, que contribuem para o desenvolvimento do vício (De Vries e Shippenberg, 2002). Em ratos, a supressão farmacológica do GHS-R1A atenua a libertação de dopamina accumbal induzida pela morfina bem como os comportamentos estereotípicos (Sustkova-Fiserova et al., 2014). O objetivo da primeira parte da presente série de experimentos foi investigar o efeito agudo de um antagonista de GHS-R1A, JMV2959, sobre a capacidade da morfina em causar uma estimulação locomotora, liberação de dopamina e condicionar a preferência local em camundongos. O objetivo da segunda parte deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento repetido com JMV2959 ou grelina sobre os níveis de peptídeos opióides (Met-encefalina-Arg⁶Phe⁷ (MEAP), dinorfina B (DynB) e Leu-encefalina-Arg⁶ (LeuArg)) em áreas relacionadas com recompensa, incluindo a amígdala, estriado, córtex pré-frontal, VTA e hipocampo.

Ratinhos NMRI machos adultos da mesma idade pós-puberdade (8-12 semanas e 25-40g peso corporal; Charles River, Sulzfeld, Alemanha) foram utilizados. Resumidamente, todos os ratos foram alojados em grupo e mantidos num ciclo de luz / escuridão 12 / 12 h (luzes acesas às sete horas). Água da torneira e comida (comida normal; Harlan Teklad, Norfolk, Inglaterra) foram fornecidos AD Libitum, exceto durante as configurações experimentais. Novos ratinhos foram utilizados para cada teste comportamental individual, bem como para a análise de péptidos opióides. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Sueco em Pesquisa Animal em Gotemburgo. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de animais usados. Todos os animais foram autorizados a aclimatar pelo menos uma semana antes do início das experiências.

O cloridrato de morfina (Apoteksbolaget Sahlgrenska Hospital; Gothenburg, Suécia) foi dissolvido em veículo (solução de cloreto de sódio 0.9%) e foi administrado ip numa dose de 20 mg / kg 10 min antes do início da experiência. Esta dose foi seleccionada uma vez que uma dose mais baixa (10 mg / kg, ip) não provocou uma estimulação locomotora nos nossos ratinhos (dados não mostrados). A dose seleccionada (6 mg / kg, ip) de JMV2959 (sintetizada nas Universidades Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR5247, CNRS, Montpellier 1 e 2, França), um antagonista de GHS-R1A, foi determinada previamente e nenhum efeito sobre a atividade locomotora, liberação de dopamina acumbal e preferência de local condicionado em camundongos (Jerlhag et al., 2009). O JMV2959 foi dissolvido em veulo (soluo de cloreto de sio a 0.9%) e foi sempre administrado vinte minutos antes da exposio ou decapitao com morfina para anise dos neis do ptido opide. A dose selecionada de JMV2959 não afetou o comportamento grosseiro dos ratos em nenhum experimento. Para os testes comportamentais, o JMV2959 foi administrado de forma aguda, uma vez que os nossos estudos prévios mostram que uma única injeção de JMV2959 atenua a recompensa induzida pelo fármaco (para revisão, ver Engel e Jerlhag (2014)). O JMV2959 foi administrado sub-cronicamente durante cinco dias subsequentes para que a análise do peptídeo opióide aumentasse a possibilidade de detectar um efeito robusto. Além disso, com injeções repetidas, evita-se o possível efeito de confusão do estresse por injeção aguda nos peptídeos. A grelina de rato acilada (Bionuclear; Bromma, Suécia) foi diluída em 0.9% cloreto de sódio e a dose seleccionada de grelina (0.33 mg / kg, ip) foi anteriormente demonstrada como causadora de recompensa em ratinhos (Jerlhag, 2008). Um design equilibrado foi usado para todos os desafios de drogas.

Estudos anteriores mostraram que a morfina provoca uma estimulação locomotora em roedores (Wise e Bozarth, 1987). A atividade locomotora foi registrada em oito caixas locomotoras com atenuação sonora, ventilação e luz fraca (420 420 200 mm, Kungsbacka mät-och reglerteknik AB; Fjärås, Suécia). Cinco por cinco fileiras de feixes de fotocélulas, no nível do chão da caixa, a criação de detecção de fotocélulas permitiu que um sistema baseado em computador registrasse a atividade dos camundongos. A actividade locomotora foi definida como o número acumulado de novas feixes de fotocélulas interrompidas durante um período 60-min. Em todas as experiências os ratos foram autorizados a habituar à caixa de actividade locomotora uma hora antes dos desafios do fármaco. Não houve diferenças entre a habituação em qualquer um dos grupos de tratamento (dados não mostrados).

Na primeira série de experimentos, os efeitos do JMV2959 (6 mg / kg, ip) na estimulação locomotora induzida pela morfina (20 mg / kg, ip) foram investigados. JMV2959 foi administrado 20 min antes da morfina e o registro da atividade foi iniciado dez minutos após a última injeção. Cada ratinho recebeu uma combinação de tratamento (veículo / veículo, JMV2959 / veículo, morfina / veículo ou JMV2959 / morfina; n= 8 por combinação de tratamento) e foi submetido apenas a um ensaio experimental.

Para avaliar os efeitos de JMV2959 sobre os efeitos recompensadores da morfina em ratos novos, testes de preferência de lugar condicionado foram realizados em camundongos como descrito anteriormente (Jerlhag, 2008). Em resumo, um aparelho CPP de duas câmaras, com iluminação 45 lx e sinais visuais e táteis distintos, foi usado. Um compartimento foi definido por paredes listradas em preto e branco e por um piso laminado escuro, enquanto o outro tinha um piso de madeira pintado de branco e paredes de textura de madeira. O procedimento consistiu em pré-condicionamento (dia 1), condicionamento (dias 2 – 5) e pós-condicionamento (dia 6). No pré-condicionamento, os ratinhos foram injectados ip com veículo e foram colocados na câmara com acesso livre a ambos os compartimentos durante 20 min para determinar a preferência inicial do local (ou lado). O condicionamento (20 min por sessão) foi realizado utilizando um procedimento tendencioso no qual a morfina (20 mg / kg) foi emparelhada com o compartimento menos preferido e veículo com o compartimento preferido. Todos os ratos receberam uma injeção de morfina, bem como de veículo todos os dias e as injeções foram alteradas entre a manhã e a tarde em um design de balanços. No pós-condicionamento dos camundongos (n= 16) foram injectados com JMV2959 (6 mg / kg, ip) ou um volume igual de solução veículo e 20 min mais tarde colocado na linha média entre os dois compartimentos com livre acesso a ambos os compartimentos para 20 min (criando os seguintes grupos de tratamento; Morph-Veh e Morph-JMV2959).

A preferência pelo lugar da condição foi calculada como a diferença em% do tempo total gasto na droga emparelhada (ie. menos preferido) compartimento durante o pós-condicionamento e a sessão de pré-condicionamento.

Dado que o JMV2959 atenua a estimulação locomotora induzida pela morfina e a preferência do local condicionado em camundongos, o efeito do JMV2959 (6 mg / kg, ip) na liberação de dopamina accumbal induzida pela morfina (20 mg / kg, ip) foi investigado usando in vivo microdiálise em camundongos que se movimentam livremente. Para medições dos níveis de dopamina extracelular, os ratos foram implantados unilateralmente com uma sonda de microdiálise posicionada no nucleus accumbens. Portanto, os camundongos foram anestesiados com isoflurano (Isofluran Baxter; Unidade de Anestesia Univentor 400, Univentor Ldt., Zejtun, Malta), colocados em uma estrutura estereotáxica (David Kopf Instruments; Tujunga, CA, EUA) e mantidos em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia. A adrenalina de xilocaína (5 μg / ml; Pfizer Inic; Nova York, EUA) foi usada como anestésico local e carprofeno (Rimadyl, 5 mg / kg ip) (Astra Zeneca; Gotemburgo, Suécia) foi usado para aliviar qualquer possível dor. O osso do crânio foi exposto e um orifício para a sonda e um para o parafuso de ancoragem foram perfurados. A sonda foi aleatoriamente alternada para o lado esquerdo ou direito do cérebro. As coordenadas de 1.5 mm anteriores ao bregma, ± 0.7 lateral à linha média e 4.7 mm abaixo da superfície da superfície do cérebro foram utilizadas para o nucleus accumbens (Franklin e Paxinos, 1997). A ponta exposta da membrana de diálise (20,000 kDa cortado com um od / id de 310 / 220 μm, HOSPAL, Gambro, Lund, Suécia) da sonda foi de 1 mm. Todas as sondas foram implantadas cirurgicamente dois dias antes do experimento. Após a cirurgia, os camundongos foram mantidos em gaiolas individuais até o dia do teste (Macrolon III).

No dia do teste, a sonda foi conectada a uma bomba de microperfusão (bomba de seringa U-864; AgnThós AB) e perfundida com solução de Ringer a uma taxa de 1.5 μl / min. Após uma hora de habituação à configuração de microdiálise, as amostras de perfusão foram coletadas a cada 20 min. O nível de dopamina na linha de base foi definido como a média de três amostras consecutivas antes do primeiro desafio droga / veículo, e o aumento na dopamina acumbal foi calculado como o aumento percentual da linha de base. Após as amostras da linha de base (−40 min até 0 min), os murganhos foram injectados com JMV2959 ou veículo (a 0 min), que foi seguido por uma injecção de morfina ou veículo (a 20 min). Após estas administrações de fármaco, foram recolhidas mais oito amostras 20 min. Coletivamente, os seguintes grupos de tratamento (n= 8 em cada grupo) foram criados: veículo-veículo (Veh-Veh), veículo-morfina (Veh-Morph), veículo JMV2959 (JMV2959-Veh) e JMV2959-morfina (JMV2959-Morph).

Os níveis de dopamina nos dialisados ​​foram determinados por HPLC com detecção eletroquímica. Uma bomba (Gyncotec P580A; Kovalent AB; V. Frölunda, Suécia), uma coluna de troca iónica (2.0 × 100 mm, Prodigy 3 μm SA; Skandinaviska GeneTec AB; Kungsbacka, Suécia) e um detector (Antec Decade; Antec Leyden; Zoeterwoude , Países Baixos) equipados com uma célula de fluxo VT-03 (Antec Leyden). A fase móvel (pH 5.6), constituída por ácido sulfónico 10 mM, ácido cítrico 200 mM, citrato de sódio 200 mM, 10% EDTA, 30% MeOH, foi filtrada sob vácuo utilizando um filtro de membrana 0.2 μm (GH Polypro; PALL Gelman Laboratory; Lund, Suécia). A fase móvel foi administrada a um caudal de 0.2 ml / min passando um desgaseificador (Kovalent AB) e o analito foi oxidado a + 0.4 V.

Após as experiências de microdiálise terem sido concluídas, os ratinhos foram decapitados e as sondas foram perfundidas com 6BX azul-celeste de pontamina para facilitar a localização da sonda. Os cérebros foram montados num dispositivo vibroslice (752 M Vibroslice; Campden Instruments Ltd., Loughborough, Reino Unido) e cortados em secções 50 μm. A localização da sonda foi determinada por observação macroscópica usando microscopia de luz. A posição exata da sonda foi verificada (Franklin e Paxinos, 1997) e apenas camundongos com colocação correta foram utilizados na análise estatística.

O tratamento dos efeitos do JMV2959 nos níveis de MEAP, DynB e LeuArg em áreas relacionadas a recompensas foi investigado. Os ratinhos foram injectados com JMV2959 (6 mg / kg, ip, n= 8) ou um volume igual de veículo (ip, n= 8) por cinco dias subseqüentes. 20 min a seguir à última injecção, os ratinhos foram sacrificados e os cérebros destes ratinhos foram recolhidos. Ratos separados foram injetados com grelina (0.33 mg / kg, ip, n= 8) ou um volume igual de veículo (ip, n= 8) por cinco dias subseqüentes. Cinco minutos após a última injecção, os ratinhos foram sacrificados e os cérebros destes ratinhos foram recolhidos. A amígdala, estriado, córtex pré-frontal, VTA e hipocampo foram rapidamente dissecados e imediatamente colocados em gelo seco e, em seguida, armazenados a −80 ° C até o processamento posterior.

Os procedimentos de homogeneização e extração de peptídeos seguiram um procedimento padrão, previamente descrito em detalhes (Nylander et al., 1997). Em resumo, ácido acético quente (95 ° C) (1 M) foi adicionado às amostras congeladas. As amostras foram aquecidas em banho-maria (95 ° C) por 5 min, resfriadas em gelo e depois homogeneizadas com um Branson Sonifier (Danbury, CT, USA). O homogenato foi reaquecido a 95 ° C durante 5 min e arrefecido em gelo antes da centrifugação para 15 min a 4 ° C e 12,074 ×g em uma centrífuga Beckman GS-15R (Fullerton, CA, EUA). Os extractos foram ainda purificados de acordo com um procedimento previamente descrito (Nylander et al., 1997). Duas frações foram coletadas: fração III (Leu-Arg e MEAP) e fração V (DynB). As amostras foram secas em centrífuga a vácuo (Savant SpeedVac Plus SC210A; Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) e armazenadas no freezer (−20 ° C) até a análise dos peptídeos.

Os níveis imunorreactivos (ir) de DynB, LeuArg e MEAP foram analisados ​​com radioimunoensaios bem estabelecidos e os protocolos foram descritos em detalhe noutra parte (Nylander et al., 1997). No ensaio DynB, foi utilizado IgG de cabra anti-coelho (GARGG; Bachem, Bubendorf, Suíça) para separar o péptido livre e ligado a anticorpo. O anti-soro Dyn (113 +) foi usado em uma diluição final de 1: 600000. A reatividade cruzada com grandes Dyn foi 100% e com DynB (1-29) 1%. Não foi observada reatividade cruzada com outros peptídeos opióides. Nos ensaios LeuArg e MEAP, utilizou-se uma suspensão de carvão para separar o péptido livre e ligado a anticorpo. Para o antisoro de LeuArg (91: 6D +, diluição final de 1: 60000), a reatividade cruzada foi menor que 0.01% para Leu-encefalina e MEAP, 0.02% para DynB, 0.04% para DynA e 0.08% para alfa-neoendorfina. O antissoro MEAP 90: 3D (II) foi usado em uma diluição final de 1: 160 000. Reatividade cruzada com Met-encefalina Met-encefalina-Arg⁶Met-encefalina-Arg⁶Gly⁷Leu⁸Leu-encefalina e Leu-encefalina-Arg⁶ era <0.1%

Um efeito principal global do tratamento foi encontrado na atividade locomotora em camundongos após a administração sistêmica de morfina (20 mg / kg) e JMV2959 (6 mg / kg) (F (3,27) = 7.409, P= 0.0009; n= 8 para Veh-Veh, JMV2959-Veh, JMV2959-Morph e n= 7 para Veh-Morph). Como mostrado em Figura 1Uma análise post-hoc revelou que o pré-tratamento com uma única injeção de JMV2959 (P<0.001) atenuou significativamente a estimulação locomotora induzida por morfina (P<0.01 Veh-Veh vs Veh-Morph). A dose seleccionada de JMV2959 não teve efeito na actividade locomotora em comparação com o tratamento com veículo (P> 0.05). Não houve diferença na resposta da atividade locomotora em camundongos tratados com veículo e camundongos tratados com JMV2959-morhpina (P> 0.05).

  

Figura 1

O antagonista do GHS-R1A JMV2959 atenua a estimulação locomotora induzida pela morfina, a liberação de dopamina acumbal e a preferência de local condicionado em camundongos. (A) A estimulação locomotora induzida pela morfina (20 mg / kg ip) foi atenuada por uma injecção única de JMV2959 (6 mg / kg ip) (n= 7 – 8 em cada grupo; **P<0.01, ***P<0.001 ANOVA unilateral seguida por um teste post-hoc de Bonferroni). (B) A condição de preferência de lugar (CPP) induzida por morfina (20 mg / kg ip) foi atenuada por uma única injeção aguda de JMV2959 (6 mg / kg ip) em camundongos (n= 8 em cada grupo *P<0.05, teste t não pareado). (C) Primeiro, demonstramos um efeito significativo da morfina (20 mg / kg ip) para aumentar a liberação de dopamina em comparação com o tratamento com veículo (intervalo de tempo 40-180 min (P<0.001), Veh-Veh vs Veh-Morph). Tal como apresentado no pré-tratamento (C) com JMV2959 (6 mg / kg ip) atenuou o aumento da libertação de dopamina induzido pela morfina em comparação com o pré-tratamento do veículo no intervalo de tempo 40 – 100 e 140 – 180 min (^##P<0.01 ^{# # #}P <0.001, JMV2959-Morph em comparação com o tratamento com Veh-Morph). A dose selecionada de JMV2959 não teve efeito significativo na liberação de dopamina acumbal em comparação com o tratamento com veículo em qualquer intervalo de tempo (P> 0.05, Veh-Veh vs JMV2959-Veh). JMV2959 reduziu, mas não bloqueou completamente, a morfina induziu liberação de dopamina no intervalo de tempo 60-140 (*P<0.05 **P<0.01, ***P <0.001, JMV2959-Morph em comparação com o tratamento com Veh-Morph). As setas representam pontos no tempo de injeção de JMV2959, veículo e morfina. Os dados foram analisados ​​com uma ANOVA de duas vias seguida por um teste post-hoc de Bonferroni (n= 8 em cada grupo). Veh-veh (Quadrado), Veh-Morph (losango), JMV2959-Veh (Triângulo), JMV2959-Morph (círculo). Todos os valores representam média ± SEM.

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A preferência de lugar condicionado induzido pela morfina (20 mg / kg) (Morph-Veh) foi significativamente atenuada por uma injeção única aguda de JMV2959 (6 mg / kg) (Morph-JMV2959) no dia pós-condicionamento (P= 0.025, n= 8 em cada grupo; Figura 1B).

As medidas de microdiálise acidentais em dopamina em camundongos revelaram um efeito principal geral do tratamento (F(3,33) = 24.15, P<0.0001), tempo F(11,308) = 7.05, P<0.0001) e interação de tratamento × tempo (F(11,308) = 8.63, P<0.0001) (Figura 1C; n= 8 em cada grupo). A morfina aumentou a liberação de dopamina acumbal em relação ao tratamento do veículo no intervalo de tempo 40-180 min (P<0.001). Como mostrado em Figura 1C este efeito foi reduzido pelo pré-tratamento com JMV2959 no intervalo de tempo 40-80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) e 160-180 min (P<0.001). JMV2959 reduziu, mas não bloqueou completamente, a liberação de dopamina acumbal induzida por morfina, uma vez que havia uma diferença entre o tratamento com veículo e o tratamento com morfina JMV2959 no intervalo de tempo 60-80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) e 160 min (P<0.05). A dose selecionada de JMV2959 não teve efeito significativo na liberação de dopamina acumbal em comparação com o tratamento com veículo em qualquer intervalo de tempo (P> 0.05).

O presente estudo apoia ainda a hipótese de que o papel fisiológico do peptídeo orexígeno inclui a regulação da recompensa. De facto, mostrámos que a administração periférica de um antagonista de GHS-R1A atenua a capacidade da morfina para provocar uma estimulação locomotora, aumentar os níveis de dopamina em NAc e induzir uma preferência de local condicionado em ratinhos. Descobrimos também que o tratamento subcrônico de JMV2959, mas não de grelina, aumentou os níveis teciduais de MEAP na VTA, DynB no hipocampo e LeuArg no estriado, fornecendo a primeira evidência de que a capacidade de sinalização da grelina para regular o reforço pode envolver peptídeos opióides .

Os dados aqui apresentados mostram que o antagonismo de GHS-R1A afeta a capacidade da morfina de ativar o sistema dopaminérgico mesolímbico em camundongos. Em concordância estão os resultados que mostram que JMV2959 bloqueia a capacidade da morfina de aumentar os níveis extracelulares de dopamina acumbal e de causar um comportamento estereotipado em ratos (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Como suporte, a administração central de grelina aumenta o ponto de interrupção, mas não o número de pressionamentos de alavanca ativos, no esquema de reforço de proporção progressiva em ratos que se auto-administram com heroína (Maric et al., 2012). A alegação de que a sinalização da grelina está subjacente à dependência de drogas é ainda apoiada pelos resultados que mostram que JMV2959 reduz a ingestão, bem como a motivação para consumir álcool em ratos e que a recompensa induzida por anfetamina, cocaína e nicotina é bloqueada pelo antagonismo GHS-R1A em roedores ( para revisão, ver Engel e Jerlhag (2014)) e que polimorfismos em genes relacionados à grelina estão associados à ingestão de álcool, fumo e anfetaminas (para revisão, ver Engel e Jerlhag (2014)).

Os presentes achados com níveis aumentados de peptídeos opióides no estriado, ATV e hipocampo após o tratamento sub-crônico com JMV2959 sugerem pela primeira vez interações entre os peptídeos opióides e a sinalização da grelina. Os opioides endógenos estão implicados em efeitos recompensadores, não apenas induzidos por opióides, mas também por outras drogas de abuso e recompensas naturais, e em processos adaptativos observados após exposição repetida a drogas (Trigo et al., 2010, Van Ree et al., 2000). De fato, a atividade do sistema dopaminérgico mesolímbico é regulada por opioides endógenos tanto ao nível da VTA como da NAc (Hirose e outros, 2005, Spanagel e outros, 1992) e as ações têm se mostrado direta ou indiretamente. através da modulação de outros transmissores (Charbogne et al., 2014).

Descobrimos aqui que o tratamento sub-crônico com JMV2959 aumentou os níveis de MEAP na VTA. A MEAP é derivada exclusivamente da proenquifeína e foi usada como marcador de peptídeos de proenquimatina que ativam principalmente os receptores δ-opióides. Nossa hipótese é que os níveis aumentados de MEAP endógena na VTA após o tratamento com JMV2959 podem prevenir a capacidade da morfina de diminuir a inibição de GABA dos neurônios dopaminérgicos mesoacumbílicos (Johnson e North, 1992), o que pode contribuir para os efeitos reduzidos da morfina observados após JMV2959. Suportativamente, GHS-R1A estão localizados em interneurônios GABAergic no VTA (Abizaid et al., 2006). Além disso, estudos anteriores mostraram que a infusão intra-VTA de JMV2959, via mecanismos desconhecidos, atenua a recompensa induzida pela grelina (Jerlhag et al., 2011) bem como a ingestão de sacarose mediada pela grelina em roedores (Skibicka et al., 2011), sugerem que o GHS-R1A ventral tegmentar é importante para a regulação da recompensa. Em apoio a tal contenção, os resultados mostram que outros peptídeos reguladores da fome, como galanina e orexina, mediam as propriedades recompensadoras da morfina. via mecanismos locais dentro do VTA (Narita e outros, 2006, Richardson e Aston-Jones, 2012).

No corpo estriado, descobrimos que o JMV2959 subcrônico aumentou os níveis de LeuArg, sugerindo que a capacidade do JMV2959 de atenuar a preferência de lugar condicionado induzida pela morfina, a liberação de dopamina e a estimulação locomotora depende, pelo menos em parte, da melhora da atividade do receptor opióide. Níveis aumentados de LeuArg podem resultar do aumento da conversão enzimática de peptídeos de dinorfina em encefalinas ou da liberação aumentada de Dyn no NAc como resposta ao aumento da dopamina, seguido pela degradação em LeuArg. Embora estudos anteriores tenham mostrado que a atividade do sistema dopaminérgico mesolímbico é regulada via receptores κ-opioides nos receptores NAc (Spanagel et al., 1992) e γ-opióides endógenos fornecem uma inibição tônica da neurotransmissão da dopamina mesoacumbal e atenua a liberação de dopamina induzida pela cocaína em NAc (Chefer et al., 2005), não mostre que JMV2959 altera os níveis de DynB no striatum. Portanto, mais estudos são necessários sobre os peptídeos de prodinorfina para elucidar as interações entre o antagonismo do GHS-R1A e as dinorfinas.

No presente estudo, também mostramos que o tratamento com JMV2959 aumenta significativamente os níveis de DynB no hipocampo. A grelina aumenta a consolidação da memória, assim como a formação da espinha dendrítica, gera potencialização a longo prazo e induz a facilitação da memória via GHS-R1A do hipocampo em roedores (Carlini et al., 2010, Diano e outros, 2006). Além disso, os camundongos knockout GHS-R1A exibem uma memória espacial melhorada no teste do labirinto aquático de Morris e uma memória contextual interrompida no paradigma de condicionamento do medo em comparação com camundongos do tipo selvagem (Albarran-Zeckler et al., 2012). Os péptidos de dinorfina, incluindo DynB, são abundantes no hipocampo e atenuam a potenciação a longo termo (Chavkin et ai., 1985, Wagner et ai., 1993) assim como prejudicam a aprendizagem espacial em ratos (Sandin et ai., 1998). Portanto, hipotetizamos que o antagonista de GHR-R1A pode atenuar a memória de recompensa inibindo a potenciação de longo prazo do hipocampo via ativação de DynB. Coletivamente, esses dados fornecem um novo mecanismo potencial pelo qual o JMV2959 via peptídeos opióides podem alterar o reforço. No entanto, os receptores opióides estão amplamente distribuídos no cérebro, sugerindo que outras áreas, não incluídas no presente estudo, podem estar envolvidas na recompensa induzida pela morfina regulada pelo GHS-R1A. Por exemplo, a ingestão de alimentos induzida pela grelina, bem como a pressão da alavanca para a sacarose, é reduzida pela administração central ou intra-hipotalâmica de um antagonista do receptor opióide-κ (Romero-Pico et al., 2013). No entanto, o papel dos peptídeos opióides em outras áreas precisa ser elucidado nos próximos estudos.

Os ligantes do receptor μ endógeno, endomorfinas e beta-endorfina, não foram analisados ​​aqui, portanto, não podemos descartar um possível efeito de JMV2959 nesses peptídeos. De fato, as propriedades recompensadoras da morfina envolvem receptores μ-opióides na VTA, bem como NAc (Hirose et al., 2005, Johnson e North, 1992, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999). No entanto, um antagonista do receptor μ não atenua a ingestão de alimentos induzidos pela grelina (Naleid et al., 2005) nem a estimulação locomotora induzida pela grelina e liberação de dopamina acidentais (Jerlhag et al., 2011), implicando que a capacidade do GHSR- O antagonista de 1A para regular o reforço não inclui os receptores μ. Por outro lado, o JMV2959 afetou os peptídeos opióides derivados da proenkepalina e da prodinorfina, mostrando que eles podem estar envolvidos nos efeitos induzidos pelos antagonistas do GHSR-1A.

Embora estudos anteriores tenham mostrado que a administração sistêmica de grelina causa recompensa (Jerlhag, 2008), bem como aumenta as propriedades recompensadoras de drogas viciantes (para revisão, consulte Engel e Jerlhag (2014)), mostramos aqui que o tratamento com grelina sub-crônica não se alterou os níveis teciduais de peptídeos opioides em qualquer uma das áreas relacionadas à recompensa estudadas. A administração sistêmica de grelina ativa a expressão de c-fos em áreas hipotalâmicas, mas não em áreas mesolímbicas e hipocampais (Pirnik et al., 2011) e a ligação da grelina fluorescentemente marcada é limitada a neurônios reguladores de alimentos do hipotálamo (Schaeffer et al., 2013 ). Tomados em conjunto com as descobertas mostrando que a grelina, exceto quantidades traço no hipotálamo, não pode ser detectada em áreas cerebrais mais profundas após a administração periférica de grelina (Furness et al., 2011, Grouselle et al., 2008, Sakata et al., 2009 ), levanta a possibilidade de que a grelina sistêmica ativa o sistema de recompensa via mecanismos indiretos independentes de opioides endógenos. Apoiadamente, a liberação de dopamina accumbal induzida pela grelina requer sinalização hipotalâmica orexigênica a montante (Cone et al., 2014), administração de grelina periférica não altera a ingestão de álcool em camundongos (Lyons et al., 2008) e que a neutralização da grelina periférica não atenua o álcool recompensa induzida em ratos ou ingestão de álcool em ratos (Jerlhag et al., no prelo). A possibilidade de que a administração subcrônica da grelina aumente os níveis teciduais de peptídeos opióides deve ser considerada, no entanto, isso precisa ser investigado em detalhes nos próximos estudos.

A capacidade de drogas aditivas para causar estimulação, liberação de dopamina e induzir uma preferência de lugar condicionada está intimamente associada com as propriedades reforçadoras de drogas que causam dependência e esses parâmetros são considerados parte do processo de dependência (Wise, 2004). Dado que descobrimos que o JMV2959 atenua esses parâmetros de recompensa em camundongos, supomos que o GHS-R1A pode desempenhar um papel importante nos processos de dependência e que os opioides endógenos estão envolvidos nesses processos. Coletivamente, esses dados indicam que os antagonistas de GHS-R1A devem ser elucidados como tratamento da dependência de drogas.

JE e EJ são apoiados por doações do Conselho de Pesquisa Sueco (Grant nº 2011-4646, 2009-2782 e 2011-4819), a fundação sueca do cérebro, LUA / ALF (Grant nº 148251) do Hospital Universitário Sahlgrenska, Álcool conselho de pesquisa do monopólio de varejo de álcool sueco e as fundações de Adlerbertska, Fredrik e Ingrid Thuring, Tore Nilsson, Längmanska, Torsten e Ragnar Söderberg, Wilhelm e Martina Lundgren, NovoNordisk, Knut e Alice Wallenberg, Magnus Bergvall, Anérs, Jeansons, Åke Wiberg , Sociedade Sueca de Medicina, Sociedade Sueca de Pesquisa Médica e Fundação de Pesquisa de Psiquiatria de Gotemburgo. Conselho de Pesquisas de Álcool do Monopólio Sueco do Varejo de Álcool e do Conselho de Pesquisa Sueco (K2012-61X-22090-01-3) apoiado IN. As fontes de financiamento não tiveram papel no desenho do estudo, na coleta, análise e interpretação dos dados, na redação do relatório e na decisão de publicar os dados.