PLoS One. 2014 Jul 29; 9 (7): e102524. doi: 10.1371 / journal.pone.0102524. eCollection 2014.
Sumário
A exposição crônica à cocaína em adictos humanos e em modelos de vício em roedores reduz a atividade cortical pré-frontal, que subsequentemente desregula o processamento de recompensa e a função executiva de maior ordem. O efeito líquido desse comprometimento do comportamento é a vulnerabilidade aumentada à recaída. Anteriormente, mostramos que o aumento induzido pela cocaína na expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) no córtex pré-frontal medial (CPF) é um mecanismo neuroadaptativo que enfraquece a eficácia reforçadora da cocaína. Como o BDNF é conhecido por afetar a sobrevivência neuronal e a plasticidade sináptica, testamos a hipótese de que a abstinência da autoadministração de cocaína levaria a alterações na morfologia neuronal e na densidade sináptica no CPF. Utilizando uma nova técnica, tomografia por matriz e coloração de Golgi, as alterações morfológicas no PFC de rato foram analisadas após 14 dias de auto-administração de cocaína e 7 dias de abstinência forçada. Nossos resultados indicam que a ramificação dendrítica total e a densidade sináptica total são significativamente reduzidas no CPF de ratos. Em contraste, a densidade de espinhas dendríticas finas é significativamente aumentada nos neurônios piramidais da camada V do PFC. Esses achados indicam que mudanças estruturais dinâmicas ocorrem durante a abstinência de cocaína, o que pode contribuir para a hipoatividade observada no CPF em indivíduos dependentes de cocaína.
Introdução
As alterações na plasticidade estrutural dentro do circuito de recompensa são propostas como mecanismos-chave que contribuem para a poderosa capacidade da cocaína de manter o comportamento de busca de drogas (revisado em [1]). Estudos anteriores mostraram um aumento na arborização dendrítica e densidade da coluna no nucleus accumbens (NAc) [2]-[4], área tegmental ventral [5]e o córtex pré-frontal (CPF) [6] após a exposição à cocaína. Embora a maioria dos estudos tenha se concentrado em mudanças estruturais associadas à atividade disfuncional do NAc, um número consideravelmente menor de estudos examinou as alterações no CPF. Várias linhas de evidência demonstram disfunção do CPF após exposição crônica à cocaína em ambos os dependentes humanos [7], [8] e em modelos de roedores de vício [9], [10]. Portanto, caracterizar as mudanças estruturais que ocorrem no PFC é pertinente para entender os eventos moleculares subjacentes ao vício.
O PFC regula o controle do impulso e a tomada de decisões e, portanto, desempenha um papel importante na capacidade de um indivíduo de controlar o comportamento, particularmente na dependência de drogas [8], [11]. Por exemplo, em indivíduos dependentes de cocaína, a diminuição da ativação do córtex pré-frontal está associada à retirada de drogas e interrompeu respostas executivas de ordem superior [7], [8], o que pode aumentar a vulnerabilidade à recaída. Em roedores, o aumento da atividade neuronal no PFC está associado à ingestão de cocaína [9], [10]comportamento compulsivo de procura de drogas [12]e reintegração de cocaína após a retirada [13]-[15]. Além disso, a biestabilidade da membrana é abolida no CPF após administração crônica de cocaína [16]. Finalmente, a atividade metabólica induzida por drogas no PFC é diminuída em ratos administrados com uma injeção de desafio durante a retirada da auto-administração de cocaína [9], [17]. Juntos, esses estudos indicam que a cocaína crônica induz mudanças funcionais profundas no PFC que podem estar associadas a um aumento no número de sinapses inibitórias e / ou uma redução nas sinapses excitatórias no CPF. No entanto, as alterações morfológicas que ocorrem no CPF após o uso crônico de drogas não foram elucidadas.
No presente estudo, procuramos examinar se a abstinência da cocaína leva a mudanças estruturais no CPF. As alterações morfológicas foram examinadas usando um método tradicional, coloração de Golgi, bem como uma nova técnica, a tomografia de matriz. A tomografia computadorizada é um método único que combina seccionamento de tecido ultrafino com imunofluorescência e reconstrução de imagem tridimensional para permitir a quantificação precisa da densidade de sinapse específica total e de subtipo [18], [19]. Usando esses métodos, nossos resultados indicaram substancial plasticidade em PFC de ratos em resposta à abstinência da cocaína.
Materiais e Métodos
Animais e habitação
Ratos Sprague-Dawley machos (Rattus norvegicus) pesando 250–300 g foram obtidos de Taconic Laboratories (Germantown, NY). Os animais foram alojados individualmente com comida e água disponíveis ad libitum na sua gaiola. Os protocolos experimentais foram todos consistentes com as diretrizes emitidas pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA e foram aprovados pela Escola de Medicina Perelman da Universidade da Pensilvânia e pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais da Universidade da Pensilvânia.
Cirurgia
Antes da cirurgia, os ratos foram anestesiados com 80 mg / kg de cetamina e 12 mg / kg de xilazina (ip; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Um cateter de silastic permanente (diâmetro interno 0.33 mm, diâmetro externo 0.64 mm) foi inserido na veia jugular direita e suturado no local. O cateter foi então passado por via subcutânea sobre a escápula e encaminhado para uma plataforma de malha traseira (CamCath, Cambridge, UK) que foi suturada abaixo da pele diretamente acima das escápulas. Os cateteres foram lavados diariamente com 0.3 ml do antibiótico Timentina (ticarcilina dissódica / clavulanato de potássio, 0.93 mg / ml; Henry Schein, Melville, NY) dissolvido em solução salina heparinizada (10 U / ml). Os cateteres foram selados com obturadores plásticos quando não estão em uso.
Auto-administração de cocaína
Os ratos foram autorizados a recuperar da cirurgia antes da auto-administração da cocaína ter começado. Os ratos foram aleatoriamente designados para um de dois grupos: animais auto-administrados com cocaína e controlos salinos ligados. Cada rato treinado para responder por infusões contingentes de cocaína foi emparelhado com um indivíduo jugo que recebeu o mesmo número e padrão temporal de infusões como auto-administrado pelo rato experimental cocaína emparelhado. A alavanca que pressionava os ratos juncados com solução salina não tinha conseqüências agendadas.
Inicialmente, ratos cocaína-experimentais foram colocados nas câmaras operantes modulares (Med Associates, St. Albans, VT) e deixados para pressionar a alavanca para infusões intravenosas de cocaína (0.25 mg cocaína / 59 µl salina, infusão sobre 5 s) em uma solução fixa. relação 1 (FR1) cronograma de reforço. Uma vez que um rato experimental cocaína alcançou pelo menos 20 infusões de cocaína em uma única sessão operante sob o cronograma FR1, o requisito de resposta foi mudado para um esquema FR5 de reforço. Para responder em ambos os horários fixos, o número máximo de infusões de cocaína foi limitado a 30 por sessão diária de autoadministração e um período de tempo limite de 20 seguiu cada infusão de cocaína, durante o qual respostas de alavancas ativas foram tabuladas, mas sem consequências . Foram realizadas sessões diárias 2 h operante (7 dias / semana) para um total de 14 dias. As respostas feitas na alavanca inativa, que não tiveram conseqüências programadas, também foram registradas durante as sessões de treinamento FR1 e FR5.
Depois do 14th Uma sessão de operante diária, ratos-controle cocaína-experimentais e jugados foram retornados às suas gaiolas onde foram submetidos a 7 dias de abstinência forçada de drogas. No 7th dia da abstinência de cocaína, os cérebros foram removidos e o PFC foi dissecado em gelo. Sete dias de abstinência de cocaína foram escolhidos a fim de estabelecer comparações diretas com o nosso estudo publicado anteriormente, examinando as alterações induzidas pela cocaína na expressão de BFCF do PFC. [20].
Perfusão
Os ratos foram anestesiados (100 mg / kg, ip pentobarbital de sódio) e perfundidos com 4% paraformaldeído gelado em 0.1 M PB, pH 7.4 (PFA). Um hemisfério de cada cérebro foi usado para coloração de golgi e o outro hemisfério para tomografia de arranjo. Os hemisférios matriciais foram pós-fixados em 4% PFA com 2.5% de sacarose por 2 horas e os hemisférios de Golgi foram fixados para 48 h em 4% PFA.
Tomografia de matriz
Experimentos de tomografia computadorizada foram realizados conforme descrito anteriormente [19], [21]. Resumidamente, o tecido fixado com PFA foi embebido em resina e as secções coronais (70 nm) ao nível do mPFC foram cortadas e recolhidas como uma fita. As fitas foram hidratadas em 50 mM glicina em Tris e bloqueadas em solução de bloqueio (0.05% Tween / 0.1% de albumina sérica bovina em tampão Tris (50 mM Tris / 150 mM NaCl, pH 7.6). As fitas foram coradas com anticorpos primários, GAD65 ( Chemicon), PSD95 (Cell Signaling), ou sinaptofisina (Abcam), em solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C. Fitas foram lavadas com tampão Tris e coradas com anticorpos secundários em 1![[ratio]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
50 em solução de bloqueio (farinha 488 de cabra anti-rato Alexa e cy3 de cabra anti-coelho ou cy5 de burro anti-coelho). As fitas foram coradas com DAPI para facilitar a localização dos mesmos sites em todas as seções. As imagens de varredura de telhas foram coletadas usando um microscópio de epifluorescência Zeiss AxioImager Z2. Imagens do mesmo site em cada uma das seções seriais 20-30 por fita foram adquiridas na 63x com programas automatizados especializados para tomografia de matriz.
Análise tomográfica de matriz
As imagens de série de cada fita foram abertas sequencialmente, convertidas em uma pilha e alinhadas com os plugins MultiStackReg e StackReg (cortesia de B. Busse na Universidade de Stanford e [21], [22]. Caixas de colheita (19.5 µmx19.5 µm) foram usadas para selecionar regiões de interesse (ROI) no neurópilo para quantificação. As seleções tinham que excluir corpos celulares neuronais ou outras características obscuras. Para análise automatizada de imagens, colheitas de interesse (ou ROIs) para sinaptofisina, descarboxilase do ácido glutâmico-65 (GAD65) e PSD95 foram automaticamente limitadas, respectivamente, com algoritmos automatizados em ImageJ. As culturas foram codificadas e a análise foi executada às cegas para a condição. Um programa de detecção automatizado baseado em limiar para quantificar o número de punctas identificadas como sinapses positivas foi usado como descrito anteriormente [23]. Densidades de terminais pré-sinápticos, terminais pós-sinápticos excitatórios e a porcentagem de sinapses positivas (inibitórias) de GAD foram calculadas a partir de uma média de locais de amostragem 75 por animal coletado de dois blocos de tecido diferentes do CPF (n
=Animais tratados com 5 tratados com cocaína, salina 5) para um total de puncta pós-sináptico 29,154 e puncta pré-sináptica 53,565 de locais de amostragem 818 nos animais tratados com solução salina 5 e 29,662 puncta pré-sináptico de locais de amostragem 17,034 em todos os animais tratados com cocaína 588. Os valores medianos para a densidade das sinapses e a percentagem de sinapses inibitórias por animal foram calculados e os testes t correram usando as medianas dos animais para testar se havia uma diferença entre as médias dos grupos.
Método Rapid-Golgi
A colorao de Golgi de seco ica foi realizada como descrito anteriormente [24], [25]. Resumidamente, o mPFC de um hemisfério de cada animal foi cortado em secções coronais 100 µm e pós-fixado em 1% de tetróxido de ósmio seguido de três lavagens em 0.1 M PB, pH 7.4. As secções foram incubadas em 3.5% de dicromato de potássio durante a noite, lavadas brevemente e infiltradas com 1.5% de nitrato de prata pelo método sanduíche [25]. As secções foram montadas em lâminas revestidas com gelatina com 20% de sacarose e desidratadas através de uma série de concentrações de álcool, seguida de desaguamento em xileno e lamínula.
Análise de Golgi
As lâminas de Golgi foram codificadas e analisadas de forma cega e todas analisadas pelo mesmo experimentador. Imagens e traçados neuronais e imagens representativas de espinhos dendríticos foram coletados usando um microscópio ereto BX51 Olympus com um estágio motorizado integrado (Prior Scientific, Rockland, MA) com uma objetiva 20 × 0.7 NA. Para análise de ramificação dendrítica, os neurônios 7 foram selecionados para análise por animal. Medimos o comprimento e a complexidade das neurites usando as macros NeuronJ e Advanced Sholl Analysis, respectivamente. O número de interseções (pontos de ramificação) dentro de círculos concêntricos em raios entre 5-250 µm (incluindo dendritos basais e apicais) foi medido e comparado entre os grupos. Para análise de densidade de coluna, 4-5 segmentos de pelo menos 20 µm de comprimento de dendritos basais de terceira ordem foram analisados por neurônio de neurônios 5-7 por animal usando um microscópio de epifluorescência Zeiss AxioImager Z2 com uma objetiva de imersão em óleo 63x. A morfologia da coluna foi classificada como descrita anteriormente [26]. Densidade linear da coluna para cada segmento dendrítico e morfologia da coluna (fina, grossa, cogumelo, em forma de taça) de cada coluna vertebral foram comparados entre os grupos. O software de código aberto do National Institutes of Health (ImageJ) foi usado para a análise de dados de Golgi e tomografia por matriz.
Resultados
A abstinência de cocaína reduz a densidade total de sinapses
A tomografia computadorizada foi utilizada para medir as alterações nas sinapses excitatórias e inibitórias, a fim de determinar as alterações morfológicas específicas que ocorrem no CPF em resposta à abstinência da autoadministração de cocaína. A tomografia computadorizada é um método de alto rendimento que permite a quantificação precisa de sinapses totais, inibitórias e excitatórias em estruturas que são muito pequenas para serem adequadamente identificadas ou localizadas com métodos tradicionais de microscopia confocal. [19]. Como as sinapses inibitórias e excitatórias são componentes essenciais do circuito de recompensa de drogas [13], [27], [28] Utilizamos essa nova metodologia para avaliar as alterações morfológicas no CPF durante a abstinência de cocaína. Cortes de PFC de setenta nm de um hemisfério cerebral de ratos 5 e 5 experiente foram corados com anticorpos para PSD95, um marcador excitatório pós-sináptico, sinaptofisina, um marcador pré-sináptico e GAD65, que rotulou neurônios inibitórios e sinapses. A densidade das sinapses e a porcentagem de sinapses inibitórias foram determinadas na camada cortical V (Figura 1A e 1B). Nossos resultados indicam que durante a abstinência de cocaína houve uma diminuição significativa na densidade de sinaptofisina (Figura 1C), que mede todos os terminais pré-sinápticos [t (7)=2, p <0.05]. Não houve diminuição significativa na densidade da sinapse excitatória [t (8)=0.48, p=0.32] medida pela contagem de PSD95 puncta (Figura 1D). Curiosamente, houve uma tendência não significativa para um aumento na porcentagem de sinapses inibitórias positivas para GAD65 [t (8)=−1.39, p=0.9] (Figura 2E).
A abstinência de cocaína reduz a ramificação dendrítica enquanto aumenta transitoriamente a densidade da coluna no PFC
O método de Golgi foi usado para examinar as alterações na ramificação neuronal e na densidade da coluna dendrítica, a fim de confirmar as alterações ultraestruturais observadas na densidade das sinapses (Figura 1). Realizamos a impregnação rápida de Golgi em uma única seção em um subgrupo de neurônios no PFC dos outros hemisférios dos mesmos animais que foram usados para os estudos de tomografia de arranjo. A ramificação dendrítica, a contagem dendrítica da coluna e a morfologia da coluna foram avaliadas. Dois neurônios piramidais representativos do PFC de um controle salino e um rato exposto à cocaína são mostrados em Figura 2A. Sholl plot mediu o número de intersecções (pontos de ramificação) dentro de círculos concêntricos em raios entre 5 – 250 µm. Nossos resultados demonstram que após 7 dias de abstinência forçada da auto-administração de cocaína houve uma redução significativa na complexidade dendrítica (Figura 2B). Análise ANOVA de medidas repetidas em dois sentidos de dados de sholl plot revelou efeitos principais significativos do tratamento [F(1,738)=30.59, p <0.0001] e raio [F(245, 738)=289.6, p <0.0001] (Figura 2B), confirmando uma perda de dendritos que concordam com a perda de sinapses medidas em estudos matriciais (Figura 1C). A análise dos dendritos basilares de segunda e terceira ordem revelou um aumento significativo nas espinhas dendríticas após 7 dias de abstinência de cocaína [t (6)=-3.12, p <0.05] (Figura 2D). Mais especificamente, a abstinência da exposição à cocaína aumentou o número do subtipo de coluna delgada, embora não tenha efeito significativo sobre outros subtipos de coluna (Figura 2E), conforme revelado por medidas repetidas de duas vias ANOVA com efeitos principais do tratamento [F(1,30)=11.9, p=0.0017], subtipo de coluna [F(4,30)=57.7, p <0.0001], e uma interação significativa de tratamento x subtipo de coluna [F(1, 4, 30)=8.8, p <0.0001].
Discussão
No presente estudo, demonstramos que há mudanças estruturais e sinápticas pronunciadas na camada V do CPF após 7 dias de abstinência forçada da auto-administração de cocaína. Especificamente, há uma diminuição significativa na ramificação dendrítica de neurônios piramidais e uma perda geral na densidade das sinapses, medida pela diminuição da densidade de botões pré-sinápticos globais marcados com sinaptofisina. Apesar da perda de densidade pré-sináptica, os dendritos basais dos neurônios piramidais da camada V sofreram um aumento na densidade da coluna dendrítica, particularmente de espinhas finas de plástico. Como não detectamos mudanças significativas na densidade do PSD95, pode-se especular que diminuições nos terminais pré-sinápticos, mas aumento na densidade da coluna podem ser devidas a um aumento no número de botões multi-sinápticos. Além disso, também é importante notar que observamos uma tendência de aumento das sinapses inibitórias no CPF. Desde espinhos finos estão envolvidos na plasticidade [29], o aumento dessas espinhas pode representar plasticidade compensatória para manter as entradas sinápticas nesses neurônios desnervados que perderam ramificações dendríticas.
Estudos anteriores demonstraram que a cocaína aumenta a arborização dendrítica e a densidade da espinha no NAc [2]-[4]. Recentemente, Dumitriu et al., 2012 [30] demonstraram que a cocaína altera dinamicamente as espinhas proximais no núcleo e na casca do NAc. Especificamente, na concha, a retirada da cocaína aumentou espinhos finos, enquanto diminuía a densidade da cabeça da espinha de cogumelo na camada NAc. [30]. Em contraste com os estudos do NAc, existem apenas alguns estudos que examinaram os efeitos da cocaína na morfologia neuronal no PFC [6], [31]. Nossos dados são consistentes com um estudo recente demonstrando que a cocaína induz um aumento na densidade da coluna no PFC [31]. Notavelmente, os camundongos que tiveram um aumento maior em espinhas persistentes e estáveis, ou seja, espinhos presentes nos dias pós-retirada, em dendritos apicais apresentaram maiores escores de preferência de lugar condicionado à cocaína e hiperatividade induzida pela cocaína [31]. Um estudo anterior em neurônios da camada II-III da PFC de ratos relatou valores de aproximadamente 3 espinhos por µm de dendrito em ambos os dendritos apicais e basais, um nível surpreendentemente denso de espinhas que era modificável pelo estresse [32]. Nossos valores em ratos controle de espinhas ∼2 / 10 µm de segmentos dendríticos são menores, o que pode ser devido à diferente população neuronal analisada (dendritos basais da camada V) ou à diferença na técnica de imagem. No presente estudo, utilizamos o método de coloração rápida de Golgi de seção única, enquanto injeções iontoforéticas de corante amarelo Lúcifer combinadas com imagens confocais foram utilizadas por Radley e colaboradores. [32] para visualizar a morfologia neuronal e dendrítica. Além disso, nossos resultados também destacam a importância da duração da abstinência da autoadministração de cocaína que leva a mudanças estruturais no cérebro. Um relatório publicado anteriormente demonstrou um aumento na arborização dendrítica após a retirada de cocaína a longo prazo (24-25 dias) em ratas [6], em contraste com a nossa diminuição observada após 7 dias de abstinência forçada em ratos machos. Apesar dessas diferenças metodológicas e diferenças nos dados de ramificação, observou-se aumento do número de espinhos em ambos os estudos, confirmando a reorganização do circuito em larga escala durante a abstinência de cocaína. Estudos futuros irão elucidar o curso do tempo desses eventos, a fim de determinar se essas mudanças estruturais são transitórias ou duradouras.
Nossos resultados indicam que a abstinência forçada da autoadministração de cocaína induz alterações estruturais dinâmicas e causa reorganização sináptica no CPF. Estes resultados podem explicar a hipo-atividade no PFC que ocorre como resultado da exposição repetida à cocaína [8], [33]. Além disso, nossos resultados apóiam estudos anteriores que demonstram a desativação do PFC [7], [8]e aumento do GABA extracelular no PFC medial durante a retirada da cocaína [34]. Assim, os mecanismos responsáveis pela hipo-atividade do PFC após exposição crônica à cocaína [8], [10] pode incluir (1) um aumento na redução GABAérgica, (2) na redução glutamatérgica e / ou (3) na entrada sináptica dopaminérgica para o PFC. O presente estudo demonstra que a abstinência da cocaína reduz significativamente a densidade global das sinapses, conforme indicado por uma redução no número de punctas sinápticas positivas para sinaptofisina. Esses dados sugerem que há uma redução na responsividade pós-sináptica no CPF, possivelmente mediada pela diminuição da entrada de glutamato ou dopamina. De fato, existem estudos indicando que a cocaína induz reduções no tom glutamatérgico [35], [36]. No entanto, usando o método de Golgi, observamos um aumento no número de espinhas dendríticas finas em dendritos basais de neurônios piramidais, o que sugere um aumento na entrada excitatória no PFC para neurites remanescentes. Esses dados aparentemente conflitantes podem refletir uma perda global de sinapses associada à grande perda de dendritos que observamos com uma resposta compensatória, possivelmente mediada pelo aumento do BDNF, como mostrado em nossos achados anteriores. [20], para aumentar a densidade de espinhas dendríticas nas neurites remanescentes.
Coletivamente, nossos achados indicam uma reorganização dinâmica no CPF durante a abstinência de cocaína. Especificamente, há uma redução significativa na conectividade sináptica, perda de ramificação dendrítica e um aumento no número de espinhas finas no PFC de rato após 7 dias de abstinência de droga forçada da autoadministração de cocaína. Esses resultados podem fornecer a base estrutural para a hipo-atividade observada no CPF de usuários crônicos de cocaína e talvez explique a perda do controle cognitivo que ocorre durante a dependência de cocaína.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Gavin Sangrey por sua ajuda na preparação das cápsulas embutidas.
Declaração de financiamento
Este trabalho foi financiado pelas bolsas do NIDA DA22339 e DA033641 (RCP & GSV) e DA18678 (RCP). HDS foi apoiado por um prêmio K01 individual (DA030445). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Referências
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