Níveis de Expressão de MicroRNA Circulantes Associados ao Transtorno de Jogos na Internet (2018)

Sumário

BACKGROUND

O uso viciante da Internet e dos jogos on-line é um distúrbio psiquiátrico em potencial denominado distúrbio de jogos na Internet (IGD, Internet gaming disorder). Perfis de expressão alterados de microRNA (miRNA) foram relatados em sangue e tecido cerebral de pacientes com certos distúrbios psiquiátricos e sugeridos como biomarcadores. No entanto, não houve relatos de perfis de miRNA no sangue em IGD.

De Depósito

Para descobrir miRNAs associados a IGD, analisamos os perfis de expressão de miRNAs de amostras 51 (controles 25 IGD e 26) usando o TaqMan Low Density miRNA Array. Para validação, realizamos PCR quantitativo de transcrição reversa com amostras independentes de 36 (controles 20 IGD e 16).

Resultados

Através de descoberta e validação independente, identificamos três miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p) que foram significativamente negativamente regulados no grupo IGD. Indivíduos com todas as três alterações miRNA tiveram um risco muito maior de IGD do que aqueles sem alteração [razão de chances (OR) 22, 95% CI 2.29-211.11], e os ORs aumentaram a dose de forma dependente do número de miRNAs alterados. Os genes-alvo previstos dos três miRNAs foram associados a vias neurais. Nós exploramos a expressão protéica dos três genes alvo a jusante por western blot e confirmamos que a expressão de GABRB2 e DPYSL2 foi significativamente maior no grupo IGD.

Conclusão

Observamos que as expressões de hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p e hsa-miR-652-3p foram negativas nos pacientes com DGI. Nossos resultados serão úteis para entender a fisiopatologia da IGD.

Palavras-chave: Transtorno de jogos pela Internet, microRNA, biomarcador, vício, western blot

Introdução

O uso viciante da Internet e de jogos baseados na Internet não é apenas um fenômeno social em países com ampla infra-estrutura de acesso à Internet, mas um distúrbio psiquiátrico em potencial denominado distúrbio de jogos pela Internet (IGD) (-). De acordo com os relatórios epidemiológicos, as taxas de prevalência de IGD em adolescentes variam entre os países, variando de 0.8 a 26.7% (). Particularmente, estudos mostram taxas de prevalência acima de 10% em adolescentes em muitos países asiáticos, como Coréia do Sul, China, Taiwan, Hong Kong e Cingapura (). A IGD está associada ao comprometimento da cognição, das relações psicossociais e do cotidiano; por exemplo, declínio acadêmico ou desempenho ocupacional (-). A IGD está agora incluída na Seção III (Condições para Estudo Adicional) da quinta revisão do Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM-V) (). Entretanto, apesar de sua importância clínico-social, pouco se sabe sobre o mecanismo genético molecular por trás do IGD.

Estudos recentes de gêmeos em larga escala sugeriram um background genético para a IGD (, ). Vink et al. investigaram as diferenças individuais no uso compulsivo da Internet com gêmeos adolescentes monozigóticos e dizigóticos 5,247 no Netherlands Twin Register e relataram que 48% das diferenças foram explicadas por fatores genéticos (). Li et al. observaram pares 825 de gêmeos adolescentes chineses e relataram que fatores genéticos explicaram 58-66% das diferenças (). Assim, os polimorfismos dos genes envolvidos na neurotransmissão, cognição e atenção, como o gene D2 do receptor de dopamina (DRD2), o gene da catecolamina-O-metiltransferase (COMT), gene transportador da serotonina (5HTTLPR) e gene alfa-4 do receptor nicotínico colinérgico (CHRNA4) foram relatados como significativamente associados à dependência da Internet (-). Recentemente, Kim et al. variantes rastreadas de mais de 100 genes candidatos relacionados à produção, ação e metabolismo de neurotransmissores por análise de sequenciamento de próxima geração e relataram que rs2229910 de NTRK3 gene está associado ao IGD ().

Além dos fatores genéticos, também é bem conhecido que os fenótipos neurocomportamentais são controlados epigeneticamente por RNAs não-codificadores, incluindo microRNAs (miRNAs) (, ). miRNAs são pequenas moléculas de RNA de cadeia simples não codificantes (aproximadamente nucleotídeos 20-23 de comprimento), que regulam negativamente a expressão de genes codificadores de proteínas por degradar mRNAs e desempenham um papel crítico no processo fisiopatológico de diversas doenças (). As linhas de evidência demonstraram que os miRNAs são abundantes no sistema nervoso central humano (SNC) e atuam no ajuste fino dos níveis de expressão de seus genes alvo, os quais estão envolvidos no desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central (). De fato, estudos recentes revelaram que os perfis de expressão de miRNAs estão alterados no tecido cerebral de pacientes com distúrbios psiquiátricos, sugerindo que seus perfis de expressão poderiam ser biomarcadores para distúrbios psiquiátricos (, , ). Por exemplo, através da análise pós-morte, Lopez et al. relataram que a expressão de miR-1202, que regula a expressão do gene metabotrópico do receptor de glutamato-4 e prediz a resposta ao antidepressivo, foi regulada negativamente nos tecidos do córtex pré-frontal de pacientes com depressão maior (). Em termos de triagem de biomarcadores, esta abordagem tem uma clara limitação, porque a realização de uma biópsia de tecido do SNC para triagem é impossível. Como os miRNAs podem ser detectados no sangue (plasma ou soro), os miRNAs circulantes têm uma vantagem definitiva como biomarcadores não invasivos em distúrbios neuropsiquiátricos. No entanto, até o momento, não houve estudos sobre os perfis de miRNA circulantes no IGD. Uma melhor compreensão dos perfis de expressão de miRNA circulante poderia ajudar a esclarecer o mecanismo de desenvolvimento de IGD e facilitar a tradução clínica.

Neste estudo, nosso objetivo foi identificar marcadores de miRNA associados à IGD observando miRNAs plasmáticos diferencialmente expressos entre os grupos IGD e controle e explorando suas implicações biológicas.

Materiais e Métodos

Sujeitos do estudo

Pesquisamos adolescentes 3,166 (com idades entre 12 e 18) usando a pontuação IGM do DSM-V. Entre eles, 251 (machos 168 e fêmeas 83) foram diagnosticados como IGD de acordo com os critérios do DSM-V (). Um total de indivíduos 91 (controles 49 IGDs e 42) forneceu o consentimento informado para este estudo. Entre eles, quatro indivíduos foram excluídos de acordo com os critérios de exclusão. Finalmente, os indivíduos 87 (indivíduos 45 IGD e indivíduos controle 42 saudáveis) foram incluídos neste estudo. Entre eles, os participantes 51 (pacientes 25 IGD e controles 26) foram recrutados como o conjunto de descobertas de 2014 para 2016. Os outros participantes 36 (pacientes 20 IGD e controles 16) foram recrutados como o conjunto de validação independente do 2016. Todos os participantes eram indivíduos coreanos, matriculados no Hospital St. Mary de Seul (Seul, Coréia do Sul) e no Hospital Boramae da Universidade Nacional de Seul (Seul, Coréia do Sul). Todos os participantes foram submetidos a uma entrevista estruturada por um psiquiatra baseado no Calendário Kiddie Coreano para Transtornos Afetivos e Esquizofrenia (K-SADS-PL) (). Todos os participantes completaram os subtestes de Design de Bloco e Vocabulário da Escala de Inteligência Coreana-Wechsler para Crianças, 4th edition (K-WISC-IV) (). A impulsividade foi avaliada pela Escala de Impulsividade de Barratt (BIS) (). As escalas do Sistema de Inibição Comportamental (BInS) e do Sistema de Ativação Comportamental (BAS) foram mensuradas para avaliar a dimensão da personalidade (). Os critérios de exclusão incluíram grandes ou atuais distúrbios médicos (por exemplo, diabetes mellitus), distúrbios neurológicos (por exemplo, distúrbios convulsivos, traumatismo craniano), distúrbios psiquiátricos (por exemplo, transtorno depressivo maior, transtornos de ansiedade), retardo mental ou abuso de substâncias (por exemplo , tabaco, cannabis, álcool). As características gerais dos sujeitos do estudo estão resumidas na Tabela Table1.1. Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board da Faculdade de Medicina da Universidade Católica da Coréia (MC16SISI0120). Todos os participantes e seus pais assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

tabela 1

Características gerais dos sujeitos do estudo.

 DiscoveryValidaçãoCombinado
 
 ControlIGDP-valorControlIGDP-valorControlIGDP-valor
N2625 1620 4245 
Anos de idade)
Mediana (min – max)13 (12 – 17)13 (12 – 15)0.75915 (13 – 18)14.5 (12 – 18)0.62814 (12 – 18)14 (12 – 18)0.509
Horário semanal de jogos na Internet (h)
Mediana (min – max)5.25 (2 – 17)18 (6 – 46)1.27E-6a5.5 (2 – 23)8 (1 – 112)0.3745.5 (2 – 23)14 (1 – 112)1.63E-5a
Renda mensal domiciliar (milhões de KRW)
Mediana (min – max)5 (1 – 9)3 (1 – 9)0.5884 (4 – 4)2 (2 – 2)1.0005 (1 – 9)3 (1 – 9)0.460
Educação (anos)
Mediana (min – max)8 (7 – 9)8 (7 – 9)0.58412 (12 – 12)6 (6 – 13)0.3058 (7 – 12)8 (6 – 13)0.269
K-WISC: projeto de bloco
Mediana (min – max)10.5 (4 – 17)10 (4 – 16)0.54410 (3 – 16)12.5 (4 – 15)0.12510 (3 – 17)11 (4 – 16)0.598
K-WISC: vocabulário
Mediana (min – max)9 (5 – 17)7 (5 – 13)0.1749.5 (8 – 15)11.5 (5 – 15)0.5959 (5 – 17)9 (5 – 15)0.527
KS
Mediana (min – max)24 (17 – 36)37 (22 – 51)3.81E-6a29 (17 – 34)59 (22 – 108)1.2E-5a25 (17 – 36)40 (22 – 108)2.05E-10a
BIS
Mediana (min – max)63 (35 – 75)67.5 (45 – 81)0.08061 (45 – 79)63 (32 – 82)0.83562 (35 – 79)65 (32 – 82)0.240
BAS
Mediana (min – max)31 (15 – 40)31 (13 – 51)0.55836.5 (22 – 48)34 (27 – 52)1.00032 (15 – 48)34 (13 – 52)0.637
BINAS
Mediana (min – max)18 (10 – 26)17.5 (13 – 27)0.64218.5 (12 – 25)20 (13 – 21)0.13818 (10 – 26)19 (13 – 27)0.302
 

IGD, pacientes com distúrbios de jogos na Internet; KS, Escala Coreana de Profissão de Vício em Internet; BIS, Escala de Impulsividade de Barratt; BAS, Sistema de Ativação Comportamental; BINES, Sistema de Inibição Comportamental; KRW, Won coreano.

aP <0.05 (teste de Mann-Whitney-Wilcoxon).

Experimentos de matriz de miRNA de baixa densidade TaqMan (TLDA)

O sangue periférico foi coletado de cada participante e transferido para o laboratório dentro do 4 h para minimizar a lise das células sangüíneas. A amostra foi centrifugada a 3,000 rpm para 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, o sobrenadante (camada de plasma) foi coletado sem contaminar as células do sangue. Os miRNAs circulantes foram extraídos usando o Kit de Purificação de miRNA ABC TaqMan (Painel Humano A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 50 de amostra de plasma e 100 de tamp ABC foram misturados. Após a hibridação com esferas magnéticas anti-miRNA específicas do alvo, os miRNAs circulantes ligados foram eluídos das esferas com 100 µl de tampão de eluição. Na fase de descoberta, os miRNAs 381 foram examinados a partir de amostras de plasma 51 (controles 25 IGDs e 26) usando o Kit de Purificação TaqMan miRNA ABC (Painel Humano A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As reações de transcrição reversa e pré-amplificação megaplex foram realizadas para aumentar a quantidade de cDNA para análise de expressão de miRNA usando Primers MegaplexPreAmp Human Pool A e Master Mix TaqManPreAmp (Thermo Fisher Scientific). O painel TLDA A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) foi executado no sistema de PCR em tempo real ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) para avaliar a expressão dos miRNAs. Os dados brutos foram processados ​​usando o software ExpressionSuite v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) para determinar os valores de Ct para cada miRNA.

Análise de dados para o TLDA

Primeiro medimos os ciclos de limiar (valor Ct) de cada miRNA. miRNAs com valor Ct> 35 foram considerados indetectáveis ​​e excluídos da análise subsequente. Todos os valores de Ct foram normalizados para o valor de Ct de miR-374b (valor de ΔCt), um dos miRNAs mais estavelmente expressos que circulam no plasma humano (). Uma razão de variação de dobra de log2 (valor ΔΔCt) da expressão foi calculada usando valores médios de amostras de controle como um calibrador no pacote HTqPCR em Biocondutor (). A quantificação relativa (RQ) de cada alvo de miRNA foi definida como 2ΔΔCt. Para o teste hipotético da diferença na expressão entre dois grupos, aplicamos a análise de variável substituta (SVA) para capturar heterogeneidades, como efeitos de lote nos experimentos usando o sva pacote em Biocondutor (). miRNAs com um P-valor <0.05 foram considerados significativamente diferentes entre os dois grupos.

Análise de enriquecimento de conjuntos de genes

Para a análise de enriquecimento de genes, usamos o ToppFun no ToppGene Suite () para inferir Ontologia de Genes significativamente enriquecida (GO) () termos, caminho e termos de doença. Como entrada para essa abordagem, usamos os genes-alvo preditos para 1,230 dos miRNAs candidatos. A análise da via foi utilizada para encontrar vias significativas dos genes alvo previstos de acordo com as vias KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP e MSigDB nas vias ToppGene. A significância dos termos de enriquecimento funcional foi determinada com base nos valores ajustados de Bonferroni. P-valor.

Validação e replicação quantitativa de PCR de transcrição reversa (qRT-PCR)

Para validar os miRNAs 10 que foram diferencialmente expressos no estágio de descoberta, o qRT-PCR foi realizado usando o ensaio TaqMan MicroRNA (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p, # 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423-5p, #002340; miR-483 -5p, #002338; e miR-652-3p, #002352) e o sistema ViiA7 (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante. Dez nanogramas de ARN total foram convertidos em ADNc de primeira cadeia com iniciadores específicos de miRNA utilizando o Kit de Transcrição Reversa TaqMan MicroRNA (#4366596, Life Technologies), seguido por PCR em tempo real com Sondas TaqMan. O RQ de cada miRNA foi definido como 2−ΔCt, onde ΔCt é a diferença nos ciclos de limiar para a amostra em questão, normalizada contra o miRNA endógeno (miR-374b-5p, #001319). Todas as reacções de PCR foram realizadas em triplicado, e os seus valores de Ct foram calculados em média. Calculamos uma razão de variação de fold de log2 (ΔΔCt) de cada miRNA da mesma forma que na análise baseada em array. Um teste não paramétrico de Mann ‐ Whitney ‐ Wilcoxon foi realizado para testar as diferenças nos níveis de expressão de miRNAs em dois grupos com um limiar P-valor de 0.05.

Análise de Western Blot

Cada amostra de soro foi primeiramente depletada das proteínas 14 de alta abundância (albumina, imunoglobulina G, imunoglobulina A, serotransferrina, haptoglobina, alfa-1 antitripsina, fibrinogênio, macroglobulina alfa-2, glicoproteína ácida alfa-1, imunoglobulina M, apolipoproteína AI , apolipoproteína A-II, complemento C3 e transtirretina) utilizando a coluna MARS-14 (4.6 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, EUA) antes da análise por Western blot. A fracção não ligada obtida a partir da coluna MARS-14 foi concentrada utilizando um filtro centrífugo Amicon Ultracel-3 (ponto de corte 3 kDa) e, em seguida, a concentração proteica foi determinada pelo método do ácido bicinconínico. As mesmas quantidades (de 10 a 30 µg) de amostras de soro controle e IGD foram separadas em gel pré-moldado 4-20% Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, CA, EUA) e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. Em seguida, a membrana foi bloqueada em TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 e 0.05% Tween 20) com 5% de leite em pó magro a temperatura ambiente por 30 min. As membranas foram então incubadas com anticorpos primários contra DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, EUA), e CNR1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EUA), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, EUA) e PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, EUA) em TBS-T com 5 % de leite seco sem gordura a 4 ° C durante a noite, e depois com anticorpos secundários apropriados ou anti-ratinho bovino (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) ou anti-coelho de cabra (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, EUA ) conjugado com peroxidase de rábano à temperatura ambiente por 1 h. A detecção do sinal foi realizada utilizando quimiluminescência com reagente ECL (GE healthcare, Piscataway, NJ, EUA). Quantificamos os resultados do western blot usando o software de análise TotalLab 1D (Non-linear Dynamics, Newcastle upon Tyne, Reino Unido). Em seguida, o valor do índice de densitometria foi calculado dividindo-se o valor densitométrico de cada amostra, conforme descrito anteriormente (). Como controlo para normalização, utilizou-se uma amostra de soro reunida a partir de 46 IGD e amostras de controlo para cada experiência. A significância estatística foi determinada usando um teste não paramétrico de Mann ‐ Whitney ‐ Wilcoxon com um limiar P-valor de 0.05.

Resultados

Características dos sujeitos do estudo

As características demográficas e clínicas dos sujeitos do estudo são mostradas na Tabela Table1.1. Quando comparamos os grupos IGD e controle de acordo com a Escala de Pronação de Dependência de Internet da Coréia (K-Escala) como descrito em outro lugar (, ), o grupo IGD mostrou um valor mediano de K-Escala significativamente maior do que o grupo controle (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Mesa (Table1) .1). O tempo médio semanal gasto em jogos na Internet no grupo IGD foi significativamente maior do que o dos controles (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Considerando que não houve diferença significativa entre dois grupos de idade, renda familiar mensal, duração da educação, design de blocos e resultados do subteste de vocabulário do K-WISC, BIS, BInS e BAS.

MiRNAs diferencialmente expressos entre IGD e controles

Para descobrir miRNAs associados a IGD, adotamos uma abordagem em duas etapas (descoberta e validação independente). O desenho do estudo e a estratégia global estão ilustrados na Figura S1 em Material Suplementar. Na etapa de descoberta, foram analisados ​​os perfis de expressão de miRNAs de amostras 51 (controles 25 IGDs e 26) utilizando o arranjo de miRNA contendo 384 miRNAs. Os níveis de expressão dos miRNAs 10 foram significativamente diferentes entre os grupos IGD e controle (Tabela (Table2) .2). Níveis relativos de expressão desses miRNAs 10 são mostrados na Figura Figura 1.1. Entre eles, dois (hsa-miR-423-5p e hsa-miR-483-5p) foram sobreregulados e oito (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411-5p e hsa-miR-652-3p) foram reprimidos no grupo IGD.

tabela 2

MicroRNAs diferencialmente expressos (miRNAs) e alterações de dobra.

miRNADiscoveryValidaçãoCombinado
 
 P-valorMudança de dobraP-valorMudança de dobraP-valorMudança de dobra
hsa-miR-15b-5p0.0330.8290.6941.1190.3810.947
hsa-miR-26b-5pa0.0080.8710.0490.8410.0130.857
hsa-miR-29b-3p0.0050.4000.5601.1870.0890.647
hsa-miR-125b-5p0.0210.5820.2900.9500.0690.723
hsa-miR-200c-3pa0.0110.3360.0030.5422.93 × 10-50.415
hsa-miR-337c-5p0.0090.3850.5820.8720.0200.553
hsa-miR-411-5p0.0040.3220.3361.2820.1580.595
hsa-miR-423-5p0.0261.3870.1890.9550.5181.175
hsa-miR-483-5p0.0181.8610.7651.4130.2111.647
hsa-miR-652-3pa0.0190.7150.0490.8770.0110.782
 

amiRNAs significativamente alterados nos conjuntos de descoberta e validação de maneira consistente.

 

Um arquivo externo que contém uma figura, ilustração, etc. O nome do objeto é fpsyt-09-00081-g001.jpg

Níveis relativos de expressão de miNNAs diferentemente expressos em 10. A quantificação relativa (RQ) foi normalizada para miR-374b-5p.

Validação qRT-PCR dos miRNAs candidatos

Para validar os miRNAs candidatos a 10, realizamos qRT-PCR com um conjunto de validação independente (controles 20 IGDs e 16) (Tabela S1 em Material Complementar). Três destes miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p e hsa-miR-652-3p) foram significativamente negativamente regulados no grupo IGD do conjunto de validação (Tabela (Table2) .2). Três outros miRNAs (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b e hsa-miR-423-5p) também foram negativamente regulados no grupo IGD, mas não significativamente. Os quatro miRNAs restantes (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p e hsa-miR-423-5p) foram expressos de forma oposta no conjunto de validação. Quando combinamos os conjuntos de descoberta e validação (um total de indivíduos 45 IGD e controles 42), os três miRNAs validados foram consistentemente significativos (Tabela (Table2) .2). Informações detalhadas, localizações cromossômicas, sequências maduras e níveis de expressão no SNC desses três miRNAs estão disponíveis na Tabela S2 em Material Complementar.

Efeito Sinérgico da Alteração Simultânea dos Três miRNAs no Risco de IGD

Para avaliar o efeito combinado dos três miRNAs, observamos as odds ratios (ORs) dos quatro subgrupos (com alterações de 0, 1, 2 ou 3 miRNA). A alteração do miRNA foi definida pelo valor RQ conforme descrito na Seção “Materiais e Métodos. ”Como todos os três marcadores de miRNAs foram regulados negativamente no grupo IGD, um miRNA cujo valor RQ estava abaixo de um foi desafiado como alterado. Informações detalhadas do valor RQ de cada sujeito do estudo para os três miRNAs estão disponíveis na Tabela S3 em Material Complementar. Para cada subgrupo, as probabilidades foram calculadas como a razão entre o número de controles e o de IGDs, então cada OR foi calculado dividindo as chances de cada subgrupo por odds do subgrupo sem quaisquer alterações de miRNA. Indivíduos com três alterações de miRNA mostraram um risco 22 vezes maior do que aqueles sem qualquer alteração de miRNA (OR 22, 95% CI 2.29-211.11). OR mostrou uma tendência crescente com o número de miRNAs alterados de 0 para 3 (r2 = 0.996) (Figura (Figure22).

Um arquivo externo que contém uma figura, ilustração, etc. O nome do objeto é fpsyt-09-00081-g002.jpg
Odds ratios (OR) pelo número de marcadores microRNA (miRNA) regulados para baixo. Os valores acima das estimativas pontuais são os ORs (intervalo de confiança 95%).

GO e Análise do Percurso dos Genes Alvo dos miRNAs Candidatos

Para obter informações sobre as funções dos três marcadores de miARN significativamente regulados negativamente no grupo IGD, os seus genes alvo foram previstos utilizando a base de dados miRWalk 2.0 (). Um total de genes 1,230 foram consistentemente previstos como alvos downstream por quatro algoritmos (miRWalk, miRanda, RNA22 e Targetscan) usando o banco de dados miRWalk (-) (Tabela S4 em Material Suplementar). A análise de enriquecimento de conjunto de genes usando o ToppFun no ToppGene Suite mostrou que os genes alvo desses miRNAs estavam significativamente associados a vias de desenvolvimento neural tais como “orientação Axon” e termos GO como “neurogênese” (Tabela S5 em Material Suplementar).

Expressão dos genes alvo previstos

Entre os genes alvo a jusante dos três miRNAs, o 140 foi previsto simultaneamente para dois ou mais miRNAs (Tabela S4 em Material Complementar). Para investigar se os níveis de expressão proteica dos genes alvo a jusante são diferentes entre os grupos IGD e controle, selecionamos os genes 2 (DUSP4 e PI15), que são previstos como alvos a jusante de todos os miRNAs 3 e genes 3 adicionais (GABRB2, DPYSL2 e CNR1) dos previstos para os miRNAs 2 e realizou análises de western blot com as amostras de plasma dos controlos 28 IGD e 28 disponíveis para a experiência. Comparamos as expressões dos cinco alvos entre os grupos IGD e controle medindo a intensidade da banda e a área descrita em outro lugar (). Entre eles, os níveis de expressão de DPYSL2 (controles 28 IGDs e 28, P = 0.0037) e GABBR2 (27 IGDs e 28 controles, P = 0.0052) foram significativamente maiores no grupo IGD (Figura (Figure3) .3). No entanto, não pudemos observar expressões diferenciais de CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443), e PI15 (P = 0.6346).

 

Um arquivo externo que contém uma figura, ilustração, etc. O nome do objeto é fpsyt-09-00081-g003.jpg

Imagens de Western blot e gráficos de ponto-caixa mostrando a expressão de (UMA) DPYSL2 e (B) GABRB2. As proteínas DPYSL2 e GABRB2 apresentaram diferenças significativas nos níveis de expressão entre o distúrbio de jogos na Internet (IGD) e amostras de controle (P-valor <0.05). As duas proteínas foram expressas em níveis mais elevados nas amostras IGD.

Discussão

Tem sido relatado que miRNAs estão envolvidos no desenvolvimento neuronal (, ) e expressão diferencial de miRNAs cerebrais são observados em doenças psiquiátricas como a esquizofrenia (). Portanto, é plausível que os perfis circulantes de miRNA possam ser biomarcadores úteis para IGD. Os miRNAs circulantes têm sido sugeridos como biomarcadores para diversos distúrbios neuropsiquiátricos (-); no entanto, os mecanismos moleculares por trás do desenvolvimento de IGD ainda são amplamente desconhecidos, apesar de sua importância clínica e social. Especificamente, não houve estudos sobre miRNAs associados a IGD. O objetivo deste estudo foi duplo. Primeiro, tentamos descobrir miRNAs de plasma associados ao IGD. Em segundo lugar, avaliamos a implicação biológica dos candidatos a miRNA, explorando a expressão proteica e GO dos genes alvo a jusante. Através da triagem genômica de perfis de expressão de miRNA e validação a jusante dos candidatos, descobrimos que a expressão de três miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p e hsa-miR-652-3p) foi significativamente menor em pacientes com IGD que controles. Embora os padrões de expressão de outros sete candidatos a miRNA não tenham sido replicados na validação, ele pode ser falso-negativo devido ao pequeno tamanho da amostra neste estudo. Até onde sabemos, este é o primeiro relato sobre a possibilidade de que os perfis de expressão de miRNAs no sangue possam ser biomarcadores úteis para IGD. A combinação dos três marcadores miRNA poderia servir como uma ferramenta minimamente invasiva para a identificação precoce de pessoas em risco de IGD.

Os miRNAs identificados neste estudo foram relatados como envolvidos em diversos distúrbios neuropsiquiátricos. Foi relatado que a expressão de hsa-miR-200c no sangue é regulada negativamente em vários distúrbios psiquiátricos, como a esquizofrenia (episódios depressivos maiores (). Foi relatado que o miR-200c é mais altamente expresso nas frações sinápticas do que no prosencéfalo total () e também estar associado à morte celular neuronal (). Com base nesses relatórios anteriores, o miR-200c está envolvido no neurodesenvolvimento e pode estar associado a distúrbios neuropsiquiátricos se sua expressão for perturbada. Vários estudos sugeriram associação entre miR-652 e risco de transtornos neuropsiquiátricos. Semelhante à nossa abordagem, para identificar biomarcadores sanguíneos para a esquizofrenia, Lai et al. realizaram a análise de TLDA com pacientes com esquizofrenia e controles normais, e descobriram que sete miRNAs incluindo hsa-miR-652 foram diferencialmente expressos em pacientes com esquizofrenia (). No estudo subsequente, eles projetaram um modelo de predição usando os dados de expressão de miRNA e distinguiram com sucesso a esquizofrenia do controle normal (). A expressão alterada de hsa-miR-652 também foi observada em alcoolistas (). Hsa-miR-26b foi encontrado para ser ativado durante a diferenciação de células neuronais (). Perkins et al. relataram que o hsa-miR-26b foi regulado negativamente no córtex pré-frontal de pacientes com esquizofrenia ().

Embora não haja evidências diretas para apoiar a relação entre a expressão perturbada desses miRNAs e a fisiopatologia da IGD, podemos inferir que a desregulação desses miRNAs pode estar associada à fisiopatologia da IGD com base em vários relatórios anteriores sobre os genes a jusante que previmos . Alguns dos genes a jusante dos três miRNAs, como GABRB2, CNR1, NRXN1 e DPYSL2 são relatados como associados a distúrbios neuropsiquiátricos. O ácido gama-aminobutírico (GABA) é um importante neurotransmissor inibitório no SNC. A desregulação do receptor GABA está implicada em distúrbios neuropsiquiátricos, incluindo vício, ansiedade e depressão (), que são também as principais características da IGD (). Polimorfismos genéticos em genes do receptor GABA são relatados como associados à dependência de álcool e esquizofrenia (, ). O 2 (DPYSL2) semelhante à diidropirimidinase é um membro da família de proteínas mediadoras da resposta à colapsina, que desempenha um papel na montagem de microtúbulos, na sinalização sináptica e na regulação do crescimento axonal. Consequentemente, esta molécula tem sido sugerida como um biomarcador para distúrbios psiquiátricos (, ). Polimorfismo no DPYSL2 O gene também foi relatado como associado ao transtorno do uso de álcool (). Relatórios anteriores e nossos dados sugerem que a superexpressão de GABRB2 e DPYSL2, alvos downstream dos miRNAs downregulated, tem implicações para a patogênese dos transtornos neuropsiquiátricos, incluindo IGD. O receptor canabinóide tipo 1 (CNR1) é um heterorreceptor pré-sináptico que modula a liberação de neurotransmissores e os distúrbios na sinalização canabinoide estão associados a vários distúrbios neuropsiquiátricos (). Polimorfismo genético de CNR1 Sabe-se que o gene está associado à dependência de substâncias em caucasianos (). Em um modelo de rato, a ativação do hipocampo ventral CNR1 perturba o comportamento social normal e a cognição (). Sabe-se que a alteração genética na família NRXN está envolvida em diversos distúrbios neuropsiquiátricos, incluindo o vício ().

Para examinar a implicação biológica dos três candidatos a miRNA de uma forma mais direta, exploramos a expressão proteica de seus genes alvo a jusante. Devido à disponibilidade limitada de amostras de plasma, dos candidatos comuns 140 (previstos a jusante de 2 ou mais miRNAs), examinamos os alvos 5 (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 e PI15) por western blot e confirmamos que a expressão de GABRB2 e DPYSL2 foi significativamente maior no grupo IGD. Relatórios anteriores e nossos dados sugerem que a superexpressão de GABRB2 e DPYSL2, alvos downstream dos miRNAs downregulated, podem ter implicações para a patogênese dos transtornos neuropsiquiátricos, incluindo IGD. Os resultados da análise do GO e da via de desenvolvimento neural também apoiam a implicação neurobiológica dos marcadores de miRNA. Outro achado interessante foi o efeito sinérgico da alteração simultânea dos miRNAs. Indivíduos com downregulation de todos os miRNAs 3 mostraram 22 vezes maior risco do que aqueles sem downregulation, e as ORs aumentaram de uma maneira dependente da dose. Embora o IC para essas três alterações fosse amplo devido ao tamanho limitado da amostra, a clara correlação positivar2 = 0.996) suporta o efeito sinérgico dos três miRNAs.

Embora tenhamos descoberto os marcadores de miRNA associados a IGD e indivíduos com todas as três alterações de miRNA tiveram um risco 22 vezes maior do que aqueles sem quaisquer alterações de miRNA, há várias limitações neste estudo. Primeiro, o pequeno tamanho da amostra aumentou a probabilidade de perder outros marcadores significativos de miRNA. Segundo, uma vez que nossos dados não foram suficientes para esclarecer se os perfis de miRNAs plasmáticos são causa ou efeito, não podemos confirmar os papéis biológicos desses marcadores não invasivos em um cenário clínico. Além disso, o perfil de miRNA e sua análise de genes a jusante usando tecido cerebral humano do banco de tecidos do cérebro pode dar uma resposta mais direta. A análise do tecido cerebral com um modelo animal de desordem do jogo também seria útil. Terceiro, devido à disponibilidade limitada de amostras de plasma, examinamos apenas cinco moléculas candidatas a jusante. Explorar mais alvos a jusante com um conjunto maior de amostras será útil para entender melhor o mecanismo molecular da IGD.

Em resumo, através da triagem genômica de perfis de expressão de miRNA e validação independente, descobrimos três miRNAs associados a IGD (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p e hsa-miR-652-3p). Muitos de seus genes a jusante são relatados como envolvidos em diversos distúrbios neuropsiquiátricos, e a validação experimental da expressão alterada desses genes a jusante suporta a implicação dos miRNAs identificados neste estudo. Descobrimos que indivíduos com regulação negativa de todos os três miRNAs estão sob alto risco de IGD. Juntamente com os fatores de risco clínicos ou ambientais conhecidos e os critérios diagnósticos, nossos achados podem facilitar a intervenção precoce para ajudar pessoas com maior risco de IGD.

Declaração de ética

Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board da Faculdade de Medicina da Universidade Católica da Coréia (MC16SISI0120). Todos os participantes e seus pais assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

Contribuições do autor

ML e HC contribuíram igualmente para este artigo. ML, D-JK e Y-JC projetaram o estudo. SJ, S-MC, YP, DC e JL realizaram experimentos e geração de dados. J-WC, S-HP, J-SC e D-JK coletaram amostras de sangue e informações clínicas. ML, HC, S-HY e Y-JC analisaram os dados. ML, HC, S-HY e Y-JC descreveram o manuscrito. Y-JC supervisionou o projeto.

Declaração de conflito de interesse

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Notas de rodapé

 

Financiamento. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Programa de Pesquisa do Cérebro através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coréia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência e TIC e Planejamento Futuro (NRF-2015M3C7A1064778).

 

 

Material suplementar

O Material Complementar deste artigo pode ser encontrado on-line em http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.

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