Química e Biologia da Sinalização Orexina (2010)

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Sumário

As orexinas (também chamadas hipocretinas) são neuropeptídeos que foram descobertos pela primeira vez em 1998 por dois grupos de pesquisa independentes.^{1, 2}. Orexins A (aminoácidos 33) e B (aminoácidos 28) são derivados de um único polipéptido pré-pró-orexina³. Eles mediam suas ações através de interações com dois GPCRs relacionados, chamados Orexin Receptor 1 e 2 (OxR1 e OxR2). O OxR1 liga-se à Orexin A com uma afinidade 100 mais alta que a Orexin B, enquanto que o OxR2 liga ambos os peptídeos com aproximadamente a mesma afinidade. As orexinas são produzidas por neurônios especializados no hipotálamo, que se projetam para muitas regiões diferentes do cérebro.^{4, 5}.

Como será revisado brevemente abaixo, estudos fisiológicos nos últimos dez anos implicaram a sinalização da orexina como desempenhando um papel central em uma variedade de importantes processos biológicos, incluindo alimentação, homeostase de energia, ciclos de sono / vigília, dependência e busca de recompensa, entre outros.⁶. Existem evidências claras de que defeitos na sinalização da orexina estão envolvidos na obesidade induzida por dieta e diabetes^{7, 8}, narcolepsia^{9, 10}transtorno de ansiedade pânico¹¹, dependência de drogas¹² e doença de Alzheimer¹³. Assim, existe um interesse considerável na indústria farmacêutica no desenvolvimento de compostos potentes para a manipulação da sinalização da orexina. Recentes progressos na compreensão e manipulação da sinalização da orexina são analisados ​​aqui.

Sinalização Orexin na coordenação do sono e alimentação

O papel mais bem compreendido da sinalização da orexina é a coordenação da alimentação e do sono. O nível de produção de orexina no hipotálamo é inversamente correlacionado com os níveis de glicose no sangue ¹⁴. A sinalização da orexina, pelo menos a curto prazo, induz uma sensação de fome e estimula o comportamento alimentar, provavelmente pela ativação de neurônios no cérebro que produzem o neuropeptídeo Y e hormônios funcionalmente relacionados. Além disso, a sinalização da orexina é um componente chave para induzir um estado de vigília em mamíferos.^{9, 15}. Em outras palavras, a orexina sinaliza que quando os animais estão com fome, eles também estão acordados, mas quando saciados, podem ficar sonolentos. Isso faz um bom sentido fisiológico em que os animais vão querer comer alimentos, não dormir, quando estão com fome.

A ablação genética do gene da orexina ou o receptor em roedores resulta em um fenótipo notavelmente semelhante à narcolepsia humana com cataplexia, na qual o animal sofre intrusão inadequada de sono em seu tempo de despertar normal, incluindo colapso em momentos ímpares.⁹. O mesmo é verdadeiro para cães com uma mutação inativadora no gene que expressa OxR2¹⁰. A maioria dos narcolépticos humanos, embora não todos, embora não possuam mutações nos genes que codificam a orexina e seus receptores, ainda assim não possuem orexina detectável. Acredita-se que isso seja devido a um ataque auto-imune nos neurônios produtores de orexina no cérebro^{16, 17}. No entanto, este modelo auto-imune para a narcolepsia humana continua a ser comprovado e nada é conhecido sobre a natureza da reação auto-imune putativa.

A biologia conhecida da sinalização da orexina prevê, assim, que os agonistas OxR2 penetrantes no cérebro devem estimular a vigília e podem ser úteis para o tratamento da narcolepsia. Yanagisawa e seus colegas publicaram experimentos de prova de conceito que apóiam essa ideia¹⁸. Eles mostraram que a injeção intracraniana direta de peptídeo de orexina no cérebro de roedores deficientes em orexina resultou em um estado elevado de vigília. Por outro lado, os antagonistas do receptor da orexina podem ser usados ​​para tratar a insônia¹⁹, embora a possível indução de cataplexia, observada em animais e humanos com deficiência crônica de orexina, seja uma preocupação (vide infra).

Sinalização Orexin em comportamentos aditivos e outros patológicos

A ínsula é uma região cerebral conhecida por estar envolvida no desenvolvimento de impulsos e desejos e geralmente está envolvida no comportamento de recompensa.²⁰. Danos a esta região do cérebro resultam em uma queda marcante na motivação dos fumantes em continuar com seu hábito²¹. Em contraste, a abstinência em fumantes é conhecida por ativar a ínsula²². A mesma região do cérebro parece estar envolvida no comportamento de busca de recompensa envolvido, além de morfina, cocaína e álcool. Neurônios produtores de orexina densamente inervam essa região do cérebro e a sinalização da orexina desempenha um papel fundamental nesses comportamentos^23-25. Por exemplo, administração do antagonista seletivo OxR1 SB-334867 (ver Figura 5) diminuiu significativamente a movimentação de roedores para auto-injetar-se com nicotina¹². Resultados semelhantes foram obtidos para outros compostos aditivos. Curiosamente, no estudo de nicotina, o bloqueio farmacológico de OxR1 não suprimiu substancialmente a ingestão de alimentos, que, juntamente com a vigília, é mediado predominantemente por OxR2. Assim, os dados pré-clínicos em roedores sugerem fortemente que os antagonistas selectivos de OxR1 podem ser fármacos anti-viciantes interessantes.

 

Figura 5

Estruturas de antagonistas dos receptores da orexina desenvolvidos pela Glaxo Smith Kline (GSK) e pela Merck.

A sinalização de Orexin também demonstrou recentemente estar envolvida em ataques de pânico e ansiedade¹¹. Utilizando um modelo de rato em que os ataques de pânico são induzidos por tratamento do animal cronicamente com um inibidor da síntese de GABA seguido de tratamento agudo com lactato de sódio, foi demonstrado que o bloqueio do OxR334867 mediado por SB1 ou o silenciamento da produção de orexina mediada por siRNA suprime ataques de pânico neste modelo. Além disso, sujeitos humanos sujeitos a ataques de pânico apresentam níveis elevados de orexina no líquido cefalorraquidiano (LCR). ¹¹, consistente com o papel da sinalização da orexina nos transtornos de ansiedade humanos.

Muito recentemente, um relatório apareceu ligando o ciclo sono / vigília à Doença de Alzheimer¹³. Especificamente, foi demonstrado que o acúmulo de beta-amilóide, uma característica da doença, está correlacionado com a vigília. Por exemplo, a privação crônica de sono aumentou os níveis de beta-amilóide no LCR do animal. Curiosamente, a administração do antagonista do receptor de orexina SB-334867 diminuiu os níveis deste intermediário neurotóxico. Assim, é possível que um regime de tratamento adequado com antagonistas de OxR possa ser um tratamento viável para retardar o desenvolvimento da doença de Alzheimer, se for diagnosticado precocemente.

Sinalização de orexina na homeostase energética, obesidade induzida por dieta e diabetes

Há evidências circunstanciais de que a sinalização da orexina é importante na homeostase energética. Por exemplo, humanos narcolépticos deficientes em orexina exibem um índice de massa corporal mais alto do que indivíduos narcolépticos com níveis normais de orexina²⁶. Ablação genética de neurônios da orexina em camundongos resulta em animais obesos²⁷ e estes ratos também desenvolvem resistência à insulina relacionada à idade⁷. Esses resultados parecem ser contra-intuitivos, uma vez que a indução farmacológica da sinalização da orexina promove agudamente o comportamento alimentar.¹. Isto sugere que os efeitos a curto e a longo prazo da sinalização da orexina na homeostase energética são diferentes.

Recentemente, essa área da biologia da orexina foi esclarecida por um estudo de referência que demonstrou conclusivamente que a sinalização da orexina opõe-se fortemente à obesidade induzida por dieta e ao subseqüente desenvolvimento de resistência à insulina em roedores.⁸. Foi demonstrado que a superexpressão crônica do gene da orexina ou a indução farmacológica do receptor da orexina bloqueavam quase completamente o desenvolvimento de obesidade e resistência à insulina em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura. Isto foi mostrado para ser em grande parte devido ao aumento do gasto de energia, embora não houve mudança no quociente respiratório, um indicador indireto de carboidratos versus utilização de lipídios. A estimulação crônica da sinalização da orexina também reduziu o consumo de alimentos. Uma variedade de experiências genéticas e farmacológicas indicaram que a maior parte deste efeito foi mediada por sinalização através de OxR2, não de OxR1. Finalmente, um achado surpreendente deste estudo é que a estimulação crônica da sinalização da orexina não teve efeito sobre camundongos sem leptina. Esses animais, quando alimentados com uma dieta rica em gordura, ainda se tornaram obsessivos e resistentes à insulina, mesmo quando tratados com o agonista do receptor de orexina. Assim, o efeito protetor da orexina parece estar enraizado na melhora da sensibilidade à leptina. Este estudo tem implicações terapêuticas óbvias no tratamento da obesidade induzida por dieta e diabetes.

Embora este estudo tenha implicado principalmente na sinalização através de OxR2 como sendo importante para o fenótipo resistivo à obesidade, foram observados alguns efeitos mediados por OxR1⁸. Os autores descobriram que a ablação genética de OxR1 sozinha protege contra hiperglicemia induzida por dieta rica em gordura, mas não a obesidade. Isto indica que a sinalização da orexina através de OxR1 pelos níveis fisiológicos normais de orexina desempenham um papel permissivo no desenvolvimento de resistência à insulina induzida por dieta com alto teor de gordura ou idade. No entanto, no cenário não fisiológico da orexina sobreexpressão sustentada através de um transgene, ambos oxR1- e OxR2-mediada proteção contra o desenvolvimento de resistência à insulina na dieta rica em gordura. Este conjunto complicado de resultados com relação a OxR1 sugere que o receptor desempenha diferentes papéis sob condições de expressão normal ou suprafisiológica da orexina, ou que o receptor medeia diferentes efeitos fisiológicos que podem aumentar ou se opor ao desenvolvimento de hiperinsulinemia e que o “vencedor” de esses efeitos concorrentes são diferentes dependendo do nível de orexina ou do tempo e duração de sua sinalização.

O acoplamento do efeito da orexina à sinalização da leptina é interessante em relação a outro estudo publicado recentemente, no qual foi descoberto que os níveis suprafisiológicos de leptina permitem que roedores diabéticos não tenham insulina suficiente para prosperar. ²⁸. Anteriormente, a leptina era conhecida por diminuir o nível de glicose no sangue, potencializando os níveis residuais de insulina endógena em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ) com deficiência parcial de insulina. ²⁹. No entanto, a ideia de que a leptina sozinha poderia resgatar animais deficientes em insulina a partir de sintomas diabéticos nunca havia sido testada e essa descoberta foi uma grande surpresa. Os fenótipos semelhantes induzidos pelo tratamento crônico de animais com níveis suprafisiológicos de orexina e leptina, juntamente com a constatação de que orexina parece funcionar melhorando a sensibilidade à leptina, levam a questionar se esses dois estudos eram lados diferentes da mesma moeda e que a estimulação da As vias de sinalização da orexina / leptina podem de fato ser um tratamento altamente promissor para diabetes tipo I ou tipo II.

A sinalização da orexina tem efeitos na periferia?

A maior parte dos efeitos da sinalização da orexina descritos acima ocorre no hipotálamo. Os papéis da sinalização da orexina, se houver, fora do sistema nervoso são controversos. A expressão das orexinas e seus receptores tem sido detectada em vários tecidos periféricos, incluindo intestino, pâncreas, rim, supra-renais, tecido adiposo e trato reprodutivo. ^30-33, mas a prova funcional de um papel para a sinalização da orexina na periferia é rara.

Um estudo recente mostrou que a incidência de células que expressam OxR1 nas ilhotas pancreáticas aumentou com hiperglicemia induzida por estreptozotocina (STZ) em ratos e co-localizada com glucagon³⁴. Além disso, caspase-3 clivada co-localizada imunoquimicamente com OxR1 nas ilhotas. Os animais com falta de orexina, por outro lado, exibiram hiperglicemia reduzida e melhor tolerância à glicose do que os animais do tipo selvagem. Estes resultados sugerem que a sinalização da orexina através do OxR1 no pâncreas pode contribuir para a apoptose de células beta e o desenvolvimento de diabetes em resposta ao tratamento com STZ. Embora a conexão seja tênue, é possível que esse efeito possa explicar as observações de Funato, et al., Mencionadas acima, de que a ablação genética de OxR1 era protetora contra hiperglicemia e hiperinsulinemia induzidas por dieta rica em gordura⁸.

A cascata de sinalização da orexina

Embora a sinalização da orexina tenha sido intensamente estudada no nível fisiológico, houve muito menos esforço dedicado à caracterização dos eventos intracelulares desencadeados pela ligação dos hormônios da orexina a seus receptores. Sabe-se que a ligação do hormônio ao seu receptor desencadeia um influxo de cálcio, que é acoplado à ativação de Erk. ³⁵. Os receptores também se ligam a uma via mediada pela fosfolipase C (PLC) que libera os estoques de cálcio intracelular.

A análise mais completa dos programas de transcrição gênica desencadeados pela sinalização da orexina foi relatada na 2007 ³⁶. Este estudo empregou perfis de expressão de genes globais para identificar genes fortemente regulados para cima ou para baixo em células HEK293 que expressam estavelmente OxR1. Verificou-se que os genes 260 são regulados positivamente e 64 regula negativamente duas vezes ou mais quando são amostrados duas e quatro horas após a estimulação com orexina. As anotações genéticas indicaram que cerca de metade dos genes altamente regulados estavam envolvidos no crescimento celular (30%) ou no metabolismo (27%). Uma análise da via usando o programa Ingenuity comercial implicou várias vias como sendo reguladas pela sinalização da orexina (Figura 1). As vias canônicas de sinalização TGF-β / Smad / BMP, FGF, NF-kB e hipóxica foram as mais proeminentes. Este estudo centrou-se em detalhes sobre a via hipóxica, que foi um estranho "hit" neste estudo desde que as células foram cultivadas em condições normóxicas. No entanto, o fator de transcrição do fator 1-α (HIF-1α) induzido por hipóxia, que anteriormente era conhecido por aumentar em resposta à hipóxia, e muitos de seus genes-alvo foram altamente induzidos pelo tratamento com orexina. Em células de câncer hipóxico, onde a ação do HIF-1α tem sido melhor estudada, ele se associa ao HIF-1β para formar um fator de transcrição heterodimérico (HIF-1) que promove uma reprogramação do metabolismo celular.³⁷. Em particular, regula positivamente a glicose e a glicólise, tendo sítios de ligação a montante de quase todos os genes envolvidos nestes eventos. Em células hipóxicas, o HIF-1 atua para desviar o produto da glicólise, o piruvato, para a produção de lactato, em vez de conversão para acetil-CoA e entrada no ciclo de TCA e fosforilação oxidativa. Isto é feito, pelo menos em parte, pela sub-regulação da expressão da lactato desidrogenase A (LDH-A) dependente de HIF-1, a enzima que medeia a conversão de piruvato em lactato, bem como piruvato desidrogenase cinas ( PDHK), que inativa a PDH, a enzima que medeia a transformação do piruvato em acetil-Co-A Figura 2). Surpreendentemente, no entanto, as células tratadas com orexina parecem empurrar a maior parte de seu fluxo metabólico através do ciclo de TCA e da fosforilação oxidativa. ³⁶, resultando em uma produção fortemente aumentada de ATP e, presumivelmente, outros intermediários biossintéticos presentes com a ativação dessas vias. Não se sabe como a sinalização da orexina e a hipóxia podem estimular a atividade do HIF-1α, mas apenas um subconjunto de genes comumente ativados por esse fator de transcrição na hipóxia é ativado em células tratadas com orexina.

 

Figura 1

Resumo dos resultados de uma análise da expressão gênica do efeito da orexina nas células que expressam o receptor de orexina 1. Início: Gráfico de pizza que resume funções anotadas de genes afetados significativamente pela sinalização da orexina. Inferior: vias de sinalização propostas ...

 

FIG. 2

Resumo esquemático do principal efeito da sinalização da orexina no metabolismo da glicose. OxSig = sinalização da orexina. O oval laranja representa um transportador de glicose. As setas indicam uma estimulação do processo indicado e as linhas perpendiculares representam um ...

Estudos paralelos de cortes hipotalâmicos obtidos de camundongos knock-out do tipo selvagem ou OxR1 geralmente concordaram com essas conclusões e validaram que os efeitos observados foram o resultado da sinalização da orexina. ³⁶. De certa forma, esse resultado é atraente, na medida em que explica um enigma em nossa compreensão da orexina biologia no nível fisiológico. Se equacionarmos um estado de vigília com alta atividade metabólica neuronal, o que parece razoável, é estranho que isso ocorra quando o cérebro é banhado em baixos níveis de glicose. Portanto, faz algum sentido que a vigília requeira uma substituição dessa situação por meio de um mecanismo que aumenta a eficiência da captação e processamento de glicose. Uma regulação positiva do metabolismo celular mediada pela orexina também parece ser consistente com a observação do aumento do gasto energético e da resistência à obesidade induzida por dieta hiperlipídica. ⁸. No entanto, é importante lembrar que este estudo se concentrou em células que expressam OxR1 e cortes neuronais obtidos de camundongos knock-out do tipo selvagem ou OxR1. O estado de vigília e a resistência à obesidade induzida por dieta, como mencionado acima, agora são considerados mais um efeito da sinalização mediada por OxR2. Pode ser que os caminhos observados sejam mais relevantes para recompensar o comportamento e outros processos que parecem ser dominados pela sinalização mediada por OxR1. Muito mais trabalho será necessário em vários tipos de células e tecidos para resolver esses problemas. Mas a ideia de que a sinalização da orexina é um importante regulador do metabolismo energético é um modelo interessante que orientará futuros estudos.

A sinalização da orexina é importante no câncer?

A descoberta de que a sinalização da orexina é capaz de turbinar o consumo de glicose sugere uma possível ligação à proliferação celular na divisão de células e, portanto, ao câncer. Entretanto, os resultados publicados discutidos acima indicam que a orexina pode estimular o metabolismo energético oxidativo ³⁶, enquanto muitas células cancerígenas empregam glicólise anaeróbica para a maior parte de seu metabolismo ³⁸. Uma possibilidade é que as células cancerígenas que empregam o metabolismo oxidativo possam empregar a sinalização da orexina de forma autócrina ou parácrina para estimular o seu metabolismo e proliferação e, em caso afirmativo, os antagonistas do receptor da orexina seriam opções terapêuticas interessantes. Por outro lado, se a sinalização da orexina forçar o fluxo metabólico através do TCA e das vias de fosforilação oxidativa à custa da glicólise anaeróbica, a ativação dessa via pode ser tóxica para as células tumorais “dependentes” de um estilo de vida glicolítico.

Existem algumas indicações de um papel para a sinalização da orexina nas células cancerígenas e, como se poderia prever a partir da análise acima, o efeito da sinalização da orexina parece ser diferente em diferentes tipos de células cancerígenas. Por exemplo, as orexinas suprimem o crescimento celular induzindo a apoptose no câncer de cólon humano, nas células de neuroblastoma e nas células tumorais pancreáticas de ratos ³⁹. Por outro lado, a expressão de OxR1 e OxR2 é maior em adenomas do que o córtex adrenal normal. Orexin A e B podem estimular a proliferação celular nestas células e os efeitos foram mais pronunciados em células adenomatosas em cultura do que as células adrenocorticais normais. ⁴⁰. Embora esses relatos sejam interessantes, nossa compreensão da importância da sinalização da orexina no câncer, se houver, está em sua infância e muito mais trabalho será necessário para determinar se os receptores de orexina ou efetores a jusante da via de sinalização representam alvos viáveis ​​para a quimioterapia do câncer. .

Controle Farmacológico da Sinalização de Orexin

A biologia revisada acima sugere que os agonistas, antagonistas e potenciadores da sinalização da orexina podem ser de interesse significativo clinicamente. Por exemplo, o tratamento da narcolepsia e cataplexia causada pela falta de produção de orexina deve ser tratável usando um agonista do receptor de orexina. Por outro lado, o comportamento aditivo deve ser tratável usando um antagonista do receptor de orexina. Dieta induzida-obesidade e diabetes podem ser combatidos com um agonista do receptor de orexina ou talvez um potenciador alostérico positivo. Várias grandes empresas farmacêuticas realizaram o desenvolvimento de moléculas que visam os receptores da orexina ⁴¹.

Antagonistas de Receptor Orexin

Uma vez que a sinalização da orexina no cérebro promove a vigília, é lógico que o bloqueio farmacológico desta via deva resultar em sonolência e, assim, os antagonistas do receptor da orexina podem ser fármacos úteis para o tratamento da insónia. No entanto, uma preocupação importante seria a indução de cataplexia. De facto, a questão central no desenvolvimento de antagonistas de receptor de orexina terapeuticamente úteis é se a inibição farmacológica transitória do receptor de orexina irá fenocopiar o fenótipo narcoléptico e cataplético da deficiência crónica de orexina.

Os dados pré-clínicos e clínicos disponíveis até agora argumentam que a resposta é "não". A maioria dos dados vem de estudos de Almorexant (Figura 3; também conhecido como ACT-078573), que está sendo desenvolvido pela Actelion Pharmaceuticals para o tratamento da insônia. Almorexant é uma tatra-hidroisoquinolina disponível por via oral que antagoniza potencialmente tanto OxR1 quanto OxR2. A Actelion publicou um estudo preliminar no início do 2007 que relatou o sucesso do tratamento de ratos, cães e seres humanos com Almorexant ou um agonista clássico do receptor GABA, o zolpidem. ¹⁹. Almorexant mostrou-se seguro e bem tolerado neste estudo. Isso induziu sinais fisiológicos subjetivos e objetivos do sono. Nos experimentos com ratos, foi demonstrado que o Almorexant induziu tanto o sono não-REM como o REM. Isto é significativo porque o zolpidem não induz o sono REM. Importante, nenhum sinal de cataplexia foi observado em nenhum dos animais experimentais ou pacientes humanos.

 

Figura 3

Resumo do desenvolvimento de Almorexant, um candidato clínico para o tratamento da insônia, e compostos relacionados com seletividade diferente para os dois receptores de orexina.

No final da 2009, a Actelion anunciou a conclusão de um extenso estudo de Fase III de um tratamento de duas semanas de adultos e idosos com insônia crônica primária. A empresa alega que o endpoint primário do estudo, a eficácia superior do Almorexant em relação ao placebo, foi atingido, assim como vários endpoints secundários (ver http://www1.actelion.com/en/our-company/news-and-events/index.page?newsId=1365361). No entanto, uma linha enigmática no comunicado de imprensa afirmou que “... foram feitas algumas observações de segurança que exigirão avaliações e avaliações adicionais em estudos de Fase III de longo prazo.” Será interessante saber o que isso significa quando os dados ficam disponíveis.

Almorexant foi o resultado de um extenso programa de desenvolvimento que começou com a tatrahydroisoquinoline 1 (Figura 3) ⁴². Este composto surgiu como um sucesso primário a partir de um rastreio de alto rendimento utilizando um ensaio de cálcio baseado em FLIPR em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) expressando níveis elevados de OxR1 ou OxR2 humano. Note que composto 1 é bastante seletivo para OxR1. De fato, este programa medicinal produziu muitos compostos potentes diferentes, alguns dos quais eram antagonistas de receptores duplos, enquanto alguns eram inibidores razoavelmente seletivos de OxR1 ou OxR2 (ver Figura 3). Balanços muito grandes no grau de seletividade foram observados como resultado de modestas alterações estruturais. Por exemplo, a substituição de um dos grupos metoxi no anel aromático “superior esquerdo” do 1 com um er isopropico resultou num antagonista especico de OxR1 completamente. Outro contraste interessante é composto 3, que é bastante seletivo para OxR2, mas compartilha muitos recursos estruturais com o antagonista duplo Almorexant. Infelizmente, não há dados estruturais sobre o receptor de orexina e, portanto, a base molecular dessa seletividade é desconhecida.

As tetrahidroisoquinolinas estão longe de serem os únicos antagonistas dos receptores da orexina relatados. Por exemplo, a Actelion relatou compostos estruturalmente distintos, como sulfonamidas 4 e 5, que são potentes antagonistas duplos e oxR2 selectivos, respectivamente (Figura 4) ⁴³. Através da inspecção das estruturas, que incluem um núcleo de glicina altamente modificado, é tentado a concluir que as tetra-hidroisoquinolinas e sulfonamidas podem ocupar locais sobrepostos no receptor, mas, tanto quanto sabemos, isto não foi testado.

 

Figura 4

Estruturas de outros antagonistas dos receptores da orexina desenvolvidos pela Actelion Pharmaceuticals.

A GSK relatou um dos primeiros antagonistas do receptor de orexina, SB-334867 ^44-46 (Figura 5), um composto que é relativamente seletivo para OxR1 e continua sendo o “composto de ferramentas” mais comumente usado em laboratórios de pesquisa que estudam a biologia da orexina. Eles também relataram um parente relativamente distante de SB-334867, 6, que inclui uma unidade de prolina, com uma potência muito melhor contra ambos os receptores, mas mantendo a seletividade razoável da OxR1 ⁴⁷. Especula-se que 6 pode ser um parente próximo de um composto de estrutura não revelada que a GSK levou em testes clínicos para o tratamento da insônia chamado SB-674042 ⁴¹. A GSK anunciou a progressão deste composto para testes clínicos de Fase II no 2007, mas nenhum dado clínico adicional foi divulgado até onde sabemos.

Uma equipe da Merck desenvolveu antagonistas do receptor de orexina contendo prolina ⁴⁸. Composto 7 (Figura 5) surgiu a partir de um rastreio de alto rendimento e evidenciou uma excelente potência in vitro contra OxR2, bem como uma atividade modesta contra OxR1, mas in vivo exibiu fraca penetração na barreira hematoencefálica. Verificou-se que este é o resultado de ser um substrato para a glicoproteína P. Eles descobriram que esse problema poderia ser amenizado pela metilação do nitrogênio benzimidazol ^{41, 48}. Composto 8, que também contém um anel fenílico em vez de uma porção pirrole no quadrante "superior direito" da molécula, é um potente antagonista do receptor duplo com excelente penetração na barreira hematoencefálica. 8 foi mostrado para ativo em ratos.

Outras empresas farmacêuticas relataram alguns compostos com atividade in vitro contra os receptores de orexina, mas estes não serão revisados ​​aqui.

É tentador especular que os mesmos compostos que estão sendo desenvolvidos como auxiliares do sono também podem ser úteis para o tratamento de vícios crônicos, embora um efeito colateral óbvio desse regime de tratamento seja que os sujeitos ficarão sonolentos se forem antagonistas de receptores duplos. No entanto, a descoberta do papel da sinalização da orexina no comportamento aditivo é relativamente recente e, até onde sabemos, não foram iniciados ensaios clínicos utilizando os compostos discutidos acima para esta indicação.

Agonistas e Potenciadores do Receptor da Orexina

Como discutido acima, Yanagisawa e colegas forneceram provas de princípio em modelos animais de que a narcolepsia deve ser tratável com um agonista do receptor de orexina ¹⁸. Eles empregaram um peptídeo de orexina modificado nesses estudos. Curiosamente, no entanto, nenhum agonista não peptídico foi relatado na literatura até onde sabemos. É difícil imaginar que telas para tais compostos não tenham sido realizadas, dada a extensa quantidade de trabalho realizado em antagonistas de receptores. Assim, parece provável que os agonistas potentes sejam difíceis de encontrar, embora não esteja claro por que isso acontece.

Muito recentemente, o primeiro potenciador alostérico positivo do receptor de orexina, 9 (Figura 6), foi identificado. Este composto foi descoberto fortuitamente durante o curso de uma modesta campanha de química medicinal destinada a aumentar a potência de um antagonista do receptor de orexina à base de peptto. ⁴⁹. Peptoide 10 foi identificado em uma tela na qual as células que expressam ou não OxR1, mas são idênticas, foram marcadas com diferentes corantes coloridos (vermelho e verde, respectivamente) e hibridizadas a um microarray exibindo vários milhares de peptóides imobilizados em uma lâmina de vidro. Os compostos que ligam as células que expressam OxR1 seletivamente foram identificados por uma alta razão vermelho: verde dos corantes fluorescentes capturados naquele local (ver ref. ⁵⁰ para o desenvolvimento desta metodologia). Um experimento de escaneamento de sarcosina ⁵¹ revelaram que apenas duas das nove cadeias laterais presentes na molécula eram essenciais para a ligação às células que expressam o receptor (destacadas em vermelho FIG. 6). Síntese e análise subseqüente do composto 11 confirmou que era o “farmacóforo mínimo” para ligação ao receptor. 11 é um antagonista muito fraco de ambos os receptores de orexina com um IC₅₀ de aproximadamente 300 μM in vitro.

 

Figura 6

Desenvolvimento de um potenciador positivo do receptor da orexina. A estrutura do peptóide que surgiu como um hit primário de uma tela de ligação é mostrada no topo. A parte da molécula que é importante para a ligação ao receptor é destacada em vermelho. este ...

A estrutura de 11 parecia sugerir uma fraca semelhança com o Almorexant (Figura 6) em que o composto continha um anel de piperonilo ligado a uma unidade de glicina, enquanto que quase as mesmas unidades, mas com um anel de dimetoxibenilo no lugar de piperonilo, estão presentes em Almorexant. Usando este modelo como guia, vários derivados de 11 foram sintetizados em que unidades de hidrocarbonetos foram adicionadas ao nitrogênio da amina via aminação redutiva. Um derivado benzílico, 12, em que um metileno adicional também havia sido inserido entre o anel aromático eo nitrogênio provou ser um antagonista muito melhorado, embora ainda com apenas uma modesta potência (FIG. 6), sugerindo que o modelo pode estar correto. Estudos de competição para determinar se o derivado peptóide 12 e Almorexant competir uns com os outros pela ligação ao receptor não foram relatados.

Durante outros esforços de otimização, compostos 9 foi sintetizado, o que diferiu de 12 apenas em que o anel de piperonila foi aberto a duas unidades de metoxi e o único ligante de metileno entre o nitrogênio da glicina e o anel aromático que estava presente no composto 10 Foi restaurado. Notavelmente, 9 não antagonizou o OxR1 num ensaio de cultura de células, mas pareceu aumentar ligeiramente a expressão de um gene repórter dependente de orexina. Os ensaios foram repetidos em concentrações mais baixas de orexina₂₀ do hormônio) e os resultados demonstraram claramente que 9 é um potenciador positivo da ativação mediada por orexina do receptor. Nesta concentração hormonal, 9 exibiu um CE₅₀ de cerca de 120 nM. Quando o ensaio foi realizado em níveis de saturação do potencializador 9 e o nível de orexina foi titulado, verificou-se que o CE₅₀ orexina diminuiu aproximadamente quatro vezes e que o nível máximo de expressão do gene repórter foi cerca de três vezes maior do que aquele provocado pela saturação dos níveis de orexina. Resultados semelhantes foram obtidos em experimentos utilizando células expressando OxR2, mostrando que 9 é um potenciador de receptor duplo.

A descoberta do primeiro potenciador do receptor da orexina é potencialmente excitante no que diz respeito a possíveis aplicações como tratamento anti-obesidade / diabetes ⁸, embora até hoje não in vivo experimentos foram relatados usando este composto. Como mencionado acima, Yanagisawa mostrou que um agonista do receptor de orexina baseado em peptídeos bloqueia a obesidade induzida por dieta e o desenvolvimento de diabetes tipo II em roedores ⁸. Uma vez que estes animais e, supostamente, seres humanos nutridos ainda expressam níveis normais do hormônio orexina, um potencial potenciador pode ser útil para estimular a ação natural favorável do hormônio nesses indivíduos. Evidentemente, é improvável que um potencializador tenha interesse no tratamento da narcolepsia, uma vez que os indivíduos afetados produzem pouca ou nenhuma orexina.

Resumo

Agora está claro que o neuropeptídeo orexina e seus receptores cognatos desempenham um papel central na regulação da alimentação, sono, gasto de energia, busca de recompensas e uma variedade de outros comportamentos. Pouco se sabe sobre os eventos intracelulares desencadeados pela sinalização da orexina. Há claramente uma grande promessa médica na manipulação farmacológica da sinalização da orexina e várias empresas farmacêuticas e laboratórios acadêmicos têm programas ativos nessa área. Embora esses compostos ainda não estejam na clínica, o potente antagonista duplo do receptor da orexina, Almorexant, completou o que aparentemente foi um ensaio clínico de fase III para o tratamento da insônia. Até agora, nenhum agonista do receptor da orexina foi relatado. Parece provável que haverá uma grande atividade nessa área nos próximos anos.

Agradecimentos

Referências