Indian J Pharmacol. 2016 Jan-fev; 48 (1): 53 – 58.
PMCID: PMC4778208
Sumário
Objetivo:
O Nucleus accumbens (NAcc) tem um papel no vício e no comportamento ingestivo. Para avaliar o sistema orexinérgico envolvido, nós infundimos o antagonista de Orexin A e avaliamos o efeito na ingestão de alimentos e na preferência por álcool em ratos Wistar.
Materiais e Métodos:
Ratos Wistar endogâmicos (n = 54) foram divididos em grupos controle e experimental (dose baixa e dose alta). Usando o método estereotáxico, a cânula guia foi colocada em posição bilateral para alcançar NAcc. Baixa dose (3 ng) e dose alta (6 ng) de antagonista de Orexin A (SB-334867) foram infundidas, e o consumo alimentar, consumo de água e consumo de álcool, e dois testes de preferência de escolha livre de álcool foram realizados no Grupo experimental. O grupo controle recebeu infusão salina e os demais métodos seguidos foram os mesmos. As medidas foram realizadas imediatamente após a infusão, em 1 h, 2 h, 4 h, e durante todo o dia e representadas na figura e tabelas.
Resultados:
Uma diminuição no consumo de água observada imediatamente após a infusão em 1st h (P <0.05) e 2nd h (P <0.01), que foi mais no grupo de dose alta em comparação com dose baixa e controles. A ingestão de álcool também seguia o mesmo padrão. Em duas mamadeiras de livre escolha, os ratos não apresentaram nenhuma preferência específica ao álcool.
Conclusão:
Houve redução dependente da dose na ingestão de alimentos e líquidos em ratos tratados. Isso sugeriu um possível papel do sistema orexinérgico no comportamento ingestivo. No entanto, Orexin A pode não ter um papel na modulação do vício em álcool pelo centro gratificante NAcc.
Introdução
Acumbens (NAcc) é conhecido por afetar o comportamento ingestivo e a dependência de substâncias.1,2Também tem sido implicado em recompensa e motivação.3] Duas sub-regiões distintas foram descritas no NAcc, e houve muita sobreposição no funcionamento dessas duas regiões.4Microinjeção de drogas aditivas no NAcc mostrou um aumento dependente da dose nos níveis de dopamina. A dopamina é um neuroquímico envolvido em circuitos de recompensa. A autoadministração intranuclear de anfetamina mostrou um aumento na sensação de recompensa.5Outras partes da região subcortical também influenciam o comportamento ingestivo, que pode estar intimamente ligado ao accumbens. Ingestão alimentar e consumo de água mostraram-se influenciados por várias partes do encéfalo basal, como o hipotálamo lateral, [6núcleo paraventricular, septum pellucidum,7] e amígdala basolateral. [8Existe extensa rede neural na regulação do comportamento ingestivo. O NAcc demonstrou estar bem conectado aos principais centros subcorticais, como a área tegmentar ventral (VTA);9] amígdala basolateral e outros centros. [10Os principais neurotransmissores envolvidos na modulação da ingestão de álcool, recompensa e ingestão de alimentos foram relatados a partir dos circuitos neurais nesta região.11]
Recentemente, hipocretinas, um grupo de peptídeos heterogêneos, foram identificadas a partir do hipotálamo, hipocretina 1 e 2 (Orexin A e B), peptídeos tendo 32 aa e 29 aa, respectivamente.12Originalmente, essas substâncias têm sido implicadas na regulação do ciclo de vigília do sono, como evidenciado pelo aumento da Orexin A encontrado no hipotálamo durante a fase ativa da vigília.13Em nosso laboratório, descobrimos que o Orexin A aumentou a ingestão de alimentos e líquidos quando injetado no NAcc.14O anticorpo de orexina administrado centralmente inibe a ingestão de alimentos dose-dependente em ratos em jejum 24, e a administração intraperitoneal de orexina não conseguiu suprimir o consumo de alimentos, representa que o anticorpo orexina atua no sistema nervoso central, mas não no tecido periférico.15Além disso, eles confirmaram que as orexinas endógenas têm papel fisiológico no comportamento alimentar. Embora inicialmente tenha sido postulado que os Orexins afetam o comportamento ingestivo, a evidência do papel da Orexin A no comportamento alimentar e a ingestão de álcool e também a preferência pelo álcool são escassos. Em nosso estudo anterior, demonstramos que o Orexin A aumentou a ingestão de alimentos e líquidos em ratos em jejum.14] Para elucidar inequivocamente o papel da Orexina A na atividade ingestiva, realizamos este conjunto de experimentos em ratos Wistar machos que jejuaram durante a noite, infundindo o antagonista de Orexin A SB-334867 no NAcc.16Também testamos a preferência do álcool em ratos tratados para elucidar o efeito do antagonista da Orexin A no consumo de álcool. Os resultados dos experimentos sobre ingestão de alimentos, água e álcool e a preferência pelo álcool são discutidos aqui.
Materiais e Métodos
Cinqüenta e quatro ratos albinos Wistar machos (n = 54) pesagem (250 ± 10 g), 3-4 meses de idade foram selecionados para estudo. Eles foram divididos em três grupos viz. Grupo de água, grupo de álcool e dois grupo de escolha de garrafa (n = 18 cada). Eles foram subdivididos em três subgrupos, viz. Grupo 1 - Controle (infusão de solução salina); Grupo 2 - Baixa dose de SB-334867 (3 ng); Grupo 3 - Alta dose de SB-334867 (6 ng, n = 6 cada). Alimentos e líquidos foram fornecidos a todos os grupos ad lib, exceto quando mencionado para jejum durante a noite.
Todos os animais foram alojados individualmente em gaiolas de polipropileno, com cama de casca apropriada e mantidos em ciclo claro / escuro 12-h em ambiente com temperatura controlada. Os animais foram mantidos de acordo com as diretrizes do comitê para fins de controle e supervisão de experimentos em animais e diretrizes do governo da Índia para o uso de animais de laboratório. O Comitê Institucional de Ética em Animais aprovou este protocolo de estudo.
Drogas e Aparelhos
Solução salina 0.9%, SB-334867 (De: Tocris bioscience) foi dissolvida em 2% ciclodextrano em água estéril. Quando não estão em uso, as soluções foram armazenadas a 4 ° C até 3 semanas. A bomba de infusão Harvard Pico plus (EUA) foi utilizada para administrar o fármaco. Água da torneira foi fornecida em garrafas de plástico, e pellets de comida de rato (Hindustan Unilever Ltd.,) foram fornecidos. Álcool etílico (Absolute) foi adquirido (Hayman Ltd., Eastways Park, Witham, Essex, CM83YE, Reino Unido) e diluído para fazer um 10% de álcool (Esta concentração foi selecionada com base em um estudo piloto sobre a preferência de concentração de álcool) . Cetamina (NEON Laboratories Limited, Thane, MS) e xilazina (Indian immunological Ltd., Hyderabad) foram utilizados para anestesia.
Procedimento Cirúrgico
Ratos albinos Wistar machos foram anestesiados por injecção de uma mistura de cloridrato de cetamina (60 mg / kg), cloridrato de xilazina (6 mg / kg) e montados num aparelho estereotáxico (Inco, Índia). Uma incisão foi feita no couro cabeludo, completamente desinfetada com espírito cirúrgico. A área foi limpa com algodão e peróxido de hidrogênio. Pontos de coordenadas foram marcados no crânio em áreas correspondentes para alcançar NAcc, com a referência de atlas cerebral de Paxinos e Watson [17] (De Bregma: Anteroposterior + 2.2 mm, lateral ± 1 mm e vertical 7.4 mm). Burr orifício foi feito, e cânula guia de aço inoxidável (gaze 22) foi implantado de acordo com as coordenadas estereotáxicas. Uma vez que a cânula está no lugar, é protegida com a ajuda de parafusos e acrílico dental. A cânula guia foi equipada com estilete e os ratos foram deixados a recuperar durante pelo menos 7 dias antes da experimentação. A cânula de infusão (cânula interna) foi fabricada a partir da agulha odontológica de aço inoxidável Septoject dos medidores 30 que possui um hub, conveniente para o manuseio.18] A cânula de infusão estende 1 mm além da respectiva cânula guia. Antes do início dos experimentos, todos os ratos receberam duas sessões de treinamento nas quais eles foram mantidos em jejum 24, em seguida, receberam comida, água e 10% de álcool. Durante esta sessão, os ratos aprenderam o jejum.
Procedimento experimental
Solução salina normal e SB-334867 (em duas doses) foram infundidos, respectivamente, em grupos separados de ratos após 24 h em jejum; ratos não anestesiados (em movimento livre) através da cânula guia segura. A infusão foi realizada por 10 μl Hamilton seringa conectada com tubo de polietileno e cânula interna. Esta seringa foi montada na bomba de Harvard. Em seguida, o estilete colocado na cânula guia foi removido. A cânula interna foi inserida na cânula guia e fixada. Em seguida, a bomba foi iniciada para fornecer a solução para o lado direito e esquerdo do NAcc um após o outro, 1 μl / min (após a cânula interna de infusão deixada por cerca de 10 s para permitir a difusão do fármaco). Duas doses de SB-334867 foram infundidas em 3 ng (dose baixa) e 6 ng (dose alta). No final da infusão, a cânula interna foi removida e o estilete foi colocado de volta na posição e o tempo foi anotado. Pós-infusão, quantidade imediatamente fornecida de alimentos, água e 10% de álcool foram fornecidos nos respectivos grupos. O efeito do SB-334867 no consumo foi medido e observado, meticulosamente, nos intervalos de tempo de infusão 1, 2, 4 e 24 h, respectivamente. As sobras de pellets, água e álcool foram removidas e a quantidade consumida foi calculada (quantidade consumida = quantidade pré-medida - quantidade excedente, por exemplo, no final de 1 h).
Após a conclusão do estudo, os ratos foram sacrificados por dose letal de anestesia e o cérebro foi dissecado e preservado para processamento histológico. Cortes de sete mícrons foram cortados e corados com violeta de cresil para confirmar o local da infusão.Figura 1].
Análise Estatística
A análise dos dados foi feita por meio do software estatístico SPSS versão - 16 (SPSS for Windows, versão 16.0. Chicago, SPSS Inc. USA); ANOVA unilateral foi feita para comparar o comportamento consumatório entre os grupos. A comparação entre foi feita por post-hoc Teste de Tukey (consumo por hora comparado separadamente, por exemplo, ingestão de alimentos de controle de 1 h vs. ingestão de alimentos tratados com SB-1 por 334867 h). Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média P <0.05, foi considerado significativo.
Consistentes
Experiência I
O consumo de alimentos e água foi medido (n = 18) neste grupo, animais canulados NAcc (n = 18), foram divididos em subgrupos, Grupo 1 (infusão de solução salina 0.9%), Grupo 2 (SB-334867-3 ng), Grupo 3 (SB-334867-6 ng). As drogas foram injetadas bilateralmente no NAcc [dados mostraram tabela 1 e A figura Figura 1a, 1a, Bb].
Ingestão de alimentos
Em comparação com o controlo no 1 h após o tratamento com SB-334867 ter diminuído significativamente (F [2, 15] = 9.171 p = 0.003) na ingestão de alimentos (ou seja, Grupo 1 x Grupo 3, p <0.002); ao passo que nenhuma mudança significativa foi observada em 2 h (F [2, 15] = 0.190 p = 0.829); 4 h (F [2, 15] = 0.160 p = 0.854); 24 h intervalos de tempo pós-infusão (F [2, 15] = 4.873 p = 0.023) (Grupo 1 vs. Grupo 3, p <0.028; Grupo 2 vs. Grupo 3, p <0.05).
Entrada de água
O tratamento com SB-334867 não apresentou efeito sobre a ingestão de água em 1 h (F [2, 15] = 0.957 p = 0.406); 2 h (água 2 h F [2, 15] = 0.773 p = 0.479); 4 h (F [2, 15] = 0.288 p = 0.753) intervalos de tempo pós-infusão; mas a ingestão total de água 24 h foi diminuída (F [2, 15] = 10.688 p = 0.001) comparado ao controle (Grupo 1 vs. Grupo 3, p <0.002; Grupo 2 vs. Grupo 3, p <0.006).
Experiência II
Álcool (10%) e consumo de alimentos foram medidos [n = 18, dados em tabela 2 e Figura 2].
Ratos canulados NAcc foram divididos em três subgrupos, Grupo 1 (0.9% salina n = 6), Grupo 2 (SB-334867-3 ng, n = 6) e Grupo 3 (SB-334867-6 ng, n = 6).
Resultados da ingestão de álcool 10%
No tratamento com 1 he 2 h SB-334867 atenuou significativamente o consumo de álcool em 1st h (F [2, 15] = 4.457 p = 0.030), (Grupo 1 vs. Grupo 3, p <0.004), 2nd h (F [2, 15] = 11.122 p = 0.001) (Grupo 1 vs. Grupo 3, p <0.001; Grupo 2 vs. Grupo 3, p <0.038). No entanto, não houve mudança significativa no consumo de álcool em 4 h (F [2, 15] = 0.709 p = 0.508) e 24 h (F [2, 15] = 2.631 p = 0.105), respectivamente.
Ingestão de alimentos
No tratamento com 1 he 2 h SB-334867 significativamente (F [2, 15] = 4.230 p = 0.035) ingestão alimentar atenuada (Grupo 1 vs. Grupo 3, p <0.03); (F [2] = 15 p = 0.000) (Grupo 1 vs. Grupo 2, p <0.000; Grupo 2 vs. Grupo 3, p <0.021), respectivamente, em comparação com o controle. Nenhuma mudança significativa foi observada em 4 h (F [2, 15] = 0.070 p = 0.933). Considerando que a ingestão total de alimentos foi diminuída (0-24 h) (F [2, 15] = 4.457 p = 0.030) (Grupo 1 vs. Grupo 3, p <0.025).
Experiência III
Alimentos, 10% de álcool e água [preferência de duas garrafas, tabela 2] consumo foram medidos. Ratas canuladas NAcc foram sub-agrupadas como Grupo 1 (0.9% salina, n = 6), Grupo 2 (SB-334867-3 ng, n = 6) e Grupo 3 (SB-334867-6 ng, n = 6), foram injetados.
Ingestão de alimentos
Tratamento SB-334867 em 1 h (F [2, 15] = 5.111, p = 0.02) ingestão alimentar atenuada (Grupo 1 vs. Grupo 3, p <0.011), mas nenhuma diferença significativa foi observada em 2 h, 4 h (F [2, 15] = 0.093 p = 0.911), (F [2, 15] = 0.797 p = 0.469), respectivamente, e no 24 h ambas as doses de antagonista mostraram diminuição na ingestão de alimentos (F [2, 15] = 12.698 p = 0.001) (Grupo 1 vs. Grupo 2 e Grupo 3, p <0.039, p <0.000, respectivamente), em comparação com o grupo controle.
Entrada de água
O tratamento SB-334867 não produziu alterações no consumo de água em nenhum grupo com intervalo de tempo de 1 h (F [2, 15] = 0.584 p = 0.578), 2 h (F [2, 15] = 0.662 p = 0.530), 4 h (F [2, 15] = 1.655 P = 0.224) e 24 h (F [2, 15] = 0.513 p = 0.609).
Consumo de álcool (10%)
O tratamento com SB-334867 atenuou a ingestão de álcool em 1 h (F [2, 15] = 9.098 p = 0.003), (Grupo 1 vs. Grupo 2 e Grupo 3, p <0.004 p <0.008, respectivamente). Nenhuma mudança de significância em qualquer grupo em 2 h (F [2, 15] = 0.854 p = 0.446), 4 h (F [2, 15] = 0.931 p = 0.416) e 24 h (F [2, 15] = 0.349 p = 0.711), respectivamente.
Ingestão total de líquidos
Nenhuma mudança significativa em nenhum dos grupos, na 1st h (F [2, 15] = 2.064 p = 0.161), 2nd h (F [2, 15] = 1.023 p = 0.383), 4th h (F [2, 15] = 1.205 p = 0.327) e 24 h (F [2, 15] = 0.484, p = 0.626).
Discussão
A modulação da ingestão de alimentos e água por vários neurotransmissores tem sido investigada. Entre várias moléculas candidatas que demonstraram afetar o comportamento alimentar, incluindo a ingestão de álcool, as Orexins também estão implicadas.19] Orexins foram originalmente acreditados para ser estimulantes da ingestão de alimentos e regulação da atividade ingestiva; mais tarde eles foram encontrados para afetar os estados de sono e vigília.20] Dube et al. demonstraram que a administração central de orexinas tem papel modulatório no comportamento ingestivo, principalmente centrado no hipotálamo. [21] Em nossa experiência atual, testamos o efeito do antagonista da Orexin A (SB-334867) no NAcc. A NAcc foi atribuída um papel fundamental na dependência e nas atividades relacionadas à alimentação.22] Orexins também foram implicados na mediação desta ação do NAcc.4] No entanto, NAcc mostrou dois distritos histologicamente distintos, [23] que pode ter diferenças funcionais [24] e suas funções pareciam se sobrepor significativamente.25Em nossos experimentos anteriores, descobrimos que a infusão de Orexin A no NAcc usando técnica de microinjeção aumentava a ingestão de alimentos e água nas horas imediatamente após a infusão, mas não havia preferência particular pelo álcool quando testado por duas opções livres de mamadeira.14Portanto, tentamos injetar o antagonista de Orexin A no NAcc e analisamos a ingestão de alimentos, a ingestão de água e a ingestão de álcool em ratos, que foram submetidos a jejum durante a noite.
O consumo em 1st h declinou significativamente em animais tratados com antagonista da orexina. Nosso estudo comprova ainda mais o papel da Orexin A no comportamento alimentar. A infusà £ o do antagonista SB-1 do receptor do tipo Orexin tipo 1 (OX334867R) atenua a alimentaçà £ oe a bebida. Orexin A mostrou consistentemente o efeito estimulatório na alimentação e bebida. O antagonista OX1R tem 10 vezes maior afinidade para Orexin A do que B. [26,27]
Os neurônios orexinérgicos projetam-se para o AccSh e ambos os receptores da orexina (OX1R e OX2R) estão presentes no NAcc, com OX2R expresso em maior extensão.28,29] Orexin A aumentou as correntes GABAérgicas e diminuiu as correntes N-metil-D-aspartato em neurônios isolados de accumbens. [30Além disso, as orexinas estimulam os neurônios dopaminérgicos da VTA.31Uma vez que os neurônios dopaminérgicos da VTA inervam e excitam os neurônios Accabs GABAérgicos (inibitórios), a sinalização da orexina poderia aumentar ainda mais a inibição local no Acc pelo aumento da atividade neuronal na VTA, resultando em maior realce do comportamento consumatório. Mas isso foi contradito por Baldo e Kelley, [32] que não encontraram efeito na alimentação ou atividade locomotora com intra-AccSh Orexin A.
Testamos a possibilidade de Orexin A agir como um modulador do consumo de álcool [tabela 2] junto com comida. Do nosso estudo anterior, estabelecemos que os ratos preferiam consumir álcool a 10% solução que foi confirmada em nosso próprio estudo anterior.33Portanto, neste estudo, fornecemos álcool nesta diluição após a infusão de droga no NAcc. Encontramos uma diminuição significativa no consumo de álcool nas horas imediatamente após a infusão do antagonista de Orexin A. O declínio na ingestão de alimentos e água foi menor no grupo de infusão de dose baixa (3 ng), enquanto foi maior no grupo de dose alta (6 ng). A fim de testar a preferência do álcool, fornecemos aos ratos duas condições de escolha do frasco, em que uma garrafa de água e outra contendo 10% de álcool foram fornecidas simultaneamente. Após a infusão do antagonista da Orexina A produziu um declínio significativo na ingestão de alimentos e ingestão de álcool. Este tipo de declínio foi encontrado tanto em doses baixas quanto altas, mas restritas a 1st h após a infusão. No entanto, o declínio na ingestão de alimentos foi mais acentuado em comparação com a água ou álcool. Esta evidência dá suporte para o envolvimento do Orexin A na regulação da ingestão de alimentos, mas não suporta a possibilidade do envolvimento de Orexin A na preferência pelo álcool.
Suporte Financeiro e Patrocínio
Departamento de Biotecnologia, Parte do projeto financiado pelo DBT, Ref: Ref: BT / PR14012 / MED / 30 / 315 / 2010 datado de 30.09.2010 Government of India.
Conflitos de Interesse
Não há conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia, pelo apoio financeiro. Kasturba Medical College, Mangalore, Universidade Manipal, pelas instalações oferecidas.
Referências