A hipocretina (orexina) facilita a recompensa atenuando os efeitos antirreversão de sua dinorfirona de co-transmissor na área tegmentar ventral (2014)

John W. Muschamp,^a,1 Jonathan A. Hollander,^b Jennifer L. Thompson,^c George Voren,^b Linda C. Hassinger,^a Sara Onvani,^a Theodore M. Kamenecka,^b Stephanie L. Borgland,^c Paul J. Kenny,^b e William A. Carlezon Jr.^a

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A hipocretina (orexina) e a dinorfina são neuromoduladores que desempenham um papel importante na regulação do afeto e da motivação. Orexin é crítico para a recompensa e está implicado na busca de drogas, enquanto a dinorfina medeia o humor negativo e está implicada em estados semelhantes à depressão. Considerando esses efeitos opostos, relatos de que ambos os peptídeos são expressos nos mesmos neurônios e estão correlacionados são contraintuitivos. Aqui, demonstramos que a orexina e a dinorfina estão co-expressas dentro das mesmas vesículas sinápticas e que essa co-localização tem uma profunda influência na recompensa, no uso de drogas e no comportamento impulsivo. O fato de que a orexina bloqueia os efeitos antirretrovirais da dinorfina de forma depressiva muda significativamente a forma como vemos o papel funcional da orexina no cérebro.

A hipocretina (orexina) e a dinorfina são neuropeptídeos com ações opostas no comportamento motivado. Orexin está implicado em estados de excitação e recompensa, enquanto que a dinorfina está implicada em estados depressivos. Mostramos que, apesar de suas ações opostas, esses peptídeos são empacotados nas mesmas vesículas sinápticas dentro do hipotálamo. O rompimento da função da orexina atenua os efeitos recompensadores da estimulação do hipotálamo lateral (LH), elimina a impulsividade induzida pela cocaína e reduz a autoadministração da cocaína. A interrupção concomitante da função da dinorfina reverte essas mudanças comportamentais. Também mostramos que orexina e dinorfina têm ações opostas na excitabilidade dos neurônios de dopamina da área tegmentar ventral (VTA), um alvo proeminente de neurônios contendo orexina, e que o antagonismo intra-VTA orexina causa diminuição na auto-administração de cocaína e autoestimulação de LH que são revertidos pelo antagonismo da dinorfina. Nossas descobertas identificam um processo celular único pelo qual a orexina pode obstruir os efeitos de elevação do limiar de recompensa da dinorfina depurada e, assim, agir de forma permissiva para facilitar a recompensa.

Orexin e dinorfina são co-transmissores.

Nós confirmamos a coexpressão de orexina e dinorfina dentro dos mesmos neurônios do hipotálamo lateral, perifornical e dorsomedial do mouse usando microscopia de fluorescência (18) (FIG. 1A). A existência de neurônios que expressam múltiplos transmissores foi descrita em outros circuitos cerebrais e pode representar a base neural para mecanismos de filtragem pelos quais a liberação de neurotransmissores co-expressos ocorre a taxas de disparo diferenciais (19). Usando o EM, descobrimos, no entanto, que a orexina e a dinorfina estão colocalizadas dentro das mesmas vesículas sinápticas. A maioria dos casos de copackage foram observados em processos axiais varicosos não mielinizados, onde a imunomarcação foi encontrada em ou próximo a vesículas. Dentro dos corpos celulares neuronais, a marcação significante foi associada com o complexo de Golgi, enquanto nenhum foi encontrado em núcleos adjacentes (FIG. 1 B e C). Os dendritos também continham rotulagem associada a vesículas para ambos os peptídeos, sugerindo potencial liberação dendrítica desses transmissores. Um pequeno número de perfis microestruturais capturou terminais axônicos com marcação para ambos os peptídeos localizados em grandes vesículas (∼100 nm) localizadas fora da zona de liberação de sinapses assimétricas (FIG. 1 B e C), apoiando a conclusão de que a orexina e a dinorfina funcionam como co-transmissores e que, em condições normais, são liberadas em conjunto e não diferencialmente em função da freqüência de queima das células.

 

FIG. 1.

Orexin e dinorfina são co-transmissores nos neurônios do hipotálamo. (A, extrema esquerda) A fotomicrografia de campo claro mostra a área do hipotálamo examinada quanto à imunorreatividade da orexina (vermelho) e dinorfina (verde). (A, Extrema Direita) Imagem de dois canais mesclada ...

Os efeitos de elevação do limiar de recompensa do bloqueio da orexina são revertidos pelo bloqueio da dinorfina.

Para explorar o significado funcional desse padrão único de expressão do transmissor, examinamos se as rupturas na sinalização da orexina e da dinorfina podem afetar comportamentos complexos que refletem a motivação normal e aberrante. Em camundongos C57BL / 6 treinados para realizar a autoestimulação intracraniana (ICSS) reforçada com estimulação hipotalâmica lateral (LH) (20), bloqueio de OX₁Rs por N- (2-metil-6-benzoxazolil) -N-1,5-naftiridina-4-il-ureia (SB334867) durante a fase leve causaram aumentos dependentes da dose nos limiares de recompensa (FIG. 2A; medidas repetidas de uma via ANOVA para Dose: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Aumentos nos limiares de ICSS refletem reduções induzidas por tratamento no impacto de recompensa da estimulação, um sinal de tipo depressivo indicativo de sensibilidade diminuída à recompensa (20). Este efeito não foi devido à sedação ou outras deficiências comportamentais inespecíficas, porque as taxas de resposta da ICSS não foram afetadas (FIG. 2B; medidas repetidas de uma via ANOVA para Dose: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

FIG. 2.

Os efeitos de elevação do limiar de recompensa do bloqueio da orexina são revertidos pelo bloqueio da dinorfina. (A) Bloqueio da sinalização da orexina no OX₁R por SB334867 (0-30 mg / kg, ip) eleva os limites de recompensa no teste ICSS, indicando uma recompensa menor. Este efeito ...

As elevações nos limiares de recompensa causadas pelo SB334867 foram prevenidas pelo pré-tratamento com nor-binaltorimina (norBNI) [ANOVA de duas vias para medidas repetidas para a interacção fármaco (entre factores) × Dose SB (dentro do factor dos indivíduos): F_3,24 = 3.98, P <0.01], que produz bloqueio de longa duração das ações da dinorfina em KORs (10). Estes dados sugerem que a perda da sinalização da orexina revela efeitos adversos latentes da dinorfina. A administração de norBNI sozinho não diminuiu os limiares de recompensa. Embora este efeito possa estar relacionado com a farmacodinâmica única da norBNI e de outros antagonistas KOR prototípicos (10), pode também indicar que há redundância em processos que modulam a atividade dos circuitos de recompensa do cérebro ou que os aumentos fásicos no tom da orexina isoladamente (sem oposição da dinorfina) são insuficientes para transmitir um sinal de recompensa do local de estimulação no hipotálamo lateral. Esses achados podem parecer inicialmente inconsistentes com o trabalho de outros que examinaram o SB334867 no limiar de ICSS durante a fase escura (21). No entanto, existem evidências consideráveis ​​de que a diminuição da função da orexina pode ter consequências que dependem de os animais serem testados durante a fase de luz ou escuridão. Por exemplo, alimentos e água retêm seus efeitos recompensadores em camundongos orexina KO quando o teste é realizado durante a fase escura, mas não durante a fase de luz (22), a hora em que realizamos todos os nossos testes comportamentais.

Para localizar os efeitos da administração sistêmica de SB334867 e norBNI na ICSS, uma coorte separada de camundongos foi implantada com eletrodos de estimulação de LH e cânulas de guia de VTA. Microinfusão de SB334867 em VTA causou aumento acentuado nos limiares de recompensa, indicando diminuição da sensibilidade à recompensa. Embora intra-VTA norBNI sozinho não tenha efeito nos limiares de ICSS, bloqueou os efeitos de elevação dos limiares da infusão subsequente de SB334867 (FIG. 2C; ANOVA de medidas repetidas unidirecionais para medicamentos: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Embora as infusões de drogas intracranianas tendam a produzir reduções modestas nas taxas máximas de resposta em comparação com as injeções de drogas sistêmicas, esses efeitos não alcançaram significância estatística (FIG. 2D; ANOVA de medidas repetidas unidirecionais para medicamentos: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Impulsividade Regulada pela Transmissão de Orexin e Dinorfina.

A impulsividade é caracterizada por déficits na supressão de comportamentos de busca de recompensa, com altos níveis de impulsividade sendo uma característica comum de muitas doenças psiquiátricas (23). Drogas de abuso, incluindo cocaína, também podem desencadear aumentos na impulsividade, que é a hipótese de impulsionar o desenvolvimento do vício (24). Considerando o papel fundamental da orexina e dinorfina dispendiosas no controle da sensibilidade ao efeito recompensador da estimulação do LH no teste ICSS, supomos que as interações entre esses dois neuropeptídeos podem influenciar a impulsividade basal e os déficits induzidos pela cocaína nesse comportamento. A impulsividade pode ser quantificada em roedores através da medição de respostas prematuras na tarefa de tempo de reação em série com escolha 5 (5-CSRTT) (25), um modelo animal análogo ao teste de desempenho contínuo usado para estudar a atenção em humanos. A resposta prematura neste teste tende a ser baixa em condições normais e é exacerbada por drogas que elevam a transmissão de DA (26). Usamos o 5-CSRTT para examinar a contribuição do sistema orexina-dinorfina para o comportamento impulsivo espontâneo e induzido por cocaína. Quando administrado isoladamente, SB334867 reduziu ainda mais o número já baixo de respostas prematuras espontâneas (FIG. 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Essas reduções ocorreram na ausência de efeitos na precisão da resposta (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), latência de recuperação de pellets (F_3,21 = 0.91, P = 0.44), ou o número de ensaios de estímulo concluídos (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), indicando que não foram devidos a vigilância ou capacidades motoras degradadas. A administração de norBNI, no entanto, reverteu os efeitos de SB334867 na resposta prematura (FIG. 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), sugerindo que a transmissão de dinorfina sem oposição é crítica na mediação desses efeitos antiimpulsivos. Dado isoladamente ou em combinação com o SB334867, nem oBNI não produziu efeitos sobre as medidas de precisão da resposta (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), latência (F_3,18 = 3.09, P > 0.06), ou o número de tentativas de estímulo concluídas (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). O pré-tratamento com SB334867 também evitou o aumento de duas vezes na resposta prematura induzida pela cocaína (FIG. 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Esses dados fornecem evidências de que a neurotransmissão da orexina pode regular o comportamento impulsivo em condições basais e estimuladas por cocaína de uma maneira sensível à dinorfina.

 

FIG. 3.

Comportamento de impulsividade regulado pelo equilíbrio de orexina e dinorfina. (A) SB334867 atenua respostas prematuras no modelo de impulsividade motora em ratos 5-CSRTT. Medidas de precisão, latência para recuperar o pellet de alimentos e número de tentativas omitidas foram ...

A dinorfina medeia a autoadministração de cocaína reduzida no OX₁R-ratos nulos.

A vulnerabilidade à dependência está acentuadamente aumentada em indivíduos impulsivos, e supõe-se que aumentos na impulsividade induzidos pela cocaína contribuam para o surgimento da dependência (23, 27). Além disso, a transmissão da orexina e a transmissão da dinorfina foram implicadas de forma independente na regulação dos efeitos recompensadores da cocaína e outras drogas de abuso (28-32). Nós hipotetizamos que as interações entre a orexina e a transmissão da dinorfina podem controlar diretamente o consumo de drogas. Para explorar essa possibilidade, examinamos a auto-administração de cocaína iv em camundongos geneticamente modificados sem OX₁Rs (OX₁R^{- / -}). Camundongos deste genótipo exibem autoadministração de cocaína significativamente mais baixa em uma ampla gama de doses (0.1-1 mg / kg por infusão), mas demonstram resposta inalterada para recompensas alimentares sob os mesmos esquemas de reforço (33), sugerindo que as reduções na ingestão de cocaína não são secundárias aos déficits no desempenho comportamental. Além disso, o OX₁R^{- / -} camundongos mostram taxas normais de autoadministração de cocaína durante as aproximadamente três sessões iniciais de acesso à cocaína, mas depois mostram rapidamente diminuições na ingestão de cocaína (33). Confirmamos este fenótipo a uma dose de 0.3 mg / kg por infusão, indicando que a sinalização via OX₁Rs desempenha um papel crítico no estabelecimento e manutenção do comportamento de autoadministração de cocaína [FIG. 4; medidas repetidas de duas vias ANOVA, genótipo (entre o fator sujeito) × tratamento medicamentoso (dentro do fator sujeito): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Assim como o pré-tratamento com norBNI restaurou a ICSS normal e o comportamento do tipo impulsivo em camundongos que receberam SB334867, também restaurou parcialmente a autoadministração de cocaína em OX₁R^{- / -} camundongos, fornecendo um exemplo único em que um déficit comportamental produzido pela ablação genética na função de um sistema de neurotransmissor é resgatado pelo bloqueio de outro. Esses achados sugerem que, no OX₁R^{- / -} camundongos, as ações não-opostas da dinorfina atenuam as propriedades recompensadoras da cocaína e, assim, diminuem a autoadministração da droga. Curiosamente, em OX₁R^{+ / +} (controlo), o norBNI reduziu inesperadamente a auto-administração de cocaína. Uma possível explicação para esse efeito é que a dinorfina liberada pelos neurônios da nonorexina, como os chamados neurônios espinhosos médios “diretos” do estriatonigral, tem os efeitos opostos na ingestão de cocaína e pode realmente facilitar os efeitos recompensadores da cocaína. A existência de duas populações de KORs com papéis opostos na recompensa de cocaína também explicaria por que nem oBNI reverteu apenas parcialmente os déficits no comportamento de consumo de cocaína detectados no OX.₁R KO ratos. Alternativamente, o antagonismo de KOR reduz os efeitos aversivos ou estressantes da abstinência de cocaína (34), que contribuem para os padrões de consumo de drogas (17). Independentemente disso, esses dados sugerem que os efeitos depressivos da dinorfina prevalecem na ausência de sinalização da orexina intacta, produzindo reduções nos efeitos recompensadores da cocaína, enquanto os efeitos da orexina facilitam os efeitos recompensadores da cocaína, estendendo sua duração na ausência de sinalização de dinorfina.

 

FIG. 4.

Redução da auto-administração de cocaína no OX₁Os ratos R KO são restaurados pelo bloqueio KOR. Imparidade da sinalização da orexina no OX₁R por deleção genética deste receptor reduz a auto-administração intravenosa de cocaína (0.3 mg / kg por infusão). Esse déficit é parcialmente ...

Orexin e dinorfina podem exercer efeitos opostos equilibrados na excitabilidade dos neurônios VTA DA.

As estruturas cerebrais que recebem informações dos neurônios hipotalâmicos da orexina e da dinorfina estão potencialmente expostas a ambos os peptídeos e, portanto, sujeitas a seus efeitos opostos na excitabilidade neuronal (35, 36). A extensão em que os efeitos de um peptídeo prevalecem sobre os do outro provavelmente depende de numerosos fatores, incluindo a abundância relativa de cada peptídeo, longevidade no espaço extracelular e expressão do receptor em diferentes populações de neurônios-alvo, bem como interações entre os receptores e seus mecanismos de sinalização intracelular em células pós-sinápticas. A impulsividade e a recompensa da cocaína são reguladas, pelo menos em parte, pelos neurónios DA na VTA (26), um alvo proeminente de células contendo orexina hipotalâmica (37). Além disso, a infusão de orexina na VTA aumenta a procura de drogas (6). Para avaliar as contribuições relativas de cada peptídeo sobre a atividade dos neurônios VTA, fizemos registros eletrofisiológicos de células DA em fatias de cérebro de camundongos C57BL / 6 expostos a orexina e dinorfina aplicados isoladamente ou em conjunto. Como esperado, quando aplicado separadamente, a orexina era uniformemente excitatória, enquanto a dinorfina produzia apenas efeitos inibitórios (FIG. 5 A e B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). Na população de neurônios DA registrados, a maioria respondeu às concentrações saturantes de ambos os peptídeos, embora uma pequena minoria respondesse seletivamente apenas à orexina ou à dinorfina (FIG. 5B). Notavelmente, quando ambos os peptídeos foram aplicados aos neurônios de dupla resposta (n = 10), não houve efeito líquido na taxa deFIG. 5A), sugerindo que os efeitos opostos de cada peptídeo em concentrações de saturação efetivamente cancelam um ao outro após a liberação conjunta. Quatro dos 10 neurônios mostraram inibição preferencial pela dinorfina, apesar da presença de orexina, enquanto uma célula foi preferencialmente excitada (alteração> 1.5 vezes) pela orexina, apesar da presença de dinorfina (FIG. 5 A e C). No geral, embora mais células tenham respondido à orexina do que à dinorfina, as células que responderam a ambos os peptídeos não tiveram nenhuma alteração na taxa de disparo quando orexina e dinorfina foram co-aplicadas, sugerindo que as influências opostas de cada peptídeo foram balanceadas dentro do conjunto de VTA DA neurônios estudados.

 

FIG. 5.

Orexin e dinorfina exercem efeitos equilibrados, mas opostos, nos neurônios VTA DA. (A, esquerda) A orexina e dinorfina co-aplicadas resultam em nenhuma alteração na taxa de disparo dos neurônios VTA DA (n = 10). Aplicada isoladamente, a dinorfina foi inibitória e a orexina foi excitatória. ...

Para elucidar ainda mais as interações potenciais orexina – dinorfina dentro dos neurônios VTA DA que eram sensíveis a orexina e dinorfina, tentamos, alternativamente, aumentar os efeitos inibitórios da dinorfina aplicada ao banho por tratamento com SB334867 (Fig. S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) ou para aumentar os efeitos excitatórios da orexina aplicada no banho por tratamento com norBNI (Fig. S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). Em ambos os experimentos, OX₁O bloqueio de R e KOR não produziu esses efeitos, sugerindo que o SB334867 e o norBNI não estão exercendo efeitos por meio de ações não específicas. Mais importante, estes dados sugerem que o tom de cada péptido in vitro é insuficiente para ser influenciado pela aplicação de antagonistas de moléculas pequenas como SB334867 e norBNI. Este achado é consistente com trabalhos anteriores que indicam que a exocitose de grandes vesículas contendo péptidos ocorre tipicamente apenas em altas frequências de queima sustentadas que normalmente não estão presentes nas preparações das fatias (38).

Verificar que norBNI não influenciou o comportamento através de ações “off-target” diretamente no OX₁Rs, em seguida, examinamos os efeitos desse antagonista no OX₁Sinalização R. Especificamente, foi utilizado um teste de leitor de placas de imageamento fluorométrico (FLIPR) para determinar a capacidade de orexina A, SB334867 ou norBNI aplicada ao banho induzir transientes de cálcio intracelular em células CHO cultivadas expressando OX humano₁Rs. Embora a orexina A produzisse o esperado aumento do cálcio intracelular (CE₅₀ = 0.01 μM) e SB334867 atenuou este efeito de forma dependente da dose (EC₅₀ = 0.035 μM), a norBNI não produziu quaisquer efeitos sobre os aumentos evocados no cálcio intracelular na linha de base ou na orexina A. Isto sugere que os efeitos da norBNI na fisiologia neuronal da VTA DA são exclusivamente via mecanismos de sinalização KOR propostos e a droga não tem efeito direto na OX₁R (39) (Fig. S3 A-C).

Interações Orexin – dinorfina na VTA regulam a auto-administração da cocaína.

Nossos estudos de eletrofisiologia demonstram que as interações dinâmicas entre a orexina e a dinorfina regulam a atividade da ATVD e que os neurônios da ATV provavelmente servem como um substrato chave para os efeitos do sistema orexina-dinorfina em comportamentos motivados. Para testar essa hipótese diretamente, examinamos os efeitos da infusão intra-VTA de SB334867 na auto-administração de cocaína iv em ratos. Comparado com a infusão de veículo intra-VTA, intra-VTA SB334867 causou uma redução marcada da ingestão de cocaína que foi bloqueada por norBNI (FIG. 6; ANOVA unidirecional: F_3,24 = 11.56, P <0.01), sugerindo que as ações da dinorfina sem oposição dentro desta área do cérebro atenuam a recompensa da cocaína. Esses resultados parecem estar em desacordo com aqueles que demonstraram a ausência de intra-VTA SB334867 na autoadministração de cocaína em esquemas de reforço de proporção fixa 1 (FR1) de baixo esforço (40). No entanto, vários relatos mostraram que, à medida que a demanda de tarefas aumenta, o SB334867 é mais efetivo na redução do consumo de drogas (2, 33). Como os ratos neste experimento estavam realizando um cronograma FR5 de esforço mais elevado, os presentes achados são consistentes com essa literatura. Esses dados fornecem evidências diretas de que a natureza oposta da orexina e dinorfina na fisiologia neuronal VTA DA pode exercer efeitos significativos sobre comportamentos conduzidos por recompensa.

 

FIG. 6.

Interacções orrexina-dinorfina na VTA mediam a toma de fármacos. A autoadministração de cocaína é reduzida por intra-VTA SB334867 (3 μg por lado), enquanto este efeito é revertido pelo pré-tratamento com norBNI (10 mg / kg, ip) (n = 9). ***P < ...

Animais

Os ratinhos C57BL / 6J machos adultos (8 semanas de idade; Jackson Laboratory) utilizados em expericias EM foram alojados em grupo (tr a cinco por gaiola); aqueles utilizados para ICSS foram alojados individualmente após a cirurgia. Ratos Sprague-Dawley machos adultos (350 g) (Charles River Laboratories) foram utilizados nos experimentos 5-CSRTT e auto-administração de cocaína e foram alojados em grupos de quatro. Os ratinhos C57BL / 6J machos adultos (dias pós-natais 19-21) utilizados para as experiências de electrofisiologia foram alojados em grupo (três a cinco por gaiola). OX1^{- / -} ratos e seu OX1^{+ / +} Os irmãos de ninhada (6 wk de idade) utilizados para os estudos de auto-administração foram obtidos no Jackson Laboratory e foram cruzados com mais de sete gerações em camundongos C57BL / 6. Estes ratos foram alojados em grupo (dois por gaiola). Todos os animais foram alojados em condições de temperatura controlada num ciclo claro / escuro 12-h, e ocorreram testes comportamentais 4-5 h no ciclo da luz; comida e água estavam disponíveis ad libitum salvo indicação em contrário. Os procedimentos foram conduzidos de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (50) e foram aprovados pelos Institutional Animal Care e Use Comités do McLean Hospital, da University of British Columbia e da Scripps Florida.

Imuno-histoquímica e Microscopia.

A fluorescência e a imunomarcação de ouro reforçada com prata para orexina A ou prodinorfina foram realizadas em secções de cérebro de ratinho alternadas de acordo com os procedimentos anteriormente relatados (51) e processados ​​seguindo protocolos EM padrão. As regiões não sobrepostas do tecido com imunocoloração foram então selecionadas aleatoriamente e fotografadas para quantificação de partículas usando o software ImageJ (National Institutes of Health) (SI Materiais e Métodos, Imuno-Histoquímica e Microscopia).

Eletrofisiologia.

As pipetas (3 – 5 MΩ) foram preenchidas com gluconato de potássio 143 mM, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (com um pH de 7.2) e 270 – 280 mM mOsmol. Os dados foram adquiridos a 20 kHz e filtrados a 2 kHz usando o software pClamp 10.0 (Molecular Devices). Depois de adquirir uma configuração de célula inteira, as células foram fixadas em voltagem em −70 mV e uma série de voltagens (250 ms, de −60 a −130 mV em passos 10-mV) foi aplicada para detectar hiperpolarização (I_h) correntes. I_h foi determinado como a mudança de corrente entre ∼30 ms e 248 ms após a aplicação da tensão. A atividade intrínseca dos neurônios VTA DA foi medida no modo clamp atual. Os experimentos começaram quando uma taxa de disparo de linha de base estável foi alcançada; Os substratos foram então aplicados por 5 min e subsequentemente lavados com líquido cefalorraquidiano artificial. Os últimos 3 min de cada segmento 5-min foram usados ​​para análise de dados. A dinorfina A (1-17; 200 nM) e a orexina A (100 nM) foram obtidas da American Peptide e dissolvidas em água destilada. Estas concentrações foram anteriormente encontradas para exercer efeitos de saturação na atividade das células VTA (5, 52). Thiorphan (1 μM) e bestatina (10 μM) foram obtidos da Sigma-Aldrich, dissolvidos em água destilada e aplicados em conjunto com a dinorfina A (SI Materiais e Métodos, Eletrofisiologia).

Ensaio FLIPR.

OX₁A actividade de R foi avaliada medindo os níveis de cálcio intracelular através do ensaio FLIPR como descrito anteriormente (53) (Materiais e Métodos SI, Ensaio do Leitor de Placas de Imagem Fluorimétrica).

ICSS.

Os ratinhos foram implantados com eléctrodos ou cânulas de estimulação monopolares (PlasticsOne) sob cetamina / xilazina (80 e 10 mg / kg, respectivamente, ip; Sigma) dirigidos estereotaxicamente ao LH (18) e / ou ATV contralateral [de bregma: anteroposterior (AP), −3.2 mm; mediolateral (ML), −0.5 mm; dorsoventral (DV), −4.7 mm da dura]. Após um período de recuperação de 7-d, os ratos foram treinados para responder à estimulação cerebral como descrito anteriormente (18). A frequência mais baixa que suportou a resposta (limiar) foi calculada usando a análise de melhor ajuste de mínimos quadrados. Quando os camundongos preenchiam os critérios de estabilidade para os limiares de ICSS (± 10% ao longo de 5 dias consecutivos), os efeitos dos tratamentos com medicamentos foram medidos. O veículo SB334867 (Scripps Florida) ou DMSO foi administrado em dias alternados utilizando uma seringa Hamilton (0.1 mL / kg ip) e os limiares foram imediatamente quantificados em sessões de teste 15-min. O norBNI (10 mg / kg ip; Sigma) foi administrado em soro fisiológico (10 mL / kg) 48 h antes do início do teste ICSS.

O 5-CSRTT.

Os ratos tinham restrição alimentar (até 85% do peso de alimentação livre) e eram treinados em câmaras operantes controladas por computador alojadas em gabinetes ventilados e atenuadores de som (Med Associates), e os procedimentos 5-CSRTT foram realizados conforme descrito (25). SB334867 (em DMSO, 0.1 mL / kg) e / ou cocaína (em soro fisiológico, 1 mL / kg; Sigma) foi administrado por injecção ip 10 min antes do teste, como noutras experiências, e norBNI foi administrado pelo menos 48 h antes do início dos testes (Materiais e Métodos da SI, The 5-Tarefa de tempo de reação de escolha de série).

Autoadministração de cocaína IV.

Ratos e camundongos foram anestesiados com uma mistura de vapor de oxigénio isoflurano (1-3% vol / vol) e preparados cirurgicamente com cateteres Silastic (VWR Scientific) na veia jugular de acordo com procedimentos estabelecidos (54) Imediatamente após o implante do cateter nos ratos, cânulas-guia bilaterais de aço inoxidável (calibre 23, 17 mm de comprimento) foram implantadas no VTA (do bregma: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, -7.5 mm da dura ) O teste com SB334867 ou norBNI durante sessões diárias de 60 minutos foi realizado após a ingestão estável de cocaína (variação <20% na resposta por 3 dias consecutivos; Materiais e Métodos do SI, Autoadministração da Cocaína IV).

Estatísticas.

Os dados são expressos como média ± SEM. Para expericias ICSS, foram utilizadas medies repetidas de duas vias ANOVA para comparar as mias entre as condies tratadas com SB334867 e norBNI + SB334867. Medidas repetidas de uma via ANOVA com testes post hoc de Newman-Keuls foram usadas para comparar as médias dentro das condições SB334867 e norBNI + SB334867. Testes repetidos one-way ANOVA e Newman-Keuls também foram usados ​​para comparar médias em todos os experimentos 5CSRTT. Medidas repetidas de duas vias ANOVA foram usadas para comparar médias entre grupos de tratamento em experimentos de auto-administração de cocaína com OX₁R KO ratos. Testes ANOVA de medidas repetidas unidirecionais e Newman-Keuls foram usados ​​para comparar as respostas médias à orexina e à dinorfina pelos neurônios VTA DA. As medidas repetidas de um fator ANOVA e Newman-Keuls também foram usadas para comparar as médias de consumo de cocaína em ratos tratados com SB334867 e norBNI. As diferenças foram consideradas significativas se P <0.05.

Agradecemos ao Dr. Garrett Fitzmaurice pelos comentários úteis sobre o manuscrito e Miranda S. Gallo e Melissa Chen pela assistência na coleta de dados. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants F32-DA026250 e K99-DA031767 (para JWM), F32-DA024932 e K99-DA031222 (para JAH), R01-DA023915 (para. PJK) e R01-MH063266 (para WAC ) e por uma bolsa de descoberta do Natural Sciences and Engineering Research Council (ao SLB).

Declaração de conflito de interesses: WAC detém uma patente (US Patent 6,528,518; Cessionário: McLean Hospital) relacionada ao uso de antagonistas kappa-opioides para o tratamento de transtornos depressivos. Todos os outros autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Este artigo é uma submissão direta PNAS.

Veja o comentário na página 5765.

Este artigo contém informações de suporte on-line em www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.