Orexin medeia a iniciação do comportamento sexual em ratos sexualmente ingênuos, mas não é crítico para o desempenho sexual (2011)

Horm Behav. Manuscrito do autor; disponível em PMC 2011 Aug 1.

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PMCID: PMC2917508

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Sumário

O neuropeptídeo hipotalâmico orexina medeia os comportamentos de excitação, sono e recompensa natural, incluindo a ingestão de alimentos. O comportamento sexual masculino é alterado pelos agonistas ou antagonistas do receptor da orexina-1, sugerindo um papel para a orexina-A neste comportamento naturalmente compensador. No entanto, o papel específico da orexina-A endógena ou B em diferentes elementos do comportamento sexual masculino é atualmente incerto. Portanto, os estudos atuais utilizaram marcadores de ativação neural e lesões específicas de orexinas para testar a hipótese de que a orexina é crítica para a motivação sexual e o desempenho em ratos machos. Primeiro, a expressão de cFos em neurônios de orexina foi demonstrada após apresentação de uma fêmea receptiva ou não receptiva sem ativação adicional por diferentes elementos de acasalamento. Em seguida, testou-se o papel funcional da orexina utilizando saporina conjugada com orexina-B, resultando em lesões corporais de orexinas no hipotálamo. As lesões foram conduzidas em machos sexualmente ingênuos e o comportamento sexual subsequente foi registrado durante quatro tentativas de acasalamento. Os machos lesionados apresentaram latências encurtadas para montar e intromitar durante o primeiro, mas não os subsequentes testes de acasalamento, sugerindo que as lesões facilitaram o início do comportamento sexual em machos sexualmente ingênuos, mas não experientes. Da mesma forma, as lesões não afetaram a motivação sexual em homens experientes, determinados por testes de pista. Finalmente, testes de labirinto em cruz elevado demonstraram redução de comportamentos semelhantes à ansiedade em machos lesionados, apoiando um papel da orexina na ansiedade associada à exposição inicial à fêmea em animais ingênuos. No geral, esses achados mostram que a orexina não é crítica para o desempenho ou motivação sexual masculina, mas pode desempenhar um papel na excitação e ansiedade relacionadas ao comportamento sexual em animais ingênuos.

Palavras-chave: orexina, hipocretina, comportamento sexual, cópula, ativação neural, motivação, hipotálamo, novidade, excitação, ansiedade

Introdução

Orexin, também conhecido como hipocretina, é um neuropeptídeo hipotalâmico crítico para o comportamento alimentar, (de Lecea e outros, 1998; Sakurai et al; 1998, Sakurai, 2006; Benoit e outros, 2008) excitação e sono (Chemelli et al., 1999; Lin et al., 1999, Sakurai, 2007; Furlong e Carrive, 2007; Furlong e outros, 2009; Carter e outros, 2009). Os neurônios Orexin estão localizados na área hipotalâmica lateral (LHA) e no hipotálamo dorsomedial perifornical (PFA-DMH) e produzem dois neuropeptídeos, orexina-A e B (de Lecea e outros, 1998; Sakurai et al., 1998). Os neurônios Orexin demonstraram se projetar para estruturas cerebrais envolvidas na mediação da excitação, incluindo o locus coeruleus, o núcleo tuberomamilar e o núcleo tegmentar peduculopontino (Peyron et al., 1998; Hagan e outros, 1999; Horvath e outros, 1999; Baldo et al., 2003). Orexin também foi implicado em recompensa e motivação, especificamente relacionado a alimentos e drogas de abuso (Aston-Jones e outros, 2009a; Aston-Jones e outros, 2009b) e os neurônios da orexina foram projetados para recompensar estruturas cerebrais relacionadas no sistema mesolímbico, incluindo a área tegmental ventral (VTA) e nucleus accumbens (NAc) (Peyron et al., 1998; Fadel e Deutch, 2002; Martin et al., 2002; Baldo et al., 2003). Os neurônios Orexin são ativados por pistas contextuais condicionadas associadas à recompensa alimentar e medicamentosa (Harris et al., 2005; de Lecea e outros, 2006; Choi et al., 2010) e demonstraram desempenhar um papel no comportamento alimentar baseado em recompensas (Choi et al., 2010). Além disso, a administração intracerebroventricular (ICV) ou intraperitoneal de um antagonista do receptor de orexina 1 (ORX1) resulta em motivação reduzida para alimentos saborosos (Thorpe et al., 2005; Nair et al., 2008), enquanto a administração do ICV orexina-A pode restabelecer esta motivação (Boutrel et al., 2005).

O papel da orexina em outros comportamentos recompensadores atualmente não está claro, embora vários estudos tenham implicado um papel da orexina no controle do comportamento sexual em ratos machos. Foi demonstrado anteriormente que os neurônios da orexina são ativados por cópula em ratos machos (Muschamp et al., 2007). Além disso, a administração de orexina-A na área pré-óptica medial (mPOA) resultou em aumento do desempenho sexual, evidenciado por latências reduzidas para montar e intrometer-se, e aumentou as freqüências de montes e intromissão (Gulia et al., 2003). Em contraste, a administração ICV de orexina-A atenuou a motivação sexual, reduzindo a preferência feminina, embora apenas em machos altamente sexualmente motivados (Bai et al., 2009). Estudos utilizando antagonistas de ORX1 também demonstraram dados contraditórios, uma vez que a administração sistêmica do antagonista de ORX1 reduziu levemente o desempenho sexual aumentando a latência para o uso de drogas sem afetar outros parâmetros do comportamento sexual (Muschamp et al., 2007), enquanto a administração ICV do antagonista ORX1 não teve efeito sobre a motivação sexual (Bai et al., 2009). Juntos, esses estudos sugerem que a administração de orexina A exógena afeta o desempenho sexual e a motivação; entretanto, a orexina endógena pode não desempenhar um papel importante na mediação do comportamento sexual (Bai et al., 2009). Portanto, o objetivo do presente estudo foi determinar se a orexina endógena é essencial para a motivação e desempenho sexual dos ratos machos.

Primeiro, foi determinado quando, durante o comportamento sexual, os neurônios daexina são ativados, testando a hipótese de que os neurônios da orexina são ativados após a introdução do estímulo recompensador. Além disso, como foi demonstrado que a experiência sexual influencia o desempenho sexual (Dewsbury, 1969) e as propriedades recompensadoras do comportamento sexual (Tenk et al., 2009), foi determinado se a experiência sexual influencia ou estimula a ativação neuronal durante o acasalamento. Finalmente, foi testado se orexina desempenha um papel crítico na motivação sexual e desempenho usando lesões específicas do corpo celular de neurônios orexina.

Materiais e Métodos

Ratos Sprague Dawley machos adultos (200-250g) foram obtidos de Harlan (Indianapolis, IN) ou Charles River Laboratories (Sherbrooke, Québec, Canadá) e alojados individualmente ou em pares dependendo da experiência individual (ver abaixo) em gaiolas de Plexiglas. A sala da colônia foi mantida em um ciclo 12 / 12 invertido claro-escuro (luzes apagadas no 10 am) e comida e água estavam disponíveis ad libitum exceto durante o teste comportamental. Ratazanas fêmeas Sprague-Dawley foram obtidas de Harlan (Indianapolis, IN) ou Charles River Laboratories (Sherbrooke, Québec, Canadá) foram ovariectomizadas bilateralmente e implantadas subcutaneamente com cápsulas silásticas de benzoato de 5% 17-p-estradiol. A receptividade sexual foi induzida por injecções subcutâneas de progesterona (500 µg em 0.1ml de óleo de gergelim) aproximadamente 4 h antes das sessões de acasalamento. Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês de Cuidado Animal da Universidade de Cincinnati e da Universidade do Oeste de Ontário e seguem as diretrizes delineadas pelo Instituto Nacional de Saúde e pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Todos os testes comportamentais foram conduzidos durante a primeira metade da fase escura sob iluminação vermelha fraca, exceto quando indicado de outra forma.

Projeto Experimental

estudos de expressão cFos

Ratos machos (n = 48) foram alojados individualmente e metade dos animais ganhou experiência sexual na gaiola durante as sessões de acasalamento 5 duas vezes por semana. Os testes de acasalamento foram realizados na gaiola para eliminar a excitação e a expressão de cFos induzida pela exposição a uma arena diferente de acasalamento e a exposição a sinais condicionados associados ao acasalamento prévio (Balfour e outros, 2004). Uma fêmea receptiva foi introduzida na gaiola de origem e os machos foram autorizados a acasalar até uma ejaculação ou por 60 minutos. Durante cada teste, o comportamento sexual foi observado. O número total de montagens e intromissões, assim como as latências para a primeira montagem e intromissão (o tempo desde a apresentação da fêmea receptiva até a primeira montagem ou intromissão) e a ejaculação (o tempo desde a primeira intromissão até a ejaculação) foram registrados. (Agmo, 1997). A metade restante dos animais permaneceu sexualmente ingênua. Estes animais foram alojados na mesma sala que os machos experientes sexualmente, foram manipulados e expostos a odores e sons associados ao acasalamento, no entanto, não acasalam. Os animais naïve e experientes foram subdivididos em grupos experimentais 6 (n = 4 por grupo). Os grupos ingênuos e experientes do 6 incluíam: Homens do controle sem exposição ao comportamento sexual (gaiola em casa); machos expostos a uma fêmea não receptiva na gaiola em casa por 15 minutos (Anestrous Female). Os machos poderiam investigar e interagir, mas não se acasalaram devido à falta de receptividade feminina; machos expostos aos odores de uma fêmea receptiva colocada em uma caixa de tela de arame no topo da gaiola para 15 minutos (Mulher Estranha); machos que exibiam montarias, mas não intromissões ou ejaculação com fêmeas mascaradas pela vagina (Monte); machos que exibiam montagens e intromissões somente (Intromissão); e machos que acasalaram com uma ejaculação (ejaculação). Uma hora após o final do teste, os machos foram sacrificados para analisar a expressão de cFos. Grupos sexualmente experientes foram pareados em parâmetros de comportamento sexual e não houve diferenças significativas entre os grupos antes do teste final. Além disso, não houve diferenças significativas entre grupos ingênuos e experientes em número de montagens mais intromissões durante o teste final.

Perfusões: expressão cFos

Todos os machos foram anestesiados com pentobarbitol sódico (270 mg / mL) e foram perfundidos transcardiamente com 4% paraformaldeído (500 mL; PFA). Após a perfusão, os cérebros foram removidos imediatamente e pós-fixados durante uma hora no mesmo fixador e depois transferidos para solução de 20% de sacarose para crioprotecção. Os cérebros foram seccionados num micrótomo de congelação (Microm, Walldorf, Alemanha) em secções coronais de 35 µm e recolhidos em secções paralelas 4 em solução crioprotectora (30% sacarose em 0.1 M PB contendo 30% etilenoglicol e 0.01% azida sódica) e armazenados a −20 ° C até processamento posterior.

Imunohistoquímica

Todas as incubações foram realizadas à temperatura ambiente com agitação suave. As secções de flutuação livre foram lavadas extensivamente com fosfato de sódio tamponado com solução salina 0.1M (PBS). Seções foram bloqueadas com 1% H2O2 (30% solução estoque) em PBS por 10 minutos, em seguida, extensivamente lavado novamente com PBS. As secções foram incubadas com uma solução de incubação (PBS contendo 0.1% albumina de soro bovino e 0.4% Triton X-100) durante 1 hora. As incubações dos anticorpos primários foram realizadas na solução de incubação durante a noite à temperatura ambiente. Após as secções de coloração foram lavadas em PBS, montadas em lâminas de vidro com carga adicional e lamínulas com ftalato de dibutil xileno (DPX).

cFos / Orexin

Uma série de secções foi imunoprocessada para cFos e orexina. As secções foram incubadas durante a noite com um anticorpo criado por coelho reconhecendo cFos (anti-cFos de coelho, sc-52; 1: 10 000, Santa Cruz Biotecnologia, Santa Cruz, CA) seguido de incubação 1 horas com coelho de cabra biotinilado (1: 500 , Vector Laboratories, Burlingame, CA) e um complexo avidina de peroxidase de rano (1: 1000, kit ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA). As secções foram incubadas durante 10 minutos em 0.02% de diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St. Louis, MO) em tampão fosfato 0.1M (PB) contendo 0.012% de peróxido de hidrogénio e 0.08% de sulfato de níquel, resultando num produto de reacção azul-preto. As secções foram então incubadas durante a noite com um anticorpo criado por coelho reconhecendo orexina-A (coelho anti-orexina-A, H-003-30; 1: 20 000, Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA) seguido de incubação 1 hora com anti-inflamatório de cabra biotinilado -rabbit e ABC, conforme descrito acima. Finalmente, as secções foram incubadas durante 10 minutos com 0.02% DAB em 0.1M PB contendo 0.012% de peróxido de hidrogénio, resultando num produto de reacção castanho avermelhado.

Todos os anticorpos foram caracterizados previamenteChen et al., 1999; Satoh et al., 2004; Solomon e outros, 2007). Os controles imunohistoquímicos incluíram a omissão de anticorpos primários, análise de western blot demonstrando bandas únicas em peso apropriado (cFos) e perda do sinal imuno-histoquímico da orexina com lesões de orexina B-saporina (orexina).

Análise de Dados

cFos / Orexin

Os neurónios marcados para orexina ou orexina e cFos foram contados bilateralmente em três secções representativas por animal conhecido por conter números máximos da população neuronal de orexina (Sakurai et al., 1998) - Ø2.3 mm a −3.6 mm de bregma (Paxinos e Watson, 1998) (Figura 1), utilizando um tubo de desenho acoplado a um microscópio Leica (Leica Microsystems; Wetzlar Germany), por um grupo cego para grupos experimentais. O PFA-DMH e LHA foram delineados com base na localização do fórnice (Figura 1a). As percentagens de neurónios de orexina expressando cFos foram calculadas e calculadas em média por hemisfério para cada animal, e as médias dos grupos foram calculadas. A significância estatística entre os grupos foi determinada usando ANOVA two-way com experiência sexual e comportamento sexual durante o teste final como fatores seguidos pelos testes de LSD de Fisher com um nível de confiança 95%.

Figura 1 

Localização dos neurônios da orexina no hipotálamo. (A) Localização anatômica dos neurônios da orexina no hipotálamo. (Paxinos e Watson, 1998), Barra de escala: 200 µm. (B) Neurônios de orexina marcados individualmente no PFA-DMH em um animal controle não acasalado. (C) Orexin ...

Estudos de lesões de orexina

Cirurgia

Os homens foram alojados individualmente e receberam uma sessão de acasalamento pré-teste com uma fêmea receptiva antes da lesão e cirurgia simulada. O comportamento sexual foi registrado como descrito acima e os grupos foram pareados com base nos parâmetros de comportamento de acasalamento. Ratos machos foram anestesiados com isoflurano (Abbot Laboratories, St. Laurent, Quebeque, Canadá) utilizando um aparelho de gás Surgivet Isotec4 (Smiths Medical Vet Division, Markham, Ontário, Canadá) e colocados num aparelho estereotáxico (Kopf Instruments, Tujunga, CA) com uma máscara de gás cobrindo o nariz e a boca para manter a anestesia. Uma incisão foi feita para expor o crânio e lambda e bregma foram encontrados e determinados como estando nivelados. Um buraco foi perfurado no crânio usando uma broca dremel (Dremel, Racine, WI) e micropipetas de vidro (40µm diâmetro, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL) preenchidos com a toxina direcionada orexina-B saporina (IT-20, Advanced Targeting Systems, San Diego, CA; 200ng / µl em PBS); ou a toxina não conjugada BLANK-saporina (IT-21, Advanced Targeting Systems, San Diego, CA; 200ng / µl em PBS; controlos simulados) foram baixadas para o hipotálamo. Demonstrou-se que esta toxina alvo se liga com uma alta afinidade às células que expressam o receptor de orexina 2 (ORX2) e com uma afinidade significativamente menor para as células que expressam ORX1 (Gerashchenko et al., 2001), e foi demonstrado que elimina especificamente os neurónios da orexina no hipotálamo (Frederick-Duus e outros, 2007). Infusões bilaterais de 1 µL (2 por hemisfério) foram injetadas nas seguintes coordenadas: AP = −2.8 e −3.2; ML = 0.7 e 0.8; DV = −9.0 (Paxinos e Watson, 1998). Após cada perfusão, a agulha foi deixada no local por 3 minutos para permitir a difusão. As agulhas foram removidas lentamente e as feridas foram fechadas com grampos de ferida. Duas semanas após a cirurgia da lesão, todos os machos foram testados quanto à experiência sexual durante quatro tentativas de acasalamento e foram então submetidos ao teste de pista e / ou labirinto em cruz elevado (ver abaixo). As cirurgias foram realizadas em três coortes diferentes, separadas por várias semanas, para atingir um número suficiente de animais por grupo.

Comportamento Sexual

Todos os machos foram testados quanto ao comportamento sexual durante as sessões de acasalamento 4 realizadas a cada segundo dia na gaiola da casa. Durante cada sessão, os machos acasalaram com uma fêmea receptiva a uma ejaculação ou por 60 minutos, o que ocorresse primeiro. O comportamento de acasalamento foi registrado como descrito acima e a eficiência da copulação também foi calculada [números de intromissões / (números de monta + números de intromissões)]. Diferenças estatísticas nos parâmetros de desempenho sexual foram comparadas entre os grupos sham e lesão para cada tentativa usando ANOVA unidirecional com fator de risco para cirurgia de lesão e teste de LSD de Fisher com um nível de confiança 95% ou, quando apropriado, testes não paramétricos foram conduzidos usando uma ANOVA one-way de Kruskal-Wallis com cirurgia de lesão como um fator e teste de Dunn com um nível de confiança 95%. Além disso, os dados de cada grupo foram comparados com os dados pré-cirúrgicos usando testes t pareados.

Motivação Sexual: Runway Test

Após o teste do comportamento sexual, um subgrupo dos machos sexualmente experientes foi testado para motivação sexual usando um aparelho de pista reta (MED Associates Inc., St. Albans, VT) (120 cm long; Lopez et al., 1999). Os machos habituaram-se ao aparato da pista em dois testes subseqüentes de 10 realizados no mesmo dia. Em seguida, dois testes foram conduzidos. Durante o primeiro experimento, um animal estímulo (fêmea estro, fêmea ou macho antro) foi colocado em uma caixa de meta com divisores perfurados no final da pista. Um ventilador foi usado para soprar os aromas dos animais de estímulo para o macho. Machos experimentais foram colocados na caixa de largada, a porta foi aberta para permitir acesso à pista, e o tempo para atingir a caixa de gol foi registrado. Uma vez alcançando a caixa de meta, os machos receberam 30 segundos para interagir com o animal de estímulo atrás da tela. Um segundo teste idêntico seguiu 1 hora depois. A significância estatística entre os tempos para atingir a caixa de objetivos entre o ensaio 1 e o ensaio 2 foi analisada utilizando testes t pareados com um nível de confiança 95%. A significância estatística entre os grupos foi determinada usando ANOVA unidirecional com cirurgia de lesão como um fator seguido pelos testes de LSD de Fisher com um nível de confiança 95%.

Comportamento semelhante à ansiedade: Labirinto em Elevação Mais Elevada

Um subgrupo dos machos sexualmente experientes foi testado para um comportamento semelhante à ansiedade para determinar se os efeitos das lesões da orexina no desempenho sexual ou motivação eram devidos a mudanças na ansiedade ou na excitação. Os machos foram expostos ao aparelho de labirinto em cruz elevado (EPM; MED Associates Inc., St. Albans, VT) em uma sala bem iluminada durante o final da fase de luz. O EPM consistia em braços 4 com 50 cm de comprimento que se estendia de uma junção central e era elevado 75 cm. Dois braços do labirinto estavam abertos para o ambiente externo e os outros dois foram fechados com tapume escuro 40 cm de altura. Os animais foram colocados no EPM e monitorados por cinco minutos. O tempo gasto em braços abertos e fechados e o número total de entradas em cada braço foram registrados usando matrizes de fotobeam. A significância estatística entre os grupos foi determinada usando uma ANOVA unidirecional com a lesão como um fator seguido pelos testes de LSD de Fisher com um nível de confiança 95%.

Perfusões e cFos induzidos pelo acasalamento

Após todos os testes comportamentais, todos os machos foram profundamente anestesiados com pentobarbital sódico (270mg / mL) e foram perfundidos transcardiamente com 500 mL de 4% PFA para verificação da lesão, conforme descrito anteriormente. Além disso, para testar os efeitos das lesões de orexina na expressão de cFos induzida pelo acasalamento, grupos de machos simulados e lesionados acasalaram até uma única ejaculação. Uma hora após a ejaculação, os machos foram transcardiados com perfusão com 4% PFA como descrito acima. Metade dos machos deste grupo não foram introduzidos a uma fêmea e foram perfundidos da gaiola para servir como controlos não pareados.

Imunohistoquímica

Os cérebros foram seccionados utilizando um micrótomo de congelação em séries paralelas 4 de secções coronais 35 µm e armazenados como descrito acima. Para a verificação da lesão, uma série de secções contendo o hipotálamo de todas as experiências de lesão foi marcada individualmente para orexina utilizando o mesmo protocolo anti-orexina-A e DAB de coelho acima descrito. Uma série de secções dos animais que se cruzaram foi corada para cFos e orexina como descrito acima.

Verificação de Lesões

Em cada animal, foram contados números de neurónios de orexina imunorreactivos para orexina bilateralmente nas secções PFA-DMH e LHA em 3 expressando números máximos de células de orexina em controlos não cirúrgicos, −2.3 mm a −3.6 mm de bregma como descrito acima. As células por hemisfério foram calculadas para cada animal, e as médias dos grupos foram calculadas. Utilizaram-se animais de controlo n operatio (a partir de expericias cFos) para determinar o nero intacto / de linha de base de neurios de orexina e os dados foram expressos como percentagens em comparao com os indivuos de controlo n operatio (Figura 2). Os machos que tinham menos de 20% ou células deexina comparados com os animais de controle sem cirurgia foram incluídos no grupo de lesão. Animais com mais de 20%, mas menos de 80% foram incluídos em um grupo de lesão parcial. Sham controles não tiveram mudanças significativas no número de células de orexina. A significância estatística entre animais com lesão simulada, parcial e completa foi calculada usando-se uma ANOVA unidirecional e o teste LSD de Fisher com nível de confiança 95%.

Figura 2 

Verificação de lesão Imagens representativas mostrando células de orexina (A) e MCH (B) num animal de lesão simulada injectado com BLANK-saporina. Imagens representativas mostrando perda de células de orexina (C), mas células MCH intactas (D) em uma lesão animal injetada com orexina ...

Especificidade da Lesão

Para verificar se as lesões estavam restritas aos neurônios da orexina, uma série de seções contendo o hipotálamo de um subgrupo de animais simulados e lesionados (n = 20) foi imunoprocessada para o hormônio concentrador de melanócito (MCH), um peptídeo hipotalâmico que tem localização sobreposta (mas não colocalização) com neurônios da orexina (Broberger et al., 1998), utilizando um anticorpo criado por coelho reconhecendo MCH (coelho anti-MCH, H-070-47; 1: 150 000, Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA) e DAB como descrito anteriormente. Neurônios MCH expressam ORX1 (Bäckberg et al., 2002) mas não ORX2 (Volgin et al., 2004) e não são significativamente reduzidos após o tratamento com orexina B-saporina (Frederick-Duus e outros, 2007). As células imunorreactivas MCH foram contadas bilateralmente em duas secções por animal (simulação: n = 7; lesão n = 5), utilizando secções alternadas às analisadas para os neurónios da orexina. As lesões não reduziram significativamente o número de neurônios MCH em PFA-DMH ou LHA (tabela 1; Figura 2b, d; PFA-DMH: p = 0.47; LHA: p = 0.33). Além disso, a expressão de cFos induzida por acasalamento foi contada bilateralmente em uma seção representativa por animal (simulada: n = 4; lesão n = 3), usando seções alternadas àquelas analisadas para neurônios de orexina. As lesões não afetaram a expressão de cFos induzida pelo acasalamento no PFA-DMH ou LHA (tabela 1; PFA-DMH: p = 0.53; LHA: p = 0.82). Finalmente, secções representativas utilizadas para contagens de orexinas (animais: simulada: n = 6; lesão: n = 6) foram contrastadas com Nissl utilizando violeta de cresilo (acetato de 5 g cresil violeta (C-5042, Sigma, St. Louis, MO), 0.5 g de acetato de sódio tri-hidratado (S209, Thermo Fisher Scientific, Ottawa, Ontário, Canadá), 1L água bidestilada com ácido acético glacial (AX0073-6, EMD Chemicals, Mississauga, Ontário, Canadá) a pH: 3.14). As contagens de neurónios corados com Nissl foram realizadas em áreas padrão de análise (250 µm × 200 µm) na localização geral dos neurónios da orexina. Números de neurônios Nissl-manchados não diferiram entre os grupos sham e lesão (tabela 1; PFA-DMH: p = 0.23; LHA: p = 0.33).

tabela 1 

Verificação da especificidade da lesão: A análise do número de neurónios corados para Nissl, MCH ou cFos induzidos por acasalamento demonstrou que não houve perda significativa de neurónios em geral, células MCH ou ativação neural induzida por acasalamento no PFA-DMH ou ...

Uma vez que a deficiência de orexina demonstrou contribuir para a narcolepsia em ratinhos (Chemelli et al., 1999), cães (Lin et al., 1999) e humanos (Siegel, 1999; Nishino et al., 2000; Peyron et al., 2000; Thannickal et al., 2000) os animais foram observados para garantir a ausência de um fenótipo narcoléptico. Os animais foram observados durante a duração de todos os testes comportamentais relatados neste estudo e não apresentaram características de narcolepsia.

Expressão de cFos induzida por acasalamento em animais lesionados

Os números de células imunorreactivas cFos foram contados bilateralmente em secções 3 por animais em áreas padrão de análise na área tegmentar ventral (VTA; 900 × 900 µm), mPOA (400 × 600 µm); Núcleo e invólucro do núcleo accumbens (NAc) (400 × 600 µm) e as sub-regiões pré-límbicas, infralímbicas e cingulares anteriores do córtex pré-frontal medial (mPFC) (600 × 800 µm por sub-região) por grupos cegos e experimentais observados . As contagens foram calculadas para cada animal e as médias dos grupos foram calculadas. A significância estatística foi calculada usando uma ANOVA de dois fatores com experiência sexual e lesão como fatores seguidos pelo teste de LSD de Fisher com nível de confiança 95%.

Consistentes

Ativação de neurônios Orexin durante o comportamento sexual

Um aumento significativo na expressão de cFos em neurônios de orexina foi observado após o comportamento sexual em ambos os PFA-DMH (F(5,31) 63.4; p <0.001; Figura 3a) e LHA (F(5,31) 10.4; p <0.001; Figura 3b), sem efeito de experiência sexual. Especificamente, em animais sexualmente ingênuos e experientes, todos os grupos experimentais de machos exibindo diferentes parâmetros de comportamento sexual (investigação de fêmeas estrascantes, exposição a odores femininos de estro, exposição de montagem, intromissões ou ejaculação) mostraram indução igual de cFos comparada ao lar controles de gaiola com uma maior porcentagem de células de orexina ativadas no PFA-DMH (60-80%) versus o LHA ​​(14-33%), sem diferenças entre os grupos experimentais. Estes resultados sugerem que os neurônios da orexina são ativados após a exposição ao estímulo feminino sem ativação adicional durante o desempenho sexual. Além disso, a ativação não é dependente da saliência de incentivo do estímulo feminino, já que tanto as fêmeas não receptivas quanto as receptivas induzem a ativação em machos sexualmente experientes.

Figura 3 

Neurônios Orexin em PFA-DMH (A) e LHA (B) expressaram cFos seguindo todos os parâmetros de comportamento de acasalamento em animais ingênuos e experientes. Abreviaturas: HC, gaiola em casa; AF: fêmea antral; EF, fêmea estro; M, monte; IM, intromissão; E, ejaculação. ...

Efeitos das lesões da orexina

Comportamento Sexual

As lesões de orexina resultaram na facilitação do comportamento sexual (latência de montagem: F(2,47) 3.962; p = 0.034; latência de intromissão: H = 9.104; p = 0.011). Durante o primeiro teste de acasalamento, os machos da lesão apresentaram latências mais curtas para montar e intromissão em comparação com os animais sham (latência de montagem: p = 0.03; latência de intromissão: p = 0.01; Figura 4a – b) e comparado com as latências durante o teste de acasalamento pré-operatório (latência de montagem: p = 0.02; latência intromissão: p = 0.03; Dados não mostrados). Os machos com lesões parciais não diferiram significativamente dos machos sham, e nenhum dos grupos diferiu do teste de acasalamento pré-operatório. Os efeitos das lesões nas latências de montagem e intromissão foram atenuados com a experiência sexual, uma vez que não houve diferenças entre os grupos, durante qualquer um dos ensaios subsequentes (ensaio 4 apresentado em Figura 4a – b). Latências de ejaculação (Figura 4c), números de montagens (Figura 4d) e intromissões (Figura 4e) bem como a eficiência de copulação (Figura 4f) não diferiram significativamente entre os grupos durante qualquer um dos ensaios ou dentro de cada grupo entre o primeiro teste de acasalamento e o teste pré-operatório.

Figura 4 

Lesões de orexina encurtaram as latências para montagem e intromissão em machos sexualmente ingênuos durante o ensaio 1. As lesões de orexina não afetaram o acasalamento durante o ensaio 4, depois que os machos adquiriram experiência sexual. (A) Montar latência. (B) Latência de Intromissão. (C) ejaculação ...
Teste de pista

As lesões de orexina não afetaram a motivação sexual avaliada em um teste de pista reta em homens sexualmente experientes. Ao longo de dois testes, os machos lesionados foram significativamente mais rápidos em relação a uma fêmea de estro no segundo ensaio comparado ao primeiro teste (p = 0.03; Figura 5). Esse tempo de corrida aumentado é indicativo de motivação sexual (Lopez et al., 1999). Lesões parciais e machos sham também correram mais rápido em direção a uma fêmea de estro durante o julgamento 2 (p = 0.03), embora isso não conseguiu atingir significância em homens sham (p = 0.052). Nenhum dos grupos mostrou maior velocidade para correr em direção a uma fêmea ou macho antral durante o ensaio 2. Além disso, não foram observadas diferenças significativas entre os machos simulados, parciais e lesionados na velocidade de corrida para qualquer estímulo animal em nenhum dos ensaios 1 nem no ensaio 2, demonstrando falta de diferenças na atividade geral na pista.

Figura 5 

As lesões de orexina não afetaram a motivação sexual em homens com experiência sexual. São mostradas as ocasiões para atingir uma fêmea de estro no teste da pista durante os testes 1 e 2. * indica redução significativa no tempo para atingir a fêmea no ensaio 2 em comparação com ...
Comportamento semelhante à ansiedade

Os resultados até o momento sugerem que as lesões podem facilitar o início do comportamento sexual em animais ingênuos através de um efeito potencial sobre as respostas a comportamentos novos e / ou ansiosos quando os machos encontram uma fêmea nova. Em apoio, os machos lesionados mostraram um comportamento semelhante à ansiedade diminuída no EPM, visto como uma porcentagem menor de tempo gasto nos braços fechados, (p = 0.012; Figura 6) e uma maior porcentagem de tempo nos braços abertos (p = 0.023; Figura 6) em comparação com machos simulados. Lesões parciais não tiveram efeito significativo. Estes dados sustentam ainda que a lesão diminuiu o comportamento semelhante à ansiedade.

Figura 6 

As lesões de orexina diminuíram o comportamento semelhante à ansiedade no labirinto em cruz elevado. A porcentagem de tempo gasto nos braços fechados (esquerda) diminuiu e a porcentagem de tempo nos braços abertos (direita) aumentou nos machos lesionados. * indica diferença significativa ...
Expressão cFos

Para avaliar se a orexina endógena contribui para a ativação neuronal induzida pelo acasalamento em regiões cerebrais inervadas pela orexina, foi conduzida a análise da expressão de cFos induzida pelo acasalamento na VTA, núcleo e concha de NAc, mPOA e mPFC. Em ambas as lesões e machos simulados, o acasalamento aumentou significativamente a cFos em todas as áreas do cérebro analisadas em comparação com os controles não pareados (tabela 2). As les�s n� afectaram a activa�o neuronal, uma vez que os animais simulados e lesionados n� diferiram na express� de cFos na linha de base ou induzida pelo acasalamento.

tabela 2 

O acasalamento induziu cFos em grupos simulados, parciais e de lesão, em comparação com controles não acasalados do mesmo estado de lesão.

Discussão

Estes estudos investigaram o papel da orexina endógena no desempenho sexual e motivação no rato macho. Verificou-se que a orexina não é essencial para a motivação ou desempenho sexual. Em vez disso, os neurônios da orexina são ativados pelo estímulo feminino, independente do status hormonal da experiência feminina ou sexual do homem. Além disso, a remoção de orexina endógena por lesões específicas de orexina diminuiu comportamentos semelhantes à ansiedade e facilitou o início do comportamento sexual em homens sexualmente ingênuos. Assim, os resultados deste estudo confirmam o papel da orexina na excitação (de Lecea e outros, 2006; Harris e Aston-Jones, 2006; Sakurai, 2007; Boutrel et al., 2009; Furlong e Carrive, 2009; Furlong e outros, 2009) e ansiedade (Suzuki et al., 2005; Davis et al, 2009; Li et al., 2010), mas não apoiam um papel crítico para a orexina na motivação ou desempenho sexual.

Os resultados desses estudos esclarecem ainda mais o papel da orexina endógena e os achados contrastantes aparentes dos estudos anteriores que examinam o papel da orexina no comportamento sexual masculino usando ferramentas farmacológicas. Infusões intra-mPOA de orexina A exógena levaram ao aumento da excitação sexual e melhor desempenho sexual, sugerindo que a orexina pode atuar no mPOA para aumentar a motivação e o desempenho do comportamento sexual (Gulia et al., 2003). No entanto, em contraste, as infusões de ICV da orexina-A atenuaram a motivação sexual e a excitação (Bai et al., 2009), enquanto um antagonista do receptor de orexina não teve efeito sobre a excitação sexual (Bai et al., 2009), indicando que a orexina endógena pode não desempenhar um papel na motivação sexual. Por fim, o bloqueio de ORX1 por injeções sistêmicas mostrou apenas prejudicar levemente o desempenho copulatório (Muschamp et al., 2007). A partir desses estudos conflitantes, algumas conclusões podem ser tiradas. Primeiro, a aplicação de orexina A exógena pode afetar o comportamento, mas o bloqueio de ORX1 não tem efeitos maiores, sugerindo um papel menor para a orexina endógena na regulação do comportamento sexual masculino (Bai et al., 2009). Os resultados atuais suportam essa possibilidade. Os estudos atuais usando a remoção da orexina, por meio de lesões específicas de orexina, indicam que a orexina endógena não é essencial para a motivação ou desempenho sexual, de acordo com as Bai et al (2009). É importante, no entanto, notar que a falta de efeitos das lesões de orexina na motivação sexual na pista pode ser devido ao fato de que os animais ganharam experiência sexual antes do teste de motivação sexual, portanto a falta de efeito no teste da pista pode ter sido devido à experiência sexual dos machos. Experiências futuras podem abordar esta advertência testando os efeitos das lesões de orexina na motivação sexual em homens ingênuos.

Também é possível que os dois ligantes de orexina e os dois subtipos de receptores de orexina (ORX1 e ORX2; Sakurai et al., 1998) pode regular o comportamento sexual em direções opostas. Utilizando técnicas de lesão celular de orexina, os ligandos para ambos os subtipos de receptores de orexina (orexina A e B) foram eliminados no presente estudo. Os dois subtipos de receptores são expressos em diferentes áreas do cérebro (Trivedi et al., 1998; Marcus et al., 2001) e foi demonstrado que regulam diferencialmente a memória para induzir cocaína induzidaSmith et al., 2009). Estudos anteriores sobre comportamento sexual focaram-se principalmente no papel da orexina A e ORX1 (ver discussão acima). O antagonista do receptor de orexina SB334867 usado nos estudos até agora especificamente alveja ORX1 que tem uma alta afinidade para orexina-A e significativamente menor afinidade para orexina-B (Sakurai et al., 1998). Da mesma forma, a orexina-A tem sido usada como orexina exógena em estudos prévios (Gulia et al., 2003; Bai et al., 2009). Estudos futuros são necessários para investigar o papel da orexina-B e ORX2 na regulação do comportamento sexual masculino.

O presente estudo testou os efeitos da perda de longo prazo da orexina. Muschamp et al. (2007) sugeriu que uma redução a longo prazo da orexina após a castração pode ser responsável pela perda de motivação e desempenho sexual. Essa hipótese foi contrariada pelos achados atuais, pois as lesões celulares orexinas não reduziram a motivação ou o desempenho sexual. É possível que a perda de orexina a longo prazo no presente estudo possa ter resultado em mecanismos compensatórios, embora não tenham sido detectadas alterações na ativação neural induzida pelo acasalamento dentro do circuito que medeia o comportamento sexual. No entanto, é claro que a redução ou falta de orexina não impede o comportamento sexual. Além disso, os resultados do presente estudo não sustentam um papel importante da orexina na indução da expressão de cFos por comportamento sexual. Está claramente estabelecido que a orexina contribui para a ativação de neurônios na VTA (Korotkova e outros, 2003; Borgland et al., 2006; Narita et al., 2006; Vittoz et al., 2008). No entanto, as lesões de células orexinas não bloquearam a ativação neural induzida pelo acasalamento na VTA, ou em qualquer outra região cerebral relacionada à recompensa analisada, apesar da presença de fibras imunorreativas à orexina nas proximidades dos neurônios ativados em machos simulados. Assim, a ativação neural induzida pelo acasalamento nessas regiões do cérebro não parece ser dependente da ação da orexina.

Um achado um tanto inesperado do presente estudo foi o efeito das lesões de orexina na facilitação da iniciação do comportamento sexual em animais sexuais ingênuos, mas não experientes. Isto foi mostrado para ser correlacionado com uma redução em comportamentos semelhantes à ansiedade. Portanto, os efeitos das lesões da orexina na motivação sexual e no desempenho podem ser secundários aos seus efeitos sobre a ansiedade e a excitação. De fato, estudos anteriores sugeriram um papel para a orexina na ansiedade, já que a infusão de orexina A no ICV diminuiu o tempo nos braços abertos do LCE em camundongos (Suzuki et al., 2005). A infusão de orexina A no núcleo paraventricular do tálamo de ratos machos diminuiu o tempo gasto na área central de uma câmara de campo aberto e diminuiu a exploração de novos objetos, indicando que a orexina pode estar envolvida na geração de comportamento semelhante à ansiedade (Li et al., 2010). Além disso, os ratos machos dominantes que apresentam maior risco de tomar o EPM têm níveis aumentados de ARNm de ORX1 no mPFC (Davis et al., 2009). Orexin também demonstrou alterar as respostas ao estresse (Ida et al., 1999; Ida et al., 2000), e a estimulação dos receptores de orexina aumenta a liberação do fator liberador de corticotrofina (Al-Barazanji e outros, 2001; Singareddy et al., 2006), corticosterona (Ida et al., 2000; Kuru et al., 2000) e hormona adrenocorticotrópica (Kuru et al., 2000). Actualmente, os antagonistas da orexina estão em ensaios clínicos para o tratamento da insónia, um distúrbio frequentemente associado a distúrbios de ansiedade (Sullivan e Neria, 2009), e é hipotetizado que os antagonistas da orexina poderiam potencialmente ser usados ​​para tratar transtornos de ansiedade (Mathew et al., 2008). Dado o crescente corpo de evidências de um papel para a orexina na ansiedade e na excitação, parece que as lesões de nicotina podem facilitar o início do comportamento sexual em homens ingênuos, reduzindo as respostas semelhantes à ansiedade associadas à introdução de um novo estímulo, a fêmea.

A ativação significativa dos neurônios da orexina foi observada após a excitação sexual e comportamento sexual em animais sexualmente ingênuos e experientes, tanto no PFA-DMH quanto no LHA, com 60-80% e 14-33% de células orexinas expressando cFos, respectivamente. Existe um corpo de evidências que apoiam uma dicotomia na função neuronal da orexina dentro da população de células da orexina, com a PFA-DMH sendo criticamente envolvida na excitação e a LHA sendo crítica para comportamentos relacionados à recompensa (Harris et al., 2005; Harris e Aston-Jones, 2006, Aston-Jones, 2009a). Assim, a ativação das células da orexina PFA-DMH pelo estímulo feminino sustenta a hipótese de que a orexina é ativada e crítica para a excitação, incluindo excitação sexual em homens ingênuos e experientes, e ansiedade associada ao novo estímulo feminino em homens ingênuos. Contudo, as células PFA-DMH foram activadas a níveis semelhantes, independentemente da experiência dos machos e do estado hormonal da fêmea, sugerindo que as células PFA-DMH foram activadas durante a excitação geral e não especificamente pela excitação sexual. Além disso, nossos estudos não suportam totalmente a existência de uma população de células de orexina completamente dicotômica, pois houve ativação significativa da LHA após a exposição a todos os parâmetros de excitação e desempenho sexual, independentemente de os comportamentos estarem associados à recompensa. Assim, machos experientes expostos a uma fêmea anestesia apresentaram níveis iguais de ativação de orexina na LHA em comparação com machos experientes que copularam para a ejaculação. No entanto, apenas o último grupo formará uma preferência de lugar condicionado para o acasalamento (Tenk et al, 2009); sugerindo que a cópula para a ejaculação é mais gratificante do que outros elementos do acasalamento. O presente estudo não testou especificamente o papel da orexina na recompensa sexual; Portanto, estudos futuros são necessários para abordar essa questão.

Em resumo, os resultados desses estudos demonstram que a orexina não é crítica para o desempenho sexual ou motivação. Em vez disso, demonstrou-se que as lesões de orexinas reduzem a ansiedade, sugerindo que a orexina endógena está envolvida no aumento da ansiedade. Além disso, a remoção da orexina resultou na facilitação da iniciação do comportamento sexual em homens sexualmente ingênuos, sugerindo que a orexina endógena pode inibir o início do acasalamento, possivelmente aumentando a ansiedade em resposta ao novo estímulo, ou seja, a fêmea. Esses achados elucidam ainda mais os circuitos neurais envolvidos no desempenho sexual e na ansiedade, e se somam a um crescente corpo de literatura sobre o papel da orexina na mediação da excitação e ansiedade.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada por doações dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 DA014591), Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (RN 014705) e Conselho Nacional de Pesquisa em Ciências e Engenharia do Canadá (Discovery Grant (341710) para LMC.

Notas de rodapé

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