A inibição neuronal transitória revela papéis opostos de vias indiretas e diretas na sensibilização (2011)

Sumário

Apesar das enormes conseqüências negativas da dependência de drogas, o uso e abuso de psicoestimulantes continua prevalecendo. A progressão da exposição inicial ao uso regular e, finalmente, ao comportamento compulsivo habitual e à perda do controle inibitório envolve uma série de adaptações moleculares em neurocircuitos discretos.^1,2,3. O corpo estriado foi identificado como um local chave para muitas das adaptações comportamentais e neurobiológicas que se pensa formarem os processos centrais que mediam o vício.^1,2,3. A maioria dos neurônios dentro do corpo estriado (~ 95%) são neurônios de projeção espinosa média GABAérgica (MSNs) tque diferem na expressão do neuropéptido e formam duas vias eferentes principais⁴.

• MSNs estriatopalídeos contêm encefalina (ENK) e formam o caminho indireto
• Considerando que os MSNs striatonigrais contêm dinorfina (DYN) e substância P e formam a via direta.

Muitos modelos conceituais hipotetizam que essas populações de MSNs se opõem tanto mecanicamente quanto funcionalmente^5,6. No entanto, há pouca evidência empírica para apoiar seu papel diferencial no controle do comportamento, porque essas populações de células são fisicamente misturadas e morfologicamente indistinguíveis, tornando a manipulação seletiva tecnicamente elusiva.

Para examinar o papel dessas populações de células estriatais no desenvolvimento de comportamentos que ocorrem após exposição repetida a drogas de abuso, combinamos duas novas estratégias: vetores virais que usam os promotores do gene ENK ou DYN para direcionar a expressão do transgene aos neurônios estriatodal ou estriatonigral , respectivamente, e um GPCR projetado (G_{eu / o}Muscarínico Humano Acoplado₄ DREADD; Receptor de Designer Exclusivamente Ativado por uma Droga Designer; hM₄D)⁷ que é ativado por um ligante farmacologicamente inerte, clozapine-N-óxido^8,9 (CNO; Fig. 1a, h). Após a expressão em neurônios cultivados, a administração de CNO estimula G_{eu / o}-acoplado hM₄Receptores D, ativando assim os canais de potássio 3 (Kir3) que retificam para dentro, resultando em hiperpolarização da membrana e silenciamento neuronal transitório⁹.

  

Figura 1

Atenuação transitória e direcionada da sinalização celular do estriado. (a, hMapas de Amplicon de pENK-hM₄D/pENK-GFP (a) e PDYN-hM₄D/pDYN-GFP (hvetores de direcionamento. (b, eu) Microscopia confocal mostrou que pENK-hM₄D os receptores foram expressos seletivamente em ...

Para testar a especificidade do fenótipo celular dos vetores virais, utilizamos microscopia de imunofluorescência de duplo marcador após a infusão de vírus no estriado dorsal (Figura Complementar 1) que expressam hM marcado com hemaglutinina₄Receptores D sob o controle do promotor ENK (pENK-hM₄D) ou o promotor DYN (pDYN-hM₄D). Nós achamos que pENK-hM₄D expressão foi principalmente em MSNs contendo ENK (90% de células de hemaglutinina foram ENK +, 85 de 94; 6% de células de hemaglutinina foram substância P +, 4 de células 70; Fig. 1b) enquanto pDYN-hM₄D a expressão foi principalmente em MSNs contendo substância P (95% das células hemaglutininas eram substância P +, 109 fora das células 115; 5% das células hemaglutininas eram ENK +, 5 das células 97; Fig. 1i). Resultados semelhantes foram obtidos após a infusão de vírus específicos do promotor que expressam a proteína fluorescente verde (pENK-GFP e pDYN-GFP; ComplementarFigs. 2a e 3a).

Dado que os MSNs estriatodalinos se projetam primariamente para os MSNs globus pallidus externos (GPe) e estriatoniguais principalmente para a substantia nigra pars reticulata (SNpr), usamos injeções do traçador retrógrado Fluoro-Gold nessas regiões cerebrais seguidas por imuno-histoquímica fluorescente com dois marcadores para confirmar que o pENK e pDYN vírus produziram infecção específica da via. Observamos que pENK-GFP células co-localizadas com expressão de Fluoro-Gold no estriado após infusões no GPe mas não no SNpr (Complementar Fig. 2b) enquanto pDYN-GFP células co-localizadas com expressão de Fluoro-Gold estriado após infusões no SNpr mas não no GPe (Complementar Fig. 3b). A express dos vectores virais n alterou o nero de neurios ENK + ou substcia P + na regi da infeco viral, sugerindo que a utilizao destes promotores para transfercia gica mediada por vus n interferiu com neis de neuroptidos endenos. Todos estes resultados demonstram que o pENK e pDYN vetores virais expressam genes em suas populações de células estriadas apropriadamente segregadas.

Embora hM₄Técnicas baseadas em receptores D têm demonstrado modular a atividade de outros tipos neuronais⁹, sua capacidade de afetar os neurônios do estriado não foi examinada. Portanto, infectamos neurônios espinhais medianos do estriado com hM₄Receptores D sob o controle de um promotor do vírus herpes simplex (HSV), prepararam cortes coronais do estriado dorsal dois dias depois, e examinaram como hM₄Os neurônios estriados espinhais médios que expressam D respondem ao CNO. Observamos que a aplicação local de CNO (10 μM) induziu uma hiperpolarização do potencial de membrana (~ 7 mV, o potencial de membrana da linha de base foi ajustado para −80 mV; Fig. 1c) e reduziu a resistência de entrada dos neurônios após a aplicação de CNO (Fig. 1d, e), sugerindo que a condutância de potássio (ie, corrente mediada por Kir3) é ativada por CNO em hM₄D neurônios que expressam receptores. Além disso, a perfusão de CNO diminuiu substancialmente o número de potenciais de ação evocados em hM₄Neurônios que expressam D, mas não nas células controle, inibindo assim efetivamente a saída funcional dos neurônios infectados por vírus Expressão de hM₄Receptores D não alteraram a resistência de entrada (P = 0.84) ou disparo de potencial de ação (P = 0.64). (Fig. 1f, g). Em conjunto, esses dados sugerem que, semelhante aos neurônios do hipocampo⁹o hM₄O método baseado em D / CNO pode efetivamente diminuir a excitabilidade dos neurônios estriados de ratos.

Como prova adicional de conceito, testamos se hM₄Os receptores D bloqueariam a neurotransmissão em um circuito bem estabelecido, onde a atividade neural é previsivelmente evocada por estímulos relevantes para o comportamento. Assim, infectamos neurônios da área tegmentar ventral (VTA) com hM₄Receptores D sob o controle de um promotor de HSV, que expressa fortemente em neurônios dopaminérgicos¹⁰e usou a voltametria cíclica de varredura rápida para medir as mudanças na liberação de dopamina no nucleus accumbens após a entrega inesperada de uma recompensa alimentar¹¹. A administração de CNO atenuou significativamente a liberação de dopamina induzida por pellets de alimentos no nucleus accumbens em comparação ao veículo (Figura Complementar 4). Finalmente, testamos se a atividade decrescente de tipos celulares neuronais específicos no estriado in vivo poderia alterar a capacidade da anfetamina em estimular a expressão de Fos. Os psicoestimulantes, como a anfetamina, são ativadores robustos dafos no corpo estriado¹² e aumentará cfos em ambos os neurônios striatonigral e striatopallidal sob nossas condições experimentais¹³. Além de seu uso como marcador de atividade neuronal, a indução do psicoestimulantefos Pensa-se que desempenha um papel importante na iniciação e manutenção das adaptações neurais associadas à sensibilização psicomotora^1,14. Descobrimos que a ativação mediada por CNO de pENK-hM₄D Os receptores reduziram significativamente o número total de células c-Fos induzidas por anfetaminas no estriado (Fig. 1k e Complementar Fig. 5a). Essa redução ocorreu em ambos os neurônios positivos para hemaglutinina (ie, aqueles que expressam hM₄Receptores D) e neurônios hemaglutinantes negativos (ou seja, aqueles que não expressam₄Receptores D; Fig. 1l), sugerindo um efeito neuronal entre hM₄Neurônios que expressam D e neurônios não infectados. Reduções significativas no número total de células c-Fos induzidas por anfetaminas e no número de células c-Fos positivas para hemaglutinina também foram observadas quando hM₄Receptores D foram ativados em neurônios da via direta (Fig. 1n, o e Complementar Fig. 5b). É importante ressaltar que esses efeitos não são simplesmente causados ​​pela expressão viral de um novo receptor, já que a expressão deENK-hM₄D ou pDYN-hM₄D na ausência de tratamento com CNO não teve efeito sobre o número de células Fos evocadas por anfetaminas (Figos Suplementares 6 e 7). Assim, estes resultados demonstram que a ativação mediada por CNO de hM₄Os receptores D também podem levar a diminuições na atividade neuronal, reduzindo a liberação de neurotransmissores e atenuando a sinalização intracelular.

A exposição repetida a drogas que causam dependência pode levar a um aumento progressivo e persistente da responsividade comportamental, muitas vezes referida como sensibilização comportamental. É importante ressaltar que a sensibilização envolve alguns dos mesmos circuitos neurais envolvidos no desenvolvimento do vício em drogas em humanos.³. Aqui usamos nossas novas ferramentas para investigar o efeito do amortecimento específico do circuito da atividade do neurônio do estriado no desenvolvimento da sensibilização à anfetamina. Hipotetizamos que os neurônios da via direta e indireta têm um papel oposto, no qual os neurônios estriatogênicos promovem a sensibilização e os neurônios estriatais do alelo suprimem a sensibilização, consistente com seus papéis conceitualmente propostos na ativação e inibição comportamental, respectivamente.^5,6. Assim, testamos se a diminuição da excitabilidade neuronal dos neurônios estriato-caliciformes induziria a sensibilização a um regime de dosagem de anfetaminas que estimulasse um nível limiar de sensibilização e se a diminuição da excitabilidade neuronal dos neurônios estriatonigrais impediria a sensibilização em um protocolo que normalmente produz uma sensibilização robusta.

Para o primeiro estudo, usamos um regime de tratamento que induz um nível limiar de sensibilização locomotora nos controles GFP (quatro exposições a medicamentos). Após um período de carência, administrou-se uma dose moderada de anfetamina à prova de desafio (2 mg / kg) na ausência de atenuação induzida pela CNO da atividade neuronal para determinar se a sensibilização era persistente. Ativação mediada por CNO de pENK-hM₄D Os receptores durante o tratamento com anfetaminas não alteraram a resposta locomotora aguda à anfetamina (Fig. 2a). No entanto, a interrupção da atividade neuronal mediada por CNO em neurônios da via indireta facilitou o desenvolvimento de uma sensibilização significativamente mais robusta em comparação com os controles da GFP (Fig. 2b). Este aumento da sensibilização foi mantido no teste com anfetamina, que foi realizado uma semana mais tarde na ausência de tratamento com CNO (Fig. 2c, d). Esses efeitos podem ser atribuídos a uma redução da atividade dos neurônios estriatopalidos por hM, dependente de CNO₄Receptores D porque hM₄A expressão do receptor D sem tratamento com CNO não produz sensibilização locomotora a este regime de dosagem suave de anfetamina (Figura Complementar 6).

  

Figura 2

A redução transitória da excitabilidade dos neurônios estriato-caliciformes ou estriatonigrais teve efeitos opostos na sensibilização às anfetaminas. (a, e) Respostas locomotoras agudas à anfetamina após ativação induzida por CNO de pENK-hM₄D (a) e PDYN-hM₄D (e) receptores. ...

A fim de determinar se os neurônios estriatogênicos podem regular a responsividade do medicamento de forma oposta, testamos em seguida o efeito da diminuição da excitabilidade dos neurônios estriatonigros no estriado dorsomedial durante um regime de tratamento com anfetaminas que produz uma sensibilização robusta nos controles da GFP (seis exposições a medicamentos ), bem como durante uma dose baixa de anfetaminas (0.5 mg / kg) na ausência de perturbações mediadas por receptores da actividade neuronal. Tal como com o amortecimento indirecto da via, os decréscimos de excitabilidade mediados pelo CNO dos neurónios da via directa durante o tratamento com anfetaminas não alteraram a resposta locomotora aguda à anfetamina (Fig. 2e). Embora o desenvolvimento de sensibilização parecesse semelhante aos controles GFP após ativação induzida por CNO de pDYN-hM₄D receptores durante a fase de tratamento (Fig. 2f), a sensibilização não persistiu no pDYN-hM₄D grupo, mas ainda era robustamente mantida nos controles GFP (Fig. 2g, h). Esses efeitos também podem ser atribuídos a uma diminuição da atividade de neurônios estriatonigênicos dependente de CNO por hM₄Receptores D porque hM₄A expressão do receptor D na ausência de tratamento com CNO não bloqueou o desenvolvimento da sensibilização locomotora, uma vez que foi observada sensibilização durante a fase de tratamento e no desafio com o fármaco (Figura Complementar 7). Esses dados sugerem que os neurônios estriatonigrais podem ser particularmente importantes para regular as adaptações comportamentais de longo prazo, que são conseqüência do uso repetido de drogas.

Em conclusão, esses dados fornecem a primeira evidência para os papéis críticos e opostos dos neurônios estriatopalidal e estriatonigral na regulação da plasticidade do comportamento dependente da experiência de drogas.. Além disso, a falta de efeito da inibição neuronal na resposta locomotora aguda à anfetamina fornece mais evidências de que os mecanismos que regulam as respostas agudas às drogas são distintos daqueles que modulam as adaptações duradouras que ocorrem com a exposição repetida ao medicamento. Finalmente, o emparelhamento de vetores virais específicos de fenótipos com receptores projetados capazes de alterar a atividade neuronal sem interromper permanentemente a função celular fornece uma nova e poderosa abordagem para desconstruir as bases moleculares da dependência.

Material suplementar

Agradecimentos

Notas de rodapé

Referências