FACS identifikuje jedinečnú reguláciu génu indukovanú kokaínom v selektívne aktivovaných dospelých striatálnych neurónoch (2011) - malé% striatálnych neurónov

J Neurosci. Rukopis autora; dostupné v PMC Sep 16, 2011.
Publikované v konečnom upravenom formulári ako:
PMCID: PMC3073079
NIHMSID: NIHMS279955

 

Finálna upravená verzia tohto článku vydavateľa je k dispozícii zadarmo na adrese J Neurosci
Pozri ďalšie články v PMC to citát publikovaný článok.

abstraktné

Početné štúdie so značkou neurálnej aktivity Fos ukazujú, že kokaín aktivuje iba malú časť riedko distribuovaných striatálnych neurónov. Doteraz neboli dostupné účinné metódy na hodnotenie neuroadaptácií indukovaných špecificky v týchto aktivovaných neurónoch. Na čistenie striatálnych neurónov aktivovaných počas lokomócie vyvolanej kokaínom v naivnej a kokaínovej senzibilizácii sme použili triedenie buniek aktivované fluorescenciou (FACS). CFO-lacZ transgénne potkany. Aktivované neuróny boli značené protilátkou proti p-galaktozidáze, proteínovému produktu génu lacZ. Cocaine indukoval selektívny profil génovej expresie selektívne v malom podiele aktivovaných neurónov, ktorý nebol pozorovaný v neaktivovanej väčšine neurónov. Tieto gény zahŕňali zmenené hladiny bezprostredných skorých génov arc, fosBa nr4a3, ako aj gény zapojené do signalizácie p38 MAPK a špecifickosti bunkového typu. Navrhujeme, aby sa táto metóda FACS mohla použiť na štúdium molekulárnych neuroadaptácií v konkrétnych neurónoch kódujúcich behaviorálne účinky zneužívaných drog a iných naučených návykov.

Kľúčové slová: senzibilizácia na kokaín, nucleus accumbens, neuronálne súbory, fluorescenčné triedenie buniek

ÚVOD

Hlavnou hypotézou súčasného neurobiologického výskumu závislosti od kokaínu je to, že chronická expozícia kokaínu spôsobuje dlhotrvajúce neuroadaptácie v striate a ďalších zložkách mezolimbického dopamínového systému odmeňovania, čo vedie k nutkavému užívaniu drog a dlhodobej zraniteľnosti relapsu (Nestler, 2001; Shaham a nádej, 2005; Kalivas, 2009; Bowers a kol., 2010; Wolf a Ferrario, 2010). Táto hypotéza je však založená na mnohých štúdiách obmedzených na meranie neuroadaptácií v homogenátoch mozgových oblastí alebo v neurónoch vybraných nezávisle od ich aktivačného stavu počas správania.

Rozlišovanie medzi neuroadaptáciami v aktivovaných a neaktivovaných neurónoch je dôležité, pretože môžu hrať rôzne úlohy pri fyziologických, behaviorálnych a psychologických účinkoch kokaínu. Početné štúdie so značkou neurálnej aktivity Fos naznačujú, že kokaín aktivuje iba malé množstvo riedko distribuovaných neurónov v striate. Po kontextovo-špecifickej lokomotorickej senzibilizácii sme preukázali, že Fos je indukovaný iba vtedy, keď boli potkanom injikované injekcie do prostredia spárovaného s liekom a nie do nespáreného prostredia (Mattson a kol., 2008; Koya a kol., 2009). Najdôležitejšie je, že sme preukázali, že tieto selektívne aktivované neuróny hrajú príčinnú úlohu v naučenom spojení medzi kokaínom a prostredím spárovaným s liekom, ktoré sprostredkuje senzibilizáciu špecifickú pre kontext (Koya a kol., 2009). Neuradaptácie vnútri selektívne aktivovaných striatálnych neurónov tak môžu hrať jedinečné a dôležité úlohy pri učení sa v kontexte špecifickej senzibilizácie a iných návykov vyvolaných drogami.

Až doteraz technické obmedzenia sťažovali hodnotenie molekulárnych zmien v malom počte riedko distribuovaných neurónov selektívne aktivovaných počas správania. Techniky, ako je mikrodisekcia pomocou laserového snímania (Kwon a Houpt, 2010) a imunohistochémia s dvojitým označením (Berretta a kol., 1992; Gerfen a kol., 1995; Peters et al., 1996) sú schopné selektívne identifikovať molekulárne zmeny v aktivovaných neurónoch, ale tieto techniky majú veľmi nízku priepustnosť alebo nie sú kvantitatívne. Triedenie buniek aktivované fluorescenciou (FACS) môže byť účinným nástrojom na čistenie populácií dospelých neurónov pre molekulárnu analýzu (Liberles and Buck, 2006; Lobo a kol., 2006). FACS sa však nepoužil na čistenie neurónov na základe ich aktivačného stavu. V súčasnej štúdii sme použili FACS na vyčistenie roztrúsených kokaínom aktivovaných striatálnych neurónov z transgénnych CFO-lacZ potkanov a porovnali svoje jedinečné vzorce génovej expresie s tými v neaktivovanej väčšine neurónov.

METÓDY

zver

Žena CFO-lacZ transgénne potkany (Kasof a kol., 1995; Koya a kol., 2009) a samice potkanov Sprague-Dawley (Charles River, Raleigh, NC, USA) boli ustajnené jednotlivo v štandardných plastových klietkach v miestnosti s kontrolovanou teplotou a vlhkosťou. Udržiavali sa na reverznom svetle 12: 12 h: tmavý cyklus (svetlá svietili na 20.00 h) a umožňovali voľný prístup k potrave a vode. Boli aklimatizované na tieto podmienky umiestnenia minimálne 7 dní pred liečbou drogami. Experimentálne postupy boli schválené Výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie NIDA.

Liečba liekov

Pri pokusoch s akútnym kokaínom sa potkanom injektoval kokaín (30 mg / kg, ip; n = 8) alebo soľankou (1 ml / kg; n = 6) a umiestnil sa do kruhovej komory z plexiskla (priemer 38 cm). Potkany boli usmrtené 90 minút po injekcii, aby sa získalo mozgové tkanivo. Toto ošetrenie sa opakovalo trikrát v oddelených dňoch, aby sa získali tri biologické replikáty na mikročipovú analýzu. Pre kvantitatívnu PCR (qPCR) boli podobne pripravené tri nezávislé biologické replikácie. Pre qPCR analýzy oblúk, pdyn, adora2aboli použité iba tieto tri nezávislé biologické replikácie. Pre qPCR analýzy fosB, nr4a3, kcnc1 a map2k6, použili sme tiež zvyšnú RNA z každej vzorky microarray.

Pri pokusoch s opakovaným užívaním kokaínu sa samice potkanov senzibilizovali štyrmi injekciami kokaínu (15 mg / kg ip) podávanými jedenkrát každý druhý deň. V dňoch injekcie bola každá krysa umiestnená do komory s lokomotorickou aktivitou plexiskla s pohyblivou silou 43 x 43 cm štvorcových (Med Associates, St. Albans, VT, USA), aby bola navyknutá na 30 minút. Potkanom sa injikoval kokaín a pohybová aktivita sa zaznamenala ako vzdialenosť ubehnutá 60 minút. Po štvrtej opakovanej injekcii kokaínu zostali potkany 7 – 8 dní vo svojej domácej klietke. V deň testu boli potkany habituované 30 min. V komorách pohybovej aktivity a potom im bola podaná injekcia kokaínu (30 mg / kg ip) alebo fyziologický roztok. Potkany boli dekapitované a mozgy boli extrahované deväťdesiat minút po injekcii. Celá senzibilizačná liečba sa opakovala trikrát v priebehu oddelených týždňov, aby sa získali tri biologické replikácie z každej skupiny na analýzu qPCR.

Bunková disociácia

Striatálne tkanivo bolo disociované, aby sa získala jednobunková suspenzia. Potkany sa dekapitovali a ich striata sa extrahovala do dvoch minút. Každý striatum bolo mleté ​​žiletkami na ľadovo studenej sklenenej doštičke a umiestnené do 1 ml Hibernátu A (kat. Č. HALF; Brain Bits, Springfield, IL). Striata sa enzymaticky štiepil v 1 ml Accutase per striatum (kat. Č. SCR005; Chemicon, Billerica, MA) s miešaním na konci 30 min pri 4 ° C. Tkanivo sa centrifugovalo počas 2 minút pri 425xg a resuspendovalo sa v 300 μl ľadovo studeného Hibernátu A. Všetky nasledujúce centrifugačné kroky sa uskutočňovali pri 4 ° C.

Štiepené striatálne tkanivo bolo mechanicky disociované trituráciou. Do jednej Eppendorfovej skúmavky sa spojili štyri striaty a desaťkrát sa triturovali Pasteurovou pipetou s veľkým priemerom (~ 1.3 mm). Skúmavky sa krátko umiestnili na ľad, aby sa usadili veľké kúsky tkaniva; 600 ul zakalenej suspenzie obsahujúcej disociované bunky sa prenieslo do skúmavky Falcon 15 ml na ľade. Do pôvodnej Eppendorfovej skúmavky sa pridalo 600μL čerstvého Hibernátu A a potom sa kroky triturácie opakovali, ako je uvedené vyššie, s pipetami so stredným a malým priemerom (~ 0.8 mm a ~ 0.4 mm). Každá zakalená suspenzia obsahujúca disociované bunky sa spojila s predchádzajúcou suspenziou.

Zostávajúce bunkové zhluky v združenej bunkovej suspenzii sa odstránili filtráciou cez vopred navlhčené bunkové sitá 100 um a 40 um (značka Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA). Malé bunkové zvyšky v suspenzii sa redukovali odstredením filtrátu počas 3 min pri 430xg pomocou gradientu hustoty Percoll v troch krokoch (kat. Č. P1644; Sigma, St. Louis, MO). Zakalená horná vrstva (približne 2 ml) obsahujúca zvyšky sa odstránila. Bunky vo zvyšných vrstvách sa resuspendovali v zostávajúcom roztoku Percoll a centrifugovali sa päť minút pri 550xg. Peleta sa resuspendovala v 1 ml Hibernátu A.

Imunoznačenie a FACS

Disociované bunky boli fixované a permeabilizované pridaním rovnakého objemu etanolu pre konečnú koncentráciu 50% etanolu a udržiavané na ľade 15 minút s občasným premiešaním. Bunky sa centrifugovali počas 2 minút pri 425xg a resuspendovali sa vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátmi bez RNázy (PBS). Bunky boli inkubované s biotinylovanou primárnou protilátkou proti NeuN (1: 1000 riedenie, kat. Č. MAB377B, Chemicon) a primárnou protilátkou proti β-galaktozidáze ((β-gal; 1: 10000, kat. Č. 4600-1409, Biogenesis, Poole) Bunky sa rotovali end-over-end v primárnej protilátke počas 30 minút pri 4 ° C a odstreďovali sa tri minúty pri 425xg. Bunky sa premyli 800 μl PBS a resuspendovali v 700 μl PBS. s fluorescenčne značeným streptavidínom (streptavidín-fykoerytrín, 1: riedenie 1000, kat. č. SA1004-1, Invitrogen, Carlsbad, CA) a sekundárnou protilátkou (Alexa Fluor 488-značená anti-kozia IgG, 1: 1000 riedenie, kat. č. A- 11055, Invitrogen) a rotačný end-over-end počas 15 min. Bunky boli premyté 800 μl PBS, centrifugované počas 3 minút pri 425 x g a resuspendované v 1 ml PBS.

Imunooznačené bunky boli skenované a triedené v jadrovom zariadení prietokovej cytometrie Johns Hopkins Bayview Campus. Na triedenie buniek sa použila ária FACS (BD, Franklin Lakes, NJ). Kontrolné vzorky sa analyzovali najskôr, aby sa stanovili optimálne kritériá pre triedenie testovaných vzoriek. Konkrétne boli fixované bunky bez ošetrenia protilátkami použité na nastavenie brány rozptylu svetla. Fixované bunky ošetrené fluorescenčnou sekundárnou protilátkou, ale bez primárnej protilátky, sa potom použili na nastavenie prahov pre fluorescenciu endogénneho tkaniva a nešpecifickú väzbu streptavidínom alebo sekundárnou protilátkou. Ďalej sa na kompenzáciu fluorescenčného prekrytia v susedných kanáloch použili kontrolné vzorky jednotlivo označené primárnou a sekundárnou protilátkou pre každý proteín (NeuN alebo P-gal). Nakoniec sa analyzovali a triedili testované vzorky označené obidvoma fluorescenčnými značkami. Triedené bunky boli zhromaždené do skúmaviek s nízkou väzbou (Cat # 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) s 100 μl PBS v každej skúmavke.

Extrakcia RNA

Po triedení boli vzorky obsahujúce buď pgal-pozitívne alebo pgal-negatívne bunky z potkanov s injekciou kokaínu alebo všetky NeuN-pozitívne bunky z potkanov s injekčným roztokom chloridu sodného odstreďované 8 min pri 2650 x g pri 18 ° C. NeuN-negatívne bunky z potkanov, ktorým bol podaný fyziologický roztok, boli centrifugované 8 min. Pri 6000xg pri 18 ° C. V prípade experimentov na mikročipoch sa RNA extrahovala pomocou Trizol Reagent (kat. Č. 15596-026, Invitrogen) podľa pokynov výrobcu. Kvalita a množstvo RNA sa hodnotili pomocou Bioanalyzer Picochip (kat. Č. 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Pre experimenty qPCR sa RNA extrahovala pomocou súpravy RNEasy Micro (kat. Č. 74004; Qiagen, Valencia, CA) podľa pokynov výrobcu s pôsobením DNázy. Množstvo a čistota RNA bola stanovená pomocou spektrofotometra Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Experimenty s mikročipom

Microarrays sa použili na analýzu RNA z NeuN-pozitívnych a NeuN-negatívnych buniek z potkanov, ktorým bola injikovaná soľanka, a pgal-pozitívnych a Pgal-negatívnych neurónov z potkanov, ktorým bola podaná kokaín. Ako je opísané vyššie v časti liečby liečivom, mikročipy obsahovali tri biologické replikáty pre každý zo štyroch typov vzoriek. Päť μl celkovej RNA z každej vzorky sa označilo pomocou súpravy na amplifikáciu RNA Illumina TotalPrep RNA (kat. Č. IL1791; Ambion, Austin, TX) v dvojkrokovom procese syntézy cDNA, po ktorom nasledovalo in vitro RNA transkripcia s biotínom-16-UTP. 0.75 μg biotínom značenej cRNA sa hybridizovalo po dobu 16 s Illumina Sentrix Rat Ref12_v1 BeadChips (kat. Č. BD-27-303; Illumina, San Diego, CA). Biotinylovaná cRNA hybridizovaná s čipom bola detegovaná streptavidínom značeným Cy3 a kvantifikovaná použitím skenera Illumina BeadStation 500GX Genetic Analysis Systems. Všetky označovania a analýzy sa uskutočňovali v jadre rodiny Johns Hopkins Bayview Medical Campus Lowe Family Genomics.

Kvantitatívna PCR v reálnom čase

Kvantitatívna PCR v reálnom čase bola použitá na potvrdenie výsledkov FACS a mikročipu. RNA bola reverzne transkribovaná do cDNA pomocou súpravy RETROscript (kat. Č. AM1710, Ambion) s oligo (dT) primérom. Každá reakcia 25 μl PCR zahŕňala 12.5 μl hlavnej zmesi expresie Taqman Gene (Cat #4369514; Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.1 μl každého z 20 μM forwardových a reverzných primérov, 0.25 μl 100 μM FAM-značenej sondy, 5 μl vody a 5 μl 1 ng / μl cDNA. Kombinácie primeru a sondy [Tabuľka 1] boli navrhnuté s použitím Designového centra Roche Universal Probe Library Assay Design na intronové preklenutie. PCR reakcie boli monitorované s použitím Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD). Program sa začal odčítaním doštičiek 20 pri teplote 50 ° C pre fotobielenie, potom nasledovalo 5 min pri 95 ° C a potom 40 cykly 20 s pri 94 ° C, 1 min pri 60 ° C a odčítanie doštičky.

Tabuľka 1 

Priméry a sondy používané pre qPCR

Pre každý gén sa najprv uskutočnili reakcie na štandardnú krivku, aby sa určila účinnosť amplifikácie [Tabuľka 1]. Hladiny expresie pre každý amplifikovaný gén boli vypočítané pomocou účinnosti ^ ACq kde ΔCq = Cq(experimentálny gén) - Cq(referenčný gén) pre každý biologický replikát. Gorasp2 bol vybraný ako referenčný gén, pretože sa v mikročipových analýzach medzi neurónmi a gliami nevyjadril inak. Ďalej bol validovaný ako referenčný gén kvôli rovnakej amplifikácii qPCR vo všetkých vzorkách pri nanášaní rovnakého množstva templátu. Technická skúška trojnásobneq hodnoty boli spriemerované pred výpočtom ACq pre každý gén vo vzorke. Pre každú mRNA meranú v qPCR boli priemerné hodnoty génovej expresie naprieč biologickými replikátmi. Potom, aby sme odzrkadlili hodnoty násobnej zmeny, rozdelili sme tento priemer priemernými hodnotami génovej expresie NeuN-pozitívnych buniek od potkanov, ktorým bola podaná soľanka. Tieto hodnoty sú v grafoch a tabuľkách označené ako stredné hodnoty a štandardné chyby.

imunohistochémia

Mozgové tkanivo sa získalo od samíc potkanov kmeňa Spraque-Dawley divého typu nasledujúcim rovnakým akútnym a opakovaným ošetrením kokaínom opísaným vyššie pre experimenty microarray a qPCR. Avšak 90 minút po injekciách v deň testu boli potkany hlboko anestézované izofluránom a perfundované 100 ml PBS nasledované 400 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Mozgy sa dodatočne fixovali v PFA počas 2 hodín a preniesli sa do 30% roztoku sacharózy pri 4 ° C počas 2-3 dní. Mozgy sa zmrazili na práškovom suchom ľade a udržiavali sa pri -80 ° C až do rozdelenia. Koronálne rezy boli narezané na hrúbku 40 μm medzi Bregma 2.5 a -0.5 (Paxinos a Watson, 1998).

Rezy boli imunoznačené pre Fos a Arc. V krátkosti boli rezy trikrát premyté v Tris-pufrovanom soľnom roztoku (TBS) a permeabilizované počas 30 min v TBS s 0.2% Triton X-100. Rezy boli opäť premyté v TBS a inkubované v primárnych protilátkach zriedených v PBS s 0.3% Triton X-100 počas 24 hodín na trepačke pri 4 ° C. Použili sme králičie polyklonálne protilátky proti c-Fos (1: riedenie 500, Cat # sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a myšiu monoklonálnu Arc protilátku (1: 100 riedenie, Cat # sc-17839, Santa Cruz Biotechnology). Rezy sa premyli trikrát v TBS a inkubovali sa v sekundárnych protilátkach zriedených v PBS počas 1.5 hodín na trepačke pri teplote miestnosti. Použili sme Alexa Fluor 488-označenú somárovú anti-králičiu protilátku (1: riedenie 200, kat. Č. A21206, Invitrogen) a kozej anti-myšej protilátky značenej Alexa Fluor 568 (1: riedenie 200, kat. Č. A11004, Invitrogen). Rezy boli premyté v TBS, namontované na sklíčka potiahnuté chrómom a pokryté sklíčkom s tvrdým nastavením VectaShield.

Fluorescenčné obrazy imunoreaktivity Fos a Arc v kaudátovom putamene a NAc (približne 2.0 mm pred Bregma) sa zachytili pomocou CCD kamery (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) pripojenej k mikroskopu Zeiss Axioskop 2. Obrázky na počítanie označených buniek boli urobené pri zväčšení 200x; obrázky na stanovenie kolokalizácie Fos a Arc boli urobené pri zväčšení 400x. Značené bunky zo štyroch hemisfér na potkana sa automaticky spočítali pomocou softvéru IPLab pre počítače Macintosh, verzia 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Počty zo všetkých štyroch hemisfér boli spriemerované na získanie jednej hodnoty pre každú krysu.

Analýza dát

Údaje o lokomočnej senzibilizácii sa analyzovali pomocou jednosmernej ANOVA s opakovanými meraniami pre hlavný účinok času počas 4 injekčných dní. Štatistická významnosť bola stanovená na p <0.05. Údaje z mikročipu boli analyzované pomocou programu DIANE 6.0, tabuľkového procesora pre mikročipy založeného na SAS JMP 7.0, ako už bolo opísané (Garg a kol., 2009). Údaje o intenzite fluorescencie z mikročipov boli filtrované detekciou p-hodnoty a Z normalizácie. Kvalita vzorky sa analyzovala pomocou rozptylov, analýzy hlavných zložiek a vzorky génov Z- hierarchické zoskupenie založené na skóre, aby sa vylúčili možné odľahlé hodnoty. Potom boli použité testy ANOVA na elimináciu génov s väčšími odchýlkami v rámci každej porovnávacej skupiny. Gény boli identifikované ako diferenciálne exprimované, ak p <0.01, absolútne Z- pomer ≥ 1.5 a pomer falošných objavov (fdr) <0.07. Pre údaje qPCR sa na porovnanie údajov pre každý gén použila jednosmerná ANOVA. Štatistická významnosť bola stanovená na p <0.05. Pre imunohistochémiu Fos a Arc sa na výpočet štatistickej významnosti použil t-test za predpokladu nerovnakej odchýlky nastavenej na p <0.05.

VÝSLEDKY

transgénne potkany cfos-lacZ

CFO-lacZ transgén u týchto krýs je regulovaný a c-fos promótor podobný tomu v endogénnom c-fos gén a je teda podobne aktivovaný v neurónoch vysokými hladinami excitačného synaptického vstupu (Shin a kol., 1990; Labiner a kol., 1993; Sgambato a kol., 1997). Bielkovinový produkt CFO-lacZ transgén, p-galaktozidáza (pgal), sa ko-exprimuje s c-Fos v silne aktivovaných neurónoch (Koya a kol., 2009) a používa sa na označenie aktivovaných striatálnych neurónov v nasledujúcom postupe purifikácie FACS.

FACS purifikácia aktivovaných striatálnych neurónov po jednotlivých akútnych injekciách kokaínu

Celá striata sa získala z CFO-lacZ potkanom 90 minút po akútnych injekciách 30 mg / kg kokaínu alebo fyziologického roztoku mimo ich domácej klietky. Disociované striatálne bunky z podobne ošetrených potkanov sa zhromaždili pred purifikáciou FACS pre každú z biologických replikátov v následných analýzach mikročipov a kvantitatívnych PCR (qPCR). Disociované striatálne bunky boli spočiatku analyzované podľa svojich charakteristík rozptylu vpred a bočnom svetle [Obrázok 1a]. Väčšina neurónov značených NeuN bola nájdená v pásme udalostí pozdĺž dolnej časti grafu. Všetky následné analýzy sa teda uskutočňovali tak, aby zahŕňali iba udalosti nájdené v tomto páse.

Obrázok 1 

Fluorescenčné aktivované triedenie βgal-značených neurónov z potkanov ošetrených jednou injekciou kokaínu

Bunky v tomto hradle boli separované podľa stupňa imunoznačenia neurónovým markerom NeuN a neurálnym aktivačným markerom Pgal. V tkanive získanom z potkanov s injekciou kokaínu malo približne 15% neurónov značených NeuN vysoké hladiny βgal [Obrázok 1b], čo zodpovedá približne 100,000 pgal-značeným neurónom na potkana. Všetky pgal značené bunky ko-exprimovali NeuN, čo naznačuje, že p-gal exprimovali iba neuróny. Na rozdiel od toho veľmi málo neurónov značených NeuN získaných z potkanov s injekciou fyziologického roztoku exprimovalo aktivačné markery pgal alebo Fos, ktoré podporujú imunoreaktivitu pgal a Fos ako markery neurálnej aktivácie u potkanov s injekciou kokaínu. Nízky počet neurónov exprimujúcich βgal z potkanov, ktorým bola podaná soľanka, neposkytoval dostatok buniek na následné molekulárne analýzy. Vo všetkých následných experimentoch so striatálnym tkanivom získaným z potkanov, ktorým sa injektoval fyziologický roztok, sme teda použili len označenie NeuN na oddelenie neuronálnych buniek od buniek neurónov. Celkovo bolo približne 30% všetkých striatálnych bunkových teliesok NeuN pozitívnych, čo zodpovedalo približne 600,000 striatálnym neurónom na potkana. Keď sa FACS-purifikované bunky skúmali fluorescenčnou mikroskopiou, všetky bunky boli okrúhle a postrádali procesy [Obrázok 2]. Mikroskopické pozorovanie potvrdilo, že FACS-triedené bunky boli vhodne označené pre NeuN- a βgal imunoreaktivitu. Zistilo sa, že vzorky FACS-purifikovaných buniek boli> 90% čisté, keď sa hodnotili pomocou druhého kola prietokovej cytometrie (údaje nie sú uvedené).

Obrázok 2 

Mikroskopické fotografie buniek a zvyškov čistených pomocou FACS

Selektivitu nášho postupu čistenia FACS sme stanovili pomocou mikročipu na analýzu vzorov génovej expresie buniek čistených pomocou FACS. Porovnali sme génovú expresiu v pgal pozitívnych a pgal negatívnych neurónoch potkanov, ktorým bola podaná kokaín, ako aj v NeuN pozitívnych a NeuN negatívnych bunkách z potkanov, ktorým bol podaný fyziologický roztok. Analýza hlavných zložiek a zhlukov naznačila, že primárnym diferenciačným faktorom bolo to, či boli bunky neuróny alebo glia [Obrázok 3a]. Druhým diferenciačným faktorom bola expresia βgal použitá na oddelenie aktivovaných od neaktivovaných neurónov. Gény boli identifikované ako diferenciálne exprimované, ak p <0.01, absolútne Z- pomer ≥ 1.5 a pomer falošných objavov (fdr) <0.07. Zistili sme, že sa zvýšilo 125 génov a znížilo sa 467 génov v βgal-pozitívnych neurónoch v porovnaní s βgal-negatívnych neurónoch získaných z rovnakého striatálneho tkaniva potkanov s injekciou kokaínu [Obrázok 3b]. Keď sa porovnali rovnaké neuróny pozitívne na βgal z potkanov injikovaných kokaínom s kontrolnými vzorkami všetkých neurónov označených NeuN z potkanov injikovaných soľným roztokom, zvýšilo sa 133 génov a v βgal-pozitívnych neurónoch sa znížilo 890 génov. Obzvlášť dve kontrolné skupiny - βgal-negatívne neuróny od potkanov s injekciou kokaínu a všetky neuróny označené NeuN od potkanov s injekčným roztokom - produkovali veľmi podobné vzory génovej expresie; expresia génu sa medzi týmito kontrolnými skupinami významne nelíšila [Obrázok 3b].

Obrázok 3 

Analýza mikročipov buniek triedených od potkanej striey po jednorazovej injekcii kokaínu alebo fyziologického roztoku

Špecifické gény nájdené v rôznych skupinách vzoriek potvrdili separáciu aktivovaných od neaktivovaných neurónov, ako aj od neurónov od buniek iných ako neurónov pomocou FACS [Tabuľka 2]. Ne-pozitívne neuróny βgal z potkanov, ktorým bola podaná kokaín, exprimovali vyššie hladiny mnohých markerových génov pre neurálnu aktiváciu v porovnaní s βgal-negatívnymi neurónmi z rovnakých potkanov, ktorým bola podaná kokaín alebo všetky neuróny označené NeuN z potkanov, ktorým bola podaná injekcia fyziologickým roztokom [Obrázok 3c]. Tieto gény markerov aktivity zahŕňali c-fos, Junbo, oblúk, EGR rodina (1, 2, 4) a nr4a3 (Guzowski a kol., 2005). Je zaujímavé, že tieto pgal-pozitívne neuróny tiež exprimovali významne vyššie hladiny génu prodynorfínu špecifického pre markerový bunkový typ D1 dopamínového receptora a významne nižšie hladiny génu dopamínového receptora D2.

Tabuľka 2 

Súhrn údajov z mikročipu a qPCR z experimentu s akútnym kokaínom.

Dáta o expresii génov pre mikročipy boli overené pomocou qPCR. Gény markerov aktivity fosB, oblúka nr4a3 boli exprimované vo vyšších hladinách v pgal pozitívnych neurónoch potkanov injektovaných kokaínom relatívne k pgal negatívnym neurónom z tých istých potkanov injektovaných kokaínu a voči všetkým neurónom potkanov injikovaných fyziologickým roztokom [Obrázok 4a; údaje a štatistické informácie v roku 2007 Tabuľka 2]. βgal-pozitívne neuróny tiež exprimovali vyššie hladiny génu prodynorfínu [Obrázok 4b]. Zatiaľ čo βgal-pozitívne neuróny mali zjavne nižšie hladiny expresie pre niekoľko génov, vrátane A2A adenozínového receptora, Kv3.1 draselného kanála a génov map2k6 / MEKK6, iba úrovne expresie Kv3.1 a map2k6 / MEKK6 boli štatisticky odlišné použitím qPCR [Obrázok 4c]. Celkovo boli zmeny génovej expresie vyhodnotené pomocou qPCR takmer identické so zmenami génovej expresie vyhodnotenými pomocou mikročipových experimentov.

Obrázok 4 

Kvantitatívna PCR demonštruje odlišný profil génovej expresie pre βgal-pozitívne neuróny po akútnych injekciách kokaínu v porovnaní s βgal-negatívnymi neurónmi od tých istých potkanov alebo so všetkými neurónmi z potkanov, ktorým bola podaná soľanka.

Na stanovenie toho, či sa zmeny mRNA v aktivovaných neurónoch odrážali na proteínovej úrovni, sme použili imunohistochemickú analýzu rezov mozgu koronálnymi kmeňmi od samíc potkanov divokého typu injektovaných kokaínom a soľným roztokom [Obrázok 5]. Tieto rezy nepodstúpili disociáciu alebo FACS, a preto imunohistochemická analýza nebola ovplyvnená disociáciou buniek zistenou v postupe FACS. In ventrálne striatum od potkanov s injekciou kokaínu [Obrázok 5a], boli markery neurálnej aktivity Fos a Arc koexprimované v rovnakých bunkách: 85 ± 4% všetkých Fos-pozitívnych buniek bolo Arc pozitívnych, zatiaľ čo 82 ± 3% všetkých Arc-pozitívnych buniek bolo Fos-pozitívnych. Injekcie kokaínu spôsobili 2.7-násobné zvýšenie neurónov značených Fos a 2.7-násobné zvýšenie neurónov značených Arc. Pri dorzálnom striatume od potkanov, ktorým sa podala kokaín [Obrázok 5b], 80 ± 2% všetkých Fos-pozitívnych buniek bolo Arc pozitívnych, zatiaľ čo 86 ± 3% všetkých Arc-pozitívnych buniek bolo Fos-pozitívnych. Injekcie kokaínu spôsobili 4.4-násobné zvýšenie neurónov značených Fos a 3.8-násobné zvýšenie neurónov značených Arc.

Obrázok 5 

Fos a Arc sú koexprimované v (a) ventrálnom striatume a (b) dorzálnom striatu po jednorazovej injekcii kokaínu

FACS purifikácia aktivovaných striatálnych neurónov od potkanov senzibilizovaných na kokaín

V druhom experimente FACS boli všetky potkany senzibilizované opakovanými injekciami kokaínu. Opakované podávanie kokaínu v lokomotorickom boxe zlepšilo lokomóciu vyvolanú kokaínom: locomócia v 7 v deň 180 bola 18 ± 1% v deň 4 lokomócia (hlavný účinok času pri opakovaných injekciách XNUMX, F3, 363 = 24.9, p <0.001), čo naznačovalo významnú psychomotorickú senzibilizáciu. O sedem dní neskôr v testovací deň sa potkanom podal kokaín alebo soľný roztok v rovnakom lokomotorickom boxe. O deväťdesiat minút neskôr sa extrahovalo striatálne tkanivo vrátane NAc a bunky sa purifikovali pomocou FACS pomocou postupu opísaného vyššie.

Bunky v rovnakom pruhu udalostí rozptylom svetla ako v predchádzajúcom experimente boli separované podľa stupňa imunoznačenia neurónovým markerom NeuN a neurálnym aktivačným markerom Pgal. V tkanive získanom z potkanov s injekciou kokaínu malo približne 10% neurónov značených NeuN vysoké hladiny βgal [Obrázok 6], čo zodpovedá približne 60,000 pgal-značeným neurónom na potkana. Všetky pgal značené bunky ko-exprimovali NeuN, čo naznačuje, že p-gal exprimovali iba neuróny. Tkanivo získané z potkanov, ktorým bol v deň testu injikovaný fyziologický roztok, produkovalo veľmi málo neurónov exprimujúcich Pgal alebo Fos, a teda nie je dostatok buniek na následné molekulárne analýzy. Preto sme použili len označenie NeuN na oddelenie neuronálnych buniek od buniek iných ako neuronálnych buniek získaných od potkanov, ktorým bola podaná soľanka. Približne 30% všetkých bunkových telies u potkanov, ktorým bola podaná soľanka, bolo NeuN pozitívnych, čo v tomto experimente zodpovedalo približne 400,000 striatálnym neurónom na potkana.

Obrázok 6 

Fluorescenčné aktivované triedenie βgal značených neurónov od senzibilizovaných krýs vystavených kokaínu 7 dní po opakovanom ošetrení kokaínom

Použili sme qPCR na porovnanie génovej expresie v βgal pozitívnych a βgal negatívnych neurónoch potkanov s injekciou kokaínu, ako aj vo všetkých NeuN-pozitívnych neurónoch potkanov s injekciou soľným roztokom po senzibilizácii na kokaín. βgal-pozitívne neuróny potkanov s injekciou kokaínu exprimovali vyššie hladiny troch markerových génov neurálnej aktivity - fosB, oblúka nr4a3–Vzťah k βgal-negatívnym neurónom od rovnakých potkanov s injekciou kokaínu a ku všetkým neurónom od potkanov s injekciou soľným roztokom [Obrázok 7a; údaje a štatistické informácie v roku 2007 Tabuľka 3]. βgal-pozitívne neuróny tiež exprimovali vyššiu hladinu génu prodynorfínu podobnú tej v experimente s injekciou jedného kokaínu [Obrázok 7b]. Naopak, pgal-pozitívne neuróny mali nižšie hladiny expresie pre niekoľko génov [Obrázok 7c], počítajúc do toho Drd2 kódujúce dopamínový receptor D2 a Map2k6 kódujúci kinázu, ktorá aktivuje p38 MAPK, podobnú experimentu s akútnou injekciou kokaínu. Nakoniec, pgal-pozitívne neuróny mali zvýšenú expresiu dusp1, známe tiež ako mkp1 [Obrázok 7c], ktorá kóduje fosfatázu, ktorá inaktivuje p38 MAPK (Sgambato a kol., 1998).

Obrázok 7 

Kvantitatívna PCR demonštruje odlišný profil génovej expresie v pgal pozitívnych neurónoch od senzitizovaných kokaín-stimulovaných potkanov, v porovnaní s pgal-negatívnymi neurónmi rovnakých krýs alebo všetkými neurónmi z potkanov infikovaných soľným roztokom
Tabuľka 3 

Zhrnutie údajov qPCR z opakovaného experimentu s kokaínom.

Na stanovenie toho, či sa zmeny mRNA v aktivovaných neurónoch odrážajú na proteínovej úrovni, sme použili imunohistochemickú analýzu rezov mozgu z koronálnych samíc potkanov citlivých na kokaín po injekciách kokaínu alebo fyziologického roztoku v deň testu. Pri ventrálnom striatu potkanov, ktorým sa injektoval kokaín, boli markery neurálnej aktivity Fos a Arc koexprimované v rovnakých bunkách: 90 ± 2% všetkých Fos pozitívnych buniek bolo Arc pozitívnych a 83 ± 2% všetkých Arc pozitívnych bunky boli Fos-pozitívne. Injekčné injekcie na kokaín spôsobili 2.3-násobné zvýšenie neurónov značených Fos a 2.2-násobné zvýšenie neurónov značených Arc. U dorzálneho striata u potkanov, ktorým bola podaná kokaín, bolo 93 ± 2% všetkých Fos-pozitívnych buniek Arc pozitívnych a 90 ± 3% všetkých Arc-pozitívnych buniek bolo Fos-pozitívnych. Injekčné injekcie na kokaín spôsobili 4.4-násobné zvýšenie neurónov značených Fos a 4.5-násobné zvýšenie neurónov značených Arc. Teda len veľmi málo buniek, ktoré nie sú označené ako Fos, exprimovalo Arc a veľmi málo buniek, ktoré nie sú označené ako Arc, exprimovalo Fos, čo podporuje naše zistenia z triedených buniek.

DISKUSIA

Vyvinuli sme postup na čistenie a hodnotenie molekulárnych zmien v neurónoch definovaných iba ich predchádzajúcim aktivačným stavom počas lokomotorickej aktivity indukovanej kokaínom. Dáta z experimentov microarray, qPCR a imunohistochémie nezávisle potvrdili, že náš postup FACS identifikoval jedinečné molekulárne zmeny v aktivovaných neurónoch, ako je definované v c-fos promótor indukcia pgal expresie. Hlavným biologickým nálezom pri použití tohto postupu bolo to, že okamžité skoré gény (IEG) sú indukované iba v aktivovaných neurónoch, zatiaľ čo expresia IEG je nezmenená alebo dokonca znížená v neaktivovanej väčšine neurónov. Pretože mnohé z týchto markerov neurálnej aktivity IEG sú tiež transkripčné faktory, je pravdepodobné, že sa v týchto aktivovaných neurónoch následne indukujú veľmi odlišné vzorce génovej expresie, čo môže prispievať k fyziologickým a behaviorálnym účinkom kokaínu (pozri napríklad (Curran a Franza, 1988; Nestler a kol., 1993; McClung a kol., 2004; Loebrich a Nedivi, 2009).

Diferenciálna indukcia IEG medzi aktivovanými a neaktivovanými neurónmi podporuje hypotézu, že počas lokomócie vyvolanej kokaínom je silne aktivovaná iba menšina neurónov, zatiaľ čo väčšina neurónov je aktivovaná v oveľa menšej miere alebo vôbec nie. Elektrofyziologické experimenty na potkanoch divokého typu naznačujú, že expresia proteínu Fos koreluje s vysokými hladinami excitačného synaptického vstupu (Shin a kol., 1990; Labiner a kol., 1993; Sgambato a kol., 1997). Vieme, že expresia Fos a Pgal je podobne regulovaná v rovnakých neurónoch v CFO-lacZ potkany (Koya a kol., 2009). Z toho vyvodzujeme, že zvýšená expresia pgal a IEG iba v malom počte striatálnych neurónov naznačuje, že iba menšina striatálnych neurónov dostáva vysoké hladiny excitačného synaptického vstupu v reakcii na podávanie kokaínu.

Diskrétna aktivácia striatálnych neurónov je v súlade s hypotézou upstate-downstate, ktorá popisuje protichodné účinky dopamínu na aktivitu striatálnych neurónov. Predpokladá sa, že dopamín vyvolaný kokaínom zvyšuje rozdiely medzi neurónmi s vysokou aktivitou a nízkou aktivitou tým, že zvyšuje prebiehajúcu elektrofyziologickú aktivitu neurónov, ktoré sú už v stave vysokej aktivity, zatiaľ čo tlmí prebiehajúcu aktivitu väčšiny neurónov s nižšou aktivitou (Wilson a Kawaguchi, 1996; Hernandez-Lopez a kol., 1997; Nicola a kol., 2000; O'Donnell, 2003; Nicola a kol., 2004). Výsledné zvýšenie pomeru signálu k šumu nielen zvyšuje selektivitu počas akútnej signalizácie, ale, ako sa uvádza v našej štúdii, môže tiež prispieť k indukcii jedinečných molekulárnych neuroadaptácií iba u neurónov s vysokou aktivitou. Medzitým sa génová expresia v pgal negatívnych neurónoch, ktoré tvoria väčšinu striatálnych neurónov potkanov s injekciou kokaínu, zdala byť odlišná od génovej expresie v striatálnych neurónoch od potkanov s injekciou fyziologického roztoku; to podporuje hypotézu, že väčšina striatálnych neurónov zostáva počas vystavenia kokaínu v dolnej polohe.

Komponenty signálnej dráhy kinázy p38 MAP kinázy boli tiež rozdielne zmenené medzi aktivovanými a neaktivovanými neurónmi. Génová expresia Map2k6 / MEKK6, kinázy, ktorá aktivuje p38, bola znížená, zatiaľ čo génová expresia Mkp1 / Dusp1, fosfatázy, ktorá inaktivuje p38 (Sgambato a kol., 1998), sa zvýšila u aktivovaných neurónov, ale nie u neaktivovaných neurónov. Takže celková signalizácia p38 MAPK hrá úlohu pri synaptickej plasticite (Bolshakov a kol., 2000; Izumi a kol., 2008), môžu byť atenuované v aktivovaných neurónoch v porovnaní s neaktivovanou väčšinou neurónov.

FACS môže tiež pomôcť identifikovať neurónové typy, ktoré sa aktivujú po akútnej alebo opakovanej expozícii kokaínu. V aktivovaných neurónoch sme zistili vyššiu expresiu génu pre neuronálny markerový gén D1 a zníženú expresiu dopamínových receptorov D2 a receptorov adenozínu A2A v aktivovaných neurónoch. To naznačuje, že Fos bol indukovaný primárne v D2 striatálnych neurónoch. Aj keď to súhlasí s mnohými imunohistochemickými štúdiami, ktoré uvádzajú indukciu Fos primárne v neurónoch D1 po injekciách psychostimulancií do domáca klietka (Berretta a kol., 1992; Cenci a kol., 1992), je v rozpore s rovnakou aktiváciou neurónov D1 a D2 zistených po injekciách psychostimulancií v relatívne nové prostredie mimo klietky domácej klietky (Jaber a kol., 1995; Badiani a kol., 1999; Hope a kol., 2006).

Pretože sme použili rovnaký βgal marker na identifikáciu aktivovaných neurónov počas FACS, ako sme použili pre náš predtým opísaný postup inaktivácie Daun02 (Koya a kol., 2009), je pravdepodobné, že pozorujeme jedinečné molekulárne zmeny v neuronálnych súboroch, ktoré sú potrebné pre naučenú zložku kontextovo špecifickej senzibilizácie lokomócie vyvolanej kokaínom. Už sme predtým zistili, že inaktivácia iba malého počtu riedko distribuovaných neurónov v domnelej skupine je dostatočná na narušenie kontextovo špecifickej psychomotorickej senzibilizácie na kokaín (Koya a kol., 2009). Tento nález bol zopakovaný pomocou tej istej ženy CFO-lacZ potkany a režim senzibilizácie použitý v tejto štúdii [http://irp.drugabuse.gov]. Tieto neuróny nie sú vo svojej podstate citlivejšie na všetky podnety, pretože zmena prostredia alebo kontextu, v ktorom sa liek podával, aktivovala po injekciách kokaínu odlišnú skupinu striatálnych neurónov (Mattson a kol., 2008; Koya a kol., 2009). Výber špecifického súboru striatálnych neurónov sa zdá byť primárne závislý od modelu aktivity kortikálnych a subkortikálnych glutamatergických aferentov (Pennartz a kol., 1994; O'Donnell, 2003) a tieto vstupy sú samy určované špecifickými environmentálnymi a interceptívnymi stimulmi prítomnými počas správania. Z tejto predchádzajúcej práce spolu s našimi súčasnými údajmi predpokladáme, že opakované párovanie kokaínu s environmentálnymi stimulmi počas nášho režimu senzibilizácie vedie k jedinečným molekulárnym zmenám v opakovane aktivovaných neuronálnych súboroch, čo môže prispieť k naučeným združeniam, ktoré sú základom kontextovo špecifickej senzibilizácie.

Celkovo sme demonštrovali novú aplikáciu FACS na izoláciu dospelých neurónov selektívne aktivovaných počas akútnej lokomotorickej aktivity indukovanej kokaínom a opakovanej lokomotorickej senzibilizácie indukovanej kokaínom. Navrhujeme, aby sa tento prístup mohol použiť aj na identifikáciu jedinečných molekulárnych neuroadaptácií v neuronálnych súboroch kódujúcich behaviorálne účinky zneužívaných drog a iných naučených návykov. Príčinné úlohy týchto jedinečných molekulárnych neuroadaptácií v nervovej plasticite a správaní sa musia nakoniec skúmať manipuláciou génovej expresie iba v aktivovaných neurónoch; táto technika sa však ešte musí vyvinúť.

Poďakovanie

Tento výskum bol podporený intramurálnym výskumným programom Národného ústavu pre zneužívanie drog. D. Guez-Barber podporili NIH MSTP TG 5T32GM07205, číslo ocenenia F30DA024931 od Národného inštitútu pre zneužívanie drog a Charles BG Murphy predseda psychiatrie na Yale University. Ďakujeme Joe Chrestovi za jeho vynikajúcu technickú pomoc s FACS a Chrisovi Cheadleovi, Tonyovi Watkinsovi a Alanovi Bergerovi za ich prácu na mikročipe. Ďakujeme Yavinovi Shahamovi za užitočné pripomienky k rukopisu.

poznámky pod čiarou

 

Pre autorov tohto rukopisu nejestvuje konflikt záujmov.

Referencie

  1. Badiani A, Oates MM, deň HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Environmentálna modulácia amfetamínom indukovanej expresie c-fos v D1 verzus D2 striatálnych neurónov. Behav Brain Res. 1999, 103: 203-209. [PubMed]
  2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM. Agonisty dopamínu a glutamátu stimulujú neurónovo špecifickú expresiu proteínu podobného Fos v striatu. J Neurophysiol. 1992, 68: 767-777. [PubMed]
  3. Bolshakov VY, Carboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. Dual MAP kinázové dráhy sprostredkujú opačné formy dlhodobej plasticity na synapsiách CA3-CA1. Nat Neurosci. 2000, 3: 1107-1112. [PubMed]
  4. Bowers MS, Chen BT, Bonci A. Synaptická plasticita receptora AMPA indukovaná psychostimulanciami: minulosť, prítomnosť a terapeutická budúcnosť. Neurón. 2010, 67: 11-24. [Článok bez PMC] [PubMed]
  5. Cenci MA, Campbell K, Wictorin K, Bjorklund A. Indukcia c-fos kokaínom alebo apomorfínom sa vyskytuje prednostne vo výstupných neurónoch premietajúcich do substancie Nigra u potkanov. Eur J Neurosci. 1992, 4: 376-380. [PubMed]
  6. Curran T, Franza BR., Jr Fos a Jun: pripojenie AP-1. Bunka. 1988, 55: 395-397. [PubMed]
  7. Garg S, Nichols JR, Esen N, LiuS, Phulwani NK, Syed MM, Wood WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. MyD88 expresia bunkami rezidentmi CNS je kľúčová pre vyvolanie ochrannej imunity v mozgových abscesoch. ASN Neuro. 2009: 1. [Článok bez PMC] [PubMed]
  8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB. Funkcia dopamínového receptora D1 a D2 v striatu: koaktivácia receptorov D1 a D2-dopamínu na samostatných populáciách neurónov vedie k okamžitej okamžitej génovej odpovedi v neurónoch obsahujúcich D1. J Neurosci. 1995, 15: 8167-8176. [PubMed]
  9. Guzowski JF, Timlin JA, Roysam B, McNaughton BL, Worley PF, Barnes CA. Mapovanie behaviorálnych nervových obvodov s okamžitou expresiou génov. Curr Opin Neurobiol. 2005, 15: 599-606. [PubMed]
  10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, Surmeier DJ, Reyes A, Galarraga E. Aktivácia receptora D1 zvyšuje evokovaný výboj v neostriatálnych stredne ostnatých neurónoch moduláciou vodivosti Ca2 + typu L. J Neurosci. 1997, 17: 3334-3342. [PubMed]
  11. Nádej B, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. Kolaínom indukovaná lokomotorická aktivita a expresia Fos v nucleus accumbens sú senzitizované po dobu 6 mesiacov po opakovanom podaní kokaínu mimo domácej klietky. Eur J Neurosci. 2006, 24: 867-875. [PubMed]
  12. Izumi Y, Tokuda K, Zorumski CF. Dlhodobá inhibícia potenciacie nízkou aktiváciou N-metyl-D-aspartátového receptora zahŕňa kalcineurín, oxid dusnatý a p38 mitogénom aktivovanú proteínkinázu. Hippocampus. 2008, 18: 258-265. [PubMed]
  13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. Akútne a chronické amfetamínové ošetrenie rôzne reguluje hladiny RNA neuropeptidových messengerov a Fos imunoreaktivitu v striatálnych neurónoch potkanov. Neuroscience. 1995, 65: 1041-1050. [PubMed]
  14. Kalivas PW. Hypotéza glutamátovej homeostázy závislosti. Nat Rev Neurosci. 2009, 10: 561-572. [PubMed]
  15. Kasof GM, Mahanty NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI. Spontánna a vyvolaná glutamátová signalizácia ovplyvňuje expresiu Fos-lacZ a smrť pyramídových buniek v kultúrach hipokampálnych rezov od transgénnych potkanov. Brain Res Mol Brain Res. 1995, 34: 197-208. [PubMed]
  16. Koya E, Golden S, Harvey B, Guez-Barber D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farquhar D, Ghosh S, Mattson B, Hope B. Cielené prerušenie kokaínom aktivované jadro accumbens neurónov zabraňuje kontextovo špecifickej senzibilizácii. Nat Neurosci. 2009, 12: 1069-U1152. [Článok bez PMC] [PubMed]
  17. Kwon B, Houpt TA. Kombinovaná metóda mikrodisekcie laserovým záchytom a histológia X-Gal na analýzu génovej expresie v c-Fos-špecifických neurónoch. J. Neurosciho metódy. 2010, 186: 155-164. [Článok bez PMC] [PubMed]
  18. Labiner DM, Butler LS, Cao Z, Hosford DA, Shin C, McNamara JO. Indukcia c-fos mRNA zapálenými záchvatmi: komplexný vzťah s vypaľovaním neurónov. J Neurosci. 1993, 13: 744-751. [PubMed]
  19. Liberles SD, Buck LB. Druhá trieda chemosenzorických receptorov v čuchovom epiteli. Nature. 2006, 442: 645-650. [PubMed]
  20. Lobo MK, Karsten SL, šedá M, Geschwind DH, Yang XW. Profilovanie FACS polí subtypov striatálnej projekcie neurónov v juvenilných a dospelých myších mozgoch. Nat Neurosci. 2006, 9: 443-452. [PubMed]
  21. Loebrich S, Nedivi E. Funkcia funkčne regulovaných génov v nervovom systéme. Physiol Rev. 2009; 89: 1079 – 1103. [Článok bez PMC] [PubMed]
  22. Mattson B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Hope B. Kontextovo špecifická senzibilizácia lokomotorickej aktivity vyvolanej kokaínom a súvisiace neurónové súbory v jadre potkana accumbens. Eur J Neurosci. 2008, 27: 202-212. [PubMed]
  23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekulárny prepínač pre dlhodobú adaptáciu v mozgu. Brain Res Mol Brain Res. 2004, 132: 146-154. [PubMed]
  24. Nestler E, Hope B, Widnell K. Drogová závislosť - model pre molekulárny základ neurálnej plasticity. Neurón. 1993; 11: 995–1006. [PubMed]
  25. Nestler EJ. Molekulárna podstata dlhodobej závislosti od závislosti. Nat Rev Neurosci. 2001, 2: 119-128. [PubMed]
  26. Nicola SM, Surmeier J, Malenka RC. Dopaminergná modulácia neuronálnej excitability v striate a nucleus accumbens. Annu Rev Neurosci. 2000, 23: 185-215. [PubMed]
  27. Nicola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO. Zvýšenie kontrastu: fyziologický účinok striatálneho dopamínu? Cell Tissue Res. 2004, 318: 93-106. [PubMed]
  28. O'Donnell P. dopamínové bránenie predných mozgových súborov. Eur J Neurosci. 2003, 17: 429-435. [PubMed]
  29. Paxinos G, Watson C. Mozog potkana v stereotaxických súradniciach. 4. San Diego: Academic Press; 1998.
  30. Pennartz CM, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH. Jadro pripadá ako komplex funkčne odlišných neuronálnych súborov: integrácia behaviorálnych, elektrofyziologických a anatomických údajov. Prog Neurobiol. 1994, 42: 719 € "761. [PubMed]
  31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ. Expresia c-Fos v potkanovom intergénnom letáku: fotická regulácia, spoločná lokalizácia s Fos-B a bunková identifikácia. Brain Res. 1996, 728: 231-241. [PubMed]
  32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM. Vplyv elektrickej stimulácie mozgovej kôry na expresiu proteínu Fos v bazálnych gangliách. Neurosci. 1997, 81: 93-112. [PubMed]
  33. Sgambato V, strany C, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. Extracelulárny signál-regulovaná kináza (ERK) riadi okamžitú skorú indukciu génov po kortikostiatálnej stimulácii. J Neurosci. 1998, 18: 8814-8825. [PubMed]
  34. Shaham Y, Hope BT. Úloha neuroadaptácií pri relapse k vyhľadávaniu drog. Nat Neurosci. 2005, 8: 1437-1439. [PubMed]
  35. Shin C, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Cohen DR. Indukcia expresie c-fos mRNA následným vybitím v hipokampu naivných a zapálených potkanov. J Neurochem. 1990, 55: 1050-1055. [PubMed]
  36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. Vznik vzniku spontánnych fluktuácií spontánnych membránových potenciálov neostriatálnych ostnatých neurónov. J Neurosci. 1996, 16: 2397-2410. [PubMed]
  37. Wolf ME, Ferrario CR. Plastifikácia AMPA receptora v jadre po opakovanej expozícii kokaínu. Neurosci Biobehav Rev 2010 [Článok bez PMC] [PubMed]