Abstrakt
Psykostimuleringsinducerad förändring av dendritiska spines på dopaminoceptiva nervceller i nukleobatterier (NAcc) har antagits som ett adaptivt neuronalt svar som är kopplat till långvarigt beroendeframkallande beteenden. NAcc består i stor utsträckning av två distinkta subpopulationer av medelstora spiny neuroner som uttrycker höga nivåer av antingen dopamin D1 eller D2 receptorer. I den föreliggande studien analyserade vi dendritisk ryggradens densitet efter kronisk kokainbehandling i olika D1- eller D2-receptorinnehållande medelstora spiny neuroner i NAcc. Dessa studier utnyttjade transgena möss som uttryckte EGFP under kontroll av antingen D1- eller D2-receptorpromotorn (Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP). Efter 28-dagar av kokainbehandling och 2-dagars uttag ökade ryggradens densitet i både Drd1-EGFP- och Drd2-EGFP-positiva neuroner. Ökningen i ryggradens densitet upprätthölls emellertid endast i Drd1-EGFP-positiva neuroner 30 dagar efter drogavdrag. I synnerhet observerades ökat ΔFosB-uttryck också i Drd1-EGFP- och Drd2-EGFP-positiva neuroner efter 2-dagar med läkemedelsuttag men endast i Drd1-EGFP-positiva neuroner efter 30-dagar med drogavdrag. Dessa resultat tyder på att den ökade ryggradensitet som observerats efter kronisk kokainbehandling är stabil endast i D1-receptorinnehållande neuroner och att ΔFosB-uttryck är associerat med bildandet och / eller upprätthållandet av dendritiska ryggrad i D1 såväl som D2-receptorinnehållande neuroner i NAcc.
Den mesolimbiska dopaminerga vägen är sammansatt av neuroner i det ventrala tegmentala området som innervar kärnan accumbens (NAcc), olfaktorisk tuberkel, prefrontal cortex och amygdala (1), medan nigrostriatal dopaminerga neuroner i substantia nigra (pars compacta) ger en stigande projicering mot dorsalstriatum (2). Psykostimulanter höjer synaptiska koncentrationer av dopamin i NAcc: kokain, genom att blockera dopaminupptaget från den synaptiska klyftan och amfetamin genom att främja dopaminfrisättning från nervterminaler (3-5). Upprepad, intermittent administrering av psykostimulantia resulterar i ökade beteendemässiga reaktioner (sensibilisering) mot de akuta stimulerande effekterna av dessa läkemedel (6-8). De flesta bevislinjer tyder på att adaptiva förändringar i det ventrala tegmentala området-NAcc-dopaminerge systemet är centrala för förändringar i den erfarenhetsberoende plasticitet som ligger till grund för läkemedelsinducerat beteende.
Förutom dopamin krävs glutamat för utveckling av beteendssensibilisering som svar på psykostimulanter (9, 10). Medelstora, spiny neurons (MSNs) i ventralstriatum får excitatoriska glutamatergiska utsprång från prefrontal cortex som synaps på huvudet på dendritiska spines. MSN är också det huvudsakliga målet för dopaminerga axoner som synaplar på ryggradshalsar (1, 11, 12). Därför representerar dendritiska ryggrad i MSN det cellulära facket där dopaminerg och glutamatergisk överföring initialt integreras.
Dopamin verkar på två huvudreceptor-subfamiljer, D1-subfamiljen (D1 och D5-subtyper) och D2-subfamiljen (D2, D3 och D4-subtyper) (13). I dorsalstriatum har anatomiska studier visat att striatonigral MSN innehåller höga D1-receptorer (tillsammans med substans P och dynorfin), medan striatopallidala MSNs övervägande uttrycker D2-receptorer (tillsammans med enkefalin) (14-17). Projektionerna från NAcc är mer komplexa än i dorsalstriatum, med skalet och kärndelarna i NAcc som projicerar till distinkta delregioner av ventral pallidum och till ventral tegmental area och substantia nigra (18). Medan D2-receptorer och enkefalin uttrycks starkt i prognoser mot ventralpallidum, upptäcks D1-receptorer och substans P lika fördelade i utskjutningar till ventral pallidum och ventral tegmental area (19). Studier av agonister och antagonister selektiva för D1- eller D2-receptorer visade att både D1- och D2-receptorer erfordras för psykostimulantberoende beteendeförändringar (20-25). Men dessa receptors roller verkar vara olika. Stimulering av D1-receptorer dämpar till exempel kokainsökande inducerad av kokain-priminginjektioner och kokainrelaterade miljöanpassningar, medan stimulering av D2-receptorer underlättar kokaininducerad återinställning (26-28).
De beteendemässiga abnormiteterna i samband med psykostimulantberoende är extremt långlivade. Därför har det varit ett stort intresse för att identifiera långvariga läkemedelsinducerade förändringar på molekylär och strukturell nivå i neuronala kretsar reglerade av dopamin och glutamat (29-32). I synnerhet har långvarig exponering för kokain eller amfetamin visat sig öka antalet dendritiska grenpunkter och spines av MSN i NAcc (33-35). Dessa strukturella förändringar har visat sig kvarstå i upp till ≈1-3.5 månader efter den senaste läkemedelsexponeringen (30, 35) och har föreslagits att ligga till grund för långvariga förändringar i synaptisk plasticitet i samband med psykostimulant exponering.
Målet med den föreliggande studien var att undersöka kokaininducerade strukturella förändringar av dendritiska spines i subpopulationer av accumbal MSN som uttrycker antingen D1- eller D2-receptorer. I dessa studier har vi använt bakteriella artificiella kromosom (BAC) transgena möss som uttrycker EGFP under kontroll av antingen D1 (Drd1-EGFP) eller D2 (Drd2-EGFP) dopaminreceptorpromotorn (36). Resultaten indikerar att även om ökad ryggradensitet initialt inträffar i D1-receptorinnehållande MSN och D2-receptorinnehållande MSN, är den förändrade ryggradens densitet stabil endast i D1-receptorinnehållande neuroner. Dessutom finner vi liknande förändringar i uttrycket av transkriptionsfaktorn ΔFosB, vilket tyder på att ΔFosB kan vara involverad i bildandet och / eller upprätthållandet av dendritiska spines i D1 såväl som D2-receptorinnehållande neuroner i NAcc.
Resultat
Analys av MSN: er i Drd1-EGFP och Drd2-EGFP BAC-transgena möss.
Projektionsmönstret för MSN från dorsalt och ventralstriatum i Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP BAC transgena möss har karakteriserats genom analys av GFP-uttryck (36). Differensialuttrycket av GFP i MSNs av dorsalstriatum motsvarar i allmänhet det hos endogena D1 respektive D2-receptorer (36). Vi analyserade vidare differentialexpression av GFP i NAcc i Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP-möss (Fig 1a och b). Även om ≈58% av neuroner i NAcc uttryckte GFP i Drd1-EGFP-möss (Fig 1a), ≈48% av neuroner i NAcc uttryckte GFP i Drd-2-EGFP-möss (Fig 1b). MSN representerar 90-95% av alla neuroner i NAcc (12, 37). D1-receptorer uttrycks endast i MSN, och D2-receptorer uttrycks i MSN och i kolinerga internuroner, vilka representerar 1-3% av striatalneuroner (37). Med hänsyn till dessa faktorer föreslår resultaten att minimalt ≈10-15% av MSN i NAcc sannolikt kommer att uttrycka både D1- och D2-receptorer.
Analys av dendritiska spines i Drd1-EGFP och Drd2-EGFP-möss.
GFP-uttryck i Drd1-EGFP och Drd2-EGFP-mössen var användbart för att fläcka neuronala cellkroppar. GFP-signalen i dendrit och dendritiska spines var emellertid för svag för att tillåta deras analys efter immunförfärande med anti-GFP-antikroppar. Partikelmedierad ballistisk tillförsel av fluorescerande färgämnen har nyligen använts för att märka neuronpopulationer på ett snabbt och effektivt sätt (38). Hela neuroner kan märkas med användning av denna teknik, och metoden verkar vara jämförbar med Golgi-Cox-färgning. För att analysera neuronernas dendritiska morfologi i NAcc, märktes fasta accumbalskivor med den lipofila fluorescensfärgen 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat (DiI) genom att använda en genpistol. Ett exempel på en DiI-färgad MSN visas i Fig 1c. Under de använda betingelserna observerade vi generellt märkta neuroner utan några överlappande dendriter från andra märkta neuroner. Vid högre förstoring kunde detaljerad dendritisk morfologi, inklusive dendritiska ryggrad, observeras (Fig 1d).
Vi använde sedan en kombination av DiI-märkning och immunhistokemi för GFP i antingen Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP transgena möss, vilket möjliggjordes genom att använda en låg koncentration av tvättmedel för vävnadspermeabilisering (se Metoder). Genom noggrann jämförelse av DiI-fläcken och GFP-uttrycket i cellkropparna i MSN kunde vi identifiera DiI- och GFP-positiva eller DiI-positiva och GFP-negativa neuroner i Drd1-EGFP (Fig 2a) eller Drd2-EGFP (Fig 2b) möss. För följande studier analyserade vi dendritisk morfologi i endast DiI- och GFP-positiva neuroner från Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP-möss.
Kronisk kokainbehandling resulterar i ökad ryggradsdensitet i Accumbal MSNs som uttrycker antingen Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP.
Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP-möss injicerades upprepade gånger med kokain (30 mg / kg) eller saltlösning i fyra på varandra följande veckor (se Metoder). Två dagar (2WD) eller 30-dagar (30WD) efter den sista läkemedelsbehandlingen behandlades hjärnor för DiI-märkning och immunhistokemi såsom beskrivits ovan. En tidigare studie rapporterade att kronisk behandling med amfetamin ökade ryggradens densitet på distala men inte proximala dendriter av MSN i NAcc (35). Vi begränsade därför vår analys till distala dendriter (dvs. de med andra eller tredje ordergrenar), inklusive terminalregioner. När det analyserades vid 2WD befanns ryggradsdensitet öka i Drd1-EGFP-positiva MSN (128% saltlösning) (Fig 3a och c) och i mindre utsträckning i Drd2-EGFP-positiva neuroner (115% saltlösning) (Fig 3 b och d). Efter 30WD bibehölls ökad ryggradensitet i Drd1-EGFP-positiva neuroner (118% saltlösningskontroll) (Fig 3 a och c) men inte i Drd2-EGFP-positiva neuroner (Fig 3 b och d).
Dendritiska spines morfologi är varierande med avseende på deras längd och ryggradets bredd. Vi klassificerade därför dendritiska utskjutningar i fyra ryggradsklasser (stubby, svamp, tunna och filopodier) vid 2WD från kokain (data visas inte). Tätheten av svamp-typ (119.7 ± 4.0%, P <0.01) och tunna ryggar (120.0 ± 3.4%, P <0.01) ökades genom kokainbehandling i Drd1-EGFP-positiva MSN, medan densiteten hos stubbiga (182.4 ± 21.6%, P <0.05) och svampryggar (122.5 ± 5.0%, P <0.01) ökade i Drd2-EGFP-positiva MSN. Det fanns ingen signifikant ökning av stubbiga ryggar i Drd1-EGFP-positiva nervceller eller tunna ryggar i Drd2-EGFP-positiva neuroner.
Kronisk kokain inducerar ΔFosB-uttryck i Drd1-EGFP- eller Drd2-EGFP-positiva MSN i NAcc.
ΔFosB är medlem i Fos-familjen av transkriptionsfaktorer. Medan akut administration av kokain inducerar en snabb och transient induktion av flera Fos-isoformer i NAcc, ökar upprepad exponering för kokain nivån av ΔFosB. Dessutom kvarstår ökningen av ΔFosB-expression i NAcc i veckor till månader efter avbrytande av läkemedelsexponering och har föreslagits att vara involverad i långvarig reglering av genuttryck, även efter att läkemedelsupptagningen upphört (29, 39, 40).
För att undersöka induktionen av ΔFosB i NAcc från Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP-möss efter kokainbehandling analyserade vi FosB- och GFP-uttryck med dubbel märkning (Fig 4 och Tabell 1) Anti-FosB-antikroppen känner igen alla former av FosB, men vi antar att den ökade immunostainen representerar AFosB (se Metoder för vidare diskussion). I saltlösningsbehandlade möss uttryckte 16% av Drd1-EGFP-positiva neuroner och 15% av Drd2-EGFP-positiva neuroner FosB-immunreaktivitet med relativt svag intensitet (Fig 4 a och b och Tabell 1). Repeterad kokainbehandling följt av 2WD resulterade i en signifikant ökning av antalet Drd1-EGFP-positiva neuroner som samuttryckte ΔFosB (55% av GFP-positiva neuroner) (Fig 4c och Tabell 1). En mindre, men fortfarande signifikant ökning av ΔFosB-uttryck, hittades i Drd2-EGFP-positiva neuroner (25% av GFP-positiva neuroner) (Fig 4d och Tabell 1). Liksom vid förändringarna i ryggradens täthet upprätthölls det ökade uttrycket av ΔFosB i Drd1-EGFP-positiva neuroner (46% av GFP-positiva neuroner) men inte i Drd2-EGFP-positiva neuroner (15% av GFP-positiva neuroner) efter 30WD (Fig 4 e och f och Tabell 1). Observera att det ökade ΔFosB-uttrycket observerat i Fig 4f är närvarande i Drd2-EGFP-negativa neuroner.
Diskussion
Långvariga anpassningar vid dopaminerg neurotransmission antas ligga till grund för beroendeframkallande beteenden i samband med psykostimulerande läkemedel. I synnerhet har psykostimuleringsinducerade ökningar av dendritisk ryggradens täthet hos MSN i NAcc antagits för att kopplas till omorganisation av synaptisk anslutning (30). NAcc består i stor utsträckning av två distinkta subpopulationer av MSN som uttrycker höga nivåer av antingen D1 eller D2 dopaminreceptorer. I den föreliggande studien har vi analyserat ryggradens densitet i olika D1- eller D2-receptorinnehållande MSN i NAcc efter kronisk kokainbehandling. De erhållna resultaten visar att även om ökad ryggradsdensitet ursprungligen uppträder i D1-receptorinnehållande MSN och D2-receptorinnehållande MSN, är förändrad ryggradensitet endast stabil i D1-receptorinnehållande neuroner. Dessutom finner vi ett liknande mönster av förändringar i uttrycket av transkriptionsfaktorn ΔFosB i D1 och D2-receptorinnehållande MSN.
Dessa studier utnyttjade BAC-transgena möss som uttrycker GFP i specifika subpopulationer av MSN under kontroll av antingen D1- eller D2-receptorpromotorn. Dessutom utvecklade vi en dubbelmärkningsmetod som kombinerade immunhistokemi för GFP med ballistisk märkning av neuroner med DiI. Tidigare studier har använt Golgi-Cox-metoden för att analysera effekten av psykostimulanter på ryggradens densitet (34) och DiI-metoden som användes här gav resultat som var kvantitativt jämförbara. Vi utvecklade dubbelmärkningsmetoden eftersom Golgi-färgning inte är kompatibel med immunhistokemi. Immunostaining kräver vanligtvis vävnadspermeabilisering med detergenter, en process som vanligen leder till solubilisering av lipofila färgämnen från membranet (38). I våra nuvarande studier krävde emellertid inte GFP-immunförstoring en hög koncentration av tvättmedel för vävnadspermeabilisering och kunde sålunda användas tillsammans med lipofil färgämnesmärkning. Vår dubbelmärkningsmetod bör generellt vara användbar för studier av strukturella förändringar i dendritiska spines, till exempel vid användning för analys av BAC-transgena möslinjer där GFP uttrycks i specifika populationer av neuroner i cortex (36).
Även om det fortfarande är något kontroversiellt antas det att D1- och D2-receptorer i stor utsträckning är anatomiskt segregerade till de direkta (striatonigrala) och indirekta (striatopallidala) striatalprojektionsneuronerna (17, 41). Initial karakterisering av lokaliseringen av GFP i Drd1-EGFP och Drd2-EGFP-mössen stämde överens med denna slutsats (36). Dessutom är vår analys av antalet GFP-positiva neuroner i NAcc från Drd1-EGFP och Drd2-EGFP-möss förenlig med slutsatsen att ≈50% av MSN uttrycker endast D1-receptorer, att ≈35-40% uttrycker endast D2-receptorer, och att ≈10-15% uttrycker både D1- och D2-receptorer. Detta värde av samuttryck liknar det som underförstått av studier av dorsalstriatum som kombinerade patch-clamp-analys av enskilda striatala neuroner med RT-PCR-tekniker för att isolera och amplifiera mRNA (≈17% -ekspression av enkefalin och substans P) (42). Det bör noteras att våra nuvarande studier inte tar upp frågan om uttryck av D3-, D4- och D5-receptorer, och de tar inte heller upp frågan om låga expressionsnivåer av D1-receptorer i MSN som uttrycker höga nivåer av D2-receptorer eller vice versa.
Flera tidigare studier har undersökt neuronal lokalisering av psykostimulantinducerat Fos-uttryck och rollen av D1- och D2-receptorer (43-45). Dessa studier stödde slutsatsen att Fos och ΔFosB induktion medieras genom aktivering av D1 receptorer. Den cellulära lokaliseringen av Fos-uttryck påverkas emellertid av det miljökontext där psykostimulerande läkemedel administreras (46, 47). Exempelvis inducerar amfetamin eller kokain i hemburet omedelbara tidiga gener (inklusive Fos) företrädesvis i substans-P-positiva celler som samexpress D1-receptorer. Däremot kan dessa läkemedel inducera Fos-uttryck i både D1- och D2-receptorinnehållande MSN när de administreras i en ny miljö. Det protokoll som används i våra nuvarande studier omfattade inte parning av läkemedelsinjektion med exponering för en ny miljö. Vi kan emellertid inte utesluta någon slags kontextberoende stress som är ansvarig för ΔFosB-uttryck i D2-receptorinnehållande MSN.
En anmärkningsvärd egenskap hos föreliggande resultat var det parallella mönstret av ökad ryggradens densitet och FFosB-uttryck. Ökad ryggradsdensitet och ΔFosB-uttryck inträffade ursprungligen i MSN som uttrycker Drd1-EGFP och Drd2-EGFP. Emellertid var dessa förändringar stabila endast i D1-receptorinnehållande neuroner. En möjlig förklaring till observationen att ökad ryggradsdensitet och ΔFosB-uttryck var övergående i D2-receptorinnehållande neuroner är att detta inträffade i den lilla fraktionen av MSN som samexpressar både D1- och D2-dopaminreceptorer. Sålunda kan de transienta egenskaperna hos dessa ökningar associeras med antagonistiska effekter av D2-receptoraktivering på D1-beroende signaleringsvägar (48). Det är av intresse att förändringarna i ryggradens densitet och ΔFosB-uttryck var reversibla, vilket kan återspegla förmågan hos D2-receptorberoende signaleringsvägar att påverka stabiliteten av FFB.
Observationen att det finns parallella förändringar i uttrycket av ΔFosB och ryggradsdensitet överensstämmer med idén att ΔFosB är involverad i initialbildningen och det efterföljande underhållet av dendritiska ryggrad i D1-receptorinnehållande neuroner i NAcc. Uttryck av ΔFosB styrs av D1 / DARPP-32 / PP1-beroende signaleringsvägen i MSN (49). Flera studier har visat att ΔFosB spelar en viktig roll i psykostimulansers givande och lokomotoriska aktiviserande åtgärder (39), sannolikt genom att påverka uttrycket av multipla gener som inkluderar neurotransmittorreceptorer, signaleringsproteiner och proteiner involverade i reglering av neuronmorfologi (50). Emellertid är de specifika molekylära mekanismerna som är involverade i kronisk kokaininducerad ryggradssbildning för närvarande inte kända. Våra tidigare studier har visat att intraaccumbal infusion av Cdk5-hämmaren roscovitin försvagad kokaininducerad ökning av ryggradens densitet (51). Dessutom är Cdk5 en nedströms målgen för ΔFosB och har blivit implicerad i kompensations adaptiva förändringar i samband med kronisk kokainbehandling (52). Därför är förändring i Cdk5-beroende fosforylering en trovärdig mekanism som ligger bakom kokaininducerad ryggradssbildning och / eller ryggradsstabilitet. PAK (53), p-katenin (54), PSD-95 (55) och spinofilin (56) är substrat för Cdk5 och är alla inblandade i reglering av ryggradsmorfogenes (57-60). Ytterligare karaktärisering av dessa och andra Cdk5-substrat i ryggraden kommer förhoppningsvis att belysa de mekanismer som är involverade i reglering av ryggradssbildning genom psykostimulanter.
Metoder
Djur.
Möss som bär en EGFP-transgen under kontroll av antingen D1- eller D2-dopaminreceptorerna alstras genom Gensat BAC-transgenprojektet (36). De transgena mössen som användes i denna studie var 4-5 veckor gamla och var på en Swiss-Webster-bakgrund. Möss behölls i en 12: 12-h ljus / mörk cykel och inrymdes i grupper av 2-5 med mat och vatten tillgängligt ad libitum. Alla djurprotokoll var i överensstämmelse med National Institutes of Health Guide för vård och användning av laboratoriedjur och godkändes av Rockefeller University Institutionella Animal Care and Use Committee.
Drogbehandling.
Kronisk kokainbehandling (30 mg / kg, dagligen) rapporterades ge en robust ökning av ryggradens täthet hos MSN i både kärnan och skalet av NAcc från råtta, men en lägre dos (15 mg / kg) ökade bara ryggradens densitet skalet (61). Vi använde därför den högre dosen av kokain för att inducera strukturell modifiering i båda delarna av NAcc. Möss fick en injektion (ip) av 30 mg / kg kokain-HCl (eller saltlösning) varje dag under 5 på varandra följande dagar följt av 2-injektionsfria dagar och denna procedur upprepades under 4 i följd i veckan. Injektioner utfördes i hemburet. 2WD eller 30WD, behandlades mushjärnor för DiI-märkning och / eller immunhistokemi.
Ballistisk märkning med fluorescerande färgämne DiI.
Möss bedövades med 80 mg / kg natriumpentobarbital och perfusionerades transkartärt med 5 ml PBS följt av snabb perfusion med 40 ml 4% paraformaldehyd i PBS (20 ml / min). Hjärnorna avlägsnades snabbt från skallen och postfixed i 4% paraformaldehyd för 10 min. Hjärnskivor (100 μm) märktes genom ballistisk tillförsel av fluorescerande färgämne DiI (Molecular Probes) som beskrivet i ref. 38. En kombinerad DiI-märkning-immunohistokemi metod utvecklades med en låg koncentration av tvättmedel. DiI-märkta sektioner permeabiliserades med 0.01% Triton X-100 i PBS för 15 min och inkuberades därefter i 0.01% Triton X-100 och 10% normal get serum i PBS för 1 h för att minimera icke-specifik märkning. Tissuesektioner inkuberades sedan med 1% normal get serum / 0.01% Triton X-100 och anti-GFP antikropp (Abcam, Cambridge, MA) för 2 h vid rumstemperatur, tvättades och inkuberades i en 1: 1,000 utspädning av FITC- konjugerad sekundär antikropp (Molecular Probes). Sektioner placerades på mikroskopskivor och täckt med monteringsmedium. Den ballistiska märkningsmetoden möjliggjorde detaljerad analys av dendritisk ryggradsstruktur och de erhållna resultaten var kvalitativt och kvantitativt jämförbara med tidigare studier med användning av Golgi-Cox-impregneringsmetoden i råtthjärnskivor (34). I motsats till tidigare studier observerade vi sällan tvåhåriga ryggrad i DiI-färgade neuroner. Denna skillnad kan orsakas av känsligheten hos färgningsmetoder eller variabilitet hos mus (denna studie) mot råttavävnad (34).
Immunohistokemi.
Djur bedövades och perfusionerades såsom beskrivits ovan. Hjärnor avlägsnades och lagrades över natten i 4% paraformaldehyd vid 4 ° C. Hjärnor överfördes till 30% sackaros i PBS-lösning för kryoprotektion. Koronala sektioner (12 ^ im) skars på en frysande mikrotom (Leica) och behandlades sedan för immunhistokemi. Hjärnsektioner permeabiliserades sedan i 0.3% Triton X-100 i PBS för 15 min och sköljdes två gånger i PBS. Sektionerna förinkuberades i 10% normalt gettserum i PBS för 1 h vid 37 ° C, exponerade för primära antikroppar (utspädd i 1% normal get serum i PBS) över natten vid 4 ° C och sköljdes därefter i PBS och inkuberades med sekundär antikroppar för 1 h vid 37 ° C. Följande antikroppar användes: kanin anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz-bioteknik), mus anti-NeuN (Chemicon), kanin anti-GFP, FITC-konjugerat anti-kanin IgG och rhodamin- konjugerad anti-mus-IgG (Molecular Probes). För triple-märkning (ΔFosB, NeuN och GFP) immuniserades hjärnavsnitt först med anti-pan FosB antikropp och anti-NeuN antikropp och inkuberades sedan med sekundära antikroppar (rhodamin-konjugerad anti-kanin IgG och cyan-konjugerad anti-mus IgG ). Dubbelfärgade hjärnsektioner bearbetades vidare för GFP immunostaining med användning av Zenon-märkningsteknologi (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Anti-pan-FosB antikroppen höjdes till N-terminalen hos FosB och känner igen AFosB och full längd FosB (62). Baserat på tidigare studier som visade att ΔFosB men inte FosB eller andra Fos-relaterade antigener uttrycks stabilt efter kronisk kokainbehandling, antar vi att de långvariga ökningarna av immunreaktivitet representerar stabilt uttryck av ΔFosB. Emellertid är identiteten hos den immunreaktiva FosB-signalen observerad i saltlösningsbehandlade möss okänd. Statistisk analys i Tabell 1 använde studentens t testet.
Dendritisk ryggradsanalys.
Individuella MSN i NAcc valdes för ryggradsanalys baserat på flera kriterier. (i) Det var minimal eller ingen överlappning med andra märkta celler för att säkerställa att processer från olika celler inte skulle förväxlas. (ii) Minst tre primära dendriter måste vara synliga för att celler ska användas för analys. (iii) Distala dendriter (terminala dendriter eller nära terminal-dendriter) undersöktes. Dendriter från båda MSN i kärnan och skalet i NAcc analyserades. Även om vi observerade glest ryggade MSN (taggig typ II), analyserade vi bara tätskiktade MSN (taggig typ I). För att beräkna ryggradens densitet spårades en längd av dendrit (> 20 mikrometer lång) med hjälp av ett konfokalmikroskop (Zeiss LSM 510) med en oljedjupslins (× 40). Alla bilder av dendriter togs på olika sätt z nivåer (0.5-1 μm djupintervall) för att undersöka morfologin hos dendritiska spines. Alla mätningar gjordes med metamorf bildanalysprogramvara (Universal Imaging, Downingtown, PA). Statistisk analys använde Kolmogorov-Smirnov-testet.
Utskjutningar från dendriter klassificerades i fyra typer baserat på deras längd som beskrivs i refs. 63 och 64. Klass 1-utsprång, även kallade stubbiga utskjutningar, var <0.5 mikrometer långa, saknade ett stort rygghuvud och verkade inte ha nacke; klass 2, eller svampformade ryggar, var mellan 0.5 och 1.25 μm långa och kännetecknades av en kort nacke och ett stort rygghuvud; klass 3, eller tunna ryggar, varierade mellan 1.25 och 3.0 μm och hade långsträckta ryggradshalsar med små huvuden; klass 4, eller filopodialförlängningar, var långa trådiga utsprång som saknade ett urskiljbart rygghuvud.
Erkännanden
Detta arbete stöddes av United States Public Health Service Grant DA10044 (till PG och ACN) och av The Simons Foundation, Peter J. Sharp Foundation, Picower Foundation och FM Kirby Foundation.
Förkortningar
- NACC
- kärnan accumbens
- MSN
- medelstor spiny neuron
- BAC
- bakteriell artificiell kromosom
- Drd1
- dopaminreceptor D1-promotor-driven
- Drd2
- dopaminreceptor D2-promotor-driven
- Dil
- 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat
- 2WD
- 2 dagar efter sista läkemedelsbehandling
- 30WD
- 30 dagar efter sista läkemedelsbehandling.
Referensprojekt
;
