FACS identifierar unik kokaininducerad genreglering i selektivt aktiverade vuxna striatala nervceller (2011) - små procent av striatala nervceller

J Neurosci. Författarmanuskript; tillgängligt i PMC september 16, 2011.
Publicerad i slutredigerad form som:
PMCID: PMC3073079
NIHMSID: NIHMS279955

 

Förläggarens slutredigerade version av den här artikeln finns gratis på J Neurosci
Se andra artiklar i PMC som citerar den publicerade artikeln.

Abstrakt

Många studier med neuralaktivitetsmarkören Fos indikerar att kokain endast aktiverar en liten del av glest fördelade striatala neuroner. Fram till nu var effektiva metoder inte tillgängliga för att bedöma neuroadaptationer inducerade specifikt inom dessa aktiverade neuroner. Vi använde fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att rena striatal neuroner aktiverade under kokaininducerad rörelse i naiv och kokainkänslig ekonomichefer-lacZ transgena råttor. Aktiverade neuroner märktes med en antikropp mot p-galaktosidas, proteinprodukten från lacZ-genen. Cokain inducerade en unik genuttrycksprofil selektivt i den lilla andelen aktiverade neuroner som inte observerades i den icke-aktiverade majoriteten av neuroner. Dessa gener inkluderade förändrade nivåer av de omedelbara tidiga generna båge, fosBoch nr4a3, såväl som gener som är involverade i p38 MAPK-signalering och celltypspecificitet. Vi föreslår att denna FACS-metod kan användas för att studera molekylära neuroadaptationer i specifika neuroner som kodar beteendevirkningarna av missbrukade läkemedel och andra lärda beteenden.

Nyckelord: kokainkänslighet, nucleus accumbens, neuronala ensembler, fluorescensaktiverad cellsortering

INLEDNING

En viktig hypotes om aktuell neurobiologisk forskning om kokainberoende är att kronisk exponering för kokain orsakar långvarig neuroadaptation inom striatum och andra komponenter i den mesolimbiska dopamin-belöningskretsen, vilket leder till tvångsmässigt läkemedelsanvändning och långvarig återfallssårbarhet (Nestler, 2001; Shaham och Hope, 2005; Kalivas, 2009; Bowers et al., 2010; Wolf och Ferrario, 2010). Emellertid är denna hypotes baserad på många studier som är begränsade till att mäta neuroadaptationer i homogenater i hjärnregioner eller i neuroner utvalda oberoende av deras aktiveringstillstånd under beteende.

Skillnaden mellan neuroadaptationer i aktiverade kontra icke-aktiverade neuroner är viktig eftersom de kan spela olika roller i de fysiologiska, beteendemässiga och psykologiska effekterna av kokain. Många studier med neuralaktivitetsmarkören Fos indikerar att kokain endast aktiverar en liten andel glest fördelade neuroner i striatum. Efter kontextspecifik lokomotorisk sensibilisering har vi visat att Fos induceras endast när råttor injicerades i läkemedelsparad miljö och inte i en icke-parad miljö (Mattson et al., 2008; Koya et al., 2009). Det viktigaste av allt är att vi har visat att dessa selektivt aktiverade neuroner spelar en kausal roll i det lärda sambandet mellan kokain och den läkemedelsparade miljön som förmedlar kontextspecifik sensibilisering (Koya et al., 2009). Således kan neuro-anpassningar inom selektivt aktiverade striatala neuroner spela unika och viktiga roller i lärande under kontextspecifik sensibilisering och andra läkemedelsinducerade beteenden.

Fram till nu har tekniska begränsningar gjort det svårt att bedöma molekylära förändringar inom det lilla antalet glest fördelade neuroner som selektivt aktiveras under beteende. Tekniker som laserupptagande mikrodissektion (Kwon och Houpt, 2010) och dubbelmärkt immunohistokemi (Berretta et al., 1992; Gerfen et al., 1995; Peters et al., 1996) kan identifiera molekylära förändringar selektivt inom aktiverade neuroner, men dessa tekniker har mycket låg genomströmning eller är inte kvantitativa. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan vara ett effektivt verktyg för att rena vuxna neuronala populationer för molekylanalys (Liberles and Buck, 2006; Lobo et al., 2006). FACS har emellertid inte använts för att rena neuroner baserat på deras aktiveringstillstånd. I den aktuella studien använde vi FACS för att rena de ispedd kokainaktiverade striatala neuronerna från transgena ekonomichefer-lacZ råttor och jämförde deras unika genuttryck med de i den icke-aktiverade majoriteten av neuroner.

METODER

djur

Kvinna ekonomichefer-lacZ transgena råttor (Kasof et al., 1995; Koya et al., 2009) och kvinnliga Sprague-Dawley-råttor (Charles River, Raleigh, NC, USA) hölls individuellt i vanliga plastburar i ett temperatur- och fuktighetsreglerat rum. De bibehölls på en 12: 12 h bakljus: mörk cykel (ljus tänds vid 20.00 h) och tillät fri tillgång till mat och vatten. De anpassades till dessa bostadsförhållanden under minst 7 dagar före läkemedelsbehandlingar. Experimentella förfaranden godkändes av NIDA Animal Care and Use Committee.

Drogbehandlingar

För akuta kokainexperiment injicerades råttor med kokain (30 mg / kg, ip; n = 8) eller saltlösning (1 ml / kg; n = 6) och placerades i en rund plexiglaskammare (38 cm diameter). Råttor avlivades 90 minuter efter injektioner för att erhålla hjärnvävnad. Denna behandling upprepades tre gånger på separata dagar för att erhålla tre biologiska replikat för mikroarray-analys. Dessutom producerades tre oberoende biologiska replikat på liknande sätt för kvantitativ PCR (qPCR). För qPCR-analyser av båge, pdyn, adora2aanvändes endast dessa tre oberoende biologiska replikat. För qPCR-analyser av fosB, nr4a3, kcnc1 och map2k6, vi använde också återstående RNA från vart och ett av mikroarrayproven.

För upprepade kokainexperiment sensibiliserades honråttor med fyra injektioner av kokain (15 mg / kg ip) som administrerades en gång varannan dag. På injektionsdagarna placerades varje råtta i en 43 × 43 cm kvadratisk Plexiglas-lokomotorisk aktivitetskammare (Med Associates, St Albans, VT, USA) för att vana under 30 minuter. Råttor injicerades med kokain och lokomotorisk aktivitet registrerades under rest avstånd under 60 minuter. Efter den fjärde upprepade kokaininjektionen förblev råttor i sin hemmabur under 7 – 8 dagar. På testdagen vantes råttor under 30 min i lokomotoriska aktivitetskamrarna och injicerades sedan med kokain (30 mg / kg ip) eller saltlösning. Råttor halshuggades och hjärnor extraherades nittio minuter efter injektioner. Hela sensibiliseringsbehandlingen upprepades tre gånger under separata veckor för att erhålla tre biologiska replikat av varje grupp för qPCR-analys.

Cell dissociation

Striatal vävnad dissocierades för att erhålla en enkelcells suspension. Råttor halshuggades och deras striata extraherades inom två minuter. Varje striatum malades med rakblad på en iskall glasplatta och placerades i 1 ml Hibernate A (Cat # HALF; Brain Bits, Springfield, IL). Striata spjälkades enzymatiskt i 1 ml Accutase per striatum (Cat # SCR005; Chemicon, Billerica, MA) med blandning av end-over-end under 30 min vid 4 ° C. Vävnad centrifugerades i två minuter vid 425 × g och återsuspenderades i 300 | ul iskallt Hibernate A. Alla efterföljande centrifugeringssteg utfördes vid 4 ° C.

Klyvad striatal vävnad dissocierades mekaniskt genom triturering. Fyra striata kombinerades i ett Eppendorf-rör och triturerades tio gånger med en Pasteur-pipett med stor diameter (~ 1.3mm). Rör placerades kort på is för stora vävnadsstycken att sedimentera; 600 ul molnig suspension innehållande dissocierade celler överfördes till ett 15 ml Falcon-rör på is. 600μL färsk viloläge A sattes till det ursprungliga Eppendorf-röret och därefter upprepades tritureringssteg som ovan med pipetter med medium och liten diameter (~ 0.8mm och ~ 0.4mm). Varje molnig suspension innehållande dissocierade celler slogs samman med den tidigare suspensionen.

Återstående cellkluster i den poolade cellsuspensionen avlägsnades genom filtrering genom förvätta 100 mikrometer och 40 mikrometersilter (Falcon-märke, BD Biosciences, San Jose, CA). Små cellulära skräp i suspensionen reducerades genom centrifugering av filtratet under 3 min vid 430 × g genom en trestegs densitetsgradient av Percoll (Cat # P1644; Sigma, St. Louis, MO). Det grumliga toppskiktet (ungefär 2 ml) innehållande skräp kastades. Celler i de återstående skikten återsuspenderades i den återstående Percoll-lösningen och centrifugerades i fem minuter vid 550xg. Pelleten återsuspenderades i 1 ml Hibernate A.

Immunolabeling och FACS

Dissocierade celler fixerades och permeabiliserades genom tillsats av en lika stor volym etanol för en slutlig koncentration av 50% etanol och hölls på is under 15 minuter med enstaka blandning. Celler centrifugerades i två minuter vid 425xg och återsuspenderades i RNas-fri fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Celler inkuberades med en biotinylerad primär antikropp mot NeuN (1: 1000-utspädning, Cat # MAB377B, Chemicon) och en primär antikropp mot p-galaktosidas ((p-gal; 1: 10000-utspädning, Cat # 4600-1409, Biogenesis, Poole Celler roterades end-over-end i primär antikropp under 30 minuter vid 4 ° C och centrifugerades i tre minuter vid 425xg. Celler tvättades med 800 μl PBS och resuspenderades i 700 μl PBS. Celler inkuberades med fluorescerande märkt streptavidin (Streptavidin-phycoerythrin, 1: 1000-utspädning, Cat # SA1004-1, Invitrogen, Carlsbad, CA) och sekundär antikropp (Alexa Fluor 488-märkt anti-get IgG, 1: 1000-utspädning, Cat # A 11055, Invitrogen) och roterad end-over-end under 15 min. Celler tvättades med 800 μl PBS, centrifugerades i tre minuter vid 425 × g och resuspenderades i 1 ml PBS.

Immunolablade celler skannades och sorterades på Johns Hopkins Bayview Campus flödescytometri-kärnanläggningen. A FACS Aria (BD, Franklin Lakes, NJ) användes för cellsortering. Kontrollprover analyserades först för att bestämma optimala kriterier för sortering av testprover. Specifikt användes fixerade celler utan antikroppsbehandling för att ställa in ljusspridningsgrinden. Fasta celler behandlade med fluorescerande sekundär antikropp, men ingen primär antikropp, användes sedan för att ställa trösklar för endogen vävnadsfluorescens och icke-specifik bindning med streptavidin eller sekundär antikropp. Därefter användes kontrollprover enstaka märkta med primär och sekundär antikropp för varje protein (NeuN eller P-gal) för att kompensera för fluorescerande överlappning i angränsande kanaler. Slutligen analyserades och testades testprover märkta med båda fluorescerande markörer. Sorterade celler uppsamlades i lågbindande rör (Cat # 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) med 100 ul PBS i varje rör.

RNA-extraktion

Efter sortering centrifugerades prover innehållande antingen pgal-positiva eller pgal-negativa celler från kokaininjicerade råttor eller alla NeuN-positiva celler från saltlösningsinsprutade råttor under 8 min vid 2650 × g vid 18 ° C. NeuN-negativa celler från saltlösningsinsprutade råttor centrifugerades under 8 min vid 6000 ×g vid 18 ° C. För mikroarray-experiment extraherades RNA med Trizol-reagens (Cat # 15596-026, Invitrogen) enligt tillverkarens instruktioner. Kvalitet och kvantitet av RNA bedömdes med användning av Bioanalyzer Picochip (Cat # 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). För qPCR-experiment extraherades RNA med RNEasy Micro-kit (Cat # 74004; Qiagen, Valencia, CA) enligt tillverkarens instruktioner med DNas-behandling. Kvantitet och renhet av RNA bedömdes med användning av en Nanodrop-spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Microarray-experiment

Microarrays användes för att analysera RNA från NeuN-positiva och NeuN-negativa celler från saltlösningsinsprutade råttor och Pgal-positiva och Pgal-negativa nervceller från kokaininjicerade råttor. Som beskrivits ovan i läkemedelsbehandlingsavsnittet innehöll mikroarrayer tre biologiska replikat för var och en av de fyra provtyperna. Fem pl av totalt RNA från varje prov märktes med användning av Illumina TotalPrep RNA-amplifieringskit (Cat # IL1791; Ambion, Austin, TX) i en tvåstegsprocess av cDNA-syntes följt av vitro RNA-transkription med biotin-16-UTP. 0.75 μg biotinmärkt cRNA hybridiserades under 16 timmar till Illumina Sentrix Rat Ref12_v1 BeadChips (Cat # BD-27-303; Illumina, San Diego, CA). Biotinylerat cRNA hybridiserat till chipet detekterades med Cy3-märkt streptavidin och kvantifierades med användning av Illuminas BeadStation 500GX Genetic Analys Systems skanner. All märkning och analys gjordes på Johns Hopkins Bayview Medical Campus Lowe Family Genomics Core.

Kvantitativ PCR i realtid

Kvantitativ PCR i realtid användes för att validera FACS och mikroarray-resultat. RNA transkriberades omvänd till cDNA med RETROscript-kit (Cat # AM1710, Ambion) med en oligo (dT) -primer. Varje 25 μl PCR-reaktion inkluderade 12.5 μl Taqman Gene Expression Master Mix (Cat #4369514; Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.1 μl vardera av 20 μM framåt- och omvända primers, 0.25 μl av 100 μM FAM-märkt sond, μl vatten och 5 μl 5 ng / μl cDNA. Primer- och sondkombinationer [Tabell 1] designades med hjälp av Roche Universal Probe Library Assay Design Center för att spela intron. PCR-reaktioner övervakades med användning av Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD). Programmet började med 20-plattavläsningar vid 50 ° C för fotblekning, följt av 5 min vid 95 ° C, och sedan 40-cykler av 20 sek vid 94 ° C, 1 min vid 60 ° C och en platta avläst.

Tabell 1 

Primers och sonder som används för qPCR

Standardkurvaneaktioner kördes först för varje gen för att bestämma amplifieringseffektivitet [Tabell 1]. Uttrycksnivåer för varje amplifierad gen beräknades med användning av effektivitet ^ ΔCq där ΔCq = Cq(experimentell gen) - Cq(referensgen) för varje biologiskt replikat. Gorasp2 valdes som referensgen eftersom den inte uttrycktes på olika sätt mellan neuroner och glia i mikroarrayanalyser. Den validerades vidare som en referensgen på grund av lika stor qPCR-amplifiering över alla prover vid laddning av samma mängd mall. Teknisk analys triplikat Cq värdena medelvärden före beräkning av ΔCq för varje gen i ett prov. För varje mRNA uppmätt i qPCR var genuttrycksvärden i genomsnitt medelvärde över biologiska replikat. För att återspegla vikningsförändringsvärden delade vi detta genomsnitt med genomsnittliga genuttrycksvärden för NeuN-positiva celler från saltinjekterade råttor. Dessa värden indikeras som medel och standardfel i grafer och tabeller.

immunohistokemi

Hjärnvävnad erhölls från vilda typ Spraque-Dawley-råttor av vildtyp efter samma akuta och upprepade kokainbehandlingar som beskrivits ovan för mikroarray- och qPCR-experimenten. Men 90 minuter efter testdag-injektioner bedövades råttor djupt med isofluran och perfunderades med 100 ml PBS följt av 400 ml 4% paraformaldehyd (PFA). Hjärnor efterfixerades i PFA under 2 timmar och överfördes till 30% sackaroslösning vid 4 ° C under 2 – 3 dagar. Hjärnor frystes på pulveriserad torris och hölls vid −80 ° C tills de hade sektioner. Koronalsektioner skars 40 μm tjockt mellan Bregma 2.5 och −0.5 (Paxinos och Watson, 1998).

Sektioner immunmärktes för Fos och Arc. I korthet tvättades sektioner tre gånger i Tris-buffrad saltlösning (TBS) och permeabiliserades under 30 min i TBS med 0.2% Triton X-100. Sektionerna tvättades igen i TBS och inkuberades i primära antikroppar utspädda i PBS med 0.3% Triton X-100 under 24 timmar på en skakare vid 4 ° C. Vi använde en polyklonal kanin mot c-Fos-antikropp (1: 500-utspädning, Cat # sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) och en mus-monoklonal Arc-antikropp (1: 100-utspädning, Cat # sc-17839, Santa Cruz Biotechnology). Sektioner tvättades tre gånger i TBS och inkuberades i sekundära antikroppar utspädda i PBS under 1.5 timmar på en skakare vid rumstemperatur. Vi använde Alexa Fluor 488-märkt åsnantikroppsantikropp (1: 200-utspädning, Cat # A21206, Invitrogen) och Alexa Fluor 568-märkt get-antikropp för get (1: 200-utspädning, Cat # A11004, Invitrogen). Sektionerna tvättades i TBS, monterades på kromalumbelagda objektglas och täckte med VectaShield-hårddiskmonteringsmedia.

Fluorescerande bilder av Fos och Arc immunoreaktivitet i caudate-putamen och NAc (ungefär 2.0 mm anterior till Bregma) togs med användning av en CCD-kamera (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) fäst vid ett Zeiss Axioskop 2-mikroskop. Bilder för att räkna märkta celler togs med 200x förstoring; bilder för att bestämma Fos och Arc colocalization togs vid 400x förstoring. Märkta celler från fyra hemisfärer per råtta räknades automatiskt med IPLab-programvara för Macintosh, version 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Räkningar från alla fyra halvkuglarna var i genomsnitt för att erhålla ett enda värde för varje råtta.

Dataanalys

Data om rörelsensensibilisering analyserades med envägs ANOVA med upprepade åtgärder för den huvudsakliga effekten av tiden under 4 injektionsdagar. Statistisk signifikans sattes till p <0.05. Microarray-data analyserades med hjälp av DIANE 6.0, ett kalkylbaserat mikroarray-analysprogram baserat på SAS JMP 7.0, som tidigare beskrivits (Garg et al., 2009). Fluorescensintensitetsdata från mikroarrayer utsattes för filtrering genom detektion p-värden och Z normalisering. Provkvalitet analyserades med användning av spridplotter, analys av huvudkomponenter och genprov Z-poängbaserad hierarkisk gruppering för att utesluta möjliga avvikelser. ANOVA-test användes sedan för att eliminera gener med större avvikelser inom varje jämförelsegrupp. Gener identifierades som differentiellt uttryckta om p <0.01, absolut Z-förhållande ≥ 1.5 och falskt upptäcktsförhållande (fdr) <0.07. För qPCR-data användes envägs ANOVA för att jämföra data för varje gen. Statistisk signifikans sattes till p <0.05. För Fos- och Arc-immunhistokemi användes ett t-test under antagande av ojämn varians för att beräkna statistisk signifikans, inställd på p <0.05.

RESULTAT

cfos-lacZ transgena råttor

Smakämnen ekonomichefer-lacZ transgen i dessa råttor regleras av a c-fos promotor liknande den i den endogena c-fos genen och aktiveras på liknande sätt i neuroner av höga nivåer av excitatorisk synaptisk inmatning (Shin et al., 1990; Labiner et al., 1993; Sgambato et al., 1997). Proteinprodukten från ekonomichefer-lacZ transgen, p-galaktosidas (pgal), uttrycks tillsammans med c-Fos i starkt aktiverade neuroner (Koya et al., 2009) och användes för att märka aktiverade striatala neuroner i följande FACS-reningsprocedur.

FACS-rening av aktiverade striatala neuroner efter enstaka akuta kokaininjektioner

Hela striata erhölls från ekonomichefer-lacZ råttor 90 minuter efter akuta injektioner av 30 mg / kg kokain eller saltlösning utanför hemmaburen. Dissocierade striatalceller från liknande behandlade råttor slogs samman före FACS-rening för vart och ett av de biologiska replikaten i efterföljande mikroarray och kvantitativa PCR (qPCR) -analyser. Dissocierade striatalceller analyserades ursprungligen enligt deras framåt- och sidoljusspridningsegenskaper [Figur 1a]. Majoriteten av NeuN-märkta neuroner hittades inom en remsa av händelser längs den nedre delen av tomten. Således gick alla efterföljande analyser framåt för att inkludera endast händelser som finns inom denna remsa.

Figur 1 

Fluorescensaktiverad cellsortering av βgal-märkta neuroner från råttor behandlade med en enda injektion av kokain

Celler inom denna grind separerades enligt deras grad av immunmärkning med den neuronala markören NeuN och den neurala aktiveringsmarkören Pgal. I vävnad erhållen från kokaininjicerade råttor hade ungefär 15% av NeuN-märkta neuroner höga nivåer av pgal [Figur 1b], vilket motsvarade ungefär 100,000 pgal-märkta neuroner per råtta. Alla βgal-märkta celler samuttryckte NeuN, vilket indikerar att endast neuroner uttryckte βgal. I motsats till detta uttryckte mycket få NeuN-märkta neuroner erhållna från saltlösningsinjicerade råttor aktiveringsmarkörerna Pgal eller Fos, som stöder Pgal- och Fos-immunreaktivitet som markörer för neural aktivering i kokaininjicerade råttor. Det låga antalet pgal-uttryckande neuroner från saltlösningsinjicerade råttor gav inte tillräckligt många celler för efterföljande molekylanalyser. Således använde vi endast NeuN-märkning för att separera neuronal från icke-neuronala celler i alla efterföljande experiment med striatal vävnad erhållen från saltlösningsinsprutade råttor. Sammantaget var ungefär 30% av alla striatal cellkroppar NeuN-positiva, vilket motsvarade ungefär 600,000 striatal neuroner per råtta. När FACS-renade celler undersöktes med fluorescensmikroskopi var alla celler runda och saknade processer [Figur 2]. Mikroskopisk observation bekräftade att FACS-sorterade celler var lämpligt märkta för NeuN- och βgal-immunreaktivitet. Prover av FACS-renade celler befanns vara> 90% rena när de bedömdes med en andra omgång av flödescytometri (data visas inte).

Figur 2 

Mikroskopfoton av FACS-renade celler och skräp

Vi bestämde selektiviteten för vår FACS-rening med mikroarray för att analysera genuttrycksmönster för de FACS-renade cellerna. Vi jämförde genuttryck i pgal-positiva och pgal-negativa neuroner från kokaininjicerade råttor såväl som NeuN-positiva och NeuN-negativa celler från saltlösningsinjicerade råttor. Huvudkomponent och klusteranalys indikerade att den primära differentierande faktorn var om cellerna var neuroner eller glia [Figur 3a]. Den andra differentierande faktorn var βgal-uttryck som användes för att separera aktiverade från icke-aktiverade nervceller. Gener identifierades som differentiellt uttryckta om p <0.01, absolut Z-förhållande ≥ 1.5 och falskt upptäcktsförhållande (fdr) <0.07. Vi fann att 125 gener ökade och 467 gener minskade i βgal-positiva nervceller i förhållande till βgal-negativa neuroner erhållna från samma striatala vävnad av kokaininjicerade råttor [Figur 3b]. När samma βgal-positiva nervceller från kokaininjicerade råttor jämfördes med kontrollprover av alla NeuN-märkta neuroner från saltlösning-injicerade råttor, ökades 133 gener och 890 gener minskades i de βgal-positiva neuronerna. Särskilt de två kontrollgrupperna - βgal-negativa neuroner från kokaininjicerade råttor och alla NeuN-märkta neuroner från saltlösning-injicerade råttor - producerade mycket liknande genuttrycksmönster; genuttryck skilde sig inte signifikant mellan dessa kontrollgrupper [Figur 3b].

Figur 3 

Microarray-analys av celler sorterade från råttstriata efter en enda injektion av kokain eller saltlösning

Specifika gener som hittades i de olika provgrupperna bekräftade separering av aktiverade från icke-aktiverade neuroner, såväl som neuronala från icke-neuronala celler med användning av FACS [Tabell 2]. Pgal-positiva neuroner från kokaininjicerade råttor uttryckte högre nivåer av många neurala aktiveringsmarkörgener i förhållande till pgal-negativa neuroner från samma kokaininjicerade råttor eller alla NeuN-märkta nervceller från saltinjekterade råttor [Figur 3c]. Dessa aktivitetsmarkörgener inkluderade c-fos, junB, båge, EGR familj (1, 2, 4) och nr4a3 (Guzowski et al., 2005). Intressant nog uttryckte dessa pgal-positiva neuroner också signifikant högre nivåer av D1-dopaminreceptorcellspecifik markör-prodynorfingen och signifikant lägre nivåer av D2-dopaminreceptorgenen.

Tabell 2 

Sammanfattning av mikroarray och qPCR-data från det akuta kokainexperimentet.

Data från mikroarraygenuttryck validerades med användning av qPCR. Aktivitetsmarkörgenerna FosB, bågeoch nr4a3 uttrycktes på högre nivåer i pgal-positiva nervceller från kokaininjicerade råttor i förhållande till både pgal-negativa neuroner från samma kokaininjicerade råttor och till alla nervceller från saltinjekterade råttor [Figur 4a; data och statistisk information i Tabell 2]. Pgal-positiva neuroner uttryckte också högre nivåer av prodynorfingenen [Figur 4b]. Medan βgal-positiva neuroner hade uppenbarligen lägre expressionsnivåer för flera gener, inklusive A2A-adenosinreceptorn, Kv3.1-kaliumkanalen och map2k6 / MEKK6-gener, var endast Kv3.1 och map2k6 / MEKK6 expressionsnivåer statistiskt olika med användning av qFigur 4c]. Sammantaget var genuttrycksförändringar bedömda med qPCR nästan identiska med genuttrycksförändringar bedömda genom mikroarray-experiment.

Figur 4 

Kvantitativ PCR visar en annan genuttrycksprofil för βgal-positiva nervceller efter akuta kokaininjektioner, jämfört med ßgal-negativa neuroner från samma råttor, eller med alla neuroner från saltinjekterade råttor

För att bestämma om mRNA-förändringar i aktiverade neuroner reflekterades på proteinnivå, använde vi immunohistokemisk analys av koronala hjärnsektioner från kokain- och saltlösningsinjicerade vildtypsråttorFigur 5]. Dessa avsnitt genomgick inte dissociation eller FACS, och immunohistokemisk analys påverkades därför inte av den celldiscociation som fanns i FACS-proceduren. I ventral striatum från kokaininjicerade råttor [Figur 5a] uttrycktes de neurala aktivitetsmarkörerna Fos och Arc i samma celler: 85 ± 4% av alla Fos-positiva celler var Arc-positiva, medan 82 ± 3% av alla Arc-positive celler var Fos-positiva. Kokaininjektioner producerade en 2.7-ökning av Fos-märkta neuroner och en 2.7-ökning av Arc-märkta neuroner. I ryggstriatum från kokaininjicerade råttor [Figur 5b], 80 ± 2% av alla Fos-positiva celler var Arc-positiva, medan 86 ± 3% av alla Arc-positiva celler var Fos-positiva. Kokaininjektioner producerade en 4.4-ökning av Fos-märkta neuroner och en 3.8-ökning av Arc-märkta neuroner.

Figur 5 

Fos och Arc uttrycks tillsammans i (a) ventral striatum och (b) dorsal striatum efter en enda injektion av kokain

FACS-rening av aktiverade striatala neuroner från kokain-sensibiliserade råttor

I det andra FACS-experimentet sensibiliserades alla råttor med upprepade kokaininjektioner. Upprepad kokainadministration i lokomotorboxen förbättrade kokaininducerad rörelse: rörelse på dag 7 var 180 ± 18% av dagen 1 rörelse (huvudeffekt av tiden över 4 upprepade injektioner, F3, 363 = 24.9, p <0.001), vilket indikerade signifikant psykomotorisk sensibilisering. Sju dagar senare på testdagen administrerades kokain eller saltlösning till råttor i samma rörlåda. Nittio minuter senare extraherades striatal vävnad inklusive NAc och celler renades med FACS med användning av proceduren som beskrivits ovan.

Celler inom samma ljusspridningsgrindade händelse av händelser som i föregående experiment separerades i enlighet med deras grad av immunmärkning med den neuronala markören NeuN och den neurala aktiveringsmarkören Pgal. I vävnad erhållen från kokaininjicerade råttor hade ungefär 10% av NeuN-märkta neuroner höga nivåer av pgal [Figur 6], vilket motsvarade ungefär 60,000 pgal-märkta neuroner per råtta. Alla βgal-märkta celler samuttryckte NeuN, vilket indikerar att endast neuroner uttryckte βgal. Återigen producerade vävnader erhållna från råttor injicerade med saltlösning på testdagen mycket få pgal- eller Fos-uttryckande neuroner, och således inte tillräckligt många celler för efterföljande molekylanalyser. Därför använde vi endast NeuN-märkning för att separera neuronala celler från icke-neuronala celler som erhållits från saltinjekterade råttor. Cirka 30% av alla cellkroppar i saltlösningsinsprutade råttor var NeuN-positiva, vilket i detta experiment motsvarade ungefär 400,000 striatal neuroner per råtta.

Figur 6 

Fluorescensaktiverad cellsortering av βgal-märkta neuroner från sensibiliserade råttor utmanade med kokain 7 dagar efter upprepad kokainbehandling

Vi använde qPCR för att jämföra genuttryck i βgal-positiva och βgal-negativa nervceller från kokaininjicerade råttor såväl som alla NeuN-positiva neuroner från saltlösning-injicerade råttor efter kokainsensibilisering. βgal-positiva nervceller från kokaininjicerade råttor uttryckte högre nivåer av tre neurala aktivitetsmarkörgener - FosB, bågeoch nr4a3–Relativt till βgal-negativa nervceller från samma kokaininjicerade råttor och till alla nervceller från saltlösning-injicerade råttor [Figur 7a; data och statistisk information i Tabell 3]. Pgal-positiva neuroner uttryckte också en högre nivå av prodynorfingenen liknande den i det enda kokaininjektionsexperimentet [Figur 7b]. Däremot hade βgal-positiva neuroner lägre expressionsnivåer för flera gener [Figur 7c], Inklusive Drd2 som kodar D2-dopaminreceptorn och Map2k6 kodning av kinaset som aktiverar p38 MAPK, liknande det enda akuta kokaininjektionsexperimentet. Slutligen hade pgal-positiva neuroner ökat uttrycket av dusp1, även känd som mkp1 [Figur 7c], som kodar fosfataset som inaktiverar p38 MAPK (Sgambato et al., 1998).

Figur 7 

Kvantitativ PCR demonstrerar en annan genuttrycksprofil i pgal-positiva nervceller från sensibiliserade kokainutmanade råttor, jämfört med pgal-negativa neuroner från samma råttor, eller alla neuroner från saltvattenutmanade råttor
Tabell 3 

Sammanfattning av qPCR-data från det upprepade kokainexperimentet.

För att bestämma om mRNA-förändringar i aktiverade neuroner återspeglas på proteinnivå, använde vi immunohistokemisk analys av koronala hjärnpartier från vildtyp kokain-sensibiliserade kvinnliga råttor efter antingen kokain eller saltinjektioner på testdagen. I ventral striatum från kokaininjicerade råttor uttrycktes de neurala aktivitetsmarkörerna Fos och Arc i samma celler: 90 ± 2% av alla Fos-positiva celler var Arc-positiva och 83 ± 2% av alla Arc-positiva cellerna var Fos-positiva. Kokaintestinjektioner producerade en 2.3-faldig ökning av Fos-märkta neuroner och en 2.2-faldig ökning av Arc-märkta neuroner. I dorsalt striatum från kokaininjicerade råttor var 93 ± 2% av alla Fos-positiva celler Arc-positiva och 90 ± 3% av alla Arc-positive celler var Fos-positiva. Kokaintestinjektioner producerade en 4.4-faldig ökning av Fos-märkta neuroner och en 4.5-faldig ökning av Arc-märkta neuroner. Således uttryckte mycket få icke-Fos-märkta celler Arc och mycket få icke-Arc-märkta celler uttryckte Fos som stöder våra resultat från sorterade celler.

DISKUSSION

Vi utvecklade en procedur för att rena och utvärdera molekylära förändringar inom neuroner definierade endast av deras tidigare aktiveringstillstånd under kokaininducerad lokomotorisk aktivitet. Data från mikroarray-, qPCR- och immunohistokemi-experimenten bekräftade oberoende att vår FACS-procedur identifierade unika molekylära förändringar inom aktiverade neuroner, enligt definitionen av c-fos promotorinduktion av pgal expression. Det huvudsakliga biologiska fyndet med användning av denna procedur var att omedelbara tidiga gener (IEG) induceras endast i aktiverade neuroner, medan IEG-uttrycket är oförändrat eller till och med minskat i den icke-aktiverade majoriteten av neuroner. Eftersom många av dessa IEG-nervaktivitetsmarkörer också är transkriptionsfaktorer, är det troligt att mycket olika mönster av genuttryck därefter induceras inom dessa aktiverade neuroner som kan bidra till den fysiologiska och beteendeeffekten av kokain (till exempel, se (Curran och Franza, 1988; Nestler et al., 1993; McClung et al., 2004; Loebrich och Nedivi, 2009).

Differential IEG-induktion mellan aktiverade och icke-aktiverade neuroner stödjer hypotesen att endast en minoritet av neuroner är starkt aktiverade under kokaininducerad rörelse, medan majoriteten av neuroner aktiveras i mycket mindre eller inte alls. Elektrofysiologiska experiment i råttor av vildtyp indikerar att Fos-proteinuttryck korrelerar med höga nivåer av excitatorisk synaptisk inmatning (Shin et al., 1990; Labiner et al., 1993; Sgambato et al., 1997). Vi vet att Fos och βgal expression regleras på samma sätt i samma neuroner i ekonomichefer-lacZ råttor (Koya et al., 2009). Således drar vi slutsatsen att ökad pgal- och IEG-expression i endast ett litet antal striatala neuroner indikerar att endast en minoritet av de striatal neuronerna får höga nivåer av excitatorisk synaptisk inmatning som svar på kokainadministrering.

Diskret aktivering av striatal neuroner överensstämmer med upstate-downstate-hypotesen som beskriver motsatta effekter av dopamin på striatal neuronal aktivitet. Kokaininducerad dopamin tros öka skillnaderna mellan neuron med hög aktivitet och låg aktivitet genom att förbättra pågående elektrofysiologisk aktivitet hos neuroner som redan befinner sig i ett högt aktivitetsläge, samtidigt som de påverkar pågående aktivitet hos majoriteten av neuroner med lägre aktivitet (Wilson och Kawaguchi, 1996; Hernandez-Lopez et al., 1997; Nicola et al., 2000; O'Donnell, 2003; Nicola et al., 2004). Den resulterande ökningen av signal / brusförhållande förbättrar inte bara selektiviteten under akut signalering, men, som föreslog i vår studie, kan också bidra till induktion av unika molekylära neuroadaptationer i endast neuron med hög aktivitet. Under tiden tycktes genuttryck i pgal-negativa nervceller, som utgör majoriteten av striatala neuroner från kokaininjicerade råttor, inte vara annorlunda från genuttryck i striatal neuroner från saltinjekterade råttor; detta stöder hypotesen att majoriteten av striatal neuroner förblir i downstaten under exponering av kokain.

Komponenter i p38 MAP-kinas-signalvägen ändrades också differentiellt mellan aktiverade och icke-aktiverade neuroner. Genuttryck av Map2k6 / MEKK6, ett kinas som aktiverar p38, minskades medan genuttrycket av Mkp1 / Dusp1, ett fosfatas som inaktiverar p38 (Sgambato et al., 1998), ökades i aktiverade neuroner men inte i icke-aktiverade neuroner. Således spelar övergripande P38 MAPK-signalering, visat sig spela en roll i synaptisk plasticitet (Bolshakov et al., 2000; Izumi et al., 2008), kan dämpas i aktiverade neuroner relativt den icke-aktiverade majoriteten av neuroner.

FACS kan också hjälpa till att identifiera de neuronaltyper som aktiveras efter akut eller upprepad kokainexponering. Vi hittade högre expression av D1 neuronal markörgen prodynorfin i aktiverade neuroner, och lägre expression av D2 neuronala markörgener D2 dopaminreceptor och A2A adenosinreceptor i aktiverade neuroner. Detta antyder att Fos framkallades främst i D1 striatal neuroner. Även om detta överensstämmer med många immunohistokemiska studier som rapporterar Fos-induktion främst i D1-neuroner efter psykostimulantinjektioner i hembur (Berretta et al., 1992; Cenci et al., 1992) motsäger den lika aktiveringen av D1- och D2-nervceller som hittades efter psykostimuleringsinjektioner i en relativt ny miljö utanför råttans hembur (Jaber et al., 1995; Badiani et al., 1999; Hopp et al., 2006).

Eftersom vi använde samma ßgalmarkör för att identifiera aktiverade neuroner under FACS som vi använde för vårt tidigare beskrivna Daun02 inaktiveringsförfarande (Koya et al., 2009), är det troligt att vi observerar unika molekylära förändringar inom neuronala ensembler som är nödvändiga för den inlärda komponenten i kontextspecifik sensibilisering av kokaininducerad rörelse. Vi har tidigare funnit att inaktivering av endast ett litet antal glest fördelade nervceller inom en förmodad ensemble är tillräcklig för att störa kontextspecifik sensibilisering av kokainpsychomotor (Koya et al., 2009). Detta fynd replikerades med samma kvinnliga ekonomichefer-lacZ råttor och sensibiliseringsschema som användes i den aktuella studien [http://irp.drugabuse.gov]. Dessa neuroner är inte i sig mer känsliga för alla stimuli, eftersom förändring av miljön eller sammanhanget där läkemedlet administrerades aktiverade en annan uppsättning striatal neuroner efter kokaininjektioner (Mattson et al., 2008; Koya et al., 2009). Val av en specifik striatal neuronal ensemble verkar främst beroende på aktivitetsmönstret från kortikala och subkortikala glutamatergiska afferenter (Pennartz et al., 1994; O'Donnell, 2003), och dessa insatser bestäms själva av specifika miljö- och interceptiva stimuli närvarande under beteende. Från detta tidigare arbete tillsammans med våra nuvarande data antar vi att upprepad parning av kokain med miljöstimuleringar under vår sensibiliseringsplan ger unika molekylära förändringar inom upprepade gånger aktiverade neuronala ensembler som kan bidra till de lärda föreningarna som ligger bakom kontextspecifik sensibilisering.

Sammantaget visade vi en ny tillämpning av FACS för att isolera vuxna neuroner som selektivt aktiverades under akut kokaininducerad lokomotorisk aktivitet och upprepad kokaininducerad lokomotorisk sensibilisering. Vi föreslår att detta tillvägagångssätt också kan användas för att identifiera unika molekylära neuroadaptationer i neuronala ensembler som kodar beteendevirkningarna av missbrukade läkemedel och andra lärda beteenden. Kausalrollerna för dessa unika molekylära neuroadaptationer i neural plastisitet och beteende måste så småningom undersökas genom att manipulera genuttryck i endast aktiverade neuroner; dock har denna teknik ännu inte utvecklats.

Erkännanden

Denna forskning stöds av det intramurala forskningsprogrammet från National Institute on Drug Abuse. D. Guez-Barber stöds av NIH MSTP TG 5T32GM07205, prisnummer F30DA024931 från National Institute on Drug Abuse och Charles BG Murphy Ordförande i psykiatri vid Yale University. Vi tackar Joe Chrest för hans utmärkta tekniska assistans med FACS, och Chris Cheadle, Tonya Watkins och Alan Berger för deras arbete med mikroarrayen. Vi tackar Yavin Shaham för hjälpsamma kommentarer till manuskriptet.

fotnoter

 

Det finns inga intressekonflikter för några författare till detta manuskript.

Referensprojekt

  1. Badiani A, Oates MM, Day HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Miljömodulering av amfetamininducerat c-fos-uttryck i D1 kontra D2 striatal neuroner. Behav Brain Res. 1999; 103: 203-209. [PubMed]
  2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM. Dopamin- och glutamatagonister stimulerar neuronspecifikt uttryck av Fos-liknande protein i striatum. J Neurophysiol. 1992; 68: 767-777. [PubMed]
  3. Bolshakov VY, Carboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. Dubbla MAP-kinasvägar förmedlar motsatta former av långsiktig plasticitet vid CA3-CA1-synapser. Nat Neurosci. 2000; 3: 1107-1112. [PubMed]
  4. Bowers MS, Chen BT, Bonci A. AMPA-receptors synaptisk plastisitet inducerad av psykostimulanter: det förflutna, det nuvarande och den terapeutiska framtiden. Nervcell. 2010; 67: 11-24. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  5. Cenci MA, Campbell K, Wictorin K, Bjorklund A. Striatal c-fos Induktion av kokain eller apomorfin förekommer företrädesvis i utgångsneuroner som projicerar till substansen Nigra i råtta. Eur J Neurosci. 1992; 4: 376-380. [PubMed]
  6. Curran T, Franza BR., Jr Fos och juni: AP-1-anslutningen. Cell. 1988; 55: 395-397. [PubMed]
  7. Garg S, Nichols JR, Esen N, Liu S, Phulwani NK, Syed MM, Wood WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. MyD88 uttryck av CNS-bosatta celler är avgörande för att framkalla skyddande immunitet i hjärnabcesser. ASN Neuro. 2009: 1. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB. D1- och D2-dopaminreceptorfunktion i striatum: koaktivering av D1- och D2-dopaminreceptorer på separata populationer av neuroner resulterar i förstärkt omedelbart tidigt genrespons i D1-innehållande neuroner. J Neurosci. 1995; 15: 8167-8176. [PubMed]
  9. Guzowski JF, Timlin JA, Roysam B, McNaughton BL, Worley PF, Barnes CA. Kartlägga beteendemässigt relevanta neuralkretsar med omedelbart-tidigt genuttryck. Curr Opin Neurobiol. 2005; 15: 599-606. [PubMed]
  10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, Surmeier DJ, Reyes A, Galarraga E. D1-receptoraktivering förbättrar framkallat urladdning i neostriatala medium-spiny neuroner genom att modulera en L-typ Ca2 + konduktans. J Neurosci. 1997; 17: 3334-3342. [PubMed]
  11. Hope B, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. Kokaininducerad lokomotorisk aktivitet och Fos-uttryck i nucleus accumbens är sensibiliserade under 6 månader efter upprepad kokainadministration utanför hemmaburen. Eur J Neurosci. 2006; 24: 867-875. [PubMed]
  12. Izumi Y, Tokuda K, Zorumski CF. Långvarig potentieringshämning genom lågnivå N-metyl-D-aspartatreceptoraktivering involverar kalcineurin, kväveoxid och p38 mitogen-aktiverat proteinkinas. Hippocampus. 2008; 18: 258-265. [PubMed]
  13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. Akuta och kroniska amfetaminbehandlingar reglerar på olika sätt RNA-nivåer i neuropeptid messenger och Fos immunoreaktivitet i råttala striatala neuroner. Neurovetenskap. 1995; 65: 1041-1050. [PubMed]
  14. Kalivas PW. Glutamathemostosthypotesen om missbruk. Nat Rev Neurosci. 2009; 10: 561-572. [PubMed]
  15. Kasof GM, Mahanty NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI. Spontan och framkallade glutamatsignalering påverkar Fos-lacZ-uttryck och pyramidformad celldöd i hippocampala skivkulturer från transgena råttor. Brain Res Mol Brain Res. 1995; 34: 197-208. [PubMed]
  16. Koya E, Golden S, Harvey B, Guez-Barber D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farquhar D, Ghosh S, Mattson B, Hope B. Riktad störning av kokainaktiverade nervkärnor skapar neuroner förhindrar kontextspecifik sensibilisering. Nat Neurosci. 2009; 12: 1069-U1152. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  17. Kwon B, Houpt TA. En kombinerad metod för laserupptagning av mikrodissektion och X-Gal-histologi för att analysera genuttryck i c-Fos-specifika neuroner. J Neurosci-metoder. 2010; 186: 155-164. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  18. Labiner DM, Butler LS, Cao Z, Hosford DA, Shin C, McNamara JO. Induktion av c-fos mRNA genom tända beslag: komplex relation med neuronal burst-avfyrning. J Neurosci. 1993; 13: 744-751. [PubMed]
  19. Liberles SD, Buck LB. En andra klass av kemosensoriska receptorer i luktepitelet. Natur. 2006; 442: 645-650. [PubMed]
  20. Lobo MK, Karsten SL, Gray M, Geschwind DH, Yang XW. FACS-arrayprofilering av striatal projiceringsneuronundertyper i juvenila och vuxna mushjärnor. Nat Neurosci. 2006; 9: 443-452. [PubMed]
  21. Loebrich S, Nedivi E. Funktionen av aktivitetsreglerade gener i nervsystemet. Physiol Rev. 2009; 89: 1079 – 1103. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  22. Mattson B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Hope B. Kontextspecifik sensibilisering av kokaininducerad lokomotorisk aktivitet och tillhörande neuronala ensembler i råttkärnan. Eur J Neurosci. 2008; 27: 202-212. [PubMed]
  23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: en molekylär växel för långsiktig anpassning i hjärnan. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-154. [PubMed]
  24. Nestler E, Hope B, Widnell K. Drogberoende - en modell för den molekylära grunden för neural plasticitet. Nervcell. 1993; 11: 995–1006. [PubMed]
  25. Nestler EJ. Molekylär grund för långvarig plasticitet underliggande beroende. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 119-128. [PubMed]
  26. Nicola SM, Surmeier J, Malenka RC. Dopaminerg modulering av neuronal excitabilitet i striatum och nucleus accumbens. Annu Rev Neurosci. 2000; 23: 185-215. [PubMed]
  27. Nicola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO. Kontrastförbättring: en fysiologisk effekt av striatal dopamin? Cell Tissue Res. 2004; 318: 93-106. [PubMed]
  28. O'Donnell P. Dopamin-grindning av neurala ensembler i förhjärnan. Eur J Neurosci. 2003; 17: 429-435. [PubMed]
  29. Paxinos G, Watson C. Rottehjärnan i stereotaxiska koordinater. 4. San Diego: Academic Press; 1998.
  30. Pennartz CM, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH. Kärnan samlas som ett komplex av funktionellt distinkta neuronala ensembler: en integration av beteendemässiga, elektrofysiologiska och anatomiska data. Prog Neurobiol. 1994; 42: 719-761. [PubMed]
  31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ. c-Fos-uttryck i den råttens intergenikulära broschyren: fotreglering, samlokalisering med Fos-B och cellulär identifiering. Brain Res. 1996; 728: 231-241. [PubMed]
  32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM. Effekt av elektrisk stimulering av hjärnbarken på uttrycket av Fos-proteinet i basala ganglier. Neurosci. 1997; 81: 93-112. [PubMed]
  33. Sgambato V, sidor C, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. Extracellulärt signalreglerat kinas (ERK) kontrollerar omedelbar tidig geninduktion vid kortikostriatal stimulering. J Neurosci. 1998; 18: 8814-8825. [PubMed]
  34. Shaham Y, Hope BT. Rollen för neuroadaptationer i återfall till läkemedelssökande. Nat Neurosci. 2005; 8: 1437-1439. [PubMed]
  35. Shin C, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Cohen DR. Induktion av c-fos-mRNA-uttryck genom efteravlastning i hippocampus av naiva och tända råttor. J Neurochem. 1990; 55: 1050-1055. [PubMed]
  36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. Ursprunget till spontana membranpotentialfluktuationer i neostriatala spiny neuroner. J Neurosci. 1996; 16: 2397-2410. [PubMed]
  37. Wolf ME, Ferrario CR. AMPA-receptorplastisitet i nucleus accumbens efter upprepad exponering för kokain. Neurosci Biobehav Rev 2010 [PMC gratis artikel] [PubMed]