Effekt av ΔFosB-överuttryck på opioid- och cannabinoidreceptormedierad signalering i nukleär accumbens (2011)

Neuro. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ, Cassidy MP, Sparta A, Zachariou V, Nestler EJ, Selley DE.

källa

Institutionen för farmakologi och toxikologi och institut för droger och alkoholstudier, Virginia Commonwealth University School of Medicine, Richmond, VA 23298, USA.

Abstrakt

Den stabila transkriptionsfaktorn ΔFosB induceras i nukleär accumbens (NAc) genom kronisk exponering för flera missbruksmedel och transgena uttryck av ΔFosB i striatum ökar de givande egenskaperna hos morfin och kokaine. Den mekanistiska grunden för dessa observationer är emellertid ofullständigt förstådd. Vi använde en bitransgen musmodell med inducerbart uttryck av FosB in dopamin D (1) -receptor / dynorfininnehållande striatala neuroner för att bestämma effekten av ΔFosB-uttryck på opioid- och cannabinoidreceptorsignalering i NAc. Resultaten visade att mu opioidmedierad G-proteinaktivitet och inhibering av adenylylcyklas förstärktes i NAc hos möss som uttryckte ΔFosB. På liknande sätt förbättrades kappa-opioidinhiberingen av adenylylcyklas i de FFB-uttryckande mössen. I motsats härtill skiljer sig inte cannabinoidreceptormedierad signalering mellan möss som överuttrycker ΔFosB och kontrollmöss. Thesa fynd tyder på att opioid- och cannabinoidreceptorsignaleringen moduleras differensiellt genom uttryck av FFosB och indikerar att ΔFosB-uttryck kan producera några av dess effekter via förbättrad mu- och kappa-opioidreceptorsignalering i NAc.

Nyckelord: G-protein, adenylylcyklas, striatum

1. Introduktion

Opioidreceptorer och cannabinoid CB1 receptorer (CB1R) är de neurobiologiska målen för två ofta använda läkarklasser som inkluderar morfin, heroin och receptbelagda opioider och marijuana (Δ9-tetrahydrocannabinol (THC)). De akuta effekterna av opioider och cannabinoider medieras av G-proteinkopplade receptorer som primärt aktiverar Gi / o proteiner och producera nedströms effektorresponser såsom inhibering av adenylylcyklas (Childers, 1991, Childers, et al., 1992, Howlett et al., 2002). Motorn, minnesskador och psykoaktiva effekter av Δ9-THC produceras av CB1R (Huestis et al., 2001, Zimmer et al., 1999), som är brett fördelade i hjärnan, med höga halter i basalganglia, hippocampus och cerebellum (Herkenham et al., 1991). De analgetiska och givande effekterna av de flesta kliniskt relevanta och missbrukade opioida läkemedel medieras främst av mu opioidreceptorer (MOR) (Matthes et al., 1996), som är berikade i det limbiska systemet och hjärnstammen (Mansour et al., 1994). Det mesolimbiska systemet, som består av dopaminerga utsprång från ventral tegmental area (VTA) till nucleus accumbens (NAc), spelar en viktig roll i de givande effekterna av opioider och cannabinoider (Bozarth och Wise, 1984, Vaccarino et al., 1985, Zangen, et al., 2006), liksom andra droger av missbruk (Koob och Volkow, 2010). Dessutom är endogena opioid- och cannabinoidsystem inblandade i de givande effekterna av flera klasser av psykoaktiva läkemedel (Maldonado, et al., 2006, Trigo et al., 2010). Således är det viktigt att belysa mekanismer med vilka opioider och CB1R-signalering regleras i NAc.

En central fråga på området för drogmissbruk har varit att identifiera proteiner som förmedlar övergången från akuta till långsiktiga effekter av psykoaktiva droger. AP-1 transkriptionsfaktorn ΔFosB är speciellt intressant eftersom det är en stabil avkortad splitsvariantprodukt av FosB gen som ackumuleras vid upprepad exponering för missbruk eller naturliga belöningar (McClung et al., 2004, Nestler, 2008, Nestler, et al., 1999). Vi har funnit att ΔFosB induceras i hjärnan efter upprepad exponering för morfin, A9-THC, kokain eller etanol, med varje läkemedel som producerar ett unikt regionalt mönster av ΔFosB-uttryck (Perrotti et al., 2008). En konsekvent upptäckt över droger var att ΔFosB inducerades starkt i striatumet, där alla fyra droger inducerade ΔFosB i NAc-kärnan och alla utom Δ9-THC signifikant inducerad expression i NAc-skalet och caudat-putamen.

Farmakologiska studier visade att samtidig administrering av dopamin D1 receptor (D1R) -antagonisten SCH 23390-blockerad ΔFosB-induktion i NAc och caudate-putamen efter intermittent kokain- eller morfinadministration, vilket föreslår den potentiella betydelsen av D1R-uttryckande neuroner (Muller och Unterwald, 2005, Nye et al., 1995). Effekten av ΔFosB-induktion på läkemedelsförmedlade beteenden har undersökts med användning av bitransgena möss som uttrycker ΔFosB i specifika neuronala populationer av NAc och dorsalstriatum (Chen et al., 1998). Möss som uttrycker ΔFosB i dynorfin / D1R-positiva neuroner i NAc och dorsalstriatum (linje 11A) visar förändrade svar på missbruksmissbruk, särskilt ökad känslighet för de givande effekterna av kokain eller morfin (Colby et al., 2003, Kelz et al., 1999, Zachariou, et al., 2006). Dessa förändringar inträffade i frånvaro av förändringar i nivåerna av MOR eller olika G-protein-subenheter. DynorfinmRNA-nivåer reducerades emellertid i NAc av FFBB som uttrycker möss (Zachariou, et al., 2006), vilket tyder på att ett mål för ΔFosB är en gen som kodar för en endogen opioidpeptid. ΔFosB induktion kan också producera beteendemässiga förändringar genom att reglera receptorsignalering i NAc, men denna möjlighet har inte undersökts. Därför använde föreliggande studier den bitransgena musmodellen för bestämning av huruvida överuttryck av ΔFosB i dynorfin / D1R innehållande striatala neuroner förändrar MOR-medierad G-proteinaktivitet och MOR- och KOR-medierad adenylylcyklasinhibering i NAc. Effekten av ΔFosB på CB1R-medierad G-proteinaktivitet bedömdes också eftersom A9-THC-administration inducerar ΔFosB i NAc (Perrotti et al., 2008) och endocannabinoid systemet är känt för att reglera hjärnbelöningskretsar (Gardner, 2005, Maldonado, et al., 2006), men effekten av ΔFosB på endocannabinoidsystemet har inte undersökts.

2. Material och metoder

2.1. Reagens

[35S] GTPyS (1250 Ci / mmol), [a-32P] ATP (800 Ci / mmol) och [3H] cAMP (26.4 Ci / mmol) inköptes från PerkinElmer (Shelton, CT). ATP, GTP, BNP, cAMP, bovint serumalbumin, kreatinfosfokinas, papaverin, imidazol och WIN-55212-2, köptes från Sigma Aldrich (St. Louis, MO). GTPγS köptes från Roche Diagnostic Corporation (Chicago, IL). DAMGO tillhandahölls av Drug Supply Programmet av National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD). Econo-1-scintillationsvätska erhölls från Fisher Scientific (Norcross, GA). Ekoliten scintillationsvätska erhölls från ICN (Costa Mesa, CA). Alla andra kemikalier erhölls från Sigma Aldrich eller Fisher Scientific.

2.2. Möss

Manliga bitransgena möss härledda från NSE-tTA (rad A) × TetOp-AFosB (linje 11) genererades som beskrivits i Kelz et al. (Kelz et al., 1999). Bitransgena möss upptäcks och upphöjdes på doxycyklin (100 μg i dricksvatten) för att undertrycka transgenuttryck. Vid 8-veckors ålder utelämnades doxycyklin från vattnet för hälften av mössen för att tillåta transgenuttryck, medan kvarstående möss upprätthölls på doxycyklin för att undertrycka transgenen. Hjärnor samlades 8 veckor senare, den tid då transkriptionella effekter av ΔFosB är maximala (McClung och Nestler, 2003). En andra transgen muslinje användes i vilken Ac-Jun, en dominant negativ antagonist av c-Jun, uttrycks i D1R / dynorfin och D2R / enkefalinceller av striatum-, hippocampus- och parietalcortexen (Peakman et al., 2003). C-Jun och relaterade Jun-familjeproteiner dimeriserar med Fos-familjeproteiner och binder till AP-1-stället för målgener för att reglera transkription. Trunkering av N-terminalen av c-Jun (Δc-Jun) gör emellertid komplexet transkriptionellt inaktivt och i stånd att hindra DNA-bindningen av aktiva AP-1-komplex. Manliga bitransgena möss härledda från NSE-tTA (linje A) × TetOp-FLAG-Ac-Jun (linje E) genererades som beskrivet i Peakman et al. (Peakman et al., 2003). Bitransgena möss upptäcks och upphöjdes på doxycyklin (100 μg i dricksvatten) för att undertrycka transgenuttryck. Valpar avvänjdes vid 3-veckor, genotyperades och separerades i grupper, med halva bibehållen doxycyklinhaltigt vatten och hälften på vanligt dricksvatten för att inducera FLAG-Δc-Jun-uttryck. Hjärnor samlades 6 veckor senare, den tid då maximala nivåer av FLAG-Δc-Jun har uppmätts (Peakman et al., 2003). Alla djurprocedurer utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av laboratoriedjur.

2.3. Membranberedning

Hjärnor lagrades vid -80 ° C till analysdagen. Före analys analyserades varje hjärna och NAc dissekerades på is. Varje prov homogeniserades i 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7.4 (membranbuffert) med 20-slag från en glashomogenisator vid 4 ° C. Homogenatet centrifugerades vid 48,000 × g vid 4 ° C för 10 min, resuspenderad i membranbuffert, centrifugeras igen vid 48,000 × g vid 4 ° C för 10 min och resuspenderad i 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl22, 0.2 mM EGTA, 100 mM NaCl, pH 7.4 (analysbuffert). Proteinnivåer bestämdes genom metoden för Bradford (Bradford, 1976) med användning av bovint serumalbumin (BSA) som standard.

2.4. Agonist-stimulerad [35S] GTPyS-bindning

Membran prekuberades för 10 minuter vid 30 ° C med adenosindeaminas (3 mU / ml) i analysbuffert. Membran (5-10 ^ g protein) inkuberades sedan för 2-tim vid 30 ° C i analysbuffert innehållande 0.1% (vikt / volym) BSA, 0.1 nM [35S] GTPγS, 30 ^ M BN och adenosindeaminas (3 mU / ml) med och utan lämpliga koncentrationer av DAMGO eller WIN55,212-2. Nonspecifik bindning mättes med 20 ^ M GTPyS. Inkubationen avslutades genom filtrering genom GF / B glasfiberfilter, följt av 3 tvättar med 3 ml iskall 50 mM Tris-HCl, pH 7.4. Bundet radioaktivitet bestämdes genom vätskescintillationsspektrofotometri efter över natt extraktion av filtren i Econo-1 scintillationsvätska.

2.5. Adenylylcyklasanalys

Membran (5-25 ^ g-protein) preinkuberades med adenosindeaminas såsom beskrivits ovan, inkuberades sedan för 15 min vid 30 ° C i närvaro eller frånvaro av 1 ^ M forskolin, med eller utan DAMGO, U50,488H eller WIN55,212-2, i analysbuffert innehållande 50 ^ M ATP, [a-32P] ATP (1.5 μCi), 0.2 mM DTT, 0.1% (vikt / volym) BSA, 50 ^ M cykliskt AMP, 50 ^ M GTP, 0.2 mM papaverin, 5 mM fosfatreatin, 20-enheter / ml kreatinfosfokinas och adenosindeaminas (3 mU / ml) i en slutlig volym 100 μl. Under dessa förhållanden, totalt [a-32P] cAMP utvunnet var i allmänhet mindre än 1% av den totala mängden tillsatt [a-32P] ATP i varje prov. Reaktionen avslutades genom kokning för 3 min och [32P] cyklisk AMP isolerades genom metoden med dubbla kolonner (Dowex och aluminiumoxid) av Salomon (Salomon, 1979). [3H] cAMP (10,000 dpm) sattes till varje rör före kolonnkromatografi som en intern standard. Radioaktivitet bestämdes genom vätskescintillationsspektrofotometri (45% effektivitet för 3H) efter att 4.5 ml av eluatet löstes i 14.5 ml Ecolite-scintillationsvätska.

2.6. Dataanalys

Om inget annat anges, rapporteras data som medelvärden ± SE av 4-8 separata försök, vilka var och en utfördes i triplikat. Netstimulerad [35S] GTPγS-bindning beräknas som agoniststimulerad bindning minus basalbindning. Netforskolinstimulerad adenylylcyklasaktivitet definieras som forskolinstimulerad aktivitet - basal aktivitet (pmol / mg / min). Procenthämning av forskolinstimulerad adenylylcyklasaktivitet definieras som (netto forskolinstimulerad aktivitet i frånvaro av agonist-net forskolinstimulerad aktivitet i närvaro av agonist / netforskolin-stimulerad aktivitet i frånvaro av agonist) x 100. Alla kurvmontering och statistiska analyser utfördes med användning av Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Koncentrations-effektkurvor analyserades genom iterativ icke-linjär regression för att erhålla EC50 och Emax värden. Statistisk signifikans av koncentrations-effektdata bestämdes genom tvåvägsanalys av varians (ANOVA) med användning av agonistdos och geninduktion (på eller av) som huvudfaktorer. Statistisk signifikans av kurvpassningsvärden (Emax eller EG50) bestämdes av den icke-parade tvåsidiga studentens t-test, med användning av Welchs korrigering eller kvadratrottransformation av data där det var nödvändigt för att korrigera för ojämna avvikelser (upptäckt av F-test) i EC50 värden.

3. Resultat

3.1. Effekt av ΔFosB-uttryck på opioid- och cannabinoidreceptormedierad G-proteinaktivering

För att bestämma om MOR- eller CB1R-medierad G-proteinaktivering förändrades genom inducerbart transgent uttryck av FFosB i den NAc-agoniststimulerade [35S] GTPyS-bindning undersöktes i isolerade membraner framställda från denna region av bitransgena möss som uttryckligen uttrycker (AFosB on) eller inte uttrycker (AFosB av) avFosB-transgenen. Den MOR-selektiva enkefalinanalogen DAMGO användes för att aktivera MOR och cannabinoidaminoalkylindolen WIN55,212-2 användes för att aktivera CB1R. Dessa ligander visade sig tidigare vara fulla agonister vid MOR och CB1R respektiveBreivogel et al., 1998, Selley, et al., 1997). Det var inte möjligt att undersöka KOR-medierad G-proteinaktivitet eftersom signalen är för låg i gnagarehjärnan (Childers, et al., 1998). Resultaten visade koncentrationsberoende stimulering av G-proteinaktivitet av både DAMGO och WIN55,122-2 i NAc från ΔFosB-av och ΔFosB på möss (Figur 1). För DAMGO-stimulerad aktivitet (Figur 1Atvåvägs ANOVA av koncentrationseffektdata avslöjade signifikanta huvudeffekter av ΔFosB-status (p <0.0001, F = 22.12, df = 1) och DAMGO-koncentration (p <0.0001, F = 29.65, df = 5) utan signifikant interaktion (p = 0.857, F = 0.387, df = 5). Icke-linjär regressionsanalys av koncentration-effektkurvorna avslöjade en signifikant större DAMGO E.max värde i ΔFosB på möss (Emax = 73 ± 5.2% stimulering) i förhållande till ΔFosB från möss (Emax = 56 ± 4.1% stimulering; p <0.05 skiljer sig från ΔFosB på möss genom Student's t-test). DAMGO EC50 värdena var inte olika mellan ΔFosB och AFosB från möss (302 ± 72 nM respektive 212 ± 56 nM, p = 0.346).

Figur 1 

Effekt av ΔFosB-uttryck på agoniststimulerad [35S] GTPyS-bindning i NAc. Membran från ΔFosB-uttryckande (AFosB on) eller kontroll (AFosB off) möss analyserades som beskrivet i Metoder med användning av varierande koncentrationer .

I motsats till resultat erhållna med MOR-agonisten DAMGO observerades inga ΔFosB-statusberoende skillnader i G-proteinaktivering med cannabinoidagonisten WIN55,212-2 (Figur 1B). Tvåvägs ANOVA av WIN55,212-2-koncentrationseffektdata avslöjade en signifikant huvudeffekt av WIN55,212-2-koncentration (p <0.0001, F = 112.4, df = 7), men inte av ΔFosB-status (p = 0.172 , F = 1.90, df = 1) och det fanns ingen interaktion (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). På samma sätt fanns det ingen effekt av ΔFosB-status på WIN55,212-2 Emax värden (103 ± 6% mot 108 ± 8% stimulering i ΔFosB på respektive från möss, p = 0.813 av studentens t-test) eller EC50 värden (103 ± 20 nM kontra 170 ± 23 nM i ΔFosB på respektive av möss, p = 0.123).

Baserat på kurvornas form och det faktum att våra tidigare studier har visat bifasiska WIN55,212-2-koncentrations-effektkurvor i hjärnan (Breivogel et al., 1999, Breivogel et al., 1998), WIN55,212-2-kurvorna analyserades också med användning av en tvåplatsmodell. Analys av medelvärdet visade en liten förbättring av passformens godhet med användning av tvåplatsmodellen (R2 = 0.933 och 0.914, summan av kvadrater = 3644 och 5463 i ΔFosB på respektive av-möss) jämfört med single-site-modellen (R2 = 0.891 och 0.879, summan av kvadrater = 6561 och 6628 i ΔFosB på respektive av-möss). Emellertid konstaterades inga signifikanta skillnader mellan ΔFosB på och av möss i antingen Emax eller EG50 värden på de höga eller låga potentiella sidorna (Kompletterande tabell 1), även om det var en trend mot ett lägre EG50 värdet på högeffekten hos möss med ΔFosB på (EC50hög = 28.0 ± 10.6 nM) jämfört med de med ΔFosB av (EC50hög = 71.5 ± 20.2 nM; p = 0.094). Vidare fanns ingen effekt av ΔFosB-status på basal [35S] GTPγS-bindning i NAc-membran (253 ± 14 kontra 226 ± 14 fmol / mg i respektive FFB på respektive av-möss, p = 0.188). Dessa data indikerar att inducerbart transgent uttryck av ΔFosB i NAc hos möss ökade MOR-medierad G-proteinaktivering utan att signifikant påverka CB1R-medierad eller basal G-proteinaktivitet.

3.2. Effekt av ΔFosB på opioid- och cannabinoidreceptormedierad inhibering av adenylylcyklas

För att utvärdera effekten av inducerbart transgent uttryck av ΔFosB på modulering av nedströms effektoraktivitet av MOR och CB1R, inhibering av 1 ^ M forskolin-stimulerad adenylylcyklasaktivitet undersöktes i NAc-membran. Förutom MOR- och CB1R-medierad inhibering av adenylylcyklasaktivitet, effekter av KOR-aktivitet undersöktes också med användning av den KOR-selektiva fullständiga agonisten U50,488 (Zhu, et al., 1997), eftersom tidigare resultat visade att dynorfinmRNA var ett mål för ΔFosB i den bitransgena modellen (Zachariou, et al., 2006). Resultaten visade att DAMGO, U50,488 och WIN55,212-2 vardera producerade koncentrationsberoende inhibering av adenylylcyklasaktivitet i både ΔFosB och ΔFosB på möss (Figur 2). Tvåvägs ANOVA av DAMGO-koncentrations-effektdata (Figur 2A) avslöjade signifikanta huvudeffekter av ΔFosB-status (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) och DAMGO-koncentration (p <0.0001, F = 29.61, df = 6), men ingen signifikant interaktion (p = 0.441, F = 0.986 , df = 6). Icke-linjär regressionsanalys av DAMGO-koncentration-effektkurvor avslöjade en signifikant lägre DAMGO EC50 värde i ΔFosB på möss (101 ± 11 nM) jämfört med ΔFosB från möss (510 ± 182 nM, p <0.05 av studentens t-test). Det fanns dock ingen signifikant skillnad i DAMGO E.max värden (20.9 ± 1.26% mot 19.8 ± 1.27% inhibering i ΔFosB på respektive från möss, p = 0.534).

Figur 2 

Effekt av ΔFosB-uttryck på inhibering av adenylylcyklasaktivitet i NAc. Membran från ΔFosB-uttryckande (AFosB on) eller kontroll (AFosB off) möss analyserades som beskrivet i Metoder i närvaro av 1 ^ M .

KOR-medierad adenylylcyklasinhibering skilde sig också som en funktion av inducerbart transgent uttryck av FFosB (Figur 2B). Tvåvägs ANOVA av U50,488 koncentrationseffektdata visade signifikanta huvudeffekter av ΔFosB-status (p = 0.0006, F = 14.53, df = 1) och U50,488-koncentration (p <0.0001, F = 26.48, df = 3) , utan någon signifikant interaktion (p = 0.833, F = 0.289, df = 3). Icke-linjär regressionsanalys av koncentration-effektkurvor avslöjade en större U50,488 Emax värde i ΔFosB på möss (18.3 ± 1.14% inhibering) jämfört med ΔFosB från möss (12.5 ± 2.03% inhibering; p <0.05 skiljer sig från ΔFosB med Studentens t-test), utan någon signifikant skillnad i U50,488 EC50 värden (310 ± 172 nM kontra 225 ± 48 nM i ΔFosB på respektive av möss, p = 0.324).

I motsats till effekter som observerades med MOR och KOR, fanns det ingen signifikant effekt av inducerbart transgena ΔFosB-uttryck på inhibering av adenylylcyklas av cannabinoidagonisten WIN55212-2 (Figur 2C). Tvåvägs ANOVA av WIN55,212-2 koncentrationseffektdata visade en signifikant effekt av läkemedelskoncentration (p <0.0001, F = 23.6, df = 2), men inte av ΔFosB-status (p = 0.735, F = 0.118, df = 1) och det fanns inte heller någon signifikant interaktion (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). Vidare fanns det ingen effekt av AFosB-status på basal eller forskolin-stimulerad adenylylcyklasaktivitet i frånvaro av någon agonist. Basal adenylylcyklasaktivitet var 491 ± 35 pmol / mg / min i ΔFosB på möss jämfört med 546 ± 44 i ΔFosB utanför möss (p = 0.346 genom Studentens t-test). På samma sätt var adenylylcyklasaktivitet i närvaro av 1 pM forskolin 2244 ± 163 pmol / mg / min i AFosB på möss jämfört med 2372 ± 138 pmol / mg / min i AFOSB utanför möss (p = 0.555).

3.3. Effekt av ΔcJun på opioid- och cannabinoidreceptormedierad inhibering av adenylylcyklas

Eftersom inducerbart transgent uttryck av ΔFosB förstärkt hämmande signaltransduktion från MOR och KOR till adenylylcyklas i NAc var det av intresse att bestämma huruvida en dominant negativ hämmare av AFosB-medierad transkription skulle modulera opioidreceptorsignalering på ett motsatt sätt. För att ta itu med denna fråga undersöktes inhibering av forskolinstimulerad adenylylcyklasaktivitet av DAMGO och U50,488 i membraner framställda från NAc av bitransgena möss som uttryckligen uttrycker ΔcJun. Resultaten visade ingen signifikant effekt av ΔcJun-uttryck på inhibering av adenylylcyklasaktivitet av MOR eller KOR (Figur 3). Tvåvägs ANOVA av DAMGO-koncentration-effektkurvor visade en signifikant huvudeffekt av DAMGO-koncentration (p <0.0001, F = 20.26, df = 6), men inte av ΔcJun-status (p = 0.840, F = 0.041, df = 1) och det fanns ingen signifikant interaktion (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). På samma sätt fanns det ingen signifikant skillnad i E.max eller EG50 värden mellan möss med ΔcJun på (Emax = 23.6 ± 2.6%; EG50 = 304 ± 43 nM) eller ΔcJun av (Emax = 26.1 ± 2.5%, p = 0.508; EG50 = 611 ± 176 nM, p = 0.129). Liknande resultat sågs med U50,488, så att tvåvägs ANOVA av koncentration-effektkurvorna visade en signifikant effekt av koncentration (p <0.0001, F = 11.94, df = 6), men inte av ΔcJun-status (p = 0.127 , F = 2.391, df = 1) och det fanns ingen signifikant interaktion (p = 0.978, F = 0.190, df = 6). På samma sätt fanns det inga signifikanta skillnader i E.max eller EG50 värden mellan möss med ΔcJun på (Emax = 14.8 ± 2.9%; EG50 = 211 ± 81 nM) eller av (Emax = 16.7 ± 1.8%, p = 0.597; EG50 = 360 ± 151 nM, p = 0.411).

Figur 3 

Effekt av ΔcJun-uttryck på inhibering av adenylylcyklasaktivitet i NAc. Membran från ΔcJun-uttryckande (ΔcJun on) eller kontroll (ΔcJun off) möss inkuberades i närvaro av DAMGO (A), U50,488H (B) eller WIN55,212-2 .

ΔcJun-uttryck påverkade inte heller signifikant hämning av adenylylcyklas i NAc av cannabinoidagonisten. Tvåvägs ANOVA för WIN55,212-2 koncentrationseffektkurvor visade en signifikant huvudeffekt av WIN55,212-2 koncentration (p <0.0001, F = 15.53, df = 6), men inte av genotyp (p = 0.066, F = 3.472, df = 1) och det fanns ingen signifikant interaktion (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). På samma sätt fanns det inga signifikanta skillnader i WIN55,212-2 Emax värden (13.0 ± 2.3% och 13.6 ± 0.9% hämning i ΔcJun mot respektive från möss, p = 0.821) och eller EC50 värden (208 ± 120 nM och 417 ± 130 nM i ΔcJun på respektive mot möss, p = 0.270). Således, även om det fanns en liten trend mot minskad potens av WIN55,212-2 hos möss som uttryckte ΔcJun, förändrade transgenet inte signifikant cannabinoidinhibering av adenylylcyklas. Vidare fanns ingen effekt av ΔcJun-status på basal eller forskolin-stimulerad adenylylcyklasaktivitet. Basal adenylylcyklasaktivitet var 1095 ± 71 pmol / mg / min och 1007 ± 77 pmol / mg / min (p = 0.403) hos möss med ΔcJun på respektive av. Adenylylcyklasaktivitet stimulerad av 1 ^ M forskolin var 4185 ± 293 pmol / mg / min kontra 4032 ± 273 pmol / mg / min (p = 0.706) hos möss med ΔcJun på eller av.

3.4. Diskussion

Resultaten av denna studie avslöjade förbättrad MOR-medierad G-proteinaktivering och inhibering av adenylylcyklas i NAc hos möss med inducerbart transgenuttryck av FosB i dynorfin / D1R innehållande neuroner. KOR-medierad hämning av adenylylcyklasaktivitet förbättrades också i NAc av FFBB som uttrycker möss, vilket föreslår att ΔFosB reglerar det endogena opioidsystemet i NAc. DAMGO Emax värdet var större för MOR-stimulerade [35S] GTPyS-bindning och dess EC50 värdet var lägre för adenylylcyklasinhibering, i ΔFosB-överuttryckande möss jämfört med kontrollmöss. Dessa fynd antyder möjligheten av receptorreserv för effektormodulation men inte G-proteinaktivering under undersökta analysbetingelser. Upptäckten att maximal inhibering av adenylylcyklas av KOR-agonisten påverkades av ΔFosB-uttryck antyder lågreceptorreserv för det KOR-medierade svaret, vilket överensstämmer med de låga nivåerna av KOR-bindningsställen i mushåne (Unterwald et al., 1991). Däremot CB1R-medierad G-proteinaktivitet och inhibering av adenylylcyklas påverkades inte av AFosB-expression, vilket tyder på att opioid- och cannabinoidsystemen skiljer sig åt i deras svar på ΔFosB i dessa NAc-neuroner.

Effekten av ΔFosB på opioidreceptormedierad signalering överensstämmer med vår tidigare rapport att ΔFosB-uttryck i striatum förändrade akuta och kroniska effekter av morfin (Zachariou, et al., 2006). Ett resultat av den studien var att möss med transgena uttryck av ΔFosB i dynorfin / D1R-striatala nervceller var känsligare för morfin på plats konditionering än kontroller. Vidare efterliknades denna effekt av virusmedierat uttryck av AFosB genom platsspecifik injektion i NAc. Dessa observationer överensstämmer med de nuvarande resultaten som visar förbättrad MOR-signalering i NAc.

Vi identifierade tidigare genen som kodar dynorfin som ett mål för FFosB och föreslog att reducerat dynorfin skulle överensstämma med förbättrade givande egenskaper hos morfin i ΔFosB-bitransgena möss (Zachariou, et al., 2006). De föreliggande resultaten visar att KOR-medierad inhibering av adenylylcyklas i NAc förbättras i FFBB-uttryckande möss, vilket kan återspegla en kompensatorisk ökning i KOR-känslighet efter minskad dynorfin. Tidigare studier har visat att KOR uppregulerades i vissa hjärnregioner av prodynorfin knockout-möss, inklusive NAc (Clarke et al., 2003).

I motsats till ΔFosB förändrade inducerbart transgent uttryck av ΔcJun inte den dominerande negativa trunkerade mutanten hos FFBB-bindningspartnern cJun, adenylylcyklasinhibering av MOR- eller KOR-agonister. Dessa resultat antyder att basala nivåer av ΔFosB-uttryck, som är relativt låga, inte spelar en signifikant roll för att upprätthålla opioidreceptorsignalering vid denna nivå av signaltransduktion i NAc. Det faktum att den konditionerade givande effekten av morfin minskade med ΔcJun-uttryck i vår tidigare studie (Zachariou, et al., 2006) antyder antingen att morfininduktion av FFosB under konditioneringsförfarandet är viktigt vid reglering av beteendemässiga svar på läkemedlet eller att transkriptionella effekter av ΔFosB andra än de som påverkar proximal signalering med opioidreceptorer kan påverka opioidbelöning. I vilket fall som helst visar resultaten från den föreliggande studien tydligt att, när ΔFosB-uttryck är förhöjt över basala nivåer i striatal dynorfin / D1R-uttryckande neuroner är det en robust ökning i kopplingen av MOR och KOR för inhibering av adenylylcyklas i NAc.

Mekanismerna genom vilka MOR- och KOR-medierad signalering förstärks av ΔFosB-överuttryck är oklar, men vi har tidigare visat att MOR-nivåer, bedömda av [3H] naloxonbindning, är inte olika i NAc av FFosB i jämförelse med från möss (Zachariou, et al., 2006). Samma studie fann att Gai1- och 2-proteinnivåer påverkades inte i denna region genom ΔFosB-uttryck. Tidigare genuttrycksanalyser visade dock att Gao mRNA uppregulerades i NAc av FFosB på möss (McClung och Nestler, 2003). Det kommer att vara av intresse för framtida studier för att fullständigt undersöka effekten av transgena ΔFosB-expression på G-protein-subenhetsuttryck på proteinnivån såväl som på uttrycket av många G-proteinmodulerande proteiner.

Det är intressant att ΔFosB-uttryck inte förbättrade CB1R-medierad signalering i NAc. Det är möjligt att förändringar i CB1R-signaler uppträder i en diskret population av neuroner som är dolda i hela NAc-preparatet. Till exempel administrering av A9- THC inducerade signifikant ΔFosB i kärnan, men inte skalet, av NAc (Perrotti et al., 2008). jagndeed har det visat sig den utmaningen med Δ9-THC efter upprepad administrering av A9-THC ökade dopaminfrisättning i NAc-kärnan, men minskad frisättning i skalet (Cadoni et al., 2008). Det är också viktigt att notera att 11A-linjen för bitransgena möss uttrycker ΔFosB endast i dynorfin / D1R-positiva medium spiny neurons av striatumen, men CB1R uttrycks i både dynorfin / D1R och enkefalin / D2R positiva striatala neuroner (Hohmann och Herkenham, 2000), liksom på terminaler av kortikala afferenter (Robbe et al., 2001). Uttryck av den dominerande negativa regulatorn för ΔFosB-medierad transkription, ΔcJun, hade inte någon signifikant effekt på cannabinoidreceptorsignalering, även om ΔcJun induceras inducerbart i både D1 och D2innehållande populationer av medelstarka nervceller i dessa möss (Peakman et al., 2003). Det är emellertid möjligt att basalt ΔFosB-uttryck är tillräckligt lågt att ΔcJun inte skulle påverka receptorsignalering, vilket föreslagits av resultat med MOR och KOR. Det är också möjligt att CB1R-signalering förbättras blygsamt med basalt ΔFosB-uttryck, så att ytterligare ökande ΔFosB-uttryck eller blockering av dess åtgärder med ΔcJun hade endast små effekter som inte nådde nivån av statistisk signifikans. Indirekt stöd för denna tolkning kan ses genom att jämföra WIN55,212-2 EC50 värden mellan möss som uttrycker ΔcJun mot ΔFosB. Förhållandet mellan WIN55,212-2 EC50 värde för adenylylcyklasinhibering hos möss med inducerat uttryck av ΔcJun till dess EC50 värdet för G-proteinaktivering hos möss med inducerat uttryck av ΔFosB var 4.0, medan samma förhållande i möss utan induktion av antingen transgen var 1.2.

Alternativt kan cannabinoider inducera ΔFosB-uttryck utan någon direkt effekt på CB1R-signalering. I detta scenario kan cannabinoider modulera responsen på de psykoaktiva effekterna av andra droger via ΔFosB-medierad transkriptionsreglering. jagn faktum, administrering av A9-THC producerar kors-sensibilisering mot opioider och amfetamin (Cadoni et al., 2001, Lamarque, et al., 2001), i överensstämmelse med denna hypotes. Vidare rapporterades upprepad administrering av cannabinoidagonisten CP55,940 för att öka MOR-medierad G-proteinaktivering i NAc, på samma sätt som möss som inducerat att uttrycka ΔFosB i föreliggande studie (Vigano et al., 2005). Effekten av ΔFosB-uttryck på A9-THC-medierade beteenden har inte utvärderats, men nuvarande resultat utesluter inte en interaktion. Resultaten av detta och vår tidigare studie (Zachariou, et al., 2006) visar ΔFosB-inducerade förändringar i MOR och KOR / dynorfin i striatumen. De givande effekterna av Δ9-THC, som mätt av platspreferensen, avskaffas i MOR null-möss, medan deletion av KOR-dämpad Δ9-THC placera aversion och avslöjade A9-THC-ställföreträdande (Ghozland et al., 2002). På liknande sätt konditioneras avvikelse mot A9-THC är frånvarande i pro-dynorfin knockout jämfört med vildtypande möss (Zimmer et al., 2001). Dessa data tyder på att Δ9-THC kan vara mer givande efter ΔFosB-induktion och därmed induktion av MOR-signalering med reduktioner i dynorfinuttryck.

Sammanfattningsvisy, resultaten av denna studie visade att uttrycket av ΔFosB i D1R / dynorfin-positiva striatala neuroner förbättrade MOR- och KOR-medierad signalering vid nivån av G-protein-medierad inhibering av adenylylcyklasaktivitet i NAc. Detta resultat är förenligt med studier som har visat en roll för det endogena opioidsystemet i belöning (Trigo et al., 2010) och tillhandahålla en potentiell mekanism för ΔFosB-medierade effekter på belöning. Däremot CB1R-medierad signalering i NAc påverkades inte signifikant av striatalafFosB-uttryck under de undersökta betingelserna, även om ytterligare studier är berättigade för att bestämma effekten av AFosB-induktion på endokannabinoidsystemet.

Forskningshöjdpunkter

  • MOR-signalering förbättras i kärnans accumbens av möss som uttrycker ΔFosB
  • KOR-inhibering av adenylylcyklas förbättras även hos möss som uttrycker ΔFosB
  • Uttryck av ΔFosB ändrar inte CB1R-signalering i kärnan accumbens

Extramaterial

Tack

Författarna tackar Hengjun He, Jordan Cox och Aaron Tomarchio för tekniskt bistånd med [35S] GTPyS-bindningsanalyser. Denna studie stöddes av USPHS Grants DA014277 (LJS), DA10770 (DES) och P01 DA08227 (EJN).

fotnoter

Ansvarsfriskrivning för förlag: Detta är en PDF-fil av ett oediterat manuskript som har godkänts för publicering. Som en tjänst till våra kunder tillhandahåller vi denna tidiga version av manuskriptet. Manuskriptet kommer att genomgå copyediting, uppsättning och granskning av det resulterande beviset innan det publiceras i sin slutliga formulär. Observera att under tillverkningsprocessen kan det upptäckas fel som kan påverka innehållet och alla juridiska ansvarsfrister som gäller för tidskriften avser.

referenser

  • Bozarth MA, Wise RA. Anatomiskt distinkta opiatreceptorfält medger belöning och fysiskt beroende. Science. 1984;224: 516-517. [PubMed]
  • Bradford MM. En snabb och känslig metod för kvantifiering av mikrogrammängder protein med användning av principen om proteinfärgbindning. Anal. Biochem. 1976;72: 248-254. [PubMed]
  • Breivogel CS, Childers SR, Deadwyler SA, Hampson RE, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Kroniskt delta9-tetrahydrocannabinolbehandling ger en tidsberoende förlust av cannabinoidreceptoraktiverade G-proteiner i hjärnan. J. Neurochem. 1999;73: 2447-2459. [PubMed]
  • Breivogel CS, Selley DE, Childers SR. Cannabinoidreceptoragonist effektivitet för stimulering [35S] GTPyS-bindning till rått-cerebellära membran korrelerar med agonistinducerad minskning i BNP-affinitet. J. Biol. Chem. 1998;273: 16865-16873. [PubMed]
  • Cadoni C, Pisanu A, Solinas M, Acquas E, Di Chiara G. Behandlingssensibilisering efter upprepad exponering för Delta 9-tetrahydrocannabinol och kors-sensibilisering med morfin. Psykofarmakologi (Berl) 2001;158: 259-266. [PubMed]
  • Cadoni C, Valentini V, Di Chiara G. Behandlingssensibilisering för delta 9-tetrahydrocannabinol och kors-sensibilisering med morfin: Differentiella förändringar i ackumulatskal och kärndopaminöverföring. J. Neurochem. 2008;106: 1586-1593. [PubMed]
  • Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgena djur med inducerande, riktade genuttryck i hjärnan. Mol. Pharmacol. 1998;54: 495-503. [PubMed]
  • Childers SR. Opioidreceptorkopplade andra budbärare. Life Sci. 1991;48: 1991-2003. [PubMed]
  • Childers SR, Fleming L, Konkoy C, Marckel D, Pacheco M, Sexton T, Ward S. Opioid och cannabinoidreceptorhämning av adenylylcyklas i hjärnan. Ann. NY Acad. Sci. 1992;654: 33-51. [PubMed]
  • Childers SR, Xiao R, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Kappa opioidreceptorstimulering av [35S] GTPγS-bindning i marsvin hjärna: Brist på bevis för kappa2-selektiv aktivering av G-proteiner. Biochem. Pharmacol. 1998;56: 113-120. [PubMed]
  • Clarke S, Zimmer A, Zimmer AM, Hill RG, Kitchen I. Regionel selektiv uppreglering av mikro-, delta- och kappa-opioidreceptorer men inte opioidreceptorliknande 1-receptorer i hjärnorna av enkefalin och dynorfin-knockout-möss. Neuroscience. 2003;122: 479-489. [PubMed]
  • Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Striatal celltypsspecifik överuttryck av DeltaFosB ökar incitamentet för kokain. J. Neurosci. 2003;23: 2488-2493. [PubMed]
  • Gardner EL. Endocannabinoid signaleringssystem och hjärnbelöning: betoning på dopamin. Pharmacol. Biochem. Behav. 2005;81: 263-284. [PubMed]
  • Ghozland S, Matthes HW, Simonin F, Filliol D, Kieffer BL, Maldonado R. Motiverande effekter av cannabinoider medieras av mu-opioid- och kappa-opioidreceptorer. J. Neurosci. 2002;22: 1146-1154. [PubMed]
  • Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvin LS, Costa BR, Rice KC. Karakterisering och lokalisering av cannabinoidreceptorer i råtthjärna: en kvantitativ in vitro autoradiografisk studie. J. Neurosci. 1991;11: 563-583. [PubMed]
  • Hohmann AG, Herkenham M. Lokalisering av cannabinoid CB (1) receptor mRNA i neuronala subpopuleringar av råtta striatum: en dubbelmärkning in situ hybridiseringsstudie. Synapse. 2000;37: 71-80. [PubMed]
  • Howlett AC, Barth F, Bonner Ti, Cabral G, Casellas P, Devane WA, Felder CC, Herkenham M, Mackie K, Martin BR, Mechoulam R, Pertwee RG. International Union of Pharmacology. XXVII. Klassificering av cannabinoidreceptorer. Farmakologisk granskning. 2002;54: 161-202.
  • Huestis MA, Gorelick DA, Heishman SJ, Preston KL, Nelson RA, Moolchan ET, Frank RA. Blockering av effekter av rökt marijuana av den CB1-selektiva cannabinoidreceptorantagonisten SR141716. Båge. Gen. Psykiatri. 2001;58: 322-328. [PubMed]
  • Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Själv DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Uttryck av transkriptionsfaktorn deltaFosB i hjärnan styr känsligheten för kokain. Nature. 1999;401: 272-276. [PubMed]
  • Koob GF, Volkow ND. Neurokretsen av missbruk. Neuropsychopharmacology. 2010;35: 217-238. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  • Lamarque S, Taghzouti K, Simon H. Kronisk behandling med Delta (9) -tetrahydrocannabinol ökar det rörelsefria svaret mot amfetamin och heroin. Konsekvenser för sårbarhet mot narkotikamissbruk. Neuro. 2001;41: 118-129. [PubMed]
  • Maldonado R, Valverde O, Berrendero F. Inblandning av endokannabinoidsystemet vid narkotikamissbruk. Trender Neurosci. 2006;29: 225-232. [PubMed]
  • Mansour A, Fox CA, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. mu-opioidreceptor-mRNA-expression i råtta-CNS: jämförelse med mu-receptorbindning. Brain Res. 1994;643: 245-265. [PubMed]
  • Matthes HWD, Maldonado R, Simonin F, Valverde O, Slowe S, Kitchen I, Befort K, Dierich A, LeMeur M, Dolle P, Tzavara E, Hanoune J, Roques BP, Kieffer BL. Förlust av morfininducerad analgesi, belöningseffekt och abstinenssymptom hos möss som saknar μ-opioidreceptorgenen. Nature. 1996;383: 819-823. [PubMed]
  • McClung CA, Nestler EJ. Reglering av genuttryck och kokainbelöning av CREB och DeltaFosB. Nat. Neurosci. 2003;6: 1208-1215. [PubMed]
  • McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: en molekylär växel för långsiktig anpassning i hjärnan. Brain Res. Mol. Brain Res. 2004;132: 146-154. [PubMed]
  • Muller DL, Unterwald EM. D1 dopaminreceptorer modulerar deltaFosB-induktion i råttstriatum efter intermittent morfinadministration. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005;314: 148-154. [PubMed]
  • Nestler EJ. Recension. Transkriptionsmekanismer för missbruk: DeltaFosBs roll. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2008;363: 3245-3255. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  • Nestler EJ, Kelz MB, Chen J. DeltaFosB: en molekylär mediator av långvarig neural och beteendets plasticitet. Brain Res. 1999;835: 10-17. [PubMed]
  • Nye HE, Hopp BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakologiska studier av reglering av kronisk FOS-relaterad antigeninduktion av kokain i striatum och kärnan accumbens. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995;275: 1671-1680. [PubMed]
  • Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, lager JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducibelt, hjärnregionsspecifik expression av en dominant negativ mutant av c-Jun i transgena möss minskar känsligheten för kokain. Brain Res. 2003;970: 73-86. [PubMed]
  • Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Distinkta mönster av DeltaFosB induktion i hjärnan av missbruk. Synapse. 2008;62: 358-369. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  • Robbe D, Alonso G, Duchamp F, Bockaert J, Manzoni OJ. Lokalisering och verkningsmekanismer hos cannabinoidreceptorer vid de glutamatergiska synapserna av muskelkärnan accumbens. J. Neurosci. 2001;21: 109-116. [PubMed]
  • Salomon Y. Adenylatcyklasanalys. Adv. Cyklisk nukleotidrester. 1979;10: 35-55. [PubMed]
  • Selley DE, Sim LJ, Xiao R, Liu Q, Childers SR. Mu-opioidreceptor-stimulerad [35S] GTPγS-bindning i råttalamus och odlade cellinjer: Signaltransduktionsmekanismer som ligger bakom agonistens effektivitet. Mol. Pharmacol. 1997;51: 87-96. [PubMed]
  • Trigo JM, Martin-Garcia E, Berrendero F, Robledo P, Maldonado R. Det endogena opioidsystemet: ett vanligt substrat i narkotikamissbruk. Drogalkohol Beroende. 2010;108: 183-194. [PubMed]
  • Unterwald EM, Knapp C, Zukin RS. Neuroanatomisk lokalisering av K1- och K2-opioidreceptorer i råtta och marsvin hjärna. Brain Res. 1991;562: 57-65. [PubMed]
  • Vaccarino FJ, Bloom FE, Koob GF. Blockad av kärnan accumbens opiatreceptorer dämpar intravenös heroinbelöning i råttan. Psykofarmakologi (Berl) 1985;86: 37-42. [PubMed]
  • Vigano D, Rubino T, Vaccani A, Bianchessi S, Marmorato P, Castiglioni C, Parolaro D. Molekylära mekanismer involverade i den asymmetriska interaktionen mellan cannabinoid och opioidsystem. Psykofarmakologi (Berl) 2005;182: 527-536. [PubMed]
  • Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. En viktig roll för DeltaFosB i kärnan accumbens i morfin åtgärder. Nat. Neurosci. 2006;9: 205-211. [PubMed]
  • Zangen A, Solinas M, Ikemoto S, Goldberg SR, Wise RA. Två hjärnplatser för cannabinoidbelöning. J. Neurosci. 2006;26: 4901-4907. [PubMed]
  • Zhu J, Luo Li, Li JG, Chen C, Liu-Chen LY. Aktivering av den klonade humana kappa opioidreceptorn av agonister ökar [35S] GTPyS-bindning till membran: bestämning av potenser och effektiviteter av ligander. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997;282: 676-684. [PubMed]
  • Zimmer A, Valjent E, Konig M, Zimmer AM, Robledo P, Hahn H, Valverde O, Maldonado R. Frånvaro av delta-9-tetrahydrocannabinol-dysforiska effekter i dynorfin-bristande möss. J. Neurosci. 2001;21: 9499-9505. [PubMed]
  • Zimmer A, Zimmer AM, Hohmann AG, Herkenham M, Bonner TI. Ökad mortalitet, hypoaktivitet och hypoalgesi hos cannabinoid CB1-receptor-knockout-möss. Proc. Natl. Acad. Sci. usa 1999;96: 5780-5785. [PMC gratis artikel] [PubMed]