PLoS One. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
Källa
Laboratory of Behavioral Physiology, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, Tokyo, Japan.
Abstrakt
Fysisk träning förbättrar flera aspekter av hippocampal funktion. I linje med tanken att neuronaktivitet är nyckeln till att främja neuronfunktioner, har tidigare litteratur konsekvent visat att akuta anfall av motion ökar neuronal aktivering i hippocampus. Upprepade aktiverande stimuli leder till en ackumulering av transkriptionsfaktorn ΔFosB, vilket medger långvarig neuralplasticitet.
I denna studie testade vi hypotesen att långsiktigt frivilligt hjullöp inducerar ΔFosB-uttryck i hippocampus och undersökte eventuella regionspecifika effekter inom de hippocampala delfälten längs dorso-ventralaxeln. Manliga C57BL / 6-möss hölls med eller utan ett löphjul under 4-veckor. Långtidshjulsträckning ökade signifikant FosB / ΔFosB immunreaktivitet i alla mäta hippocampala regioner (dvs. i DG, CA1 och CA3 delfält av både dorsal och ventral hippocampus). Resultaten bekräftade att hjulkörning inducerat regionspecifikt uttryck för FosB / FosB immunreaktivitet i cortex, vilket tyder på att den enhetliga ökningen i FosB / FosB inom hippocampus inte är en icke-specifik följd av körning. Western blot-data indikerade att den ökade hippocampala FosB / AFosB-immunreaktiviteten huvudsakligen berodde på ökad FosB. Dessa resultat tyder på att långvarig fysisk träning är en potent utlösare för ΔFosB induktion genom hela hippocampus, vilket skulle förklara varför motion kan förbättra både dorsala och ventrala hippocampusberoende funktioner. Intressant visade vi att uttrycket FosB / ΔFosB i generaldirektoratet var positivt korrelerat med antalet dubbelkortinimmunreaktiva (dvs. omogena) neuroner.
Även om mekanismerna genom vilka ΔFosB medierar träningsinducerad neurogenes fortfarande är osäker, innebär dessa data att träningsinducerad neurogenes är åtminstone aktivitetsberoende. Tillsammans föreslår våra nuvarande resultat att ΔFosB är ett nytt molekylärt mål som är inblandat i reglering av träningsinducerad hippocampal plasticitet.
Beskrivning
Övning ger olika fördelar med molekylära, strukturella och funktionella aspekter av hippocampus hos gnagare [1,2], av vilka några stöddes av mänskliga studier [3,4]. Emellertid är de mekanismer som ligger bakom de övningsinducerade förändringarna i hippocampal plasticitet inte tillräckligt förstådda. Tidigare litteratur har konsekvent visat att övning väcker hippocampal neuronal aktivering hos gnagare. Immunohistokemiska studier som använder c-Fos, en markör för transient neuronal aktivering, har visat att både tvungen och frivillig körning ökade c-Fos uttryck i dentat gyrus (DG), CA1 och CA3-delfält av gnagarehippocampus [5-7]. Dessutom har en tidigare studie med laser-Doppler-flödesmetod (LDF) visat att milt löpband körs ökat regionalt cerebral blodflöde (rCBF), en alternativ markör för neuronal aktivering, i CA1-delfältet i råtta [8]. Immunohistokemiska studier möjliggör detaljerade regionspecifika analyser efter träning har upphört, medan LDF möjliggör övervakning av rCBF i realtid i ett lokalt område under träning. Trots fördelarna och begränsningarna i varje studie visade dessa studier på liknande sätt en effekt av akut träning på hippocampal neuronaktivitet. Dessa resultat tyder på en mekanism, varigenom långsiktig regelbunden övning främjar hippocampal plasticitet genom upprepad utlösning av neuronaktivering [9].
Transkriptionsfaktorn ΔFosB, en trunkerad splitsisoform av FosB i full längd, induceras av olika typer av upprepade stimuli i specifika hjärnområden, där det gradvis ackumuleras på grund av dess unika stabilitet (en halveringstid av veckor) [10-12]. En växande mängd bevis visar att ökade nivåer av ΔFosB medger långvarig neural och beteendetsplasticitet associerad med särskilda stimuli [11,13]. Till exempel ökar kronisk administrering av missbruksmedel, såsom kokain och morfin, vanligtvis ΔFosB-uttryck i kärnans accumbens, vilket representerar en av de molekylära mekanismer som ligger till grund för ökad känslighet för dessa läkemedel [11,14,15]. Similarly till andra belöning stimuli, inklusive fetthalt och sexuell erfarenhet [16,17], lobefintligt frivilligt hjulkörning ökade också FosB / ΔFosB immunreaktivitet i ryggkärnans accumbens, vilket tyder på att frivillig löpning är en naturlig belöning för gnagare [18,19]. I vår litteratur har dock ingen litteratur undersökt huruvida upprepad exponering för fysisk aktivitet inducerar ΔFosB-uttryck i hippocampus. Eftersom träning utlöser neuronal aktivering i hippocampus, antog vi att långsiktigt frivilligt hjullöp också skulle inducera ΔFosB-uttryck i hippocampus. Medan exakta mekanismer med vilka ΔFosB reglerar hippocampal plasticitet fortfarande är osäker har studier visat att möss saknar FosB gen visar nedsatt hippocampal neurogenes och ökat depression-liknande beteende [20,21]. jagmotion, är känd för att förbättra neurogenes och har antidepressiva egenskaper [22-25]. jagf vår hypotes är korrekt, ΔFosB skulle vara en ny potentiell molekylär målmedierande motion-inducerad hippokampal plasticitet.
Hippocampus har anatomisk och funktionell gradient längs sin longitudinella (dorso-ventrala) axel [26]. Dorsal hippocampus spelar en nyckelroll i rumslig inlärning och minne [27,28], medan den ventrala hippocampus är företrädesvis inblandad i reglering av känslomässigt beteende [29,30]. Vidare har studier visat att fysiologiska stimuli inducerar olika mönster av c-Fos uttryck i de dorsala och ventrala delarna av hippocampusen [31-33]. Eftersom träning förbättrar både dorsal [34-37] och ventrala hippocampusberoende funktioner [24,25,38] är det viktigt att undersöka om långfristig frivillig körning orsakar regionspecifikt uttryck av ΔFosB i hippocampus.
Den primära hypotesen av denna studie var att långsiktigt frivilligt hjullöpning skulle inducera ΔFosB-uttryck i mushippocampus. Denna hypotes undersöktes av FosB / FosB immunhistokemi i dorsala och ventrala hippocampala delfält, DG, CA1 och CA3, med extra tonvikt på att identifiera regionspecifik induktion. Resultaten bekräftades genom western blotting, som användes för att identifiera isoformen av FosB genprodukter inducerad i hippocampus. Vi undersökte också cortex för regionspecifik FosB / ΔFosB induktion för att utesluta möjligheten att långvarig övning inte specifikt ökade FosB / FosB immunreaktivitet i hjärnan. Slutligen undersöktes den korrelativa associationen mellan FosB / AFosB-expression och neurogenes som det första steget i att söka de funktionella implikationerna av träningsinducerad ΔFosB-induktion vid reglering av hippocampal plasticitet.
Material och metoder
1: Djur och etik uttalande
Tjugo manliga C57BL / 6-möss (8-veckors ålder) köptes från en kommersiell uppfödare (SLC, Shizuoka, Japan). Tio möss användes för Experiment 1 och de andra tio för Experiment 2. Möss hölls under kontrollerade temperaturförhållanden (22-24 ° C) och ljus (12 / 12-h ljus / mörk cykel, tänds vid 0500) och tillhandahölls mat och vatten AD libitum. Alla försöksförfaranden godkändes av Djurförsökets Etikkommitté i Tokyo Metropolitan University.
Vid varje försök tillsattes möss slumpmässigt till antingen en kontrollgrupp (Control, n = 5) eller en löpande grupp (Runner, n = 5). Under den första veckan hölls alla möss i vanliga plastburar i grupper (5-möss / bur) för initial acklimatisering. Sedan överfördes Runner-möss till en bur utrustad med ett löphjul (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, USA). Eftersom social isolering är känd för att undertrycka övningsinducerad neurogenes i hippocampus [39], Runner möss hölls som en grupp (5 möss / bur) under ytterligare 4 veckor. Antalet hjulrotationer registrerades varje morgon och kroppsvikt (g) uppmättes varje vecka.
2: Experiment 1. Immunohistokemisk undersökning av FosB / AFosB-expression och hippocampal neurogenes
2.1: Perfusion och vävnadsbehandling
På morgonen (0900-1100) efter den sista dagen av löpperioden, mösses djupt bedövades med pentobarbitalnatrium och transcardiellt perfusionerades med kall saltlösning. Hjärnan avlägsnades snabbt och eftermonterades i 4% paraformaldehyd i 0.1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7.4) över natten. Hjärnan skyddades sedan i 30% sackaros i PBS och frystes tills vidare behandling. Koronala hjärnsektioner (40 ^ im) i en halvklot erhölls med användning av en frysande mikrotom och uppsamlades i PBS med 0.01% natriumazid.
2.2: Immunohistokemi
En en-i-sex serie av sektioner valdes slumpmässigt för FosB / AFosB immunostaining. En närliggande serie användes för märkning av doublecortin (DCX), en markör för omogna neuroner som validerades för att utvärdera neurogenes [40,41]. Efter släckning av endogen peroxidasaktivitet med 1% H2O2 i PBS preinkuberades frittflytande sektioner med blockeringslösning innehållande 10% normalt hästserum i PBS för 2 h. Efter sköljningar i PBS inkuberades sektioner med kaninpolyklonal pan-FosB-antikropp (1: 1000, sc-48, Santa Cruz-bioteknik, Dallas, TX, USA) utspädd i PBS med 0.5% Triton X-100 och 0.5% BSA (PBST -BSA) för 24 h vid 4 ° C. En annan serie av sektioner inkuberades med get polyklonal anti-DCX antikropp (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) i PBST-BSA för 48 h vid 4 ° C. Sektionerna inkuberades vidare med en lämplig biotinylerad sekundär antikropp (anti-kanin IgG, 1: 1000, AP182B; anti-get-IgG, 1: 1000, AP180B, båda antikroppar från EMD Millipore, Billerica, MA, USA) i PBST-BSA för 2 h vid rumstemperatur. Sektionerna behandlades sedan med avidin-biotin-peroxidaskomplex (Vectastain ABC peroxidas kit, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, USA) för 90 min efter tillverkarens instruktioner. Antigenema visualiserades äntligen med 0.02% 3,3-diaminobenzidin (DAB) i 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) innehållande 0.01% H2O2. För FosB / AFosB immunostaining intensifierades reaktionen med nickelammoniumsulfat. För DCX-färgning motverkades cellkärnor med Nissl-färgning. Sektionerna monterades på gelatinbelagda glidbanor och täckglas placerades.
2.3: Kvantifiering av FosB / ΔFosB immunreaktivitet med användning av bildgränser
Pan-FosB-antikroppen som användes i denna studie höjdes mot en intern region som delades av FosB och ΔFosB N-terminala regionen, så att det inte kan diskriminera mellan de två isoformerna. Därför beskrivs de immunostainerade strukturerna som FosB / AFosB immunoreaktiva (FosB / AFosB-ir) kärnor. För en objektiv blind kvantifiering kodades objektglas före analysen. Mus hjärnatlaset [42] använde sig för att identifiera platsen för följande intressanta regioner (ROI): granulatcellskikt (GCL) i DG (3-sektioner), pyramidalcellskikt av CA1 (3-sektioner) och CA3 (2-3-sektioner) i dorsalhippocampus (stängt till -2.2 mm från bregma); DG (2 sektioner), CA1 (2 sektioner) och CA3 (2 sektioner) i ventral hippocampus (stängt till -3.4 mm från bregma) (Figur 4, vänster). De kaudala sektionerna innehåller både de dorsala och ventrala delarna av hippocampusen, men den ventrala delen var riktade. I generaldirektoratet analyserades suprapyramidala (DGsp) och infrapyramidala (DGip) blad separat. Motorcortex (2-3-sektioner, stängda till -0.6 mm från bregma), somatosensorisk fatcortex (2-3 sektioner, stängda till -0.6 mm från bregma), visuell cortex (3 sektioner, stängda till -2.9 mm från bregma), hörselkors (3-sektioner, stängda till -2.9 mm från bregma) och luktlampa (3-sektioner, stängda till + 4.3 mm från bregma) analyserades också (Figur 6, vänster).
Digitala bilder (2070 × 1548 pixlar) av varje ROI togs med ett optiskt mikroskop (BX-51, Olympus, Tokyo, Japan) utrustade med en CCD-kamera (DP-73, Olympus) och bildhanteringsprogramvara (cellSens, Olympus). objektiv förstoring var 10 × för hippokampala ROI och 4 × för kortikala ROI. För att identifiera måttlig till stark FosB / AFosB immunreaktivitet (Figur 1D-G), med hjälp av flera sektioner i förväg optimerades både bildupptagningsinställningar (ljusintensitet, storlek på fältstopp, exponeringstid och vitbalans) och tröskelvärden för var och en av RGB-komponenterna för hippokampala och kortikala ROI. Följande analys utfördes sedan under optimerade betingelser (1). ROIs valdes av en oregelbunden formad polygon (Figur 1A, B) (2). Bilden var trösklad, vilken omvandlade FosB / FFB-ir-kärnorna till en röd färg (Figur 1C-G) (3). % ROI beräknades sedan automatiskt enligt följande:% ROI = (konverterat område (i rött) / totalt ROI-område) × 100.
För att validera denna tröskelanalys för bilder, valdes 20-regioner slumpmässigt från olika hjärnområden med olika regionstorlekar. Förutom bildgränsbeläggningskvantiteten räknades antalet FosB / AFosB-ir-kärnor inom de valda regionerna manuellt och densiteten av FosB / AFosB-ir-kärnor erhölls genom att dividera antalet FosB / AFosB-ir-kärnor med den uppmätta område (mm2).
2.4: Kvantificering av DCX-ir omogena neuroner i dentatgyrus
DCX-ir omogena neuroner i DG hos Runner-möss var rikliga och överlappande, vilket gör det svårt att exakt räkna det diskreta antalet DCX-ir soma med ett optiskt mikroskop. I en tidigare studie visade dock Sholl-analysen för morfologisk utvärdering att varje DCX-ir-neuron i genomsnitt har en enkel dendrit när den mäts inom 40 μm av soma [43]. Följaktligen utvecklades följande ursprungliga analys för att möjliggöra regionspecifik kvantifiering av DCX-ir-neuroner.
- (1) En bild av GCL projicerades på en datorskärm med hjälp av bildhanteringsprogram och en 40 × objektivlins (2). På den levande bilden ritades ett linjesegment (150 ± 0.1 μm) längs mitten av GCLFigur 2) (3). Ändring av fokusdjupet, antalet gånger linjesegmentet korsade DCX-ir dendriter räknades (4). ROI-värdena (Dorsal DGsp, dDGsp; Dorsal DGip, dDGip; ventral DGsp, vDGsp; ventral DGip, vDGip) motsvarade regionerna där FosB / ΔFosB immunreaktivitet analyserades (5). I varje avkastning ritades 2-3-linjesegment per sektion och antalet övergångar var i genomsnitt över 2-3-sektioner per mus. Eftersom tjockleken på GCL är ungefär 60-80 μm, bör antalet övergångar reflektera antalet DCX-ir-neuroner inom analyserad begränsad region.
En representativ bild av DCX-ir omogna neuroner och ett linjesegment (150 ± 0.1 μm) överlagda för att räkna antalet övergångar med DCX-ir-dendriter.
3. Experiment 2. Identifiering av FosB / ΔFosB isoformen inducerad av hjulkörning
3.1: Perfusion och vävnadsbehandling
En ytterligare kohort av möss behandlades som ovan i Experiment 1. Efter 4-veckor med löpande ingrepp perficerades mössen kortkardiellt med kall saltlösning under djupbedövning. Hippocampusen dissocierades snabbt och frystes med flytande kväve och lagrades vid -80 ° C. Hippocampi av varje mus homogeniserades i RIPA-buffert (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% natriumdeoxikolat, 0.1% SDS, # 8990, Thermo Scientific, IL, USA) innehållande proteas hämmare (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Tyskland). Lysaten centrifugerades för 15 min vid 5000 rpm vid 4 ° C och supernatanter uppsamlades. Proteinkoncentrationer mättes med en BCA Protein Assay kit (# 23227, Thermo Scientific, IL, USA).
3.2: Western blotting
Lika mängder protein (30 / g / lane) elektroforeserades på en 10% polyakrylamidgel, överfördes sedan till ett PVDF-membran (Immun-Blot, 0.2 ^ m, Bio-Rad, MD, USA). Nonspecifik bindning blockerades genom förinkubering av membranet för 1h i TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) innehållande 3% BSA. Membranet inkuberades med pan-FosB antikroppen (1: 1000) som användes ovan för immunohistokemi, upplöst i TBST innehållande 3% BSA. Efter tvätt med TBST inkuberades membranet med HRP-konjugerad anti-kanin-IgG-antikropp (1: 5000 i TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, Storbritannien) för 1 h vid rumstemperatur. Efter tvätt med TBST visualiserades proteinband genom inkubation med förbättrad kemiluminescens (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, USA) och fångades med användning av en Image Quant LAS 4000-mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Membranet reproberades sedan med anti-glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) -antikroppen (#2275, 1: 5000 i TBS-T, Trevigen, MD, USA) som en laddningskontroll. Den optiska densiteten hos proteinbanden kvantifierades med användning av Image-J och normaliserades till nivån av GAPDH.
4: Statistisk analys
Förändringar i muskroppsvikten analyserades genom tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA (grupp × tid). Ett oparat t-test användes för att bestämma statistiska skillnader mellan grupper (Control vs Runner). Pearsons korrelationsanalys användes för att validera FosB / ΔFosB immunreaktivitetsanalysen (manuell räkning mot bildgränser) och för att undersöka associeringen mellan nivån av FosB / ΔFosB-uttryck och antalet DCX-korsningar i generaldirektoratet. Data presenterades som medelvärde ± SEM. Tröskeln för statistisk signifikans fastställdes till P <0.05.
Resultat
1: Kroppsvikt och räckvidd i Experiment 1 och 2
Förändringar i kroppsvikt hos både Control and Runner-möss i Experiment 1 och 2 slås samman och visas i Figur 3. Tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA indikerade en signifikant interaktion (grupp × tid, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) och gruppens huvudeffekt F(1, 18) = 6.07, P <0.05), vilket indikerar en signifikant lägre kroppsvikt hos Runner-möss. Körsträckan per bur visas i Tabell 1. Även om precis körsträcka för varje mus var osäker på grund av att mössen hölls ihop, bekräftade regelbunden observation att alla möss ofta utförde hjulkörning. Runner-mössen i Experiment 2 sprang längre än de i Experiment 1, men det genomsnittliga körsträckan (m / dag / bur) var konsekvent under varje experiment.
2: Validering av FosB / FosB immunreaktivitetskvantifiering med användning av bildtröskel
Det fanns en signifikant korrelation mellan FosB / ΔFosB-ir-området erhållet genom bildgränser och densitet av FosB / FosB-ir-kärnor erhållna genom manuell räkning (r = 0.941, P <00001, Figur 4).
3: FosB / AFosB immunreaktivitet i hippocampusen
Representativa bilder av FosB / ΔFosB immunostaining i de dorsala och ventrala hippocampala delfälten visades i Figur 5. I alla analyserade ROI analyserades FosB / AFosB immunreaktivitet i Runner-möss (Figur 5, höger) var kvalitativt högre än i kontrollmöss (Figur 5, Centrum). I Runner-möss indikerade kvantitativ analys en signifikant ökning av FosB / ΔFosB-ir-området i både dorsalt (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) och de ventrala hippocampala delfälten (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Figur 6).
4: FosB / AFosB immunreaktivitet i cortexen
Representativa bilder av FosB / FosB immunostaining i de kortikala ROIs visas i Figur 7. Kvantitativ analys avslöjade regionberoende förändringar i FosB / FosB immunreaktivitet med långsiktig körning (Figur 8). I Runner-möss var FosB / ΔFosB-ir-området signifikant högre i motorcortexen (P <0.05) och den somatosensoriska tunnbarken (P <0.05), men inte i den visuella cortexen (P = 0.662) eller luktlampan (P = 0.523). I den auditiva cortexen tenderade FosB / ΔFosB-ir-området mot en ökning av Runner-möss (P =
5: Neurogenes
Representativa bilder av DCX immunostaining visas i Figur 9. I dorsal hippocampus, DCX immunreaktivitet i Runner-möss (Figur 9, höger) var kvalitativt högre jämfört med kontrollmöss (Figur 9, vänster). Jämfört med dorsalhippocampus var DCX-immunreaktivitet i ventralhippocampus svagare i både Control and Runner-möss. I Runner-möss var antalet övergångar signifikant högre i dDGsp (P <0.01) och dDGip (P <0.01; Figur 10). I ventralhippocampus tenderades antalet korsningar i Runner-möss att öka, men det fanns inga signifikanta skillnader mellan grupper (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Figur 10).
6: Korrelation mellan FosB / AFosB-uttryck och neurogenes
En korrelationsanalys utfördes mellan FosB / ΔFosB-ir-området och antalet DCX-övergångar (Figur 11). Eftersom varje dataset (t.ex. dorsal DGsp i Control-möss) består av endast 5-par, utfördes analysen först med alla 40-par. Intrånget var att det fanns en signifikant korrelation mellan FosB / ΔFosB-ir-området och antalet DCX-övergångar (r = 0.885, P <0.0001). Dessutom identifierades en signifikant korrelation när Dorsal DG (r = 0.762, P <0.05) och den ventrala DG (r = 0.816, P <0.01) analyserades separat.
7: Identifiering av FosB / FosB isoformen inducerad genom långvarig drift
Slutligen, för att identifiera isoformen av FosB genprodukter inducerad i hippocampus som svar på långvarig körning utsattes hippocampan från en ytterligare kohort av möss för western blotting med användning av samma pan-FosB antikropp. Flera band av 35-37 kDa, som representerar modifierade isoformer av ΔFosB [44], ökade signifikant i Runner kontra Control-möss (Figur 12, P <0.01). Å andra sidan kunde FosB-isoformen på 48 kDa inte detekteras i någon av grupperna. Ett annat band som är svagt synligt över 25 kDa representerar sannolikt Δ2ΔFosB-isoformen (27 kDa). Det fanns två andra band, över 50 kDa och 37 kDa, som troligtvis berodde på icke-specifik bindning. Vid kvantifiering hittades inga skillnader i dessa icke-ΔFosB-band mellan grupper (data visas inte).
Diskussion
Sammanfattningsvis utförde föreliggande studie först en immunohistokemisk analys för att undersöka 1) huruvida det långsiktiga frivilliga hjulkörningen inducerar FosB / ΔFosB-uttryck i hippocampusen; och 2) huruvida ett regionspecifikt svar existerar längs sin dorso-ventralaxel.
Fyra veckor av frivilligt hjulkörning medförde en signifikant ökning av FosB / ΔFosB-immunreaktivitet i alla de analyserade hippocampala regionerna (dvs. DG, CA1 och CA3-delfält av både dorsala och ventrala delar av hippocampus). Vi bekräftade att 35-37kDa ΔFosB isoformen var huvudrollen FosB genprodukten ackumuleras som svar på långsiktig körning. Dessa resultat stöder tydligt hypotesen att långvarig regelbunden övning är en potent utlösare för ΔFosB induktion genom hela hippocampusen och att dess induktion kan vara en ny molekylär mekanism genom vilken övning påverkar olika typer av dorsala och / eller ventrala hippocampusberoende funktioner.
1: Validering och begränsningar vid kvantifiering av FosB / FosB-immunreaktivitet med användning av bildtröskel
En bildtändningsteknik, som i stor utsträckning användes i immunohistokemiska studier för att räkna antalet målceller och för att utvärdera cellmorfologi, antogs i denna studie för regionspecifik kvantifiering av FosB / FFBB-immunoreaktivitet [15,45,46]. En signifikant korrelation mellan nivåerna av FosB / AFosB immunreaktivitet kvantifierad genom bildgränsning och manuellt räkning visades (Figur 4). Eftersom densitet och överlappning förhindrade att räkna antalet FosB / ΔFosB-ir-kärnor i mycket täta områden, innebär den demonstrerade korrelationen endast noggrannhet för bildtröskelmetoden när FosB / ΔFosB-ir-områdena representerar <~ 40% av den totala avkastningen område. Därför krävs noggrann tolkning för FosB / ΔFosB-ir-områden> 40% av det totala ROI-området.
I synnerhet i DG av Runner-möss (Figur 4), FosB / ΔFosB-uttryck inducerades kraftigt av hjulkörning och de flesta av FosB / ΔFosB-ir-kärnorna överlappade. I dessa områden leder ökad induktion av FosB / ΔFosB-uttryck till en större underskattning av expressionsnivån, oavsett vilken kvantifieringsmetod som används (bildtröskelvärde eller manuell räkning). Trots risken för underskattning är det emellertid viktigt att notera att den aktuella studien framgångsrikt visade signifikanta ökningar i FosB / ΔFosB-ir-området i DG för Runner-möss. Detta antyder att de metodologiska begränsningarna inte äventyrar våra resultat. Istället ökar den potentiella underskattningen tillförlitligheten för upptäckten att långvarig körning ökade FosB / ΔFosB-immunreaktivitet i hippocampus.
2: enhetlig induktion av ΔFosB i hippocampus genom långvarig körning
Hippocampus har anatomiska och funktionella lutningar längs sin längsaxel [26], så för den här studien analyserades FosB / ΔFosB-immunreaktivitet i dorsala och ventrale delar av hippocampus separat. Data visade att långsiktig körning ökade enhetligt FosB / ΔFosB-uttryck i alla hippocampala ROI: er uppmätta. Denna enhetliga induktion av FosB / ΔFosB-immunreaktivitet kan orsakas icke-specifikt av systemiska metaboliska förändringar förknippade med långvarig körning. Det är emellertid viktigt att notera att det fanns regionspecifika ökningar av FosB / ΔFosB-immunreaktivitet i cortex. Detta resultat stöds av nyligen förekommande fynd som visar att en akut anfall av löpband som körde ökade regionala cerebrala blodflöden i hippocampus, men inte i luktlampan [8]. Rhodes et al. (2003) visade att 7 dagar med frivillig hjulkörning inducerade c-Fos-uttryck i DG och CA2 / 3 i hippocampus (CA1 inte uppmättes) och i den sensoriska cortex, men inte i den visuella cortex [47]. Sammantaget antyder dessa studier att enhetlig induktion av FosB / ΔFosB-uttryck i hippocampus inte är en ospecifik konsekvens av långvarig körning. Intressant nog har Hawley et al. rapporterade nyligen att kronisk oförutsägbar stress ökade FosB / ΔFosB-uttrycket i ryggen, men inte i den ventrala, DG för råttan hippocampus [48]. Med ytterligare undersökning kommer de distinkta mönstren av FosB / ΔFosB-induktion, såsom de som framkallas av träning eller stress, att ge fortsatt insikt om stimulansberoende påverkan på hippocampus.
Den primära pan-FosB-antikroppen som användes i denna studie är känd för att känna igen alla isoformer av FosB-proteiner. Vid västlig blottinganalys fann vi att de enda isoformerna som ökade i hippocampus efter långvarig körning var de modifierade isoformerna av ΔFosB (35 – 37 kDa), de enda stabila isoformerna bland Fos-familjeproteiner [11]. Detta konstaterande överensstämmer med tidigare arbete med användning av pan-Fos-antikropp för att visa att 35 – 37 kDa ΔFosB är det dominerande Fos-familjeproteinet som induceras i frontala cortex av kronisk stress [44]. Därför återspeglar ökningen av hippocampal FosB / ΔFosB immunoreaktivitet här inducerad genom långvarig körning troligen nivån på FosB.
Mindre är känt om landsspecifika effekter av träning på molekylära och strukturella aspekter av hippocampus. Många beteendestudier indikerar emellertid en stor potential för övningsinducerade förbättringar i både rygg och ventral hippocampal funktioner. Motion har visat sig förbättra rumsligt lärande och minne [34-38] och rumslig och kontextuell behandling beror huvudsakligen på rygghippocampus [27,28]. Däremot är träning också känt för att utöva ångestdämpande och antidepressiva egenskaper [24,25,38] och dessa känslomässiga svar regleras övervägande av ventral hippocampus [29,30]. Den enhetliga induktionen av osFosB genom långvarig körning sett i denna studie antyder att någon form av neuroplastiska förändringar inträffade genom hela hippocampus. Detta förklarar varför träning kan påverka både rygg och ventral hippocampusberoende funktioner.
3: Landsspecifik analys av träningsinducerad neurogenes
En funktionell dissociation av neurogenes mellan dorsal och ventral hippocampus har också fått ökad uppmärksamhet [49]. I denna studie utnyttjade de morfologiska egenskaperna hos DCX-ir omogna neuroner [43], räknade vi antalet korsningar mellan DCX-ir dendriter och ett linjesegment ritat längs mitten av GCL. Denna mätning gav inte det totala antalet DCX-ir-neuroner i DG, men det möjliggjorde regionspecifik kvantifiering som behövs för att utföra en korrelationsanalys med FosB / ΔFosB-uttrycksdata (se nedan). Efter långvarig körning ökade antalet DCX-ir-neuroner signifikant i dorsalen, men inte den ventrala, DG. Detta antyder att träning kan stimulera neurogenes mer slående i ryggen jämfört med den ventrale delen av DG. Emellertid har tidigare studier rapporterat motstridiga resultat där hjulkörningen ökade neurogenesen i både dorsal och ventral DG [50,51]. I den aktuella studien tenderade antalet DCX-ir-korsningar i den ventrale DG att öka med körning, även om den lilla provstorleken (5-möss per grupp) kan ha begränsat förmågan att upptäcka en statistiskt signifikant skillnad mellan grupper. Därför är det troligtvis för tidigt att utesluta möjligheten att frivillig hjulkörning kan stimulera ventral hippocampal neurogenes. Ytterligare detaljerade studier är nödvändiga för att förstå regionens specificitet av träningsinducerad neurogenes angående dess flerstegsprocess (cellproliferation, differentiering, migration och överlevnad).
4: Funktionella implikationer av träningsinducerad ΔFosB-induktion för att reglera hippocampal plasticitet
Slutligen, som det första steget i att erkänna de funktionella implikationerna av träningsinducerad ΔFosB-induktion i hippocampus, undersökte vi förhållandet mellan FosB / ΔFosB-immunreaktivitet till DCX-ir-korsningar i både dorsal och ventral DG och fann ett signifikant, positivt samband mellan de två variablerna. Även om de exakta mekanismerna genom vilka osFosB reglerar träningsinducerad neurogenes förblir osäkra, visade en ny studie att FosB-nollmöss, som saknar FosB, ΔFosB och Δ2ΔFosB (alla FosB produkter), uppvisade underskott i basal hippocampal neurogenes, inklusive minskad spridning av neuronala stamceller, ökad ektopisk migration av nyfödda neuroner och onormala DG-strukturer [20]. Dessa förändringar observerades emellertid inte i FosB(d / d) möss, som saknar FosB, men inte ΔFosB / Δ2ΔFosB. Intressant nog i FosB-nollmöss, uttryck för några neurogenesrelaterade gener, inklusive VGF (VGF nervtillväxtfaktor inducerbar) och Tjej (Galanin-prepropeptid) nedreglerades [20]. Eftersom VGF och GAL är sekretionsmolekyler anser ett förslag som håller löfte att neuroner som uttrycker ΔFosB kan reglera neurogenes genom autokrin / paracrinaktivitet [20].
Dessutom bör det noteras att regionen där osFosB induceras genom att köra rumsligt överlappar det område där neurogen aktivitet är hög. Detta fynd tyder på att träningsinducerad neurogenes är på det minsta aktivitetsberoende. Neuronal aktivering är nyckeln till att upprätthålla och förbättra funktionen i centrala nervsystemet [9], genom mekanismer som inkluderar expression och frisättning av hjärnan härledd neurotrofisk faktor (BDNF) [52,53], upptag av seruminsulinliknande tillväxtfaktor-1 (IGF-1) genom blod-hjärnbarriären [54,55], undertryckande av apoptos [56] och reglering av mitokondriell rörlighet [57]. Följaktligen antyder den aktuella studien att långvarig träning utlöste upprepad neuronal aktivering, tydligt i det ökade ΔFosB-uttrycket, vilket bidrar till att förbättra hippocampal plasticitet, potentiellt genom dessa multipla mekanismer som beskrivs ovan.
Denna studie bedömde endast träningsinducerad neurogenes och dess associering med FosB / ΔFosB-uttryck i DG. Emellertid inducerades FosB / ΔFosB immunoreaktivitet också i CA1 och CA3 subfält. Medan ytterligare studier krävs för att få mer förståelse för de funktionella rollerna för övningsinducerad ΔFosB-uttryck inom dessa underfält, erbjuder tidigare litteratur en lovande möjlighet. Guan et al. (2011) demonstrerade att specifik ablation av det cyklinberoende kinaset 5 (Cdk5) i CA1- eller CA3-pyramidala neuronerna försämrade minneskonsolideringen respektive återvinning [58]. Intressant nog är Cdk5 nedströmsmålet för ΔFosB [59] och är involverad i att reglera synaptisk plasticitet [60]. Därför kan träningsinducerad ΔFosB-uttryck vara involverad i att reglera synaptisk plasticitet genom Cdk5-aktivering i CA1- och CA3-underfältet.
Slutsats
Medan akuta träningsanordningar var kända för att inducera uttryck av omedelbara tidiga genproteiner i hippocampus ger den nuvarande studien det första beviset på att långvarig regelbunden träning väsentligt inducerar ΔFosB-uttryck i hela hippocampus. thär enhetlig induktion av ΔFosB stöder den nuvarande förståelsen att träning är en effektiv icke-farmakologisk ingripande som kan förbättra flera hippokampfunktioner. Tillsammans med den signifikanta korrelationen mellan FosB / ΔFosB-uttryck och neurogenes är dessa data provocerande och indikerar ett behov av ytterligare studier som beskriver rollen av FosB för att förmedla effekterna av träning på hippocampal funktion, inklusive neurogenes.
Finansieringsdeklaration
Referensprojekt
;
