Aversivt beteende som induceras av optogenetisk inaktivering av dopaminneuroner i ventral tegmental area medieras av dopamin D2-receptorer i nukleär accumbens (2014)

Proc Natl Acad Sci USA A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455-6460.

Publicerad online Apr 15, 2014. doi:  10.1073 / pnas.1404323111

PMCID: PMC4036004

Neuroscience

Denna artikel har varit citerad av Andra artiklar i PMC.

Gå till:

Signifikans

Dopamin (DA) -neuroner i det ventrala tegmentala området (VTA) reagerar på aversiva stimuli, mestadels genom övergående silning. Det är fortfarande oklart om denna reaktion direkt inducerar aversiva svar vid uppförande av möss. Vi undersökte denna fråga genom att optogenetiskt kontrollera DA-neuroner i VTA och fann att inaktiveringen av DA-neuroner resulterade i aversivt svar och lärande. Kärnans accumbens (NAc), huvudkärnorna i VTA DA-neuroner, ansågs vara ansvariga för detta svar, så vi undersökte vilken av de grundläggande vägarna i NAc som var kritisk för detta beteende genom att använda knockdown av D1 eller D2-receptorn, och fann att den D2-receptorspecifika vägen var avgörande för detta beteende.

Abstrakt

Dopamin (DA) överföring från ventral tegmental area (VTA) är avgörande för att kontrollera både givande och aversiva beteenden. Den transienta tystnaden av DA neuroner är ett av svaren på aversiva stimuli, men dess konsekvenser och neurala mekanismer när det gäller aversiva svar och lärande har i stor utsträckning förblivit oroväckande. Här, vi rapporterar den optogenetiska inaktiveringen av VTA DA-neuroner snabbt nedreglerade DA-nivåer och inducerad uppreglering av den neurala aktiviteten i nukleär accumbens (NAc) som utvärderas av Fos uttryck. Thans optogenetiska undertryckande av DA-neuronbränning framkallade genast aversiva svar på det tidigare föredragna mörka rummet och ledde till aversiv inlärning mot den optogenetiskt konditionerade platsen. Viktigt är att denna platsavvikelse avskaffades genom nedslagning av dopamin D2-receptorer men inte av D1-receptorer i NAc. Avstängning av DA-neuroner i VTA var således oumbärlig för inducering av aversiva svar och inlärning genom dopamin D2-receptorer i NAc.

Det mesolimbiska dopaminerga systemet spelar inte bara en nyckelroll i ett brett spektrum av motivation och lärande (1-3), men dess dysfunktion har också blivit implicerad i svåra neuropsykiatriska störningar som exemplifieras vid Parkinsons sjukdom, schizofreni och drogmissbruk. Dopamin (DA) -neuroner i det ventrala tegmentala området (VTA) reagerar på givande stimuli genom fasavbrott, och den här funktionens huvudfunktion är teoretiserad för att koda "belöningsförutsägningsfelet", skillnaden i värdet mellan det förutspådda belöningen och verklig belöning (4). I motsats till svaret på givande stimuli är deras reaktioner på aversiva stimuli långt ifrån homologa; dvs vissa DA neuroner aktiveras som svar på aversiva stimuli, medan de flesta andra reagerar genom att tillfälligt undertrycka sina avfyringar (5-9). Faktum är att nyligen gjorda studier har visat att optogenetisk aktivering av GABAerga neuroner och resulterande inaktivering av DA-neuroner undertrycker belöningskonsumtion och inducerar ett aversivt svar (10, 11). Det har emellertid i stor utsträckning förblev svårt att bestämma vilka mekanismer i neurala kretsar som är nödvändiga för förvärv av aversivt lärande efter inaktivering av DA-neuroner i VTA och om hur beteenderesponser styrs mot att undertrycka belöningskonsumtion och inducera aversiv beteende.

Ackumulerade bevis har visat att det motivativa och kognitiva lärandet som svar på positiva och negativa stimuli regleras i stor utsträckning av neurala kretsar inklusive de basala ganglierna (12), som mottager en stor del av det dopaminerga utsprånget från midjen. I striatumet utgörs två grundläggande neurala kretsar av specifika mellanspiriga neuroner (MSN), vilka var och en uttrycker en distinkt typ av DA-receptor (13).

  • En krets är den direkta vägen, som består av MSN: erna som direkt projicerar till basalgangliernas utgångskärnor, substantia nigra pars reticulata (SNr) och övervägande uttrycker dopamin D1-receptorer (D1Rs).
  • Den andra är den indirekta vägen, som består av de MSN som indirekt projicerar genom globus pallidus till SNr och främst uttrycker dopamin D2 receptorer (D2Rs).

DA-signaler från mittradet modulerar dessa två parallella vägar dynamiskt på motsatt sätt via D1R och D2R, och denna modulering är avsedd att underlätta motiverande lärande (3, 14).

  • När det gäller de givande stimuli anses uppreglerade DA-nivåer som induceras av givande signaler att aktivera D1R och därigenom främst underlätta den direkta vägen i nukleär accumbens (NAc).
  • Å andra sidan minskar undertryckningen av DA neuron firningar som svar på aversiva stimuli DA-nivåer i NAc; och denna reaktion är avsedd att specifikt främja signalöverföringen i den indirekta vägen genom aktiverade D2R.

Även om studier som använder de farmakologiska strategierna och reversibla neurotransmission-blockeringsmetoden (RNB) har stödt denna regleringsmekanism i NAc (15, 16) har det varit okänt om undertryckandet av DA-neuronavbrott är tillräckligt för att främja aktiviteten hos den indirekta vägen och därefter inducera undvikande beteende. I denna föreliggande studie behandlade vi denna fråga genom att selektivt inaktivera DA-neuroner i VTA genom optogenetiskt manipulerande membran-hyperpolariserande Arch-protein (17) och uttryckligen visat att undertryckandet av DA neuroner i VTA minskade därefter DA-nivåer i NAc och inducerad aversiv reaktion och inlärning. Vidare undersökte vi mekanismerna för regleringen av denna reaktion och avslöjade att denna aversiva reaktion var specifikt kontrollerad av D2R i NAc.

Resultat

Optogenetisk inaktivering av DA Neurons Blocks Dark Room Preference.

För att selektivt inaktivera firningar av DA-neuroner injicerade vi en Cre-inducerbar adenoassocierad viral konstruktion som kodar för Arch-eGFP [AAV-dubbel-floxed inverterad öppen läsram (DIO) -Arch] (17) ensidigt in i VTA hos vuxna tyrosinhydroxylas (TH) -Cre-möss (18) och vildtyp (WT) littermates och placerade en optisk fiber ovanför VTA (Fig. S1 A och C). Två veckor efter operationen detekterades Arch-eGFP på ett begränsat sätt i VTA (Fig. S1B). Vi testade den hyperpolariserande effekten av Arch-proteinet genom elektrofysiologisk inspelning och mätt effekten av optisk stimulering av VTA av TH-Cre-möss injicerade med AAV-DIO-Arch. In vivo elektrofysiologiska inspelningar från VTA av bedövade TH-Cre-möss visade att optisk stimulering av förmodade DA-neuroner hämmade sina avfyringar (Fig. S2), vilket indikerar att den optiska stimuleringen tillräckligt hyperpolariserar membranpotentialen hos Arch-uttryckande DA-celler och sålunda hämmar deras spontana avfyrning.

Genom att använda dessa möss undersökte vi nästa gång huruvida den optiska inaktiveringen av DA neuroner i VTA skulle kunna fungera som en aversiv signal för beteendeinlärning. Möss har en medfödd tendens att föredra en mörk miljö (19). Vi utformade en beteendeapparat där mössen fritt kunde utforska det mörka rummet och öppna ljust utrymme (Fig 1A). Efter förtvivlan stannade WT-mössen företrädesvis i det mörka rummet antingen med eller utan optisk stimulering i det mörka rummet (Fig. S1D), vilket säkerställde att optisk stimulering inte hade något inflytande på deras mörkrums föredragande beteende. Vi planerade djurets beteendexperiment för att testa effekten av optisk inaktivering av DA neuroner på deras beteende (Fig. S1E). Efter uppställning och förtestning bestämdes mössen genom att optiskt stimulera DA neuronerna i VTA när de stannade i det mörka rummet. Även under den första 5 min konditioneringen stannade TH-Cre-mössen ur det tidigare föredragna mörka rummet och undvikde successivt det mörka rummet under hela konditioneringen (Fig 1B). TH-Cre-mössen vändte inte sin undvikande mot det mörka rummet trots att de inte fick någon optisk stimulering vid posttestet (Fig 1C). Dessa data indikerar att hyperpolarisering av DA neuroner inte bara inducerade övergående aversivt beteende utan också fungerade som en signal för aversivt lärande mot det mörka rummet och visar också att inaktiveringen av DA neuroner spelade en kausal roll i både övergående aversivt beteende och långvarigt aversivt lärande.

Fig. 1.  

Optogenetisk inaktivering av DA-neuroner blockerar mörkrumspreferensen hos fritt uppförande möss. (A) En illustration av apparaten som användes i mörkrumspreferensprovet. Möss fick flytta runt det mörka rummet och det lätta utrymmet. (B) Tidskurs .

Optogenetisk nedreglering av DA nivåer i NAc.

Vi undersökte därefter om inaktiveringen av DA-neuroner i VTA faktiskt modifierade koncentrationen av DA i dess huvudmålningsregion, NAc. Vi mättade DA-nivåer i NAc genom snabb-scan-cyklisk voltammetri (FSCV) i bedövade TH-Cre-möss som hade injicerats med AAV-DIO-Arch i deras VTA. DA-nivåer i NAc ökades snabbt genom elektrisk stimulering av VTA, och den framkallade DA-frisättningen reducerades signifikant genom samtidig optisk stimulering av VTA (Fig. S3). Vi testade sedan huruvida optisk stimulering av VTA kunde minska tonisk DA-nivå i NAc. I samma experimentella inställningar observerade vi att DA-nivån i NAc minskade transientvis med 20 s för optisk stimulering av VTA (Fig 2), vilket överensstämmer med den rapporterade FSCV-reaktionen mot aversiva stimuli (20). Dessa data visar att optisk stimulering av VTA var effektiv nog att inaktivera VTA DA-neuronerna och att minska DA-nivån i NAc under beteendexperimentet.

Fig. 2.  

Optisk inaktivering av DA-neuroner i VTA reducerar DA-nivå i NAc. (A) Medelvärde DA svar på optisk stimulering i NAc, mätt av FSCV. Den gröna linjen indikerar varaktigheten av optisk stimulering (n = 7-11 spår). (B) Medelvärde .

Uppreglering av Fos-genuttryck genom optisk inaktivering av DA-neuroner i VTA.

Den beteendemässiga förändringen orsakad av konditionerad inaktivering av DA neuroner i VTA föreslog att optisk stimulering direkt förändrade neural aktivitet och resulterade i förändring av beteendemässig prestanda. Så vi undersökte därefter de regioner där neural aktivitet förhöjdes genom konditionerad inaktivering av DA-neuroner genom att undersöka uttrycket av Fos, en omedelbar tidig gen. Strax efter att konditioneringen utfördes i mörkrumstestet, bearbetades möss snabbt för att bestämma mängden Fos-uttryck genom kvantitativ in situ-hybridiseringsanalys (Fig 3 och Fig. S4). NAc, regionen som mottar en stor mängd dopaminerga utsprång från VTA, visade en signifikant ökad mängd Fos-uttryck i TH-Cre-mössen (Fig 3). Denna uppreglering upptäcktes också i den kontralaterala sidan av optisk stimulering, vilket förmodligen orsakades av en liten mängd virusinfektion i den sidan. Uppreglering var emellertid mycket högre vid den ipsilaterala sidan än vid den kontralaterala sidan av optisk stimulering, vilket tyder på att optisk inaktivering av DA-neuroner direkt uppreglerade den neurala aktiviteten hos NAc. Det ökade Fos-uttrycket observerades också i andra hjärnregioner, inklusive septum, periventrikulära regioner av striatumen, basolateral amygdala (BLA) och lateral hypotalamus, men inte i lateral habenula eller medial prefrontal cortex (mPFC; Fig. S4). Dessa resultat indikerar att de regioner som aktiveras genom optisk inaktivering av DA-neuroner inte var begränsade till de direkta målregionerna av VTA DA-neuroner, utan snarare inkluderade de regioner som kan indirekt aktiveras på en neuralt kretsberoende sätt. Denna observation antyder att optisk inaktivering av DA neuroner modifierad kretsövergripande neuronaktivitet och inte bara kunde framkalla en aversiv reaktion utan också utlösa flera andra hjärnfunktioner såsom ångest, rädsla och stressresponser (21).

Fig. 3.  

Aktivitetsrelaterat uttryck av Fos-genen inducerad genom optogenisk DA-neuroninaktivering. (A-C) Representativa fotografier för Fos uttryck (gul) i NAc. Bilder togs av den stimulerade sidan av en TH-Cre-mus (A), av icke-stimulerade .

DA-signalering genom D2R är kritisk för optogenetiskt inducerad betingad platsavvikelse.

Majoriteten av dopaminerga signaler från VTA sänds till MSN: erna i NAc genom DA-receptorer, D1R och D2R. D1R uttrycks nästan uteslutande i substansen P (kodad av Tac1-genen) -expressande MSN, och D2R uttrycks övervägande i enkefalin (kodad av Penk-gen) -expressande MSN; varje typ av MSN utgör de direkta och indirekta vägarna i NAc (3). Eftersom affiniteten för DA är mycket högre för D2R (nM-ordningen) än för D1R (μM-ordningen) (22, 23), anses en minskning av DA-nivåer resultera i inaktivering av Gi-kopplad D2R men inte ha någon märkbar effekt på D1R (3, 24), därigenom uppreglera den neurala aktiviteten specifikt i den indirekta vägen. Vidare observerades Fos-aktiveringen mer framträdande i Penk- eller Drd2 (D2R) -expressande celler än i Tac1- eller Drd1a (D1R) -uttryckande cellerna (Fig. S5). Baserat på dessa observationer antog vi att DA-signalering via D2R skulle kunna spela en viktig roll i den observerade aversiva konditioneringen.

För att testa den här hypotesen utförde vi testet med tre kammare-konditionerad platsaversion (CPA) (Fig. S6). Vi förberedde en beteendeapparat som innehöll två kamrar med nästan identiska omständigheter och en liten korridor. Detta subjektiva miljöförhållande i CPA-testet gjorde det möjligt för oss att ytterligare undersöka huruvida inaktiveringen av VTA DA-neuroner är kapabel att framkalla aversiv reaktion och lärande, förutom att blockera den mörka rumspreferensen. När djuren fick flytta runt hela apparaten, stannade de flesta i två kamrar utan någon typisk beteendemässig skillnad vid pretest. Den optiska konditioneringen utfördes sedan genom parning av optisk stimulering med en fast kammare. Även när någon av kamrarna användes för konditioneringen, undviker TH-Cre-mössna permanent och signifikant att stanna i den optiskt konditionerade kammaren under konditioneringen och vid eftertestet (Fig. S6 B-E). Statistisk analys validerade en signifikant minskning av uppehållstiden för TH-Cre-mössen i den optiskt konditionerade kammaren vid posttest jämfört med vistiden för WT-mössen (Fig. S6F).

Vi försökte sedan ange DA-receptorsubtyper som är involverade i detta aversiva beteende genom att specifikt undertrycka var och en av DA-receptorerna i NAc (Fig 4 och Fig. S7). Vi konstruerade och validerade lentivirala vektorer innehållande kort hårnål RNA (shRNA) specifikt för varje DA-receptor med konstitutivt uttryck av mCherry. Tre veckor efter injicering av lentivirus i NAc var det robusta uttrycket av mCherry lokaliserat i NAc (Fig 4B). Den effektiva knockdownen av mRNA-expression av varje receptor bekräftades genom kvantitativ realtids PCR-analys (Fig. S7A). Mätning av proteinnivåer genom Western blotting visade också att injektion av var och en av lentivirerna selektivt reducerade sin målproteinprodukt utan att påverka uttrycket av den andra subtypen av DA-receptor (Fig 4C och Fig. S7 B-G). ShD1R- och shD2R-uttryckande lentivirus minskade deras målproteinivå till 46.2 ± 1.1% respektive 38.4 ± 4.9% jämfört med nivån för kontrollviruset (Fig 4C). Dessa resultat verifierade att de lentivirala vektorerna som uttryckte shRNA specifika för D1R och D2R selektivt och tillräckligt undertryckte sina mål-RNA och nedreglerade mängden av respektive proteinprodukter. Vi bekräftade också att det virusmedierade uttrycket av mCherry inte detekterades i VTA, med undantag för möjligheten att det lentivirus-medierade shRNAet direkt påverkat VTA.

Fig. 4.  

DA-signalering genom D2R är kritisk för optogenetiskt inducerad CPA. (A) En illustration som visar det kirurgiska förfarandet. Det shRNA-kodande lentiviruset för D1R eller D2R injicerades bilateralt i NAc. AAV-DIO-Arch injicerades ensidigt i .

Genom att använda dessa lentivirus som innehåller shRNA testade vi vilken typ av DA-receptor som var ansvarig för det aversiva beteendet inducerat genom optogenetisk inaktivering av DA neuroner. Vi injicerade shRNA-innehållande lentivirus eller kontroll lentivirus i den bilaterala NAc tillsammans med AAV-DIO-Arch i vänster VTA av TH-Cre-mössen. Den optiska fibern infördes också ovanför VTA (Fig 4A). När tre-kammarens CPA-test genomfördes vid tre veckor efter operationen visade TH-Cre-mössen injicerade med lenti: shD1R-mCherry fortfarande explicit CPA mot den optiska stimuleringsparade kammaren jämförbar med den hos TH-Cre-mössen injicerade med kontroll lentivirus (lenti: mCherry). I motsats härtill misslyckades TH-Cre-mössen injicerade med lenti: shD2R-mCherry att uppvisa uppenbar CPA under konditionering (Fig 4D). Det exklusiva inlärningsunderskottet hos TH-Cre-mössen injicerade med lenti: shD2R-mCherry blev ytterligare underbyggt genom analys av aversivt lärande vid posttestet (Fig 4E). Dessa resultat visar att det aversiva beteendet till den plats som konditioneras av DA-neuroninaktiveringen uttryckligen framkallades genom D2R, och inte genom D1R, i NAc.

Diskussion

I striatumet har studier visat att aktiveringen av Gs-kopplad D1R underlättar dess avfyring, medan aktivering av Gi-kopplad D2R resulterar i undertryckt avfyrningseffektivitet (25). AcEnligt specifikiteten hos DA-receptoruttryck aktiverar fasavbrott av DA-neuroner huvudsakligen den direkta vägen genom D1R, medan en övergående minskning av DA-neuronavfyringar främst främjar den indirekta vägenkompetensen genom D2R (3, 26). Baserat på denna regleringsmekanism har det föreslagits att tystnad av DA neuroner som svar på aversiva stimuli behandlas huvudsakligen genom den indirekta vägen och resulterar i aversamt beteende (3). Nya studier har visat att blockad av den synaptiska överföringen av den indirekta vägen försvårar förvärvet av aversivt beteende som orsakas av en elektrisk chock (15) och att denna nedsättning orsakas av inhiberingen av D2R-medierad signalöverföring (16). jagn tillägg, den optogenetiska uppreglering av D2R-uttryckande MSN i den indirekta vägen framkallar beteendeundvikande (27). Men eftersom DA neuroner uppvisar både förbättrade och undertryckta avfyringar som svar på aversiva stimuli och eftersom annan chockrelaterad sensorisk information behandlas samtidigt i hjärnan, är det fortfarande att klargöras huruvida silencing av DA neuroner direkt kan utlösa aversiv reaktion och inlärning, och om denna reaktion regleras genom D2R-uttryckande MSN i den indirekta vägen.

I den här studien använde vi optogenetisk kontroll av DA neuron firningar i de två beteendestest: det föredragna mörkrummet och tre-kammarens CPA-test. Vår optogenetiska manipulation visade effektiv undertryckning av DA neuron firningar i VTA och nedreglering av DA nivåer i NAc. Vår exakta optogenetiska inaktivering av DA neuron firningar endast under den period som djuren stannade i konditionerade kammaren uttryckte uttryckligen en aversiv reaktion och inlärning, vilket visade att övergående DA-tystning direkt orsakade passivt undvikande beteende. Vidare har denna undersökning belysat att D2R-medierad signalbehandling är en nyckelbestämmande faktor för induktionen av denna aversiva reaktion och inlärning.

Även om våra data visade att D1R inte hade någon effekt i beteendexperimenten för att framkalla CPA, har flera studier dokumenterat att fasavbrott av DA neuroner krävs för rädslesvar och aversivt lärande (28, 29). Denna skillnad beror på experimentell inställning; dvs vårt optogena tillvägagångssätt utesluter möjligheten att signaleringen via aktiverade DA-neuroner uppkallar aversiv beteende, vilket indikerar att inaktiverande DA-neuroner var tillräckliga för att inducera aversivt beteende och lärande. Funktionen och signalbehandlingen av den aktiverade DA-avfyrningen som framkallas av aversiva stimuli skulle ha olika bidrag till aversiva beteenden från de som studeras här och behöver förtydligas i framtiden.

DA neuroner projicerar också till olika andra regioner, inklusive mPFC, amygdala och hippocampus. En ny studie visade att optogenetisk aktivering av laterala habenula neuroner som projicerar till DA-neuroner i VTA är kapabla att framkalla aversivt beteende, och dessa DA-neuroner är huvudsakligen och specifikt riktade mot mPFC (30), även om deras optogenetiska konditionering var annorlunda än i vår nuvarande studie, eftersom deras optogenetiska stimulering förlängdes för en hel konditioneringsperiod. Eftersom den dopaminerga ingången till mPFC har rapporterats aktiveras inte bara av avrivande stimuli utan också av kronisk stress (31, 32), är det möjligt att deras kontinuerliga aktivering av mPFC-projicerande DA neuroner skulle uppfattas som signaler från en mycket stressande miljö; och, som ett resultat av ackumulering av stressande konditionering, skulle djuren visa aversivt beteende i den konditionerade kammaren. Däremot inhiberade vi avfyrning av DA neuroner endast medan djuren stannade i konditionerade kammaren. Resultaten av våra beteendexperiment med hjälp av timing-matchad konditionering visade att en plötslig undertryckning av DA-signalen skulle uppfattas som en plötslig aversiv inmatning, vilket resulterade i deras snabba aversiva respons.

DA-neuroner kommer också fram till amygdala, regionen som i stor utsträckning bidrar till rädslan. Faktum är att DA som signalerar amygdala har blivit involverad i rädslesvaret och förvärvet av rädsla minne (33, 34). I vår studie identifierade DA neuroner i VTA en uppsättning DA neuroner som projicerade till BLA, men omfattningen av dessa prognoser var mycket lägre än den som projicerade till NAc. Även om vi inte kunde utesluta en subtil effekt av amygdala-projicerad DA-signalering på vårt observerade aversiva beteende, skulle huvudverkan av vår optogenetiska inaktivering av DA-neuroner vara på NAc, eftersom våra experiment med specifik nedbrytning av D2R i NAc dramatiskt minskat det aversiva beteendet. Framtida undersökningar som adresserar målspecifik DA-signalering krävs för att belysa effekterna av kretsövergripande modifiering av DA-neuroner på aversiva stimuli och rädslaskonditionering.

Material och metoder

Ämnen.

Tyrosinhydroxylas :: IRES-Cre (TH-Cre) knock-in-möss (EM: 00254) (18) erhölls från European Mouse Mutant Archive. Alla försöksdjur hade återkorsats till C57BL / 6J-stammen för mer än 10-generationer. Mössen parades med C57BL / 6J WT-mössen och inrymdes med en standard 12-h ljus / 12-h mörkcykel och gav ad libitum mat och vatten. Cre+ och Cre- möss från samma kullar (3-6 mo i ålder) användes för experimenten. Alla djurförsök godkändes av djurkommittén för Osaka Bioscience Institute enligt riktlinjerna för djurförsök.

Beteendeprov.

Under alla beteendeförsök kopplades möss med en optisk fiber och fick flytta runt hela apparaten. Musens rörelse övervakades så att de kunde röra sig utan några hinder även när de var anslutna till en optisk fiber på huvudet. Musens position detekterades av en videokamera som var suspenderad över beteendeapparaten och analyserades av ett skräddarsytt program med hjälp av Labview-mjukvaran.

Mörkrums preferensprov.

Den skräddarsydda beteendeapparaten som användes i testet bestod av ett mörkt rum (15 × 9.5 cm) och ett ljust öppet utrymme (15 × 11 cm). Det mörka rummet hade väggar, ett golv och ett tak som var alla färgade i svart och hade en ingång (4.5 cm lång) till det öppna ljusa utrymmet. Det öppna ljusa rummet var format som en ellipsa och hade ett metallgallgolv och tydliga väggar utan tak. Före provet hölls alla möss för 10 min i apparaten. Testet bestod av tre sessioner: på den första halvan av dagen 1 (pretest: 5 min) fick möss utforska hela apparaten. Från slutet av dagen 1 till dag 4 (konditionering: totalt 35 min) fick mus optisk stimulering när de stannade i det mörka rummet. På dag 5 testades mörkrumsinställningen utan optisk stimulering (posttest: 5 min; Fig. S1E).

Kammaren CPA-test.

Den skräddarsydda trekammare-konditionerade platspreferensen / CPA-apparaten som användes i testet var sammansatt av två kamrar (10 × 17 cm) och en anslutande korridor. Testet bestod av tre sessioner. Dag 1 (pretest: 15 min): Möss fick lov att fritt utforska hela apparaten. Möss som stannade 1.5 gånger längre i en kammare än i den andra var uteslutna från testet. Dagar 2 och 3 (konditionering: 15 min vardera): Möss fick optisk stimulering när de stannade i den ljusparna kammaren. Valet av den ljusparade kammaren var motvikt. Dag 4 (efterprövning: 15 min): Testet genomfördes under samma betingelser som i pretestet (Fig. S6A).

I konditioneringsperioden stoppades den optiska stimuleringen för 30 s när mössen ständigt stannade över 30 s i det mörka rummet eller den ljusparna kammaren för att undvika överhettning. Laserkraften kontrollerades vara ungefär 5 mW vid spetsen av den optiska fibern i alla beteendestest.

In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry.

FSCV-experiment utfördes med användning av metoden beskriven i tidigare studier (35-37). Mössen bedövades med en ketamin / xylazinblandning såsom beskrivs i SI-material och metoder och placerad i en stereotaxisk ram. En optisk fiber som användes för att stimulera Arch-uttryckande DA-neuroner var belägen nära den stimulerande elektroden. Den stimulerande optroden placerades sedan i VTA (från bregma: anterior-posterior, -3.2 mm, lateral, 0.5 mm och dorsal-ventral, 3.5 mm) och sänktes med 0.25-mm-intervall. En kolfibermikroelektrod (300 μm i längd) för voltammetrisk inspelning sänktes i NAc (från bregma: anterior-posterior, 1.0 mm, lateral, 1.0 mm och dorsal-ventral, 3.5 mm). Voltammetriska mätningar gjordes varje 100 ms genom att applicera en triangulvågform (-0.4 V till + 1.3 V till -0.4 V mot Ag / AgCl, vid 400 V / s) till kolfiber-mikroelektroden. En skräddarsydd potentiostat användes för isolering av vågform och strömförstärkning. DA-frisättning framkallades genom elektrisk stimulering av DA-neuroner genom användning av 24-pulsstimulering (100 μA, 5 ms-varaktighet, 30 Hz). En optisk stimulering av DA-neuroner (532 nm, ~5 mW-effekt vid fiberspetsen) applicerades för 10 s som startade 5 s före starten av en elektrisk stimulering. Kolfibre-mikroelektroder kalibrerades i en lösning med kända koncentrationer av DA (0.2 ^ M, 0.5 ^ M och 1.0 ^ M). Alla voltammetrydata analyserades av skräddarsydda program med hjälp av Labview och Matlab-mjukvaran. Reduktion av DA-nivåer genom optisk stimulering löstes med huvudkomponentanalys, med användning av mall DA-vågformer erhållna från elektriska VTA-stimuleringar för att separera dopamin-signaler (35, 36).

Statistisk analys.

Statistisk analys genomfördes med hjälp av GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software). Data analyserades genom upprepade åtgärder ANOVA (Fig. 1B, , 4D,4Doch Fig. S6 D och E) eller envägs ANOVA (Fig. 1C, , 3D,3D, 4 C och Eoch Fig. S4 K-M, S6Foch S7A) och posthoc-analyser gjordes med hjälp av Bonferroni-testet. Alla märken / kolumner och staplar representerade genomsnittet respektive ± SEM.

Andra experimentella förfaranden inklusive viruspreparation och injektion, elektrofysiologisk inspelning och immunhistokemisk och mRNA-analys beskrivs i detalj i SI-material och metoder.

Extramaterial

Stödjande information:  

Erkännanden

Vi tackar E. Boyden för Arch-konstruktionen, R. Matsui för teknisk rådgivning i lentivirusproduktion och -rening, och Y. Hayashi för teknisk rådgivning vid programmering av dataanalys. Detta arbete stöddes av forskningsbidrag i hjälp 22220005 (till SN), 23120011 (till SY och SN), 24700339 (till TD) och 25871080 (till SY) från ministeriet för utbildning, kultur, idrott, vetenskap och Japans teknik och ett bidrag från Takeda Science Foundation (till SN).

fotnoter

 

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Den här artikeln innehåller stödinformation online på www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.

referenser

1. Wise RA. Dopamin, lärande och motivation. Nat Rev Neurosci. 2004; 5 (6): 483-494. [PubMed]
2. Schultz W. Multipla dopaminfunktioner vid olika tidskurser. Annu Rev Neurosci. 2007; 30: 259-288. [PubMed]
3. Bromberg-Martin ES, Matsumoto M, Hikosaka O. Dopamin i motiverande kontroll: Belöning, aversiv och varning. Nervcell. 2010; 68 (5): 815-834. [PMC gratis artikel] [PubMed]
4. Schultz W, Dayan P, Montague PR. Ett neuralt substrat av förutsägelse och belöning. Vetenskap. 1997; 275 (5306): 1593-1599. [PubMed]
5. Schultz W, Romo R. Svar från nigrostriatal dopaminneuroner till högintensiv somatosensorisk stimulering i den bedövade apen. J Neurophysiol. 1987; 57 (1): 201-217. [PubMed]
6. Unglös MA, Magill PJ, Bolam JP. Uniform inhibering av dopaminneuroner i det ventrala tegmentala området med aversiva stimuli. Vetenskap. 2004; 303 (5666): 2040-2042. [PubMed]
7. Brischoux F, Chakraborty S, Brierley DI, Ungless MA. Fasisk excitation av dopaminneuroner i ventral VTA genom skadliga stimuli. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106 (12): 4894-4899. [PMC gratis artikel] [PubMed]
8. Matsumoto M, Hikosaka O. Två typer av dopaminneuron överför tydligt positiva och negativa motivationssignaler. Natur. 2009; 459 (7248): 837-841. [PMC gratis artikel] [PubMed]
9. Cohen JY, Haesler S, Vong L, Lowell BB, Uchida N. Neuron-typspecifika signaler för belöning och straff i det ventrala tegmentalområdet. Natur. 2012; 482 (7383): 85-88. [PMC gratis artikel] [PubMed]
10. Tan KR, et al. GABA-neuroner i VTA-konditionerade ställnadsavvikelsen. Nervcell. 2012; 73 (6): 1173-1183. [PubMed]
11. van Zessen R, Phillips JL, Budygin EA, Stuber GD. Aktivering av VTA GABA-neuroner stör konsumtionsförbrukningen. Nervcell. 2012; 73 (6): 1184-1194. [PMC gratis artikel] [PubMed]
12. Packard MG, Knowlton BJ. Lärande och minnesfunktionerna hos de basala ganglierna. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 563-593. [PubMed]
13. Surmeier DJ, Song WJ, Yan Z. Koordinerat uttryck av dopaminreceptorer i neostriatalt medium snygga neuroner. J Neurosci. 1996; 16 (20): 6579-6591. [PubMed]
14. Surmeier DJ, Plotkin J, Shen W. Dopamin och synaptisk plasticitet i dorsala striatala kretsar som styr åtgärdsvalet. Curr Opin Neurobiol. 2009; 19 (6): 621-628. [PMC gratis artikel] [PubMed]
15. Hikida T, Kimura K, Wada N, Funabiki K, Nakanishi S. Distinkta roller för synaptisk överföring i direkta och indirekta striatalvägar för att belöna och aversive beteende. Nervcell. 2010; 66 (6): 896-907. [PubMed]
16. Hikida T, et al. Pathway-specifik modulering av kärnan accumbens i belöning och aversive beteende via selektiva sändare receptorer. Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110 (1): 342-347. [PMC gratis artikel] [PubMed]
17. Chow BY, et al. Högpresterande genetiskt målbar optisk neuraltilträngning av ljushyrda protonpumpar. Natur. 2010; 463 (7277): 98-102. [PMC gratis artikel] [PubMed]
18. Lindeberg J et al. Transgena uttryck av Cre rekombinas från tyrosinhydroxylas-locus. Uppkomst. 2004; 40 (2): 67-73. [PubMed]
19. Bourin M, Hascoët M. Muslampan / mörklådan testet. Eur J Pharmacol. 2003; 463 (1-3): 55-65. [PubMed]
20. Roitman MF, Wheeler RA, Wightman RM, Carelli RM. Realtids kemiska svar i kärnan accumbens skiljer givande och aversiva stimuli. Nat Neurosci. 2008; 11 (12): 1376-1377. [PMC gratis artikel] [PubMed]
21. LeDoux JE. Känslor i hjärnan. Annu Rev Neurosci. 2000; 23: 155-184. [PubMed]
22. Maeno H. Dopaminreceptorer i kajnkärnan hos hunden. Mol Cell Biochem. 1982; 43 (2): 65-80. [PubMed]
23. Richfield EK, Penney JB, Young AB. Anatomiska och affinitetsstat jämförelser mellan dopamin D1 och D2 receptorer i råtta centrala nervsystemet. Neuroscience. 1989; 30 (3): 767-777. [PubMed]
24. Hikosaka O. Basal ganglia mekanismer av belöningsorienterad ögonrörelse. Ann NY Acad Sci. 2007; 1104: 229-249. [PubMed]
25. Surmeier DJ, Ding J, Dag M, Wang Z, Shen W. D1 och D2 dopaminreceptormodulation av striatal glutamatergisk signalering i striatala mediumspina neuroner. Trender Neurosci. 2007; 30 (5): 228-235. [PubMed]
26. Frank MJ. Dynamisk dopaminmodulering i basalganglierna: Ett neurokomputativt konto av kognitiva underskott i medicinerad och nonmedicated Parkinsonism. J Cogn Neurosci. 2005; 17 (1): 51-72. [PubMed]
27. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC. Distinkta roller för direkt och indirekt vägarna striatala neuroner i förstärkning. Nat Neurosci. 2012; 15 (6): 816-818. [PMC gratis artikel] [PubMed]
28. Fadok JP, Dickerson TM, Palmiter RD. Dopamin är nödvändigt för cueberoende räddningskonditionering. J Neurosci. 2009; 29 (36): 11089-11097. [PMC gratis artikel] [PubMed]
29. Zweifel LS, et al. Aktivering av dopaminneuroner är kritisk för aversiv konditionering och förebyggande av generaliserad ångest. Nat Neurosci. 2011; 14 (5): 620-626. [PMC gratis artikel] [PubMed]
30. Lammel S et al. Inputspecifik kontroll av belöning och aversion i det ventrala tegmentalområdet. Natur. 2012; 491 (7423): 212-217. [PMC gratis artikel] [PubMed]
31. Mantz J, Thierry AM, Glowinski J. Effekt av skadlig svansnyp på utsläppshastigheten för mesokortiska och mesolimbiska dopaminneuroner: Selektiv aktivering av det mesokortiska systemet. Brain Res. 1989; 476 (2): 377-381. [PubMed]
32. Tidey JW, Miczek KA. Socialt besvärsspänning selektivt förändrar mesokortikolimbisk dopaminfrisättning: En in vivo mikrodialysstudie. Brain Res. 1996; 721 (1-2): 140-149. [PubMed]
33. Pezze MA, Feldon J. Mesolimbic dopaminerga vägar i rädsla kondition. Prog Neurobiol. 2004; 74 (5): 301-320. [PubMed]
34. de la Mora MP, Gallegos-Cari A, Arizmendi-García Y, Marcellino D, Fuxe K. Rollen av dopaminreceptormekanismer vid amygdaloidmodulering av rädsla och ångest: Strukturell och funktionell analys. Prog Neurobiol. 2010; 90 (2): 198-216. [PubMed]
35. Heien ML, Johnson MA, Wightman RM. Upplösning av neurotransmittorer som detekteras genom snabbskanning av cyklisk voltammetri. Anal Chem. 2004; 76 (19): 5697-5704. [PubMed]
36. Heien ML, et al. Realtidsmätning av dopaminfluktuationer efter kokain i hjärnan hos beteende råttor. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102 (29): 10023-10028. [PMC gratis artikel] [PubMed]
37. Natori S, et al. Subsecond belöningsrelaterad dopaminfrisättning i musens dorsala striatum. Neurosci Res. 2009; 63 (4): 267-272. [PubMed]