Transient neuronal hämning avslöjar motsatta roller av indirekta och direkta vägar vid sensibilisering (2011)

Abstrakt

Trots de överväldigande negativa konsekvenserna av narkotikamissbruk är psykostimulant användning och missbruk fortfarande utbredd. Progressionen från inledande läkemedelsexponering för regelbunden användning och i slutändan till kompulsiv, vanligt beteende och förlust av inhiberande kontroll innefattar en serie molekylära anpassningar i diskreta neurokretsar^1,2,3. Den striatum har identifierats som en nyckelplats för många av de beteendemässiga och neurobiologiska anpassningarna som anses vara kärnprocesser som medger beroende^1,2,3. Majoriteten av neuroner inom striatumet (~ 95%) är GABAergic medium spiny projection neurons (MSNs) thatt skiljer sig åt i deras neuropeptiduttryck och bildar två större efferenta vägar⁴.

• Striatopallidala MSN innehåller enkefalin (ENK) och bildar den indirekta vägen
• medan striatonigral MSN innehåller dynorfin (DYN) och substans P och bildar den direkta vägen.

Många konceptuella modeller antydar att dessa populationer av MSNs motsätter varandra varandra mekaniskt och funktionellt^5,6. Emellertid finns det lite empiriskt bevis för att stödja deras differentiella roll i kontrollen av beteende eftersom dessa cellpopulationer är fysiskt sammanflätade och morfologiskt oskiljbara, vilket gör selektiv manipulation tekniskt elusiv.

För att undersöka rollen för dessa striatala cellpopulationer i utvecklingen av beteenden som uppstår efter upprepad exponering för missbruksmissbruk kombinerade vi två nya strategier: virala vektorer som använder antingen ENK- eller DYN-genpromotorerna för att rikta transgenuttryck mot striatopallidala eller striatonigrale neuroner , respektive en konstruerad GPCR (G_{i / o}kopplad human muskarin M₄ DREADD; Designer Receptor exklusivt aktiverad av en Designer Drug; hM₄D)⁷ som aktiveras av en annars farmakologiskt inert ligand, clozapin-N-oxid^8,9 (CNO; Fig. 1a, h). Efter expression i odlade neuroner stimulerar administrering av CNO G_{i / o}-kopplad hM₄D-receptorer som sålunda aktiverar inåtriktade kalium 3-kanaler (Kir3), vilket resulterar i membranhyperpolarisering och transient neuronal ljuddämpning⁹.

  

Figur 1

Övergående och målinriktad dämpning av striatalcellsignalering. (a, h) Amplicon-kartor på sENK-hm₄D/pENK-GFP (a) och sDYN-hm₄D/pDYN-GFP (h) riktade vektorer. (b, jag) Konfokal mikroskopi visade att pENK-hm₄D receptorer uttrycktes selektivt i striatopallidala .

För att testa för cellfenotypspecificitet hos virusvektorerna använde vi immunfluorescensmikroskopi med dubbelmärkning efter dorsalstriatuminfusion av virus (Kompletterande Fig. 1) som uttrycker hemagglutinin-märkt hM₄D-receptorer under kontroll av antingen ENK-promotorn (sENK-hm₄D) eller DYN-promotorn (sidDYN-hm₄D). Vi fann att pENK-hm₄D uttryck var främst i ENK-innehållande MSN (90% av hemagglutininceller var ENK +, 85 ur 94; 6% av hemagglutininceller var substans P +, 4 ur 70-celler; Fig. 1b) medan pDYN-hm₄D uttryck var huvudsakligen i substans P-innehållande MSN (95% av hemagglutininceller var substans P +, 109 ur 115-celler; 5% av hemagglutininceller var ENK +, 5 ur 97-celler; Fig. 1i). Liknande resultat erhölls efter infusion av promotorspecifika virus som uttrycker grönt fluorescerande protein (sENK-GFP och pDYN-GFP; SupplementaryFigs. 2a och 3a).

Med tanke på att striatopallidala MSN-projekt främst avser de globala pallidus-externa (GPe) och striatonigral-MSN: erna, främst projekt till substantia nigra pars reticulata (SNpr), använde vi injektioner av retrogradspåraren Fluoro-Gold i dessa hjärnregioner följt av dubbelmärkning fluorescerande immunhistokemi för att bekräfta att sENK och pDYN virus gav vägspecifik infektion. Vi observerade att pENK-GFP celler samlokaliseras med striatal fluor-Guld-uttryck efter infusioner i GPe men inte SNpr (Kompletterande Fig. 2b) medan pDYN-GFP celler samlokaliseras med striatal fluor-guld uttryck efter infusioner i SNpr men inte GPe (Kompletterande Fig. 3b). Uttryck av de virala vektorerna förändrade inte antalet ENK + eller substans P + neuroner i området för virusinfektion, vilket antyder att användning av dessa promotorer för virusmedierad genöverföring inte störde endogena neuropeptidnivåer. Alla dessa resultat visar att pENK och pDYN virala vektorer uttrycker gener i deras lämpligt segregerade striatalcellpopulationer.

Även om hM₄D-receptorbaserade tekniker har visat sig modulera aktivitet hos andra neuronala typer⁹, deras förmåga att påverka striatal neuroner har inte undersökts. Därför infekterade vi striatalmediet snygga neuroner med hM₄D-receptorer som kontrolleras av en herpes simplexvirus (HSV) -promotor, framställde koronalskivor av dorsalstriatum två dagar senare och undersökt hur hM₄D-uttryckande medium spiny striatal neurons svarar på CNO. Vi observerade att lokal tillämpning av CNO (10 ^ M) inducerade en hyperpolarisering av membranpotentialen (~ 7 mV, baslinjemembranpotentialen justerades till -80 mV; Fig. 1c) och reducerade neuronernas ingående motstånd efter CNO-applikation (Fig. 1d, e), vilket tyder på att kaliumkonduktans (dvs Kir3-medierad ström) aktiveras av CNO i hM₄D-receptoruttryckande neuroner. Vidare minskade perfusion av CNO väsentligt antalet framkallade aktionspotentialer i hM₄D-uttryckande neuroner, men inte i kontrollceller, vilket därigenom effektivt hämmar den funktionella utgången hos de virusinfekterade neuronerna. Uttryck av hM₄D-receptorerna förändrade inte ingångsresistensen (P = 0.84) eller actionspänning (P = 0.64). (Fig. 1f, g). Tillsammans föreslår dessa data att det liknar hippocampala neuroner⁹, hM₄D / CNO-baserad metod kan effektivt minska excitabiliteten hos råttstriatala neuroner.

Som ytterligare bevis på konceptet testade vi om hM₄D-receptorer skulle blockera neurotransmission i en väletablerad krets, där neural aktivitet framkallas förutsägbart av beteendemässigt relevanta stimuli. Följaktligen infekterade vi ventral tegmental-området (VTA) neuroner med hM₄D-receptorer under kontroll av en HSV-promotor, vilken uttrycker starkt i dopaminneuroner¹⁰, och använde snabbskanning cyklisk voltammetri för att mäta förändringar i dopaminfrisättning i kärnan accumbens efter oväntad leverans av en matbelöning¹¹. Administrering av CNO avsevärt försvagad matpellets-framkallad dopaminfrisättning i kärnan accumbens jämfört med vehikel (Kompletterande Fig. 4). Slutligen testade vi om minskande aktivitet av specifika neuronala celltyper i striatumet in vivo- kan förändra förmågan hos amfetamin att stimulera Fos uttryck. Psykostimulanter, såsom amfetamin, är robusta aktivatorer av c-fos i striatumet¹² och kommer att öka c-fos i både striatonigral och striatopallidala neuroner under våra experimentella förhållanden¹³. Förutom dess användning som en markör för neuronaktivitet, inducerar psykostimulerande induktion av c-fos antas spela en viktig roll vid initiering och underhåll av neurala anpassningar som hör samman med psykomotorisk sensibilisering^1,14. Vi fann att CNO-medierad aktivering av pENK-hm₄D receptorer reducerade signifikant det totala antalet amfetamininducerade c-Fos-celler i striatumet (Fig. 1k och Kompletterande Fig. 5a). Denna reduktion uppstod i både hemagglutinin-positiva neuroner (dvs. de som uttrycker hM₄D-receptorer) och hemagglutinin-negativa neuroner (dvs. de som inte uttrycker hM₄D-receptorer; Fig. 1l), vilket föreslår en neuronal cross-talk effekt mellan hM₄D-uttryckande neuroner och oinfekterade neuroner. Signifikanta minskningar av det totala antalet amfetaminframkallade c-Fos-celler och antalet hemagglutinin-positiva c-Fos-celler sågs också när hM₄D-receptorer aktiverades i direktvägsneuroner (Fig. 1n, o och Kompletterande Fig. 5b). Viktigt är att dessa effekter inte bara orsakas av virusuttryck av en ny receptor eftersom uttryck av antingen pENK-hm₄D eller sDYN-hm₄D receptorer i frånvaro av CNO-behandling hade ingen effekt på antalet amfetamin-framkallade Fos-celler (Kompletterande figurer 6 och 7). Således visar dessa fynd att den CNO-medierade aktiveringen av hM₄D-receptorer kan också leda till minskningar i neuronaktiviteten genom att reducera neurotransmitterfrisättning och dämpande intracellulär signalering.

Upprepad exponering för beroendeframkallande läkemedel kan leda till en progressiv och bestående ökning av beteendehänsyn, som ofta kallas beteendessensibilisering. Viktigt är att sensibilisering innebär några av samma neurala kretsar som är inblandade i utvecklingen av mänsklig narkotikamissbruk³. Här använder vi våra nya verktyg för att undersöka effekten av kretsspecifik dämpning av striatal neuronaktivitet vid utvecklingen av amfetamin sensibilisering. Vi förutspådde att direkta och indirekta vägarneuroner har motsatta roller där striatonigrale neuroner främjar sensibilisering och striatopallidala neuroner undertrycker sensibilisering, i överensstämmelse med deras konceptuellt föreslagna roller vid beteendeaktivering och inhibition^5,6. Följaktligen testade vi huruvida biokemiskt minskande neuronal excitabilitet hos striatopallidala neuroner skulle inducera sensibilisering till en amfetamindoseringsregimen som framkallar en tröskelnivån av sensibilisering och huruvida minskning av neuronal excitabilitet hos striatonigrale neuroner skulle förhindra sensibilisering i ett protokoll som normalt ger robust sensibilisering.

För den första studien använde vi en behandlingsregim som inducerar en tröskelnivå för lokomotorisk sensibilisering i GFP-kontroller (fyra läkemedelsexponeringar). Efter en tillbakadragningsperiod administrerades en amfetamindos med måttlig utmaning (2 mg / kg) i frånvaro av CNO-inducerad dämpning av neuronaktivitet för att bestämma om sensibilisering var beständig. CNO-medierad aktivering av pENK-hm₄D receptorer under amfetaminbehandling förändrade inte det akuta lokomotoriska svaret mot amfetamin (Fig. 2a). Men CNO-medierad störning av neuronaktivitet i indirekta vägarna underlättade utvecklingen av en signifikant mer robust sensibilisering jämfört med GFP-kontroller (Fig. 2b). Denna förstärkning av sensibilisering upprätthölls på amfetaminutmaningen, vilken genomfördes en vecka senare i frånvaro av CNO-behandling (Fig. 2c, d). Dessa effekter kan hänföras till en CNO-beroende reduktion av aktivitet av striatopallidala neuroner av hM₄D-receptorer eftersom hM₄D-receptoruttryck utan CNO-behandling producerar inte lokomotorisk sensibilisering till denna milda doseringsregimen av amfetamin (Kompletterande Fig. 6).

  

Figur 2

Övergående minskning av excitabiliteten hos striatopallidala eller striatonigrale neuroner hade motsatta effekter på amfetamin sensibilisering. (a, e) Akuta lokomotoriska reaktioner på amfetamin efter CNO-inducerad aktivering av pENK-hm₄D (a) och sDYN-hm₄D (e) receptorer. .

För att bestämma huruvida striatonigrala neuroner kan reglera läkemedelsresponsen på ett motsatta sätt testade vi därefter effekten av biokemiskt minskande excitabilitet hos striatonigrale neuroner i dorsomedialstriatum under en läkemedelsbehandling av amfetamin som ger robust sensibilisering i GFP-kontroller (sex läkemedelsexponeringar ) såväl som under en låg utmaningsdos av amfetamin (0.5 mg / kg) i frånvaro av receptormedierad störning av neuronaktivitet. Precis som vid indirekt vägdämpning förändrade CNO-medierade minskningar av excitabilitet hos direktvägsneuroner under amfetaminbehandling inte det akuta lokomotoriska svaret mot amfetamin (Fig. 2e). Fastän utvecklingen av sensibilisering uppträdde liknar GFP-kontrollerna efter CNO-inducerad aktivering av pDYN-hm₄D receptorer under behandlingsfasen (Fig. 2f), fortsatte sensibilisering inte i pDYN-hm₄D gruppen men var fortfarande starkt underhållen i GFP-kontrollerna (Fig. 2g, h). Dessa effekter kan också hänföras till en CNO-beroende minskning av aktivitet av striatonigrale neuroner av hM₄D-receptorer eftersom hM₄D-receptoruttryck i frånvaro av CNO-behandling blockerade inte utvecklingen av lokomotorisk sensibilisering eftersom sensibilisering observerades under behandlingsfasen och på läkemedelsutmaningen (Kompletterande Fig. 7). Dessa data tyder på att striatonigrale neuroner kan vara särskilt viktiga för att reglera de långsiktiga beteendemässiga anpassningarna som är en följd av upprepad drogbruk.

Sammanfattningsvis ger dessa data de första bevisen för de kritiska och motsatta rollerna av striatopallidala och striatonigrale neuroner vid reglering av läkemedelsupplevelse-beroende beteende plasticitet. Dessutom ger bristen på effekt av neuronhämning på det akuta lokomotoriska svaret till amfetamin ytterligare bevis för att de mekanismer som reglerar akuta läkemedelsresponser skiljer sig från de som modulerar de vidhängande anpassningar som uppstår vid upprepad läkemedelsexponering. Slutligen ger parning av fenotypiska specifika virusvektorer med designerreceptorer som kan förändra neuronaktivitet utan permanent störande cellfunktion en ny och kraftfull metod för att dekonstruera den molekylära grunden för beroende.

Extramaterial

Erkännanden

fotnoter

Referensprojekt