hypocretin和LC-NE神经元的功能性接线：对唤醒的影响（2013）

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卡特我1, 德莱恰湖, Adamantidis A..

抽象

为了在快速变化的环境中生存，动物必须感知其外部世界和内部生理状态，并适当调节唤醒水平。 异常高的觉醒水平可能导致内部能量储存的低效使用以及对显着的环境刺激的不专注的关注。 或者，异常低的觉醒水平可能导致无法正确寻找食物，水，性伴侣以及生命所需的其他因素。 在大脑中，表达hypocretin神经肽的神经元可以独特地构成感知动物的外部和内部状态并根据行为需要调节觉醒状态。 近年来，我们应用时间上精确的光遗传学技术来研究这些神经元及其下游连接在调节唤醒中的作用。 特别地，我们发现脑干蓝斑（LC）中的去甲肾上腺素能神经元对于介导hypocretin神经元对唤醒的影响特别重要。 在这里，我们讨论我们最近的结果，并考虑这些神经元的解剖连接在调节生物体的唤醒状态跨越各种睡眠和觉醒状态的意义。

关键词： hypocretin，orexin，hypothalamus，神经回路，光遗传学，唤醒系统，睡眠，去甲肾上腺素

睡眠和觉醒是两个相互排斥的状态，在整个动物王国中都与超时和昼夜周期一起循环。 唤醒是一种有意识的状态，动物可以在其中感知并与环境相互作用。 在长时间的清醒之后，睡眠压力增加并导致睡眠的发作，其特征在于与定型姿势和较高感觉阈值相对不活动的时期。

在哺乳动物中，睡眠通常分为慢波睡眠（SWS，或人类的NREM睡眠）和快速眼动（REM）睡眠（也称为“反常睡眠”）。 唤醒，SWS和REM睡眠是不同的行为状态，可以通过精确的脑电图（EEG）和肌电图（EMG）特征来定义。 在唤醒期间，低幅度，混频振荡占主导地位。 SWS的特征在于高振幅慢振荡（0.5-4 Hz），其优势（通过EEG功率密度测量）反映睡眠深度。 REM睡眠是一种单一的行为状态，其特征是更快的混合频率振荡，其中θ（5-10 Hz）振荡在啮齿动物中占主导地位，伴随肌肉萎缩，以及心脏和呼吸速率的波动。

虽然睡眠和觉醒的状态在质量和数量上都很容易表征，但很难界定“觉醒”的意思。唤醒一词通常指的是觉醒时的警惕性和警觉性，表现为运动激活，反应性增强感官输入，情绪反应和增强的认知处理。

睡眠 - 觉醒周期组织和一般觉醒水平的大脑机制仍不清楚，许多经典研究已经确定了几个神经元群，其活动与不同的行为状态相关。 最初假设在行为转换之前有活跃的神经元（即，在睡眠到唤醒转换之前活跃的神经元） 促进 即将到来的状态，而在特定状态（觉醒或睡眠）期间活跃的神经元非常重要 保持 它。 由于理解网络中的神经元可能显示与状态边界相关的活动，因为与其他更多因果神经元的连接而不直接对状态转换负责，因此这种观点变得更加复杂。 然而，通常推断存在神经群体在睡眠和/或唤醒状态中起到因果作用。 被认为促进唤醒的人群包括：hypocretin（hcrt-也称为“orexins”） - 表达神经元在下丘脑外侧，noradrenergic locus cousuleus（LC）表达脑干神经元，5-羟色胺能中缝背核（DRN）在脑干中，下丘脑后部的组胺能结核瘤（TMN），中脑的胆碱能性脑桥（PPT）和后背背侧（LDT）核，以及基底前脑中的胆碱能神经元（琼斯， 2003）。 相反，来自下丘脑前部结构的抑制性神经元在SWS期间是活跃的，而来自下丘脑外侧的黑色素浓缩激素（MCH）神经元以及来自脑干的谷氨酸能和GABA能神经元在REM睡眠期间是活跃的（Fort等， 2009).

近年来，我们和其他人已经开始使用各种小鼠模型的光遗传学技术来解决诸如此类的问题 唤醒系统如何调节觉醒和觉醒? 它们如何通过功能相互作用来促进，维持或扩大特定环境中的唤醒？ 在我们最近的研究中，我们对表达hcrt的神经元特别感兴趣（de Lecea等， 1998; Sakurai等人， 1998）。 hcrt是两种神经兴奋肽（de Lecea等， 1998; Sakurai等人， 1998）在小鼠外侧下丘脑的~3200神经元中产生（分别在大鼠和人脑中的~6700和50,000-80,000）（de Lecea和Sutcliffe， 2005; Modirrousta等人， 2005）。 这些神经元接收来自分布在皮质，边缘系统，皮质下区域的多个系统的功能性输入，包括下丘脑本身，丘脑和来自脑干胆碱能核，网状结构，中脑中缝核和导水管周围灰质的上升投射。 反过来，这些神经元通过中枢神经系统，包括大脑的唤醒和奖励中心，向表达hcrt受体的神经元（OX1R和OX2R）投射。 hcrt神经元的传入和传出预测表明它们在多种下丘脑功能中起作用，包括调节睡眠/觉醒周期和目标导向行为。 有趣的是，我们发现从hcrt神经元到去甲肾上腺素能LC神经元的特定传出投射介导了睡眠 - 觉醒过渡以及可能更为一般的觉醒方面。

在这里，我们总结了最近的光遗传学实验，这些实验测试了hcrt和LC神经元引起唤醒状态转变和维持的假设（Adamantidis等， 2007; 卡特等人， 2009, 2010, 2012）。 首先，我们使用传统的遗传和药理学技术简要地突出和总结以前有关这些系统的报告。 接下来，我们使用光遗传学探针整合我们自己的发现，以选择性地刺激或抑制自由移动的小鼠中的这些系统。 最后，我们讨论未解决的问题，并推测唤醒回路的未来解剖和功能解剖。

Hypocretins，清醒和发作性睡病

在安静的清醒，SWS和REM睡眠期间，hcrt神经元通常是静音的，但在主动唤醒和REM睡眠 - 觉醒转换期间显示高放电率（Lee等， 2005; Mileykovskiy等人， 2005; Takahashi等人， 2008; 哈萨尼等人， 2009）。 此外，它们在环境刺激（例如听觉刺激）引起的唤醒过程中表现出高放电率（Takahashi等， 2008）和目标导向的行为（Mileykovskiy等， 2005; Takahashi等人， 2008）。 这些研究表明，hcrt神经元参与睡眠 - 觉醒过渡，以及在各种目标导向行为中观察到的警觉性增强。

阻断或抑制hcrt信号传导表明hcrt对小鼠，大鼠，狗，人类和可能的斑马鱼的行为状态的完整性的必要性（Sakurai， 2007; Yokogawa等人， 2007）。 事实上，最引人注目的功能丧失证据来自于hcrt缺乏与发作性睡病症状之间的联系（Peyron等， 2000; Saper等人， 2010）。 患有猝倒症的嗜睡症患者完全没有癫痫 hcrt 下丘脑中的基因转录物以及脑脊液中未检测到的或几乎不可检测的hcrt水平（Thannickal等， 2000; 樱井， 2007; Yokogawa等人， 2007）。 杜宾犬发作性睡病犬有突变症 OX2R和所有基因工程啮齿动物的删除 hcrt, OX2R，或hcrt细胞呈现类似顽固性嗜睡症的行为逮捕（嗜睡症，琼斯， 2003; 樱井， 2007; Sehgal和Mignot， 2011）。 重要的是，遗传救援 hcrt 基因表达缓解小鼠发作性睡病症状（Liu et al。， 2011; Blanco-Centurion等人， 2013).

侧脑室（icv）输注hcrt肽或hcrt激动剂会导致清醒时间增加，SWS和REM睡眠减少[Sakurai评论]2007）]。 在LC，LDT，基底前脑或外侧下丘脑中立体定向注射肽会增加觉醒和运动活动，这通常与SWS和REM睡眠明显减少有关（Hagan等， 1999）。 最近，仅在hcrt神经元中使用选择性GABA-B受体基因缺失的hcrt神经元的遗传抑制在明暗时期诱导睡眠/觉醒状态的严重破碎，而没有显示总睡眠/觉醒持续时间或迹象的异常。猝倒症（Matsuki等， 2009）。 总的来说，这些数据表明hcrt肽对于定义睡眠和苏醒状态之间的界限很重要，如嗜睡症动物模型中睡眠和苏醒状态的碎片所示。

尽管有大量文献报道hcrt肽的生物学功能对于维持适当的唤醒和睡眠是必不可少的，但尚不清楚两种hcrt受体OX1R或OX2R中的哪一个在生物学上负责hcrt对唤醒的影响以及睡眠稳定性和肌肉音调控制。 OX1R mRNA在许多脑区域中表达，特别是LC，中缝核，LDT OX2R mRNA在大脑皮层，中缝核以及背内侧和后侧（在tuberomammillary nucleus）下丘脑中显示出互补的表达模式（Trivedi等， 1998; 马库斯等人， 2001; Mieda等人， 2011）。 因此，有人提出，对觉醒和NREM睡眠 - 觉醒的控制主要取决于OX2R（Mochizuki等， 2011虽然REM睡眠失调（嗜睡症 - 猝倒症特有）是由OX1R和OX2R信号丢失引起的（Mieda等， 2011）。 然而，它们对发作性睡病的调节，特别是猝倒和睡眠发作的影响仍不清楚。 患有可遗传性发作性睡病的狗在体内具有无效突变 OX2R 基因（Lin et al。， 1999）和相应的鼠标模型， OX2R KO小鼠表现出比狗更不严重的症状（Willie等， 2003）。 虽然OX1R参与了唤醒的调节（Mieda等， 2011），它对发作性睡病症状的贡献还有待进一步表征。

重要的是，其他唤醒系统的活动在猝倒期间会受到强烈干扰。 LC神经元停止放电（Gulyani等， 1999）和5-羟色胺能神经元显着降低其活性（Wu， 2004），而细胞位于杏仁核中（Gulyani等， 2002并且TMN显示出更高的射击水平（约翰等人， 2004）。 该关联表明OX1R（LC，raphe）和OX2R（TMN，raphe）都参与维持适当的肌张力。 最近的研究还强调了改变的胆​​碱能系统在触发发作性睡眠小鼠猝倒症中的作用（Kalogiannis等， 2011, 2010）。 因此，一个重要的，未解决的目标是确定hcrt神经元的功能连接，以及从hcrt终端突触释放的动力学，以精确描绘下游投影（de Lecea等， 2012）控制唤醒，睡眠状态，肌肉张力和目标导向行为。

蓝斑，去甲肾上腺素和唤醒

LC与4相邻th 脑干中的心室，并包含合成单胺去甲肾上腺素（NE）的神经元。 尽管其他四个细胞群也产生NE（A1，A2，A5和A7细胞群），但LC产生了大脑总NE的约50％，并且是皮质的唯一来源。 脑内有许多功能性NE受体，其中α1和β受体通常引起兴奋性突触后电位，而α2受体通常引起抑制性突触后电位。 在LC神经元上密集发现了α2受体（Berridge和Waterhouse， 2003）自身并作为抑制自身受体来抑制内在活动。

清醒表现动物的录音表明，LC神经元在清醒状态下以1-3 Hz频繁点火，在SWS睡眠期间点火，在REM睡眠期间几乎无声（Aston-Jones和Bloom， 1981; 琼斯 2003; Saper等人， 2010）。 在突出刺激的呈现期间，LC还在8-10 Hz的短脉冲中相位地发射，这可能增加唤醒持续时间。 与hcrt神经元一样，放电率的变化先于睡眠 - 觉醒转换的变化（Aston-Jones和Bloom， 1981），表明这些细胞对转变为清醒或注意力很重要。

有趣的是，LC的物理损伤不会引起皮质脑电图或唤醒行为指数的一致变化（Lidbrink， 1974; Blanco-Centurion等人， 2007）。 基因消除多巴胺β-羟化酶（NE合成所需的酶）也不会破坏睡眠 - 觉醒状态（Hunsley等， 2006）。 这表明存在LC结构外部的冗余神经回路，分别支持皮质活动和补偿发育机制。 然而，中枢注射α1和β去甲肾上腺素受体的药理学拮抗剂（Berridge和España， 2000）抑制性α2自身受体的激动剂（De Sarro等， 1987）具有实质的镇静作用。 NE直接中央进入脑室或前脑可促进觉醒（Segal和Mandell， 1970; Flicker和Geyer， 1982）。 使用局部显微注射胆碱能激动剂（氨甲酰甲胆碱）刺激LC中的神经元，在氟烷麻醉的大鼠中产生前脑脑电图的快速激活（Berridge和Foote， 1991）。 最近，与睡眠状态相比，LC-NE系统对于维持清醒时皮层神经元的膜电位增加至关重要（君士坦丁堡和布鲁诺， 2011）。 总之，这些研究表明LC-NE系统使皮质活动失去同步并增加皮质膜电位以增加唤醒。

光遗传学解剖hcrt和LC-NE控制唤醒

hcrt和LC-NE神经元的活性与睡眠 - 觉醒转换相关，然而，难以选择性地刺激或抑制具有与睡眠或觉醒发作相关的时间分辨率的特定hcrt和LC-NE群体，并且实现空间选择性探测这些细胞而不影响周围细胞或传代纤维。 为了更好地理解觉醒神经回路的时间动态，我们最近应用光遗传学可逆地和有选择地操纵自由移动动物中hcrt和LC神经元的活动（Adamantidis等， 2007; 卡特等人， 2009, 2010, 2012）。 光遗传学使用致敏物视蛋白分子（例如，视紫红质素-2（ChR2）或halorhodopsin-NpHR）分别用特定波长的闪光选择性激活或沉默遗传靶向细胞（Boyden等， 2005）。 关于光遗传学技术的更多信息可以在许多其他优秀评论中找到（Zhang et al。， 2006; Miesenbock， 2009; Scanziani和Häusser， 2009; Yizhar等人， 2011; 戴瑟罗特， 2012).

为了将这些执行器传递给hcrt或LC神经元，我们分别在细胞类型特异性启动子的控制下使用慢病毒和cre依赖的腺相关病毒（AAV）基因传递工具（Adamantidis等， 2007）。 为了向hcrt或LC领域提供光，我们设计了光学神经接口，其中光纤长期植入小鼠头骨，如其他地方所述（Adamantidis等， 2005, 2007; Aravanis等人， 2007; 张等人， 2010）。 使用这种策略，我们能够控制hcrt神经活动 细胞/组织 和 体内 具有毫秒精确的光学刺激（Adamantidis等， 2007）。 刺激的高时间和空间精度使我们能够模拟hypocretin神经元放电率的生理范围（1-30 Hz）（Hassani等， 2009）。 实际上，我们使用光脉冲序列进行光遗传学刺激，这些训练基于hcrt神经元的实际频率分析参数 体内 （对于下文描述的LC-NE神经元的光遗传学控制也是如此）。 我们发现直接单侧光学刺激hcrt神经元增加了从SWS或REM睡眠转变为觉醒的可能性（图 （Figure1A）.1A）。 有趣的是，高频光学刺激（5-30 Hz光脉冲序列）减少了觉醒的潜伏期，而1 Hz列车没有，表明神经递质（谷氨酸）和神经调节剂（包括来自终端的hcrt或强啡肽）的频率依赖性突触释放。 我们进一步表明刺激hcrt神经元的作用可以通过注射OX1R拮抗剂或通过hcrt基因的遗传缺失来阻断，表明hcrt肽至少部分地介导光遗传学诱导的睡眠 - 觉醒转变。 这些结果表明，hcrt表达神经元的hcrt释放对于这些神经元的唤醒促进特性是必需的。 重要的是，这些结果证明了hcrt神经元激活和睡眠 - 觉醒转换之间的因果关系，与先前的相关研究一致。 hcrt神经元的光学沉默促进SWS这一事实进一步支持了这一事实（Tsunematsu等， 2011).

图1 

大脑唤醒回路的光遗传学解剖。 （一个） 用ChR2刺激hcrt神经元导致10 Hz但不是1 Hz的睡眠 - 觉醒潜伏期减少（来自Adamantidis等的数据， 2007). （B） 用ChR2刺激LC神经元导致立即 ...

这些结果最近由Sasaki和合作者证实（Sasaki等， 2011），使用名为Designer Receptors的药物遗传学方法，由Designer Drugs独家激活（DREADDs）来激活和抑制hcrt神经活动。 DREADD技术允许双峰调节神经活动，时间分辨率为几小时（Dong et al。， 2010）。 他们发现hcrt神经活动的激活增加了觉醒，而hcrt活动的抑制促进了SWS。

在第二项研究中（Carter等， 2009），我们证明睡眠 - 觉醒转换的hcrt控制是在睡眠稳态过程的依赖下，因为hcrt介导的睡眠 - 觉醒转换被睡眠压力增加（由睡眠剥夺引起）阻断。 然而，hcrt的光遗传学刺激的作用持续存在于组胺脱羧酶敲除小鼠（不能合成组胺的小鼠）中，这表明组胺能系统的另一个目标是hcrt的作用。 最后，我们发现下游唤醒中心如LC神经元均响应hcrt光遗传学刺激而增加其活性（通过c-Fos表达测量）。 因为以前的工作显示hcrt对LC NE神经元的兴奋作用（Bourgin等， 2000），我们调查了hcrt-LC连接并将我们的实验研究集中在去甲肾上腺素能LC作为光遗传学操作的新靶点。

在第三项研究中（Carter等， 2010），我们通过立体定位注射Cre重组酶依赖性腺相关病毒（rAAV）将LC-NE神经元遗传靶向选择性表达酪氨酸羟化酶（TH）神经元中Cre的敲入小鼠（Atasoy等， 2008; Tsai等人， 2009）。 我们发现NpHR和ChR2都是功能性的并且可以分别抑制和激活LC-NE神经元。 细胞/组织 和 体内 （数字 （Figure1B）.1B）。 我们发现LC-NE神经元的光遗传学低频（1-10 Hz）刺激导致SWS和REM睡眠的即时（低于5 s）睡眠 - 觉醒转变。 在清醒期间刺激LC神经元增加了运动活动和清醒所花费的总时间，证实了强烈的唤醒效应。 相反，NpHR介导的LC-NE神经元沉默减少了唤醒发作的持续时间，但是当动物睡着时没有阻止睡眠 - 觉醒转换。 总之，这项研究表明，LC-NE神经元的激活对于维持正常的觉醒持续时间（NpHR实验）是必要的，并且足以诱导立即的睡眠 - 觉醒转变，持续的觉醒和增加的运动唤醒。 因此，我们提出LC-NE神经元充当快速调谐系统，以促进睡眠 - 觉醒转换和一般唤醒。 有趣的是，我们发现LC-NE神经元的持续光学激活会诱发运动停滞（Carter et al。， 2010）。 在动物模型和人类患者中，这种行为逮捕与猝倒，紧张症或行为冻结有共同的症状（Scammell等， 2009）。 可能的机制可能涉及从LC-NE突触末端消除NE或脑干运动核的LC-NE过度兴奋，这将导致麻痹。 需要进一步研究以揭示潜在的机制。

在我们最近的研究中（Carter等， 2012），我们测试了LC活动控制hcrt神经元对睡眠到觉醒过渡的影响的假设。 由于hcrt和LC神经种群位于不同的大脑区域，因此在同一只动物中物理上可能同时访问两个结构。 因此，我们采取了双重光遗传学方法来刺激hcrt神经元，同时在SWS睡眠期间同时抑制或刺激去甲肾上腺素能LC神经元。 我们发现在hcrt刺激过程中沉默LC神经元可以阻断hcrt介导的从睡眠到觉醒的转变（图 （Figure1C）.1C）。 相反，我们发现通过步进功能视蛋白（SFO）激活增加LC神经元的兴奋性 - 这增加了靶细胞（Berndt等， 2009） - 在hcrt刺激期间（使用LC刺激协议本身不会增加睡眠 - 觉醒转换）增强hcrt介导的睡眠 - 觉醒转换（图 （Figure1D）.1D）。 总之，我们的结果表明，LC在非活动期间作为hcrt介导的SWS至苏醒转换的必要且足够的下游效应物。

hcrt和LC-NE系统动力学

在我们的实验研究中，我们观察到hcrt和LC-NE神经元的光遗传学操作影响睡眠 - 觉醒过渡，具有显着不同的时间动态（Adamantidis等， 2007; 卡特等人， 2009, 2010, 2012）。 hcrt神经元的急性光学激活导致10-30 s的一段时间内的睡眠 - 觉醒转变，而LC神经元的刺激导致睡眠 - 觉醒转变小于5 s。 一种解释是hcrt神经元可以在下丘脑相关功能期间充当唤醒的上游积分器，而LC-NE系统充当唤醒，压力和注意力的主要效应器。 然而，神经元效应系统可能是多余的并且由不同的输入组激活。 因此，我们不能排除阻断其他唤醒系统，如中枢组胺能和胆碱能系统，也会严重影响其他实验条件下hcrt诱导的行为状态转变。

除了这些短期效应之外，有趣的是，持续（即半慢性）hcrt神经元的~1-4 h的光刺激实验增加了睡眠 - 觉醒转变而不改变觉醒的总持续时间，而长期LC-NE神经元的光刺激显着增加了清醒持续时间。 这些结果表明hcrt系统可以调节睡眠 - 觉醒边界，而LC-NE神经元可以通过增加皮质膜电位和使皮质脑电图去同步来控制唤醒持续时间。

hcrt神经元的下丘脑定位意味着这些细胞在稳态过程中具有突出的唤醒作用，包括性行为，食物觅食，应激反应和动机。 除了他们对觉醒的控制之外，唤醒系统还参与奖励寻求行为，性活动，飞行或战斗反应等。这种冗余可能在整个进化和多样化的大脑机制中巩固唤醒功能，支持唤醒和唤醒相关的行为。生存。 例如，激活LC-NE系统会增加唤醒并导致焦虑行为（Itoi和Sugimoto， 2010）。 相比之下，神经肽S（NPS）系统，一种由LC的腹侧限制性神经元群体产生的肽，也会增加唤醒，但 减少 焦虑（Pape等， 2010）。 因此，为了支持这种不同的行为功能，唤醒电路必须达到高水平的规范，可能通过其传入和传出连接的选择性区室化，发射器/调制器释放能力和与其他唤醒电路的连贯活动。

展望

在过去的五年中，将光遗传学，基因工程小鼠模型以及对睡眠的EEG / EMG分析相结合，提供了一套独特而强大的工具，可进一步了解hcrt和LC系统对唤醒的贡献，以及其他调节睡眠和清醒程度的神经元。 将光遗传学探针靶向大脑中其他神经元群体将确定它们在睡眠/苏醒边界中的单独作用和联合作用。 此外，这些工具将使我们能够基于解剖学预测，突触神经传递和递质释放动力学来确定唤醒状态背后的大脑机制。 以高时间精度（<1 s）为目标并选择性地操纵这些电路的能力进一步允许研究其在各种行为中的作用，例如食物摄入，成瘾，压力，注意力和性唤起。 最终，这些研究可能会揭示精神疾病的病理生理机制，例如慢性焦虑，成瘾，注意力缺陷和抑郁。

利益冲突声明

作者声明，研究是在没有任何可被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

Matthew E. Carter得到希尔达和普雷斯顿戴维斯基金会的奖学金支持。 Luis de Lecea得到了国防高级研究计划局，全国精神分裂症和抑郁症研究联盟以及克拉曼家庭基金会的资助。 Antoine Adamantidis得到道格拉斯基金会，加拿大健康研究所，加拿大创新基金会，加拿大研究主席和NSERC的支持。

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