酒精的慢性自我给药导致ΔFosB升高:具有不同饮酒模式的杂交小鼠的比较(2012)

BMC Neurosci。 2012 Oct 29;13:130. doi: 10.1186/1471-2202-13-130.
 

来源

瓦格纳酒精中毒与酗酒中心 德克萨斯大学奥斯汀分校神经科学研究所,德克萨斯州奥斯汀,78712,美国。 [电子邮件保护]

抽象

抽象:

背景:

无法减少或调节酒精摄入量是酒精使用障碍的标志性症状。 研究经验引起的饮酒变化的新行为和遗传模型将进一步提高我们对酒精使用障碍的认识。 在比较两种F1小鼠杂交株时,先前观察到不同的酒精自我管理行为:C57BL / 6J x NZB / B1NJ (BXN) 在高浓度酒精和禁欲期后,表现出酒精偏好减少 而C57BL / 6J x FVB / NJ(BxF)显示持续的酒精偏好。 这些表型很有意思,因为这些杂种以经验依赖的方式证明了乙醇摄入中遗传加性(BxN)和超显性(BxF)的发生。

具体而言,BxF表现出持续的酒精偏好,BxN在高乙醇浓度经历后表现出降低的酒精偏好; 然而,低乙醇浓度的经验会产生对两种杂种的持续酒精偏好.

在本研究中,我们检验了这些表型的假设,即诱导转录因子ΔFosB在奖赏,厌恶和应激相关脑区的差异产生。

结果:

神经元可塑性的变化(通过ΔFosB水平测量)是经验依赖性的,以及脑区域和基因型特异性,进一步支持神经元电路是乙醇消耗的动机方面的基础.

与对照小鼠相比,表现出降低的酒精偏好的BxN小鼠在Edinger-Westphal核中的ΔFosB水平低于表现出持续酒精偏好的小鼠,并且在中央内侧杏仁核中ΔFosB水平增加。

显示持续酒精偏好的BxN小鼠在腹侧被盖区域表现出较高的ΔFosB水平, Edinger-Westphal核和杏仁核(中央和侧面分裂)。

而且,在 Edinger-Westphal细胞核和腹侧被盖区域的BxN小鼠ΔFosB水平与乙醇偏好和摄入量显着正相关。 此外,分层聚类分析显示,许多具有总体低ΔFosB水平的未经乙醇处理的小鼠处于聚类中,而许多显示具有总体高ΔFosB水平的持续酒精偏好的小鼠聚集在一起。

结论:

通过比较和对比两种酒精表型,本研究表明,奖励和压力相关的回路(包括Edinger-Westphal核,腹侧被盖区,杏仁核)经历了显着的可塑性,表现为酒精偏好降低。

背景

已知有与酒精滥用和酗酒有关的易感因素,环境和遗传因素。 对于个体而言,饮用大量酒精而对后果影响不大的能力是许多酗酒者的主要发病症状,这表明对酒精的低反应是酒精中毒发展的主要脆弱因素[1,2]。 定义导致酒精适度的神经生物学因素将有助于我们了解酒精使用和滥用,并且是为被诊断患有酒精使用障碍的个体开发改进治疗方法的有效策略。 使用啮齿动物模型模拟人类疾病已成为推动了解这种疾病和改善治疗方法的有力工具。 有几种啮齿动物模型用于研究酗酒和酗酒的方面,但没有一种酗酒模式. 小鼠在类似环境条件下口服自我给药乙醇溶液的程度在很大程度上取决于其遗传背景[3].

最近,我们发现C57BL / 6JxFVB / NJ(BxF)和FVB / NJxC57BL / 6J(FVBxB6)F1杂交小鼠在两瓶优选试验期间自我管理异常高水平的酒精(雌性消耗20-35 g / kg /天)和雄性7-25 g / kg /天,取决于浓度和范例)[4]。 与现有的近交系菌株相比,这种新的遗传模型具有显着的优势,包括超显性表型和高血液酒精含量的证据[4]。 此外,BxF小鼠表现出的高乙醇消耗量见于两种额外的乙醇饮用范例(在暗处饮用和在预定的液体进入期间接受乙醇)[4]。 然后,当比较两种F1杂交小鼠品系时,我们观察到明显的酒精自我管理行为:C57BL / 6J x NZB / B1NJ(BxN)显示在高浓度酒精和禁欲期后酒精偏好降低,BxF显示持续的酒精偏好[5]. 使用一系列行为测试,我们已经证明BxN比BxF小鼠对厌恶和镇静更敏感,但对乙醇的影响不大。 [6].

对饮酒过量的新行为和遗传模型以及经验引起的饮酒变化的基础研究将进一步提高我们对酗酒和酗酒的认识。 降低的酒精偏好表型是有趣的,因为BxN小鼠最初显示出对乙醇溶液的高度偏爱。 尽管在高乙醇浓度和禁欲经验之后减少酒精摄入的动机方面尚不清楚,但BxN小鼠可能比较适度饮酒,因为他们仍然消耗乙醇溶液,但水平降低,可能是由于厌恶经验。

持续的酒精偏好模型也很有意思,因为无论以前的经验如何,BxF小鼠都能稳定地消耗极高水平的乙醇。 持续和减少酒精偏好可能与酒精剥夺效应有关,这种现象是动物在强制戒毒一段时间后表现出显着增加的酒精消耗e [[7]。 酒精剥夺效应是研究增加饮酒行为的有用现象。 尽管已知诱导酒精剥夺效应的实验时间表与此处使用的时间表完全不同,但将持续和降低的酒精偏好与酒精剥夺效应进行比较将此处讨论的不同行为表型与酒精研究的啮齿动物模型中的重要现象相关联。 降低酒精偏好与酒精剥夺效果相反,持续的酒精偏好可以被描述为没有酒精剥夺效应。 使用多种遗传动物模型,如BxF和BxN,极大地促进了该领域的进步,因为酒精使用障碍被认为是由遗传和环境之间复杂的相互作用引起的。 鉴定这些杂种的差异立即早期基因表达提供了对乙醇的有益和厌恶性质重要的脑电路的洞察。

使用神经元可塑性和/或活性的分子标记,在特定的啮齿动物模型中研究了乙醇和其他药物参与的神经电路[815]。 自我管理和实验者施用的乙醇不会产生等效的脑代谢图,这表明特定的电路是乙醇增强作用的基础[8,9].

尚未在酒精研究中广泛探索的一个关键组成部分是检查持续和减少酒精偏好行为以及识别在这些行为中使用的神经元回路。 该实验的目的是识别持续和减少酒精偏好所涉及的大脑区域。 因为慢性酒精给药(以及其他滥用药物)已经被证明会导致大脑在ΔFosB水平上的区域差异,我们测试了这样的假设:这些行为表型通过诱导转录因子ΔFosB在已知的大脑区域中的差异产生来表示。参与奖励,厌恶和压力 [10].

导致ΔFosB水平区域差异的慢性刺激包括滥用药物(酒精,可卡因,安非他明,尼古丁,吗啡和抗精神病药),慢性压力(束缚应激,不可预测的足部休克,电惊厥性癫痫发作)和强迫性车轮运行[11]。 作为大脑中长期适应的潜在介质,鉴定FosB(FosB或ΔFosB)的主要变体以响应慢性乙醇治疗是一个重要的区别。

有几项研究在慢性刺激后测量FosB和ΔFosB,尚未证实ΔFosB是主要的同种型(如下所述)。 然而,有强有力的证据表明ΔFosB而非FosB是慢性刺激后的主要同种型[1012]。 Ryabinin和Wang(1998)的一项研究发现,在低醇喜欢DBA / 2J小鼠时,重复乙醇注射4天后,导致以下大脑区域FosB表达的强烈增加:前皮质杏仁核,侧脑室,中央杏仁核,外侧杏仁核,外侧下丘脑,伏隔核,纹状体末端床核和丘脑室旁核[13]。 他们的结果确定了乙醇响应神经电路。 在有限的获取条件下,在获得和维持乙醇自我给药期间,还在高醇优选的C57BL / 6J小鼠中测量了FosB表达。 在获得自我管理期间,FosB水平没有变化[14]. 然而,经过两周限制乙醇自我给药后,杏仁核和Edinger-Westphal核中央内核的FosB水平升高[15]. 总体而言,报告确定了从事乙醇自我管理的新区域,并暗示了中脑皮质激素通路和延长杏仁核的作用[16]。 然而,重要的是要注意ΔFosB水平的变化取决于乙醇给药途径,剂量和暴露于治疗或时间表的时间长度[1315].

本研究中使用的小鼠品系提供了有趣的模型,用于比较持续和降低的酒精偏好以及导致这些不同酒精反应的潜在机制。 该研究表明,表现出降低酒精偏好的小鼠在奖赏和压力相关的回路中也显示出显着的可塑性(包括Edinger-Westphal核,腹侧被盖区,杏仁核,伏隔核和扣带皮层)。

成果

酒精浓度和禁欲期对BxF和BxN小鼠自我给药的影响

为了证明不同的乙醇浓度和/或禁欲期改变了随后的乙醇消耗量,我们设计了四个时间表(组)来测量乙醇消耗量(图 (Figure1a,B)。1A,B)。 每种杂交种有四个实验组:高浓度,高浓度,禁欲期,低浓度和低浓度的禁欲期。 乙醇偏好的完整数据(图 (Figure2)2)和消费(图 (Figure3)3)数据(适用于所有组和两种基因型)均可供参考。 为了建立和说明持续和降低酒精偏好的行为表型,9%乙醇偏好和消费数据如图所示 Figures44and5。5。 这些行为表型基于9%乙醇偏好与来自高浓度组中的第一,第二,第三和第四呈现的消耗以及低浓度组的相应实验日的比较。 进行9%乙醇偏好和消耗的双向ANOVA(基因型x时间)。 对于高浓度组,乙醇偏好(图 (Figure4a)4a)和消费(图 (Figure5a)5a)BxF比BxN更大,BxF展现出持续的酒精偏好和消费,而BxN展现出减少的酒精偏好和消费(乙醇偏好-相互作用F(3,54)= 4.83,P <0. 01,基因型F(1,54, 24.10)= 0.001,P <3,54,时间F(9.92)= 0.0001,P <1,54;乙醇消费–相互作用N / S,基因型F(50.73)= 0.0001,P <3,54,时间F(11.68, 0.0001)= XNUMX,P <XNUMX)。 对于戒酒的高浓度人群,乙醇偏爱(图 (Figure4b)4b)和消费(图 (Figure5b)5b)BxF比BxN更大,BxF表现出持续的酒精偏好和消费,而BxN表现出降低的酒精偏好和消费(乙醇偏好-相互作用F(3,132)= 15.89,P <0.0001,基因型F(1,132)= 250.43,P <0.0001,时间F(3,132)= 27.48,P <0.0001;乙醇消耗–相互作用F(3,132)= 11.35,P <0.0001,基因型F(1,132)= 510.88,P <0.0001,时间F(3,132)= 22.42, P <0.0001)。 对于低浓度组,乙醇偏爱(图 (Figure4c)4c)和消费(图 (Figure5c)5c)BxF比BxN更大,并且两个杂种均表现出持续的酒精偏好和消耗(乙醇偏好-相互作用N / S,基因型F(1,54)= 12.2,P <0.01,时间N / S;乙醇消费-相互作用N / S,基因型F(1,54)= 74.83,P <0.0001,时间N / S)。 对于戒酒的低浓度人群,乙醇偏爱(图 (Figure4d)4d)和消费(图 (Figure5d)5d)BxF比BxN大,并且两个杂种均表现出适度降低的酒精偏好和消耗(乙醇偏好-相互作用N / S,基因型F(1,132)= 166.58,P <0.0001,时间N / S;乙醇消费-相互作用F(3,132)= 3.61,P <0.05,基因型F(1,132)= 480.64,P <0.0001,时间F(3,132)= 7.87,P <0.0001)。 总而言之,在高浓度组(无戒酒)中,BxF表现出持续的酒精偏好,而BxN则表现出较低的酒精偏好,而在低浓度组(无禁欲)中,BxF和B6xN均表现出持续的酒精偏好。 由于感兴趣的表型最好在没有禁欲的人群中捕获,因此它们是本研究其余部分的重点。

图1  

连续获取自愿乙醇消费的实验时间表。 a。 低浓度和高浓度组的实验时间表。 b。 具有禁欲期和高浓度的低浓度实验时间表 ...
图2  

乙醇偏好取决于基因型和乙醇浓度。 a。 在高浓度组中,BxF的乙醇偏好(乙醇消耗/总液体消耗)大于BxN,并且随着提供的乙醇浓度而变化。 b ...
图3  

乙醇消耗取决于基因型和乙醇浓度。 a。 在高浓度组中,BxF的乙醇消耗(g / kg /天纯乙醇)大于BxN,并且随着提供的乙醇浓度而变化。 b。 在高浓度 ...
图4  

持续和减少的酒精偏好行为表型。 显示来自第一,第二,第三和第四呈现的9%乙醇偏好的比较以建立持续或降低的酒精偏好的行为表型。 a. ...
图5  

持续和减少的酒精消费行为表型。 显示来自第一,第二,第三和第四呈现的9%乙醇消耗的比较以建立持续或减少的酒精消耗的行为表型。 ...

ΔFosB水平

ΔFosB定量和分析用于鉴定在持续和降低的酒精偏好期间长期活化的神经电路。 每种杂交品有三个实验组:高浓度,低浓度和水(对照)。 ΔFosB数据表示为ΔFosB阳性神经元的百分比[(ΔFosB阳性神经元的数量)/(ΔFosB阳性神经元的数量+ Nissl阳性神经元的数量)](表 (Table1)。1)。 以前的工作表明乙醇经验可以诱导神经变性[17]。 因此,我们研究了本研究中的神经元数量,并且报告了基于基因型或组的本研究中量化的脑区域没有显着差异。 进行以下三种ΔFosB数据分析:1)三向ANOVA(基因型x组x脑区域),2)每种基因型的双向ANOVA(脑区x组)和3相关矩阵被开发用于映射相关性网络。

表1  

ΔFosB阳性神经元百分比

重复测量三向方差分析(基因型x组x脑区域)显示基因型x脑区相互作用[F(15,375)= 2.01,P <.05],组x脑区相互作用[F(15.375)= 1.99,P <0.01]和大脑区域的主要作用[F(15,375)= 43.36,P <.000]。 对每种基因型重复测量双向ANOVA(脑区x组)表明,对于BxF和BxN,组和脑区都有主要作用[BxF – F(2,374)= 11.79,P <.0001,组; F(15,374)= 25.64,P <.0001,是大脑区域的主要作用; BxN – F(2,360)= 43.38,P <.0001,小组的主要影响; F(15,360)= 23.73,P <.0001,基因型的主要作用]。 事后分析显示BxN的六个显着组差异(图 (Figure6a-C)。6AC)。 低浓度组的ΔFosB水平百分比高于La,CeC / CeL,EW和VTA中的水组。 高浓度组中ΔFosB的百分比高于CeMPV中的水组。 低浓度组的ΔFosB百分比高于EW中的高浓度组。 表中列出了量化的所有其他脑区域的ΔFosB数据 Table1。1。 使用Pearson的r相关分析确定给定大脑区域中ΔFosB阳性神经元的百分比是否与乙醇消耗或偏好相关。 乙醇的消耗和偏好与BxN小鼠的EW和VTA中的%ΔFosB呈显着正相关(乙醇消耗量– EW r = 0.85; VTA r = 0.85;乙醇偏爱度– EW r = 0.83,VTA r = 0.88; p <0.05对全部)。

图6  

持续和降低的酒精偏好诱导杏仁核,EW和VTA中的ΔFosB。 杏仁核区域中ΔFosB阳性神经元的百分比(a。),EW(b。)和VTA(c。) d。 和 e。 ΔFosB/ Nissl染色的代表性图像 ...

使用主成分分析和层次聚类进一步探索ΔFosB表达,基因型,脑区域和乙醇消耗之间的复杂关系。 主成分分析显示数据中的大部分可变性(~80%)由5成分表示。 然后执行无监督的层次聚类(由个体和大脑区域聚类)并使用第一主成分进行排序(图 (Figure7)。7)。 个体聚类揭示了基于乙醇消耗的强烈但不完美的分组模式,无论基因型如何。 许多未经乙醇处理的小鼠聚集在一起并且表现出比平均值更少的整体ΔFosB,并且显示持续酒精偏好的许多小鼠聚集在一起并且表现出比平均值更多的整体ΔFosB。 这两个群体是最不同的。 其间的三个簇代表ΔFosB值和乙醇饮用表型的大于,小于和平均混合。

图7  

ΔFosB水平不仅仅由乙醇消耗驱动。 进行分层聚类,并显示各个ΔFosB水平和相应的9%乙醇消耗的所得热图。 绿色=ΔFosB小于 ...

讨论

比较两种F1杂交小鼠品系时观察到不同的酒精自我管理行为: BxN显示在高浓度酒精和禁欲期后饮酒偏好减少,而BxF表现出持续的酒精偏好. BxF模型稳定,高消耗(持续酒精偏好)和BxN模型适度饮酒(降低酒精偏好)。 神经元可塑性(或活性,通过ΔFosB水平测量)根据乙醇经验而不同,进一步支持特定神经元回路在持续和降低的酒精偏好中的潜在作用。

对于高酒精消耗菌株,C57BL / 6,乙醇偏好和消耗高度依赖于初始乙醇浓度,禁欲长度和亚株(C57BL / 6Cr或C57BL / 6J)[7,18]。 我们发现在测试的四种不同方案中,BxF小鼠中观察到的乙醇偏好和消耗始终较高(并且比BxN更稳定)。 BxN的中度高乙醇偏好和消费仅在一个慢性饮酒计划(低浓度无戒烟)下持续,而在所有其他慢性饮酒计划中观察到偏好和消费的减少。 BxN降低的酒精偏好提供了一种新的动物模型,其中经验(在多次高乙醇浓度和/或几次短暂禁欲的经历之后重复呈现乙醇)显着降低了它们对先前高度优选的乙醇浓度的响应。

自我管理和实验者施用的乙醇产生不同的脑代谢图,表明特定的电路是乙醇增强作用的基础 [8,9]。 我们测试了这样的假设:持续和减少的酒精偏好行为表型由已知涉及奖赏,厌恶和压力的脑区中诱导型转录因子ΔFosB的差异产生来表示。 ΔFosB是具有独特的长期稳定性的转录因子,并且不像c-Fos那样对刺激脱敏,而是在慢性治疗期间累积。 ΔFosB的增加是由于神经元活动增加,并且被认为反映了持久的神经元可塑性。 我们发现脑区ΔFosB阳性神经元的百分比取决于基因型(BxF和BxN)和组(水控制,低浓度和高浓度)。

F或BxN,事后分析显示,自愿乙醇消耗导致EW核,VTA和杏仁核中ΔFosB增加:表明已知涉及乙醇,奖赏和应激反应的脑区神经元可塑性增加。 高浓度组中的BxN小鼠(降低酒精偏好)降低了EW中的神经元可塑性,表明这些神经元对酒精摄入有反应,具有依赖经验的可塑性。 在低浓度组(表现出持续的酒精偏好),EW中的神经元可塑性大于高浓度和水对照组。 虽然使用不同的乙醇饮用范例和遗传小鼠模型进行,但我们在BxN小鼠的EW中的发现与先前的乙醇消耗研究一致[14,15]。 非节前EW最近被定性为含有perioculomotor urocortin(Ucn)的神经元[19]。 Ucn1是一种促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)样肽,可与CRF1和CRF2受体结合。 以前使用遗传,药理和病变方法的研究表明,Ucn1参与调节饮酒[1922]。 Ť这是啮齿动物高酒精摄入的已知遗传倾向,与EW和LSi中Ucn1的较高基础水平相关 [23]。 因此,我们在EW中观察到的高酒精偏好和消耗BxF小鼠的事后意义的缺乏是出乎意料的。 也许这是由于与BxN水组相比,BxF水组中ΔFosB水平略微升高。 实际上,所有表现出持续酒精偏好的小鼠(BxF高浓度组,BxF低浓度组和BxN低浓度组)的ΔFosB水平百分比非常相似。

对于BxN,低浓度组中的乙醇消耗增加了VTA中的神经元可塑性(大于高浓度和水对照组)。 低浓度组的乙醇偏好和消耗也更大。 我们在VTA中观察到的高酒精偏好和消耗BxF小鼠的事后意义缺乏是出乎意料的,可能是由于水对照组中ΔFosB的基础水平略高。 与BxN水组相比,BxF水组中ΔFosB水平的百分比略微升高,而所有表现出持续酒精偏好的小鼠的ΔFosB水平百分比非常相似(BxF高浓度组,BxF低浓度组和BxN低浓度组) 。 VTA多巴胺系统在调节乙醇的增强作用中起主要作用,并参与许多对乙醇和奖赏相关行为重要的相互关联[2426]。 此外,VTA投射到杏仁核和EW核。 已经证明大鼠可以直接将乙醇自我给予VTA [27]. 此外,乙醇暴露增加了VTA中多巴胺能神经元的放电率[28,29]。 增加的放电率可能与我们在BxN中慢性自愿乙醇给药后观察到的VTA中的ΔFosB诱导有关。

酒精依赖会诱发长期的神经适应,导致负面的情绪状态; 负强化的重要机制是杏仁核内的促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)信号传导 [30]。 CeA中神经元的药理学操作靶向GABA,CRF,阿片类药物,血清素,强啡肽和去甲肾上腺素受体[25,3134]。 GABA拮抗剂以及CRF拮抗剂降低了乙醇消耗 [32,33,35]. CeA的病变减少了持续获取自愿乙醇的消耗 [36]. 我们的研究结果进一步支持了CeA在调节酒精饮用行为中的作用。 中央杏仁核中的GABA能神经元形成异质群体,其连接似乎与其肽含量相关。 这些GABA能神经元整合了CeA的输出活性。 正如[在[Wee和Koob(2010]),s几项研究已经确定了强啡肽和κ阿片受体在维持和升级乙醇摄入中的作用e [[37]。 最近,Walker等人证明延长的杏仁核中的κ-阿片受体拮抗剂nor-binaltorphimine选择性地减少了依赖性动物的乙醇自我给药[38]。 Kappa阿片受体信号传导仍然是压力,奖励和厌恶交叉研究的关键利益。 还已经证明,应激诱导的乙醇自我给药是由κ阿片样物质受体信号传导介导的 [39]。 中央CeA可以细分为晚期 - 囊(CeL / CeC)和内侧后腹。 CeL / CeC的GABA能神经元从VTA接受多巴胺能神经支配; 如前所述,这些神经元在急性乙醇给药后被激活,并且显示增加的ΔFosB小鼠显示持续的酒精偏好。 另外,见Mc [新娘(2002])对CeA和酒精的影响进行了优秀的评论[40]。 在我们的研究中,具有持续酒精偏好的BxN小鼠(低浓度组)在CeC / CeL中表现出增加的神经元可塑性,并且具有降低的酒精偏好的La和BxN小鼠(高浓度组)在CeMPV中表现出增加的神经元可塑性。 这些结果表明,特定的乙醇经验涉及杏仁核中GABA能神经元的可塑性。 利用这些数据,以及VTA和EW中神经元可塑性的相应变化,我们建议该电路在持续的酒精偏好条件下经历显着的可塑性。

先前的研究表明,C57BL / 6J小鼠可以通过两瓶选择饮用来达到高血液酒精含量,但是这些血液酒精含量不能持续,并且通常饮酒不符合Dole和Gentry(1984)所述的药理学动机标准[41,42]。 表现出降低的酒精偏好的BxN小鼠消耗量低于典型的C57BL / 6J小鼠的预期[1]。 因此,虽然我们没有采集血液酒精样本​​,但是BxN小鼠显示出降低的酒精偏好不太可能达到持续的药理学相关的血液酒精水平,这表明高血液酒精浓度对于在这些大脑区域诱导可塑性不是必需的。 值得注意的是,尽管BxF脑区的事后结果(针对多重比较校正)未显示慢性乙醇消耗后任何区域的ΔFosB阳性神经元百分比的显着变化,但是BxF中也存在非常显着的组效应。有这些不同的时间表。

为了可视化变量之间的潜在关系,执行了层次聚类。 得到的分析的热图显示了ΔFosB水平与乙醇消耗之间的总体趋势,而与基因型无关。 较高的ΔFosB水平与高饮酒相关,较低的ΔFosB水平与对照动物相关; 然而,这种关系的强度不足以仅根据ΔFosB水平准确预测饮酒表型。

结论

用两种F1杂交小鼠品系观察到不同的酒精自我管理行为:BxN在高浓度酒精经历后表现出降低的酒精偏好,而BxF表现出持续的酒精偏好。 BxF模型稳定,高消耗(持续酒精偏好)和BxN模型适度饮酒(降低酒精偏好)。 神经元可塑性的变化(通过ΔFosB水平测量)是经验依赖性的,以及脑区域和基因型特异性,进一步定义神经元电路是乙醇消耗的动机方面的基础。 这些结果表明,杂交小鼠中一个亲本系的变化导致酒精消耗模式的变化和ΔFosB表达模式的显着变化,表明不同的脑网络参与这些不同的杂种小鼠。

方法

伦理

本研究严格按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行。 该方案得到了德克萨斯大学奥斯汀分校的机构动物护理和使用委员会(AUP 2010-00028)的批准。 所有手术均在戊巴比妥钠麻醉下进行,并且尽一切努力使痛苦最小化。

动物

研究使用从C1BL / 57J并且或者FVB / NJ或NZB / B6NJ小鼠的相互交叉雌性F1杂交小鼠进行(BXF F1和BXN F1,产妇应变X父本菌株)。 C57BL / 6J,FVB / NJ和NZB / B1NJ育种者购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)并在7-8周交配。 将后代断奶成每种基因型的异性组(BxF F1,BxN F1)。 我们只测试了雌性小鼠以便于与之前收集的数据进行比较[1,5,6]。 将小鼠圈养在标准笼中,提供食物和水 随意。 菌落室和测试室在12 h灯上:12 h暗循环(在07点亮00:XNUMX)。

两瓶选择乙醇偏好测试

两瓶选择方法用于确定雌性BxF和BxN小鼠的自愿乙醇自我给药模式[1,6]。 将F1杂种雌性小鼠(年龄63天)单独圈养在标准笼中,同时在引入乙醇溶液之前使用含有水的吸管的瓶子适应一周。 适应后,小鼠可以使用两个相同的瓶子:一个装有水,另一个装有乙醇溶液。 每天更换管位置以控制位置偏好。 为了解释潜在的溢出和蒸发,每天从个体饮用值中减去没有小鼠的对照笼中的管消耗的平均重量。 在整个实验过程中每隔4天对小鼠称重。 在整个实验中每天测量所有流体消耗。 计算每只小鼠消耗的乙醇量和乙醇偏好,并且对于每种乙醇浓度平均这些值。 醇浓度和自我给药戒断期间在BXF和BxN小鼠的影响通过指定一实验组与获取高浓度(升级访问3-35%的乙醇溶液,随后3,9的18重复循环演示,和27%乙醇,最后呈现9%乙醇)和另一组具有低浓度(升级获得3-9%乙醇,其余实验进行,获得9%乙醇)。 这些组中的每一组都有一个小组,该小组曾经或未经历过三个为期一周的禁欲期。 对照小鼠与实验小鼠同时经历类似的条件,但仅提供一瓶水。

在总共有对于每个混合五组:水(N = 14-16),高浓度(N = 10),高浓度与节欲期(N = 20),低浓度(N = 10),和低浓度禁欲期(n = 20)。 参见图 图11 详细的两瓶选择组时间表。

ΔFosB免疫组织化学和定量

在连续16天连续接触水(对照)或水和酒精(高浓度和低浓度)的小鼠的72个脑区中测量了ΔFosB免疫组织化学(IHC)。 高浓度对乙醇偏爱和消耗的影响远大于戒酒的影响。 因此,经历禁欲期的人群不包括在ΔFosBIHC测量中。 此外,该实验超出了持续或降低酒精偏好的首次出现,以显示行为表型在重复乙醇浓度变化的反复循环中是稳定的,以检验慢性乙醇消费的影响。 在实验的第73天去除酒精后四到八小时,将小鼠深麻醉(175 mg / kg戊巴比妥钠),并向其内心灌注20 ml 0.01 M磷酸盐缓冲盐水(PBS),再灌注100 ml 4% PBS中的低聚甲醛。 取出大脑,在4°C下固定在4%多聚甲醛中,包埋在3%琼脂糖中,在玻璃纤维切片器上切成薄片(50 um,冠状),置于冷冻保护剂(30%蔗糖,30%乙二醇和0.1%聚乙烯醇)中将其在PBS中的吡咯烷酮中于4°C放置过夜,并在-20°C下保存直至进行IHC处理。 解冻后的切片用PBS洗涤,用0.3%H2O2处理,并在3%正常山羊血清中孵育4小时,以最大程度地减少非特异性标记。 然后将组织切片在3%正常山羊血清和抗FosB(SC-48,1:5000稀释度,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)中于1°C孵育过夜。 将切片洗涤,在生物素化的山羊抗兔Ig(200:1稀释度,Vector Laboratories,Burlingame,CA)中孵育200小时,洗涤,并在抗生物素蛋白-生物素复合物(0.05:0.015稀释度,Elite kit-Vector Laboratories)中孵育。 过氧化物酶活性通过与XNUMX%二氨基联苯胺(含XNUMX%H2O2)。 组织切片用Nissl复染(使用亚甲蓝/天蓝II)。 幻灯片被编码用于盲计数。 使用光学分馏器方法和StereoInvestigator计算机软件在50X(油)放大倍数下计数ΔFosB-IR神经元。 采样参数信息:计数帧(50um x 50um x 10um)对于所有量化的区域是相同的; 然而,确定每个脑区域的网格大小以确保总双侧细胞计数等于100-300以便实现小于0.1的变异系数。 数据计算为每个区域的ΔFosB阳性细胞核的百分比(ΔFosB阳性细胞核数/神经元数)。

在该研究中使用的FosB抗体(SC-48,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)针对FosB的内部区域产生并识别FosB和ΔFosB。 尽管该抗体同时识别FosB和ΔFosB,但本研究中定量的免疫阳性神经元将被称为ΔFosB阳性神经元,因为已经显示滥用药物(包括酒精)在神经元中特异性地诱导ΔFosB而不是FosB。 Perrotti等。 ([2008])使用两种抗体测量ΔFosB诱导(响应于长期施用滥用药物,包括酒精):一种识别FosB和ΔFosB(SC-48),一种选择性ΔFosB(不可商购),并发现所有药物研究表明,使用FosB抗体(SC-48)观察到的免疫反应性是由ΔFosB引起的,因为他们没有使用对全长FosB有选择性的抗体检测到任何免疫反应神经元[10]。 另外,已知ΔFosB通过各种慢性治疗以大脑区域和细胞类型特异性方式诱导,并且可以获得关于该主题的优秀评论[11,43,44].

神经解剖结构的缩写和位置

Il –边缘皮层(+1.70毫米); Cg1 –扣带回皮层1(+1.1 mm); Cg2 –扣带回皮层1(+1.10 mm); NAcc核心–伏隔核核心(+1.10 mm); NAcc壳–伏核壳(+1.10毫米); LSi –外侧中隔片(+1.10毫米); La –杏仁核外侧(-1.22毫米); Bla –基底外侧杏仁核(−1.22 mm); CeC / CeL –中央囊和中央外侧杏仁核(-1.22 mm); CeMPV –杏仁核中央核的内侧后腹部分(-1.22 mm); PAG –导水管周围灰色(−3.64 mm); EW –爱丁格·威斯特法尔核(−3.64 mm); VTA –腹侧被盖区域(−3.64 mm); DR –背缝(− 4.60 mm); PBN –臂旁核(−5.2 mm); NTS –孤束核(−6.96 mm)。 立体定位坐标中的小鼠脑[45用于主观匹配一至三个部分用于量化每个脑区域。

统计程序

除非另有说明,否则数据以平均值±SEM报告。 数据是正常分布的。 使用Statistica版本6(StatSoft,Tulsa,OK,USA)和GraphPad Prism版本4.00(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)进行统计。 针对乙醇消耗和偏好数据进行重复测量双向ANOVA以评估组之间的差异。 对ΔFosB数据进行了双向和三向ANOVA,以评估组(高浓度,低浓度和水),脑区域和基因型的相互作用和主要影响。 Bonferroni对多重比较的纠正和Bonferroni的事后纠正在适当的时候进行。 具体来说,我们假设压力和奖励回路会增加小鼠的FosB,显示酒精偏好降低。 对于每个杂交杂交,Pearson's r用于鉴定在乙醇经历的小鼠中ΔFosB水平与乙醇偏好和消耗之间存在显着相关性。

进行分层聚类以便可视化数据如何共同变化并评估数据组如何组合在一起。 推算的中值取代了丢失百分比ΔFosB数据,其未超过数据的15%。 尽管存在比实际观察到估算值更大的不确定性,但是层次聚类分析需要完全成员资格或完全删除以进行案例比较。 使用Ward方法进行分层聚类,并且通过主成分分析(JMP,版本8,SAS Institute Inc.,Cary,NC)的第一主成分对所得聚类进行排序。 对于水和乙醇经历的组,每个脑区域的ΔFosB数据进行z分数转换并且进行主成分分析以确定簇的数量。 然后使用监督的层次聚类分析由大脑区域和个体聚类数据。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争的利益。

作者的贡献

ARO,YAB,RAH,TAJ为该研究的设计做出了贡献。 ARO获得了这些数据。 ARO,IP,RDM分析了数据。 ARO,RDM,IP,TAJ,YAB和RAH参与起草和修改手稿。 所有作者阅读并认可的终稿。

致谢

我们要感谢Drs。 Jody Mayfield和Colleen McClung进行了有益的讨论,Marni Martinez,Jennifer Stokes,Michelle Foshat,Jose Cienfuegos,Jamie Seymour和Darshan Pandya提供技术支持。 这项研究得到了酒精中毒联合会资助的综合神经科学倡议AA13520和国家酒精滥用和酒精中毒研究所AA06399-S和AA16424的支持。

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