神经科学杂志，6九月2006，26（36）：9196-9204; doi：10.1523 / JNEUROSCI.1124-06.2006
彼得奥劳森1, J. David Jentsch2, Natalie Tronson1, Rachel L. Neve3, Eric J. Nestler4及 简·泰勒1
1.通讯应发给Jane R. Taylor，耶鲁大学医学院分子精神病学系精神病学系，康涅狄格州心脏健康中心Ribicoff研究设施，34 Park Street，New Haven，CT 06508。[电子邮件保护]
抽象
动机的改变与几种精神疾病的病理生理学有关，包括药物滥用和抑郁症。 已知反复暴露于滥用或应激的药物会持续诱导伏隔核（NAc）和背侧纹状体中的转录因子ΔFosB，假设其有助于多巴胺调节的信号传导中的神经适应。. 然而，鲜为人知的是，ΔFosB特异性地参与了对出乎动机的动机行为的调节。 我们在这里显示ΔFosB在转基因小鼠的NAc和背侧纹状体中的诱导性过表达，或者特别是通过使用病毒介导的基因转移在大鼠的NAc核心中，增强了食物增强的仪器性能和渐进比率响应。 在先前反复暴露于大鼠中的可卡因，苯丙胺，MDMA [（+） - 3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺]或尼古丁之后发现非常相似的行为效应。 这些结果揭示了ΔFosB对动力过程的强大调节，并提供证据表明药物诱导的基因表达改变通过诱导NAc核心内的ΔFosB可能在激励影响对器乐行为的影响中起关键作用。
介绍
反复的药物暴露导致基因转录的暂时动态改变，在伏核（NAc）内产生持久的神经适应性（Nestler，2004）。 这个大脑区域在药物和天然强化过程中起着关键作用（Kelley和Berridge，2002虽然对转录因子的了解很少，但这些因素会影响由非药物，食物等食欲增强剂所激发的行为。 ΔFosB是通过慢性药物暴露在NAc和背侧纹状体内激活的转录因子（Konradi等人，1994; Nye等，1995; 陈等人，1997; Pich等，1997; Shaw-Lutchman等人，2003）和强制轮子运行（Werme等，2002）。 它也在这些地区被几种形式的慢性压力诱发（Perrotti等，2004）。 与诱导纹状体ΔFosB相关的药物强化过程的增强已得到很好的证实（Kelz等人，1999; Colby等，2003; Zachariou等，2006）。 然而，这些区域中ΔFosB水平升高对由天然增强物驱动的器械行为的影响尚不清楚。
工具反应的表现是吸毒行为的必要组成部分，随着向成瘾的过渡进展，这些行为可能会失调或不灵活（Jentsch和Taylor，1999; 伯克和海曼，2000; Berridge和Robinson，2003; Everitt和Robbins，2005）。 NAc涉及与成瘾相关的工具行为的多个方面 (Balleine和Killcross，1994; Corbit等人，2001; de Borchgrave等，2002; Di Ciano和Everitt，2004b; Everitt和Robbins，2005）。 因此，NAc内药物诱导的神经适应可能会影响器乐行为的表现。 事实上，慢性可卡因暴露增强了蔗糖增强的器乐表现（Miles等，2004）和操作被认为阻止NAc核心内的神经可塑性，包括抑制PKA（蛋白激酶A）或蛋白质合成，干扰食物奖励的器乐反应（Baldwin等，2002a; Hernandez等，2002）。 NAc核心还调节条件影响对工具行为的动机影响（Parkinson等，1999; Corbit等人，2001; Hall等，2001; Di Ciano和Everitt，2004a; Ito等，2004），提供神经生物学基质，其中ΔFosB诱导可能有力地影响器官性能和食欲，水或滥用药物等食欲增强剂的动机。
在这里，我们使用两种互补的遗传方法研究了ΔFosB对食物驱动的器官行为的影响：（1）NAc内的ΔFosB和转基因小鼠背侧纹状体（NSE-tTA×TetOp-ΔFosB）和（2）过表达的诱导性过表达。通过在大鼠中使用病毒介导的基因转移特异性地在NAc核心中的ΔFosB. 我们还评估了在报告增加ΔFosB的条件下，先前反复接触可卡因，苯丙胺，（+） - 3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）或尼古丁是否会增加食物增强的器械响应和/或使用渐进比例计划的动机，正如已经证明的药物强化自我管理（Horger等，1990, 1992; Piazza等人，1990; Vezina等，2002; Miles等，2004）。 我们的结果证明了ΔFosB对仪器行为的持续影响，并表明该转录因子可能在NAc核心中作为激励功能的调节剂起作用。
材料和方法
动物和动物护理
从Charles River Laboratories（Wilmington，MA）获得实验天真的Sprague Dawley大鼠。 雄性转基因11A小鼠来自表达神经元特异性烯醇化酶（NSE）-tTA四环素反式激活蛋白（A系）的纯合转基因小鼠与表达TetOp（四环素响应启动子）-ΔFosB（11系）的小鼠之间的杂交; 亲本系保持在远交混合背景（50％ICR和50％C57BL6×SJL）（陈等人，1998; Kelz等人，1999）。 这些双转基因11A小鼠仅在以下情况下表达ΔFosB:( 1）两种转基因存在于同一细胞中，并且（2）tTA的转录激活不受四环素抗生素如强力霉素的存在的抑制。 因此，对这些小鼠施用强力霉素可以对ΔFosB的表达进行时间控制，并用于预防发育期间的表达; 事实上，强力霉素给药与ΔFosB无可检测的泄漏表达相关（陈等人，1998; Kelz等人，1999）。 此外，选择11A系列转基因小鼠用于本实验，因为它们显示出主要限于含有强啡肽的纹状体神经元（NAc和背侧纹状体）的表达模式，非常类似于慢性药物诱导ΔFosB的模式。暴露（Kelz等人，1999）。 此外，ΔFosB的纹状体表达的量化已经量化（陈等人，1998; Kelz等人，1999）。 这些小鼠在德克萨斯大学西南大学生成，并在耶鲁大学的设施中进行维护和测试。 在整个妊娠和发育过程中，将所有小鼠维持在多西环素上直至饮用水中8-9周龄，浓度为100μg/ ml，已知TetOp驱动的转基因处于“关闭”状态，并使用起始6当ΔFosB表达变得最大时，多周时关闭强力霉素Kelz等人，1999）。 所有实验都涉及同窝异基因小鼠与多西环素的比较，这本身对动机行为没有影响（Kelz等人，1999; McClung和Nestler，2003; Zachariou等，2006).
所有实验受试者在受控温度和湿度条件下在12 h光/暗循环下成对（大鼠）或成组（小鼠;每笼4至5只）饲养（在7上点亮：00 AM并在7处关闭：00下午）。 在进行任何研究之前，他们至少允许7 d适应住房设施。 动物随时可以随意获取水，并且如下所述，获取食物的机会有限。 所有动物使用均按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，并得到德克萨斯大学西南分校和耶鲁大学动物护理和使用委员会的批准。
毒品
可卡因盐酸盐[由国家药物滥用研究所（NIDA）友情提供]，d-苯丙胺硫酸盐（Sigma，St.Louis，MO），MDMA盐酸盐（由NIDA友情提供）和（ - ） - 尼古丁酒石酸氢盐（Sigma）将其溶于无菌生理盐水（0.9％）中，并以5 ml / kg（小鼠）或2 ml / kg（大鼠）的体积腹膜内注射。 在注射前用碳酸氢钠调节尼古丁溶液的pH。
病毒载体
如前所述进行病毒介导的基因转移（Carlezon等，1998; Perrotti等，2004）。 简而言之，将编码特定蛋白质的cDNA插入单纯疱疹病毒（HSV）扩增子HSV-PrPUC中，并使用辅助5d11.2将其包装到病毒中。 根据实验方案，随后将驱动编码对照蛋白β-半乳糖苷酶的HSV-LacZ或编码ΔFosB的HSV-ΔFosB表达的载体注入NAc核心。
实验过程
大纲。
实验1检查了先前重复药物暴露对食物增强仪器性能和累积比率响应的影响。 将大鼠随机分成5个实验组（n = 9-10 /组）。 这些组每天两次注射（腹膜内; 9：00 AM和5：00 PM）用盐水或下列药物之一：尼古丁，0.35 mg / kg; MDMA，2.5 mg / kg; 可卡因，15 mg / kg; 或连续苯胺，2.5 mg / kg连续15天。 根据我们之前公布的数据选择剂量（泰勒和Jentsch，2001; Olausson等人，2003在治疗日1和15监测药物诱导的运动刺激。 在停药5后，对动物进行连续10的仪器响应训练，随后在第二天进行累进比率测试。 两只动物被排除在统计分析之外，因为它们没有获得仪器响应，在三个最终训练课程中的每一个训练课程中只有一个活跃的杠杆响应。
实验2和3检测了转基因小鼠中诱导性纹状体过度表达ΔFosB对器械性能的影响，并对增强的渐进比率作出反应。 先前已经证明ΔFosB在这些小鼠中的诱导性过表达模拟了在运动活动和条件性位置偏好范例中重复药物暴露的影响（Kelz等人，1999; Zachariou等，2006）。 这些小鼠可以提供关于纹状体ΔFosB对特定行为过程的贡献的关键信息。 将基因型雄性小鼠维持在多西环素上或在8周龄时转换为自来水。 在6周停用多西环素后开始实验，此时转基因表达最大（Kelz等人，1999）。 在实验2中，动物（n = 16）受到食物限制并且在10连续天的下述仪器程序（见下文，仪器响应和渐进比测试）中训练。 在仪器测试完成后，在这些小鼠中评估可卡因诱导的运动刺激。 在实验3中，在18连续天数的仪器响应下训练一组单独的小鼠（n = 10），在此期间递送最多的50增强物。 在第11天，对所有小鼠进行累积比率测试。 在12当天，我们通过预先进行比例反应来确定强化物贬值的影响。
实验4和5检测了病毒介导的ΔFosB特异性在NAc内的过表达的影响。 实验4测试了ΔFosB过表达对仪器性能的影响。 在这里，大鼠在NAc核心中输注HSV-ΔFosB（n = 8）或HSV-LacZ（n = 8），并且在稍后开始40 h时对仪器程序进行训练。 在10每日训练课程之后，如下所述评估运动活动监测设备中所有动物的基线活动水平（参见下文，运动活动）。 实验5特别评估了NAcΔFosB过表达对进行性比率响应的影响。 这里，最初训练大鼠连续15天，分配到实验组，随后在NAc核心中输注HSV-ΔFosB（n = 8）或HSV-LacZ（n = 7）。 对于4 d，动物未经测试且未经处理以允许ΔFosB表达达到峰值。 在输注后的第5天，对所有动物按渐进比例计划测试杠杆按压。 在测试的最后一天之后，杀死所有大鼠并且在组织化学上验证输注套管在NAc核心中的放置。 基于输注套管的放置，将两只大鼠从实验4和一只来自实验5的大鼠中排除。
基因表达的表征在单独的一组动物中进行。 在这里，HSV-LacZ注入NAc核心，动物在3 d后被杀死。 随后用免疫组织化学方法评估β-半乳糖苷酶的表达。
运动活动.
使用活动计（Digiscan animal activity monitor; Omnitech Electronics，Columbus，OH）测量运动活动。 活动计配有两排红外光电传感器，每排由16传感器组成，2.5传感器相距XNUMX厘米。 活动计量表由PC计算机使用Micropro软件（Omnitech Electronics）收集的活动计量表控制和数据。
将实验动物置于透明塑料盒（25×45×20 cm）中，将其放入活动计量器中。 最初使动物适应于运动活动记录设备的30 min。 在一些实验中，随后取出动物，根据实验设计注射可卡因，苯丙胺，尼古丁或媒介物，并放回盒子中。 然后记录60 min的运动活性，在药物注射后开始5 min以避免非特异性注射诱导的运动过度。 所有实验均在动物的轻相期间（9：00 AM和6：00 PM之间）进行。
乐器响应和渐进比率测试。
使用MedPC软件（Med Associates，St.Albans，VT）控制的大鼠标准操作室（30×20×25 cm）或小鼠（16×14×13 cm）评估仪器响应。 每个腔室都装在一个声音衰减的外室中，配有白噪声发生器和风扇，以减少外部噪音的影响。 安装在后墙上的房屋灯照亮了房间。 颗粒分配器将食品颗粒（20或45 mg; Bio-Serv，Frenchtown，NJ）作为增强剂送入杂志。 通过安装在加强件容器上方的光电池检测头部入口。 在这本杂志中是一个刺激的光。 对于老鼠，在弹匣的每一侧放置一个杠杆。 对于小鼠，将两个鼻子孔放置在腔室的后壁上（即，与加强件盒相对）。
在训练开始前的5期间，动物被限制在每天90 min食物中并且在其家笼中暴露于基于谷物的食物颗粒（小鼠，20 mg;大鼠，45 mg）。 在测试期间，根据行为方案（见下文）在操作室中间歇地获得食物颗粒以及在90 min的家庭笼中无限量地获得食物颗粒，在每日测试期后开始30分钟。 这种食物进入时间表允许每只动物达到其个体饱腹点并减少由优势动物和下属动物之间的竞争引起的变化。 在我们的手中，这个时间表允许在初始体重减轻后体重增加缓慢 〜85-90％的自由进食重量。 在整个实验过程中监测动物重量。
所有受试者最初习惯于2 d的测试装置; 在这些会议期间，食品颗粒以固定时间15（FT-15）计划送入增强剂杂志。 从第二天开始，受试者每天接受10的每日训练。 根据先前公布的仪器调节程序测试对食物的反应（Baldwin等，2002b）。 对正确（即，主动）杠杆/鼻托的响应得到了加强，而对另一个（无效）杠杆/鼻托的响应则没有编程后果。 对于所有实验组，活动鼻托或杠杆（左/右）的位置是平衡的。 完成响应要求（见下文）导致杂志刺激光的开始，随后1随后通过递送单个食物颗粒。 两秒钟后，刺激灯关闭。 根据固定比率（FR10）计划成功完成响应后获得第一批1增强剂，之后在可变比率（VR2）时间表响应后获得颗粒。 会议持续了15分钟。
实验3（小鼠）和5（大鼠）使用替代训练计划来避免训练期间器械性能差异对随后的进行性比率响应的潜在影响（详述如下）。 在实验3中，小鼠在针对1 d的FR2时间表上训练，然后在针对2的FR8时间表上训练d。 第一次测试的3使用了60 min会话。 在最近的7培训日，当50强化剂被收购时，会议终止。 在实验5中，如上所述，对于所有其他实验，在1 min会话中对大鼠进行FR2 / VR15时间表训练，但有两个例外。 首先，提供了最大数量的150颗粒/会话。 其次，这些动物接受5额外的训练天数（即，总共15 d），以允许在任何实验操作之前建立稳定的表现。
还以渐进比例的增强方案对动物进行食物响应测试。 在该测试中，获得食物的响应要求以FR1计划开始，但是逐渐增加2以获得随后的增强剂（即，1，3，5，7 ......，X + 2响应）。 在使用大鼠的药物治疗实验中，通过5逐步增加时间表，产生1，6，11，16 ......，X + 5的最终时间表。 所有其他参数保持与上面详述的训练程序相同。 当没有对5 min作出积极响应时终止测试。
增强剂贬值。
使用强化剂特定的喂食来检查增强剂贬值的影响。 在此之前，允许小鼠在3 h期间在其家笼中食用无限的基于谷物的食物颗粒，然后如上所述在增强的渐进比例计划上进行测试。
手术技巧.
使用Equithesin [含有戊巴比妥（35 mg / kg）和水合氯醛（183.6 mg / kg）在乙醇（10％v / v）和丙二醇（39％v / v）中的混合物麻醉动物; 以4.32 ml / kg，ip]给药。 使用Kopf立体定向设备，将套管（Plastics One，Roanoke，VA）手术植入NAc核心上方。 相对于前囟使用的立体定位坐标如下：前/后，+ 1.5 mm; 侧面/内侧，±1.5 mm; 腹侧/背侧，-6.0 mm（Paxinos和Watson，1986）。 使用螺钉和牙科粘固剂将套管固定到颅骨上。 将闭孔器放入导管中以防止阻塞。 手术后，对动物进行标准的术后护理，并允许在任何实验开始前恢复5 d。
输液。
在训练开始前双侧40 h进行病毒载体的脑内输注（见下文）。 注射注射器（31测量仪），在引导插管尖端下方延伸1 mm，同时缓慢降低到左侧和右侧NAc，并且1.0μl/侧在4微秒期间输注，输注速率为0.25μl/ min使用微量输注泵（PHD-5000; Harvard Apparatus，Holliston，MA）。 在输注完成后将输注针留在适当位置1 min，并更换假插管。 在行为实验完成后对套管放置进行组织学验证（参见图6B），并且在实验数据的统计分析中仅包括具有正确放置的套管的动物。
组织学分析和免疫染色。
在实验完成后，将作为实验一部分接受外科手术的动物用Equithesin麻醉，并根据标准程序用0.1 m PBS（5 min）和10％福尔马林（10 min）经心脏灌注。 将脑在福尔马林中后固定，随后置于磷酸盐缓冲的蔗糖溶液（30％）中。 然后在切片机上以40μm切片切割所有脑，并用于套管放置和蛋白质表达的组织学分析。
套管放置在用中性红复染的切片中，并在乙醇脱水后安装在二苯乙烯增塑剂和二甲苯（DPX）的显微镜载玻片上。 如前所述进行免疫组织化学（Hommel等，2003）。 简而言之，HSV-LacZ输注后β-半乳糖苷酶的表达通过使用山羊抗β-半乳糖苷酶一抗（1：5000; Biogenesis，Kingston，NH）的免疫荧光染色来确定。 过夜温育后，冲洗切片，随后与缀合Cy2的荧光驴抗山羊二抗（1：200; Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）一起温育。 再次洗涤切片，然后用乙醇脱水并固定在DPX中。 相邻处理相邻的对照切片而不包含一抗。 使用a在520 nm评估免疫荧光 蔡司 （德国Oberkochen）带有FITC滤光片的显微镜和在相同曝光时间下拍摄的图像 蔡司 Axiovision数字成像系统。
统计报表
使用单向，双向或三向方差分析，然后进行舍弗或邓内特的事后检验，对所有实验的数据进行评估，并在适当的情况下使用霍尔姆的顺序剔除检验对多个比较进行校正。 p≤0.05的值被认为具有统计学意义。
成果
实验1：重复药物暴露对器械性能和渐进比率响应的影响
为了证实我们的重复药物暴露范例产生功能上显着的神经适应，我们首先评估运动致敏作为慢性药物作用的原型行为测量。 大鼠每天注射两次尼古丁（0.35 mg / kg），MDMA（5 mg / kg），可卡因（15 mg / kg）或安非他明（2.5 mg / kg），并在第一次注射后测试运动活性。治疗日1和15（补充图1A-E，可在 www.jneurosci.org 作为补充材料）。 统计分析揭示了通过日间相互作用的显着治疗（F.(4,42) = 9.335; p≤0.0001）。 除MDMA（p = 0.62）外，与15天（尼古丁，p≤1;可卡因，p≤0.001;苯丙胺，p≤0.001）相比，所有药物在0.01日诱导显着更高的运动活性（即致敏）。 重复盐水注射没有效果。 没有一种药物治疗改变了在15日适应期间测量的基线运动活动（补充图2A，可在 www.jneurosci.org 作为补充材料）。
在最后一次注射药物后五天，我们检查了先前重复的尼古丁，摇头丸，可卡因或安非他明暴露对食物增强器械行为的影响。 每种药物的数据分别列出 图1A-H使用相同的盐水对照组进行比较。 我们发现，之前暴露于这些药物中的每一种都显着且有选择性地增加了食物增强的器械响应（训练日通过杠杆治疗，F(36,378) = 1.683; p≤0.01; 事后分析：尼古丁，p≤0.01; MDMA，p≤0.05; 可卡因，p≤0.01; 苯丙胺，p≤0.001）。 在渐近表现中观察到的仪器响应持续升高表明动机可能增强，与之前报告的反复精神兴奋剂暴露后的增加一致（见讨论）。 因此，我们测试了先前的重复药物暴露是否使用渐进比例计划增强了动机 先前药物暴露对主动杠杆的响应有统计学影响（杠杆相互作用治疗，F(4,42) = 3.340; p≤0.05）（图。 2A）以及最终断点（F.(4,42) = 5.560; p≤0.001）（图。 2B）。 另外的分析表明，所有处理都增加了活性反应的数量（尼古丁，p≤0.001; MDMA，p≤0.05;可卡因，p≤0.001;苯丙胺，p≤0.001）和断裂点（尼古丁，p≤0.001; MDMA） ，p≤0.01;可卡因，p≤0.0001;苯丙胺，p≤0.0001）与这些处理对动机的影响一致。 鉴于药物对基线运动活动缺乏影响，并且对无效杠杆按压没有影响，在这些条件下对食物的响应增加不太可能反映运动活动的非特异性增加。
图1。
先前对0.35 d每日两次重复注射尼古丁（2.5 mg / kg），MDMA（15 mg / kg），可卡因（2.5 mg / kg）或安非他明（15 mg / kg）对随后的器械行为的影响。 一起测试动物，但为了清楚起见，使用相同的盐水处理对照组分别呈现每种药物的作用。 A（主动反应）和B（无效反应）显示先前尼古丁暴露的影响; C，D，MDMA; E，F，可卡因; G，H，苯丙胺。 数据表示为平均值±SEM。
图2。
先前用生理盐水，尼古丁（15 mg / kg），摇头丸（0.35 mg / kg），可卡因（2.5 mg / kg）或苯丙胺（15 mg / kg）重复治疗（每天两次，每天2.5天）对仪器反应的影响逐步增加配比。 数据表示为平均值±SEM。 *** p <0.001； ** p <0.01； * p ＜0.05。 萨尔，盐碱； 尼古丁可可，可卡因; 安非他命，安非他明； 公关，进步比率。
以前的药物暴露对食物限制前，器械训练的第一天或最后一天，或在进行性比率测试之前记录的体重也没有影响（补充图2B，可在 www.jneurosci.org 作为补充材料）。 3 d限制食物进入最初将体重减少到平均91-92％的自由进食重量。 在行为测试结束时，体重已经恢复到预限制体重的97-99％，并且在药物暴露的和盐水处理的动物之间没有观察到差异。 因此，体重的改变以及饥饿或食欲的差异不应对观察到的器械表现或动机的增强作出显着贡献。
实验2：转基因小鼠中ΔFosB的诱导性过表达; 工具性能
我们接下来检查了在转基因小鼠中器官性能是否也增加，其在NAc和背侧纹状体中具有显着的选择性诱导过度表达ΔFosB（Kelz等人，1999）。 在该实验中，将ΔFosB过表达小鼠与不过度表达ΔFosB的同窝对照进行比较，因为它们维持在多西环素上（参见材料和方法）。 我们发现ΔFosB的过表达显着增加了食物强化的反应（通过训练日的杠杆基因表达，F(9,126) = 3.156; p≤0.01）（图。 3一个）。 在非活动孔径中做出的鼻子反应的数量在两组之间没有差异（图。 3B）。 总之，这些数据表明NAc和背侧纹状体中ΔFosB的过度表达选择性地提高了器械性能
图3
转基因小鼠诱导纹状体过度表达ΔFosB对器械性能的影响。 A，主动回应。 B，不活跃的回应。 数据表示为平均值±SEM。
为了排除ΔFosB过表达动物的器官表现的增强可以通过食欲或饥饿的改变来解释，在食物限制之前以及训练的第一天和最后一天记录体重。 ΔFosB在食物限制前对体重没有影响，在行为测试期间也没有对体重的影响。 在这里，限制食物进入3 d将体重减少到平均87-89％的自由进食重量。 在行为测试结束时，动物体重是预先限制体重的97-99％，在ΔFosB和对照小鼠中观察到相同的变化（补充图片3A，可在 www.jneurosci.org 作为补充材料）。 因此，ΔFosB过表达对饥饿或食欲的潜在影响不太可能导致观察到的仪器响应的增强。
当仪器性能测试完成后，ΔFosB过表达不会改变30最小时期内测量的基线运动活性（补充图3B，可在 www.jneurosci.org 作为补充材料）。 该观察结果支持这样的观点，即活性的非特异性改变不会有助于在这些动物中观察到的增强的器械性能。 然而，据报道ΔFosB过表达的转基因小鼠对急性和重复的可卡因表现出增强的运动反应（Kelz等人，1999）。 因为我们使用稍微不同的从多西环素中撤出以诱导基因表达的计划（6周与食物限制），我们开始确认这种表型。 实际上，ΔFosB过表达小鼠在注射可卡因时表现出明显更大的运动活性增加与在多西环素上维持的同窝对照相比（通过基因表达进行治疗，F）(1,44) = 4.241; p≤0.05）（补充图.3C，可在 www.jneurosci.org 作为补充材料）。
实验3：转基因小鼠中ΔFosB的诱导性过表达; 进步比率
鉴于先前的药物暴露诱导纹状体ΔFosB（Nestler等，2001并且在这里发现增加进行性比率响应，我们接下来测试ΔFosB的转基因纹状体过表达是否也增加了渐进比例增强的表现。 一组新的小鼠在条件下进行仪器响应训练（参见材料和方法），在测试渐进比率响应之前，仪器性能没有显着差异（F(1,16) <1）。 但是，在渐进比率测试中，我们观察到通过杠杆相互作用引起的显着基因表达（F(1,16) = 5.30; p≤0.05）（图。 4A）发现ΔFosB过表达小鼠与维持强力霉素的同窝对照小鼠相比，产生了更多的活性反应（p≤0.05），而无活性杠杆反应的数量没有差异。 ΔFosB过表达的小鼠也达到了更高的断裂点（F(1,16) = 5.73; p≤0.05）（图。 4B）。 这些数据表明，与之前的精神兴奋剂暴露一样，ΔFosB的纹状体过度表达增加了动力。 因为在ΔFosB过表达小鼠中无活性反应的数量没有改变，所以活性的非特异性增加不可能促成这些效应。 基线运动活性的评估进一步支持了这一观点，其中在过量表达ΔFosB的小鼠和在多西环素上维持的同窝对照小鼠之间没有差异。 在测试当天测量，ΔFosB过表达和对照动物之间的体重没有显着差异。 因此，尽管ΔFosB过表达的动物会发出更多以食物为动机的器乐反应，但它们在免费提供时似乎不会消耗更多的食物。 对这一观察结果最可能的解释是，尽管动机决定了动物获得强化物的力度，但许多其他因素（食欲，饱腹感，代谢状态等）会影响摄食行为和食物的实际消耗。
图4。
在饱腹感引起的增强子贬值之前和之后，双转基因小鼠中FosB的诱导型过表达对增强器进行反应的仪器响应的影响。 A，B，基线：杠杆响应（A），断点（B）。 C，D，在增强材料贬值之后：杠杆响应（C），断裂点（D）。 数据表示为平均值±SEM。 * p ＜0.05。
这里使用的ΔFosB转基因小鼠在整个纹状体中表达ΔFosB。 虽然腹侧纹状体（包括NAc）与动机过程有关，但背侧纹状体被认为参与了器乐习惯的获得（Yin等人，2004; Faure等，2005）。 虽然我们没有观察到在训练阶段使用低比率时间表和最大加固限制的仪器性能差异，但条件相对抵抗了器乐习惯的发展（迪金森，1985），习惯的建立可能会影响累进比率计划下的响应。 通过评估通过预先进行的累进比率响应来评估强化物贬值的影响，直接测试了这种可能性。 这种喂食消除了ΔFosB对进行性比率反应的影响，在ΔFosB过表达和对照小鼠之间观察到的反应或断裂点没有差异（F(1,16) <1）（图。 4光盘）。 总之，这些数据表明，ΔFosB的纹状体过度表达并未改变使用该测试计划对奖励结果值变化的敏感性。 相反，在渐进比率测试中观察到的仪器响应似乎是目标导向的，并且在ΔFosB过表达小鼠中观察到的增加的断裂点可能归因于增强的动机而不是升高的习惯样响应。
实验4：病毒介导的NAc核心中ΔFosB的过表达：仪器性能
为了评估在NAc中选择性地ΔFosB过表达是否可以解释在转基因小鼠中观察到的行为，我们将HSV-ΔFosB或HSV-LacZ作为对照选择性地注入大鼠的NAc核心并研究该操作对食物的影响。 - 增强乐器演奏（图。 5A，B）。 在杂志训练之后，HSV-ΔFosB或HSV-LacZ在行为测试开始之前被注入NAc核心40 h。 输注的位置和病毒介导的基因表达的程度显示在 图6，A和B.对HSV-ΔFosB的NAc输注产生了活性反应数量的持续增加（基因表达由杠杆，F(1,12) = 8.534; p≤0.05）（图。 5A），在整个实验过程中持续存在。 这些影响具有选择性，因为NAc核心内ΔFosB过表达对非活性反应数量没有显着影响（图。 5B）或基线运动活动在实验完成后的第二天记录（数据未显示）。 因此，NAc中ΔFosB的过表达模拟了先前药物暴露或纹状体过度表达ΔFosB的行为效应。
图5。
在仪器响应训练前输注HSV-ΔFosB对NAc核心的影响。 A，主动回应。 B，不活跃的回应。 数据表示为平均值±SEM。
图6。
A，用于病毒载体实验的输注位点的放置。 顶部，填充的黑色圆圈对应于预期的输注部位。 只有在〜内进行输液如圆圈所示，该区域的0.5 mm（即，在NAc核心内）被认为是可接受的。 在该区域之外进行输注的动物被排除在统计分析之外。 底部，NAc内的代表性动物的输液部位。 B，输注HSV-LacZ后蛋白质表达的免疫组织化学验证。 上图显示NAc核心内的β-半乳糖苷酶表达（2.5和10×放大倍数）。 下图显示使用相同的免疫组织化学方法在相邻对照切片中缺乏免疫荧光，而不包含第一抗体。
实验5：病毒介导的NAc核心中ΔFosB的过表达：进行性比率
最后的实验直接确定了使用病毒介导的基因转移方法在NAc核心中限制性过表达ΔFosB是否足以增强大鼠的动力。 在这里，HSV-ΔFosB仅在完成器械训练后输注，消除了训练期间ΔFosB过表达对随后的进行性比率测试的任何潜在影响。 像以前一样训练一组新的大鼠，并根据他们在训练最后几天的表现分成平衡的实验组。 动物随后接受HSV-ΔFosB或HSV-LacZ的双侧输注到NAc核心中，并且在过表达的5 d后进行累积比率测试。 统计分析显示通过杠杆相互作用显着的基因表达（F.(1,12) = 14.91; p≤0.01）（图。 7一个）。 输注HSV-ΔFosB的大鼠与输注HSV-LacZ的大鼠相比产生更多的主动反应（p≤0.01），而对无活性杠杆的反应不受影响。 与此增加一致，输注HSV-ΔFosB的大鼠也具有更高的断裂点（F(1,12) = 18.849; p≤0.001）（图。 7B）比注入HSV-LacZ的动物。 在进行性比率测试之前，ΔFosB对测试1 h的基线运动活性没有影响（补充图4A，可在 www.jneurosci.org 作为补充材料）。 在进行性比率测试的当天，体重也没有差异（补充图片4B，可在 www.jneurosci.org 作为补充材料）。 这些发现支持了我们对转基因ΔFosB过表达小鼠的观察，并表明在NAc中选择性过表达ΔFosB足以增强与食物相关的动机。
图7。
测试前5 d输注HSV-ΔFosB对仪器的反应性（按逐步进行的配筋比例）的影响。 A，杠杆反应。 B，断点。 数据表示为平均值±SEM。 *** p <0.001； ** p <0.01。
讨论
本研究表明，NAc中ΔFosB的过度表达增强了食物增强的器乐行为河 之前暴露于可卡因，安非他明，摇头丸或尼古丁增强使后续器乐表现持续增加。 这些药物暴露也在渐进的强化比例表下增加了食物动机行为. 使用可诱导的转基因（NSE-tTA×TetOP-ΔFosB）小鼠或使用新型病毒载体在NAc中选择性地表达ΔFosB，通过在纹状体中限制性过表达ΔFosB来模拟先前药物暴露的这些作用。。 值得注意的是，在已经获得仪器响应之后，NAc核心中ΔFosB的过表达增强了在渐进比例计划下的食物动机。 总之，我们的研究结果确定了NAc核心中的ΔFosB作为药物诱导的神经适应的潜在介质，可以促进器官行为，扩展该转录因子的作用，包括与对食物增强行为表现的动机影响相关的过程。 他们还提出了诱导NAc中ΔFosB表达的条件可能影响天然和药物增强剂的动机特性的可能性。.
在慢性但非急性暴露于滥用药物后，ΔFosB在表达强啡肽的中等多刺神经元中累积NAc和背侧纹状体。 这种区域表达模式在这里使用的可诱导的转基因ΔFosB过表达小鼠中复制。 在这些老鼠中， 通过条件性位置偏爱测量，升高的纹状体水平ΔFosB可增加动物对可卡因和吗啡的敏感性 (Kelz等人，1999; Zachariou等，2006）。 它还增加了对可卡因的进步比率的反应，这表明纹状体ΔFosB过表达增强了自我管理可卡因的动机（Colby等，2003）。 在这里，我们发现这些小鼠中的纹状体ΔFosB过表达也增加了对食物增强剂的反应的进展比率，并且这些效果通过在大鼠的NAc核心中受限的病毒介导的ΔFosB的过表达而再现。 我们的数据表明，ΔFosB可能作为初级强化物的动力转录调节剂，无论是食物，药物还是运动，这一观点与慢性车轮运动或蔗糖饮用后ΔFosB的纹状体表达增加的初步观察一致（McClung等，2004). 这些数据表明，NAc过度表达ΔFosB可以增强天然和药物强化剂的动机影响。
NAc的子区域被认为可以区别地调解pavlovian或工具激励过程对工具性能的影响 (Corbit等人，2001; de Borchgrave等，2002），对器械性能的更一般的动机影响可能由其他区域编码，如杏仁核的中央核 (Corbit和Balleine，2005）。 然而，NAc核心也被提议成为获得目标导向的器乐学习的关键场所（Smith-Roe和Kelley，2000; Baldwin等，2002a,b; Kelley，2004）。 我们显示先前药物暴露和转基因纹状体ΔFosB过表达对增强仪器行为的等效影响。 限制在NAc核心的HSV-ΔFosB输注也增加了食物增强的仪器响应。 尽管这些实验并未排除背侧纹状体在这些行为中的贡献，但它们强烈表明ΔFosB诱导的NAc内基因表达的改变足以增加食物激发的反应。 因为在先前已经达到稳定的乐器演奏之后表达ΔFosB时，渐进比率响应也得到了增强，因此似乎可能会激发对乐器行为的激励作用。 然而，我们的操纵也会影响乐器学习过程的可能性不能完全排除。 为了支持我们的结论，先前口服可卡因暴露后观察到器械性能的提高（Miles等，2004）一直被认为涉及动机改变与慢性尼古丁治疗的能力一致，以增加小鼠的进行比率反应（Brunzell等，2006). 此外，多巴胺转运蛋白敲除小鼠，其中细胞外多巴胺水平增加，显示出增强的ΔFosB免疫反应性和食物强化动机，但没有改变学习（Cagniard等，2006). 此外，我们发现，当食物被喂食“贬值”时，小鼠纹状体ΔFosB的过度表达不影响表现。 这些数据表明，动物对强化剂的动机价值敏感，并且响应是目标导向的.
之前的重复药物暴露也可以增强与天然增强剂相关的条件刺激所施加的行为控制，通过pavlovian方法测量（Harmer和Phillips，1998; 泰勒和Jentsch，2001; Olausson等人，2003），条件强化（泰勒和霍格，1999; Olausson等人，2004）和pavlovian-to-instrumental transfer（Wyvell和Berridge，2001）。 现在有令人信服的证据表明，与壳相反，NAc核心参与了帕洛维亚条件刺激对药物激发行为的控制（Parkinson等，1999, 2002; Hall等，2001; Dalley等，2002; Ito等，2004）。 我们的结果可能表明药物诱导的NAc中ΔFosB的诱导可能是这些程序中行为控制得到增强的一种机制。 作为条件强化物的帕夫洛条件刺激也可能有助于目前的行为效果。 通过纹状体ΔFosB的增加介导的这种条件刺激对行为的增强控制也可能有助于蛋白质对药物诱导的条件性位置偏爱的影响。 (Kelz等人，1999; Zachariou等，2006）和可卡因的累进比率（Colby等，2003）。 已经假设动机过程的改变有助于成瘾行为的发展和维持（Robinson和Berridge，1993; Jentsch和Taylor，1999; Robbins和Everitt，1999; Nestler，2004）。 目前的数据也与强调成瘾行为中的多种工具和帕夫洛文过程的其他理论一致（Everitt和Robbins，2005）。 现在需要进一步的工作来确定药物和ΔFosB诱导的神经适应在NAc和其他边缘 - 纹状体亚区域中的作用，这些因素可能有助于器官表现并促成强迫行为的特定联想或动机因素。
尽管NAc中的变化影响由初级或条件强化物驱动的行为的精确分子机制尚不清楚（Kelley和Berridge，2002），NAc的GABAergic中型多刺神经元被认为是药物和经验依赖性可塑性的关键底物。 在这里，来自腹侧被盖区的多巴胺能输入和来自皮质输卵管传入的谷氨酸能输入会聚到常见的树突和树突棘上。 (Sesack和Pickel，1990; 史密斯和Bolam，1990）。 慢性精神兴奋剂暴露 增加NAc壳和核心中神经元上的这种刺的密度 (Robinson和Kolb，1999; Robinson等，2001; Li等人，2003, 2004）。 最近，行为致敏的诱导与NAc核心内树突棘的增加有关（Li等人，2004）。 值得注意的是，可卡因引起的脊柱密度增加仅在D中持续存在1共表达ΔFosB的阳性神经元（Robinson和Kolb，1999; Lee等人，2006). 因此，NAc核心中的ΔFosB可能导致持久的突触可塑性，这可能影响器械行为. 实际上，多巴胺 - 谷氨酸神经传递的关键作用（Smith-Roe和Kelley，2000），蛋白激酶A活性（Baldwin等，2002a）和从头合成蛋白质（Hernandez等，2002在先前已经报道了NAc核心内的仪器性能。 我们现在将ΔFosB鉴定为转录因子，其在NAc核心中过表达时可持续增强食物强化响应。 涉及这些作用的特定基因或蛋白质仍有待精确定义。 ΔFosB调节参与神经可塑性的NAc中多种蛋白质的表达 (McClung和Nestler，2003）。 最近的微阵列分析表征了在此使用的表达ΔFosB的转基因小鼠的NAc中的基因表达模式，并鉴定了由ΔFosB的相对短期表达调节的基因子集（McClung和Nestler，2003）。 BDNF就是这样一种基因，已知这种神经回路中的BDNF可以增强对药物和食物相关线索的响应（Horger等，1999; Grimm等，2003; Lu等人，2004）。 另一个感兴趣的基因是 细胞周期蛋白依赖性激酶5（Bibb等，2001），也是由ΔFosB引起的， 并且可以调节可卡因诱导的结构可塑性（Norrholm等，2003通过对自然或药物强化物的渐进比率响应测量的动机（JR泰勒，未发表的观察结果）。 另外的候选物是AMPA谷氨酸受体的GluR2亚基 (Kelz等人，1999）和转录因子NFκB（核因子κB）（Ang等人，2001）。 评估NAc亚区域中的这些和其他受调节的蛋白质作为调节ΔFosB对器械性能和动机的行为影响的候选者将是重要的。
目前的一系列实验提供的证据表明，NAc中ΔFosB的过度表达可以增强食物动机行为，从而调节器官表现，正如之前已经证明的药物奖励。 这些数据提供了新证据，表明ΔFosB可以作为一般分子开关，与强化目标导向行为的激励方面的增强相关联。 我们的研究结果提出，通过上瘾药物，压力或高回报食物诱导NAcΔFosB可能是一种关键机制，通过这种机制，功能失调的动机状态会导致与强迫行为相关的精神疾病。.
脚注
o 收到了三月15，2006。
o 修订于6月收到23，2006。
o 8月接受2，2006。
这项工作得到了国家药物滥用研究所，国家精神卫生研究所和国家酒精滥用和酒精中毒研究所的资助。 我们非常感谢Daleja Krueger，Drew Kiraly，Ralph DiLeone博士，Robert Sears和Jonathan Hommel博士在耶鲁大学精神病学系的宝贵帮助。 我们也感谢Jennifer Quinn博士和Paul Hitchcott博士对本手稿提供了有益的评论。
通讯应发给Jane R. Taylor，耶鲁大学医学院分子精神病学系精神病学系，康涅狄格州心脏健康中心Ribicoff研究设施，34 Park Street，New Haven，CT 06508。[电子邮件保护]
版权所有©2006神经科学学会0270-6474 / 06 / 269196-09 $ 15.00 / 0
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