Behav Brain Res。 作者手稿; 可在PMC 2015 Jun 5中找到。
以最终编辑形式发布为：
Behav Brain Res。 2014 Apr 1; 262：101-108。
在线发布2014 Jan 7。 DOI： 10.1016 / j.bbr.2013.12.014
PMCID：PMC4457313
NIHMSID：NIHMS554276
抽象
该研究确定了青少年尼古丁给药对大鼠表现出对新环境具有高或低行为反应性的成人酒精偏好的影响，并确定尼古丁是否在给药后立即改变腹侧纹状体（vStr）和前额皮质（PFC）中的ΔFosB或大鼠成熟到成年后。
动物的特征是在出生后的新开放区域（PND）31中表现出高（HLA）或低（LLA）运动活性，并且从PND 0.9接受盐水（0.56％）或尼古丁（35 mg游离碱/ kg）的注射。 -42。 在有偏见的范例中，在68天调节后，在PND 8上评估乙醇诱导的条件性位置偏爱（CPP）; 在PND 43或PND 68上测量ΔFosB。 青春期尼古丁暴露后， 当用乙醇调理时，HLA动物表现出CPP; LLA动物未受影响. 此外，8天的青少年尼古丁暴露增加了HLA和LLA大鼠边缘区域中ΔFosB的水平，但是这种增加仅在LLA动物中持续到成年期。
结果表明青少年尼古丁暴露有助于在HLA大鼠中建立乙醇CPP，并且ΔFosB的持续升高对于在成年期建立乙醇CPP不是必需的或足够的。 这些研究强调了在确定青少年尼古丁暴露的行为和细胞效应时评估行为表型的重要性。
1. 简介
大量研究表明，高寻求新奇和探索与药物奖励的敏感性增加有关[1–8]。 青少年已被证明比成年人表现出更大的新奇寻求和探索[9–11]，有几份报告表明青少年在开始吸毒时比成人更容易上瘾[12–18]。 因此，青少年可能更容易受到滥用药物的强化和奖励影响，具有高度寻求感觉的青少年可能代表最脆弱的人群。
青少年最常用的两种药物是尼古丁和酒精[19, 20]，有证据表明使用尼古丁会影响酒精的摄入量。 吸烟和饮酒行为经常一起发生，其中任何一种行为的频率与另一种行为的频率相关[21]。 格兰特[22据报道，在29年龄之前开始吸烟的人中，几乎14％的人在其一生中成为酒精依赖者和8％进展为酗酒。 此外，在19和14之间开始吸烟的人中的16％变为酒精依赖性，其中7％的这些个体进展为酒精滥用。 有趣的是，直到17年龄才开始吸烟的人患酒精依赖或成瘾的可能性降低一半。 因此，早发性吸烟是终生饮酒，酒精依赖和滥用的强有力预测指标[22].
青少年尼古丁暴露已被证明可以增加成人实验动物中几种药物的奖赏效果，包括尼古丁，可卡因和地西泮[23–26]。 此外，Riley等人。 [27]证明在青春期，但不是成年期给小鼠施用尼古丁，在成年期测量时增加对乙醇戒断的敏感性，并且表明青春期代表对尼古丁敏感的关键时期，导致持续到成年期的大脑变化。 一些研究表明青少年接触尼古丁会导致成年期的焦虑状态[这种观点得到支持]28–30]。 青少年尼古丁暴露后持久性改变可能涉及转录因子ΔFosB，已显示其对中脑边缘通路产生持续致敏作用，并提高对几种滥用药物（包括酒精）的动机特性的敏感性[31–34]，并且其在边缘系统中的过度表达增强了药物的偏好[31, 35]。 有趣的是，青少年动物在伏隔核（NAcc）中响应给予可卡因或安非他明的ΔFosB表现出比成人更大的增加[36]。 尚未研究青春期尼古丁给药对ΔFosB的影响。 由于青少年动物相对于成年人对滥用药物的反应表现出ΔFosB的增强调节，因此他们可能对反复接触后的奖励刺激比对类似暴露的成人更敏感。 研究表明，在4注射后建立尼古丁诱导的条件性位置偏爱（CPP）的青春期大鼠在腹侧被盖区（VTA）中表现出FosB免疫反应性增加（ΔFosB剪接变体没有特别测量）， NAcc和前额叶皮层（PFC）在行为测试后立即进行[37].
尽管有证据表明青春期是寻求感觉增加和首次使用药物的时期，但使用尼古丁与乙醇使用增加有关，并且对滥用药物的敏感性增加与ΔFosB积累有关[31]，青少年尼古丁暴露对ΔFosB水平的影响及其对乙醇回报的长期影响尚不清楚。 因此，本研究：1）通过对新环境的行为反应，即表现出高或低的运动活动，确定青少年尼古丁给药对青春期大鼠成年酒精偏好的影响。 和2）确定尼古丁是否在青春期后或在成熟到成年后立即改变这些动物的腹侧纹状体（vStr）和PFC中的ΔFosB。
2。 方法
2.1材料
乙醇从AAPER Alcohol and Chemical Company（Shelbyville，KY）获得。 除非另有说明，否则所有其他试剂均购自Sigma-Aldrich Life Sciences（St.Louis，MO）。
2.2主题
将定时怀孕大鼠（n = 89）的雄性和雌性后代（n = 10）用作受试者; 出生日定义为出生后日0（PND 0）。 为了确保小窝的类似发育，所有猫科动物都在PND 10上淘汰12-5幼仔（6-5雄性/ 6-1雌性），并保持与各自的水坝一起饲养至PND 21，此时动物断奶并安置在具有玉米芯床上用品的标准聚丙烯笼中的3的相同性别组中。 在12：12-hr光 - 暗循环（7am / 7pm）下，将所有动物饲养在南佛罗里达大学的温度和湿度受控的动物饲养箱中。 在轻度阶段进行实验，并且动物的护理和使用符合机构动物护理和使用委员会以及美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南。 根据这些指南，实验利用每组最少数量的动物来获得有意义的数据。
2.3对新环境行为反应的表征
运动活动用于表征大鼠对新环境的行为反应性。 为了实现这一点，在PND 31上，将动物从它们的笼子中取出并在中等照度（100 lux）下放置在圆形场地（20 cm直径）中5 min。 使用视频摄像机自动记录移动的总距离（TDM），并使用EthoVision软件（Noldus Information Technology，Leesburg，VA）进行分析[如[38]。 使用中值分裂策略将动物分类为在新的开放场中表现出高（HLA）或低（LLA）运动活性，前者在上部50％中表现出活性，后者在相对于它们的较低50％中表现出活性。同窝[4].
2.4尼古丁注射剂
在PND 0.9开始的0.56或4天，动物每天一次注射（sc）磷酸盐缓冲盐水（PBS，8％）或PBS中的烟碱氢酒石酸氢盐（35 mg游离碱尼古丁/ kg）。 这种剂量的尼古丁已被证明可以增加对条件刺激的反应[39, 40]并增加断点以加强响应[41]表明它是有益的和强化的，并用于先前的青少年研究[38]。 对于每次注射，将动物在其家笼中运送到昏暗的手术室，放置在衬有新鲜床上用品的新笼子中，注射并返回其家笼。
2.5条件性位置偏好（CPP）
对于CPP的测量，大鼠在PND 35，PND 42，动物（n = 18;每组60-40）接受最后一次注射尼古丁后PND 4-5和21天注射尼古丁，允许自由进入两个相互连接的Plexiglas室（每个腔室：18厘米宽×21厘米长×5厘米高），包含三个8最小间隔的独特视觉（垂直或水平黑白条纹）和触觉提示（橡胶处理或砂纸地板）。 在设备每侧上花费的平均时间用于确定每只动物的基线室偏好。 虽然每只动物在基线时都表现出侧向偏好，但在群体内没有优先选择特定腔室的趋势。 在接下来的61天，从PND 68到17，使用偏向调节范例，其中训练动物以使非优选室与乙醇的主观效果相关联。 为了调理，每只动物接受乙醇注射（1.0％; 15 g / kg，ip），随后将其限制在最初非优选的室中XNUMX min。 这种剂量和浓度的乙醇已被证明可以在青春期后期建立CPP [42并显着提高青少年和年轻成年动物NAcc中的多巴胺[43, 44]。 在注射盐水（15％，ip）后，将对照动物的0.9 min限制在最初非优选的室中。 乙醇调节的动物和对照动物在每天被限制在最初优选的室内15 min之前接受盐水注射。 因此，每只动物每天接受2训练，一次用于最初的非优选，一次用于优选的室。 这些会议的顺序在每天交替进行，发生在上午和下午，相隔至少5小时。 在PND 69上，在最后一次训练后大约16-18小时，允许动物自由进入两个室以进行5分钟，并测量在每个室中花费的时间以评估CPP。 通过从最初非优选腔室中花费的时间减去在最初优选的腔室中花费的时间来计算偏好分数。
2.6 Western Blot分析
对于免疫印迹分析，大鼠快速断头并且在PND 24或4上分别注射8th或39th尼古丁后，vStr和PFC分离43小时（n = 32;每组4）或在PND上注射26后8天69（n = 16;每组4），对应于在单独的一组动物中评估CPP的那天。 将组织在干冰上快速冷冻并储存在-80℃直至均匀化，如[38]。 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（10％聚丙烯酰胺）分离蛋白质，并电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上。 在含有1％Tween 0.1和20％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水中将膜封闭5小时。 随后，一抗[FosB（5G4）#2251，1：4000; Cell Signaling，Danvers，MA]，产生强大的ΔFosB标记[45在封闭溶液中加入]，并将膜在4℃下温育过夜。 16小时后，将膜洗涤并与二抗[山羊抗兔IgG-HRP，1：2000，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA]在室温下在封闭溶液中孵育1小时，并且信号使用增强的化学发光可视化。 免疫检测后，剥离印迹，封闭并与针对β-微管蛋白[H-235，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，1：16,000]的一抗作为上样对照温育。 使用光密度计和Un-Scan-It凝胶数字化软件（Silk Scientific Inc.，Orem，Utah）在每个印迹上定量代表ΔFosB的35 / 37 kDa条带和对应于β-微管蛋白的50 kDa条带。 对于每个样品，将前者的光密度标准化为后者，并且结果表示为每个印迹上相应盐水对照的百分比，以消除印迹之间的可变性。
2.7统计分析
使用四因素方差分析（ANOVA）确定对CPP的影响[（男性或女性）×（HLA或LLA）×（盐水或尼古丁暴露）×（盐水或乙醇调理）]，事后使用Tukey检验确定组之间的显着差异。 三因素方差分析用于确定雄性和雌性HLA和LLA动物[（雄性或雌性）×（HLA或LLA）×（盐水或尼古丁）]之间的ΔFosB差异，并在事后进行了学生t检验，以确定组之间的差异。 p <4的水平被认为是显着效果的证据。 由于这些研究中的样本量很小，导致统计功效，效应量降低
3。 结果
3.1对新环境的行为反应
青少年大鼠在新的5 min开放场中表现出的运动活动如图所示 图1。 TDM呈正态分布（Kolmogorov-Smirnov D = 0.083，p> 0.05），动物的活动范围在4339至7739 cm / 5分钟之间。 TDM的中位数为5936 cm / 5 min，其中一只动物处于中位数（灰色圆圈所示），将其从进一步研究中删除。 HLA和LLA组的TDM显着不同[t（86）= 12.15，p <0.05； Cohen D = 2.56]，HLA动物的TDM为6621 TDM±71 cm / 5 min，LLA动物的TDM为5499±59 cm / 5 min。 根据对新环境的行为反应将动物系统地分为实验组，以确保所有组在新的野外活动中表现出同等的能力，并包含相同数量的HLA和LLA动物（表1）。 此外，给予每组不超过给定垫料的1雄性和1雌性。
青春期后尼古丁暴露后成年期的3.2乙醇CPP
第一组实验确定青春期的尼古丁暴露是否增加了对成年期酒精的奖赏效应的脆弱性，并确定反应是否依赖于大鼠对新环境的行为反应性。 在将大鼠分类为HLA或LLA后，当大鼠是PND 35上的年轻成人时，动物接受来自PND 42-69的盐水或尼古丁的注射，以及CPP对乙醇的注射。 结果显示在 图2。 方差分析表明，新的开放野外活动（HLA或LLA），尼古丁暴露和乙醇调节之间存在显着的三向相互作用[F（3）= 1,19，p <5.165]，观察到的功效为0.05，估计的效果尺寸
重复尼古丁暴露期间青春期的3.3ΔFosB
因为边缘结构中ΔFosB的增加增强了药物的偏好[15,16]，实验确定青少年尼古丁暴露是否对来自HLA和LLA大鼠的vStr和PFC中的该转录因子的水平具有不同的影响。 在行为分类后，雄性和雌性大鼠在PND 4开始接受8或35天的盐水或尼古丁注射。 分别在PND 24或39上最后一次注射后43小时分离脑样品，并进行Western免疫印迹分析。 vStr中ΔFosB测量结果（图3）表明两种注射天数的显着主要作用[F（1，16）= 4.542，p <0.05;
青春期后尼古丁暴露后成年期的3.4ΔFosB
为了确定在青春期观察到的ΔFosB中尼古丁诱导的升高是否持续到青年期，在大鼠的行为分类后，动物在PND 8-35注射生理盐水或尼古丁42天，在PND 27注射69天，分离vStr和PFC并量化ΔFosB。 vStr中ΔFosB测量结果（图4）表明两种表型的显着主要作用[F（1，16）= 14.349，p <0.05;
4。 讨论
本研究表明，青春期暴露于尼古丁对乙醇CPP的差异有不同的影响，并且在具有不同行为反应性的大鼠的边缘区域中ΔFosB的改变对新环境有影响。 青少年尼古丁暴露促进了成年期乙醇CPP的建立，仅在青春期新环境中表现出高运动活性的动物中。 此外，尽管青春期尼古丁暴露在施用8天后增加了vStr和PFC中ΔFosB的水平，但是这种增加仅在新环境中表现出低运动活性的动物中持续到成年期。
因此，结果表明青少年尼古丁暴露对成年期乙醇CPP的影响取决于动物的行为表型，并且表明边缘区域中ΔFosB的持续升高对于促进成年期的乙醇CPP不是必需的或不足的。
青少年尼古丁暴露促进HLA动物成年期CPP乙醇的发现与新发现的行为反应性增加的个体对滥用化合物的奖赏效果比反应性较低的个体表现出更大的敏感性的发现一致[1–8]。 然而，应该注意的是，CPP可以通过在调理期间加强特定行为或由条件性药物作用产生[47因此，在将CPP结果解释为药物奖励提高时，应谨慎使用。 的确，史密斯等人。 [48在青少年尼古丁暴露后，未观察到成年Sprague-Dawley大鼠乙醇摄入量增加，这表明乙醇的有益特性并未因先前的尼古丁经验而改变。 然而，这些作者在21天使用连续暴露范例，并且在新环境中没有根据运动活动区分动物。 本研究的结果表明，每日注射尼古丁的后果可能与持续尼古丁暴露产生的后果不同，并证明区分HLA和LLA大鼠的重要性，这一区别在研究青少年时可能尤为重要。 虽然许多研究者报告说青少年人群可能对药物的奖赏和补强作用更敏感[49–51]，这一观察结果可能反映了青少年具有HLA动物特征的发展趋势[10]。 事实上，对人类群体的研究已经证明，在青春期寻求感觉高峰并且之后会下降，那些保持青春期感觉的人最容易使酒精使用升级[52].
结果表明青少年尼古丁暴露对来自HLA和LLA大鼠的脑中ΔFosB的不同影响强调了这些动物组之间的固有差异。 结果显示，在青少年尼古丁暴露的8天后，来自两组大鼠的vStr和PFC中ΔFosB水平明显增加，但是这种效应仅在来自LLA大鼠的脑中持续到成年期。 Soderstrom等人。 [53]证明，在最后一次尼古丁注射后10天，来自PND 0.4-34的43天尼古丁暴露（37 mg / kg，ip）增加了NAcc中的FosB免疫反应性，但是这些作者没有特异性地测量ΔFosB或表征其行为表型。这些动物。 结果表明仅在LLA青少年中发生青少年尼古丁暴露后ΔFosB的长时间升高表明LLA青少年比其HLA对应物更像“成人样”。 实际上，已经在成年动物中反复证明了给药后ΔFosB的持续升高[31, 33, 34].
预计在青春期暴露于尼古丁的HLA动物将证明在成年期乙醇诱导的CPP和ΔFosB的持续升高，其可能使奖赏途径敏感。 然而，结果表明青少年尼古丁暴露后ΔFosB持续升高既不是必要的，也不足以在成年期建立乙醇CPP。 因为本研究中使用的偏向CPP范例对乙醇的抗焦虑作用敏感[54, 55]，青少年烟碱暴露后观察到的乙醇诱导的CPP可能是由对乙醇抗焦虑作用的敏感性变化所介导的，而不是由致敏的奖励途径所致。 青春期暴露于尼古丁的成年动物对成年后的压力和焦虑表现出更高的敏感性，皮质酮的升高证明了这一点[28]，降低了对新高原开放场的探索，减少了高架十字迷宫张开臂的时间[29, 30]。 因此，由于乙醇的抗焦虑特性，作为青少年暴露于尼古丁的成年动物可能在偏向范例中表现出乙醇CPP。 有趣的是，表现出ΔFosB表达升高的动物可能对压力和焦虑不太敏感，这表现为在高架十字迷宫的张开臂中花费的时间增加[56]，增加Porsolt强迫游泳测试的游泳时间[56]，社会失败压力后的弹性增强[57和减少皮质酮对束缚应激的反应[58]。 因此，暴露于尼古丁的LLA动物，其作为成人表现出持续的ΔFosB表达，可能没有发现乙醇奖赏的抗焦虑作用，因此，在偏倚范例中不能表现出CPP。 实际上，与注射盐水的LLA动物相比，注射乙醇的LLA动物在乙醇配对侧所花费的时间显示出大的减少（D = 0.80），提示乙醇诱导的条件性位置厌恶。 需要进一步研究以确认HLA和LLA动物在青少年尼古丁暴露后的焦虑行为和压力敏感性之间的差异。
虽然在雄性和雌性动物之间没有观察到统计学上显着的差异，但是存在一些中度到大的性别相关效应。 在25盐水注射后，男性青少年PFC中的ΔFosB测量值比女性青少年低约4％，19尼古丁注射后男性青少年4％高于女性青少年，表明青少年男性在暴露次数较少后可能表现出ΔFosB增加尼古丁比青春期女性。 另外，ΔFosB测量值在成年雄性的vStr和PFC中比在成年雌性中观察到的15-17％高，无论这些动物是否暴露于作为青少年的盐水或尼古丁。 后一发现与一项报告一致，该报告证明成年雄性在伏隔核和壳区域的ΔFosB水平略高于雌性对应物，并且这种差异存在于注射生理盐水或可卡因的动物中（15 mg / kg）对于2周，表明这种差异与药物暴露无关[45]。 据我们所知，没有对青少年或成年动物的研究检查过尼古丁暴露后ΔFosB表达的性别差异; 这些发现值得进一步调查。
总而言之，在新环境下表现出行为反应差异的青春期动物在以下方面也表现出差异：1）尼古丁暴露对成年期乙醇对敏感性的敏感性的长期后果； 2）在反复暴露于尼古丁期间诱导ΔFosB； 3）重复尼古丁暴露后ΔFosB的持久性。 这些发现为研究青春期动物固有脆弱性的差异提供了基础，这些差异可以使用相对简单的行为方法进行筛选。
亮点
- 青少年尼古丁暴露导致高感觉寻求成人的酒精CPP
- 青少年尼古丁暴露增加ΔFosB表达
- 青少年尼古丁之后的ΔFosB表达在低感觉寻求者中持续到成年期
脚注
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参考资料
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