ΔFosB的N-末端结构域在应激和滥用药物中的功能作用（2014）

神经科学。 2014 Oct 10。 pii: S0306-4522(14)00856-2. doi: 10.1016/j.neuroscience.2014.10.002.

Ohnishi YN1, Ohnishi YH1, Vialou V2, 穆松岛2, LaPlant Q.2, 西A3, Nestler EJ4.

抽象

以前的研究表明，在伏隔核中起作用的转录因子ΔFosB可介导可卡因等滥用药物的有益效应，以及介导对慢性社会压力的恢复能力。 然而，用于建立这些ΔFosB表型的转基因和病毒基因转移模型除了ΔFosB之外还表达ΔFosBmRNA的替代翻译产物，称为Δ2ΔFosB，其缺乏ΔFosB中存在的N-末端78αa。 为了研究Δ2ΔFosB对这些药物和应激表型的可能贡献，我们制备了过表达ΔFosBmRNA的点突变体形式的病毒载体，其不能进行替代翻译，以及单独过表达Δ2ΔFosB的载体。 我们的研究结果表明，当伏隔核过度表达时，ΔFosB的突变形式再现了我们早期模型中所见的奖赏和弹性的增强，而对Δ2ΔFosB没有影响。 全长FosB（FosB基因的另一个主要产物）的过表达也没有效果。 这些发现证实了ΔFosB在伏隔核中控制对滥用和压力药物反应的独特作用。

引言

ΔFosB由。编码 FOSB 基因与其他Fos家族转录因子具有同源性，包括c-Fos，FosB，Fra1和Fra2。 在急性给予许多滥用药物后，所有Fos家族蛋白在特定脑区迅速和短暂诱导[见 ]。 这些反应最常见于伏隔核（NAc）和背侧纹状体，它们是药物的奖赏和运动行为的重要介质。 然而，所有这些Fos家族蛋白都是高度不稳定的并且在给药后数小时内恢复到基础水平。 相反，ΔFosB，由于其在体外和体内的不寻常的稳定性（; Carle等，2006; ），在反复接触药物后，在相同的大脑区域内独特积累（; ; ）。 最近的研究表明，长期暴露于某些形式的应激也会诱导ΔFosB在NAc中的积累，并且这种诱导优先发生在对应激的有害作用具有相对抗性的动物中（即，有弹性的动物）（; , ).

我们已经证明NAc中ΔFosB的过表达，无论是在诱导型转基因小鼠中还是通过局部病毒介导的基因转移，都会增加动物对可卡因和其他滥用药物的奖赏和运动激活作用的敏感性（; ; ; ; Robison等，2013）。 这种归纳也促进了自然奖励的消费和动力（; ; ; ; ; Pitchers等，2009; ），增加颅内自我刺激范例中的脑刺激奖励（），使动物对几种形式的慢性压力更具弹性（, ）。 同样，组成型缺乏全长FosB表达，但表达增加的表达ΔFosB的小鼠，对压力的敏感性降低（）。 总之，这些发现支持了这样的观点，即在NAc中起作用的ΔFosB可以增强动物的奖赏，情绪和动机状态。

然而，这些研究的一个主要警告是另一种产品 FOSB 基因，称为Δ2ΔFosB，也在所有这些遗传突变小鼠和病毒载体系统中表达，留下Δ2ΔFosB对观察到的行为表型的可能贡献。 Δ2ΔFosB从位于Δ内的备选起始密码子翻译FOSB mRNA转录本（）。 该替代性翻译导致Δ2ΔFosB的形成，其缺少ΔFosB的78 N末端aa。 在这项研究中，我们通过过度表达Δ2ΔFosB在药物滥用和应激模型中的作用，或ΔFosB或FosB，用AAV（腺相关病毒）载体检测; 我们使用Δ的突变形式FOSB 不能经历这种替代翻译机制的mRNA。 我们的研究结果证实，在早期研究中看到的亲奖励和促弹性行为确实是通过ΔFosB介导的，而不是通过其他两种蛋白质产生的。 FOSB 基因，全长FosB或Δ2ΔFosB。

方法

动物

在实验之前，将9-至11-一周龄的C57BL / 6J雄性小鼠（The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA）分组饲养，每笼5只，置于恒温（23℃）下的菌落室中。 12小时光照/黑暗循环（在7 AM点亮），随意获取食物和水。 一些实验利用了转基因小鼠，其中ΔFosB的过表达受四环素基因调控系统的控制，如上所述（）。 将小鼠用于多西环素（以维持基因表达关闭）或使用能够使ΔFosB表达的多西环素。 所有方案均由西奈山的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

AAV矢量

我们使用AAV2血清型包装在人类即刻早期巨细胞病毒（CMV）启动子下表达全长FosB，ΔFosB或Δ2ΔFosB的AAV载体，其中在介入IRES2（内部核糖体再入位点2）后编码维纳斯荧光蛋白。 AAV-ΔFosB构建体表达Δ的突变形式FOSB mRNA，其中代表Met79的密码子突变为Leu以消除产生Δ2ΔFosB的备选翻译起始位点。

病毒介导的基因转移

将小鼠置于氯胺酮（100 mg / kg）和甲苯噻嗪（10 mg / kg）麻醉下的小动物立体定位仪器中，并暴露其颅表面。 将三十三个规格的注射器针头双侧下降到NAc中以0.5°角（前/后+ 10;内侧/外侧+ 1.6;背侧/腹侧 - 1.5mm）注入4.4μl的AAV载体。 输注以0.1μl/ min的速率发生。 接受AAV注射的动物在手术后恢复至少24小时。 为了确认表达，将小鼠麻醉并用4％多聚甲醛/ PBS（磷酸盐缓冲盐水）心内灌注。 将脑用30％蔗糖冷冻保护，然后冷冻并在-80℃下储存直至使用。 在低温恒温器上切割冠状切片（40μm）并通过共聚焦显微镜处理以进行扫描。

行为测试

根据公布的方案，用几种标准行为测定法对小鼠进行如下研究：

慢性病（10天） 社会失败压力 完全按照描述进行（; ）。 简而言之，将一只实验小鼠和一只CD1攻击者放在CD5小鼠的笼子中用于1 min。 然后用塑料分隔器将它们分开，塑料分隔器被穿孔以允许感觉接触以提醒当天。 每天早晨10天，将实验小鼠移入不同的攻击性小鼠笼中。 未失败的对照小鼠经历了类似的暴露，但与其他C57BL / 6J小鼠一起。 测试 社交 如前所述进行（; ）。 简言之，将测试小鼠置于一个新的竞技场内，该竞技场的一侧包括一个小笼子。 当小笼子是空的时，最初监测运动（例如，行进的距离，在这个小笼子附近花费的时间）150秒，然后在该笼子中用CD150小鼠另外1秒。 使用EthoVision 5.0软件（Noldus）获得运动信息。

我们使用标准，无偏见 条件性位置偏爱 （CPP）程序（; Robison等，2013）。 简而言之，动物在光束监测的三腔室中预先测试20 min，可自由进入环境不同的侧室。 然后将小鼠分成对照组和实验组，具有相同的预测试分数。 在实验操作后，小鼠经历四次30 min训练（交替的可卡因和盐水配对）。 在测试当天，小鼠具有不受限制地进入所有腔室的20 min，并且通过减去在可卡因配对室中花费的时间减去在盐水配对室中花费的时间来计算CPP得分。 在每次测试注射后，通过CPP盒中的光束破裂测量可卡因诱导的运动活性30 min。

高架加迷宫 使用配有白色底面的黑色有机玻璃进行测试以提供对比度（）。 将小鼠置于正迷宫的中心，并允许在红光条件下自由探索迷宫的5 min。 用视频跟踪设备（Ethovision）和安装在天花板上的摄像机监测每只鼠标在开放和闭合臂中随时间的位置。

一般，走动 运动活动 夜间阶段在家庭笼子中使用光电网格设备（Med Associates Inc.，St.Albans，VT，USA）进行评估，计算12 hr期间的动态光束断裂次数（).

蛋白质印迹

NAc样品如所述进行Western印迹（, ）。 使用超声处理器（Cole Parmer，Vemon Hills，IL）在含有磷酸酶抑制剂混合物I和II（Sigma，St.Louis，MO，USA）和蛋白酶抑制剂（Roche，Basel，Switzerland）的100μl缓冲液中均化冷冻的NAc解剖。 ， 美国）。 使用DC蛋白质测定法（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）测定蛋白质浓度，并将10-30μg蛋白质加载到12.5％或4％-15％梯度Tris-HCl聚丙烯酰胺凝胶上用于电泳分级分离（Bio） -RAD）。 在将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜后，将滤膜与识别所有的抗FosB抗体一起温育 FOSB 基因产物，然后使用二抗，最后根据制造商的方案使用Odyssey系统（Li-Cor）进行定量。

统计报表

使用方差分析和学生t检验，进行多次比较校正，显着性设置为p <0.05。

成果

如图所示 图1A是， FOSB 基因编码全长FosB和ΔFosB的mRNA。 ΔFOSB mRNA是由外显子4中的可变剪接事件产生的 FOSB 初级成绩单; 这导致产生过早终止密码子和截短的ΔFosB蛋白，其缺乏FosB中存在的C-末端101αa。 FosB和ΔFOSB mRNA共享相同的ATG起始密码子，位于外显子3的1末端。 自从最初的克隆以来就已经知道了 FOSB 这两种mRNA在外显子2中共享替代翻译起始位点的产物，称为Δ1，Δ2和Δ3ATG。 以前的工作表明，由Δ产生少量蛋白质产物FOSB mRNA，但不是 FOSB mRNA，通过Δ2ATG; 这种蛋白质被称为Δ2ΔFosB，缺少ΔFosB的78 a N末端区域（）。 相比之下，Δ1和Δ3ATG似乎是沉默的，因为没有证据表明它们用于翻译 FOSB 或ΔFOSB 成绩单。

图1 

表达水平 FOSB 基因产品

图1B 说明了诱导 FOSB 在重复可卡因给药过程后NAc中的基因产物，在最后一次可卡因剂量后检测动物2小时。 在这个时间点，ΔFosB和FosB蛋白都显示出可卡因的显着诱导，而没有一致的Δ2ΔFosB诱导。 注意，ΔFosB和FosB的诱导不同于在最后一次药物剂量后在24小时或更长时间观察到的模式，此时由于ΔFosB蛋白的独特稳定性仅诱导ΔFosB（; ; ）。 然而，与缺乏通过重复可卡因给药诱导Δ2ΔFosB相比，我们已经习惯过度表达ΔFosB并因此研究其行为后果的转基因小鼠系统（; ; ）除ΔFosB外，还导致Δ2ΔFosB过量表达，尽管水平较低。图1C）。 用过量表达野生型Δ的病毒载体可观察到相似水平的Δ2ΔFosB诱导FOSB （例如，见 图2）。 这些观察结果提出了先前报道的ΔFosB的一些所谓行为可能部分通过Δ2ΔFosB介导的可能性。

图2

选择性表达 FOSB 在Neuro2A细胞中具有AAV载体的基因产物

为了区分ΔFosB与Δ2ΔFosB的不同作用，我们生成了单独过表达Δ2ΔFosB的AAV载体，以及过表达Δ的突变形式的新载体。FOSB mRNA（mΔFOSB mRNA）不能进行替代翻译以产生Δ2ΔFosB。 两种载体也表达金星作为表达的标记。 我们比较了这两种载体对其他载体的影响，其中FosB加金星或金星单独作为对照。 这些新的AAV载体选择性过表达其编码的转基因的能力描述于 图2.

接下来，测试每个的效果 FOSB 基因产物，在NAc中起作用。 在复杂行为方面，我们将这些AAV中的每一个注射到不同小鼠组的双侧大脑区域，并且在转基因表达最大的几周后将3注射到XNUMX中（图3A），进行了一系列测试。 我们首先评估了它的能力 FOSB 基因产物影响先前报道的社会失败范式中ΔFosB的亲恢复力表型（, ），如图所示 图3A，控制小鼠单独表达维纳斯显示社会互动行为的预期减少，这是一个公认的易感性行为标记（; ）。 与不具有作用的Δ2ΔFosB和FosB相比，mΔFosB的过表达完全逆转了这种表型。

图3 

的影响 FOSB NAc中基因产物对可卡因或社会压力的行为反应

测试每个的相对贡献 FOSB 基因产物对可卡因的有益作用，我们在NAc中双侧过表达Δ2ΔFosB本身，mΔFosB或FosB，并在条件性位置偏好范例中研究动物。 如图所示 图3B，NAc中mΔFosB的双侧过表达增加了阈值剂量可卡因的位置调节作用，其在表达金星的对照动物中不产生显着的位置偏爱。 相反，Δ2ΔFosB或FosB的过表达对可卡因位置调节没有影响。 由于我们使用的阈值剂量的可卡因在对照动物中没有产生显着的位置偏好，我们不能排除FosB或Δ2ΔFosB可能降低可卡因的奖赏效果的可能性。

最后，为了评估基线行为，我们检查了动物家笼中的运动活动以及高架十字迷宫中的焦虑样行为。 NAc中的FosB，mΔFosB和Δ2ΔFosB过表达对运动活动有影响，尽管FosB和Δ2ΔFosB-但不是mΔFosB-在高架十字迷宫中产生小但显着的焦虑样行为减少（图3D，E）。 这些数据表明 FOSB 基因表达在正常条件下不会明显改变行为。

讨论

本研究的结果证实，先前报道的ΔFosB的表型确实是通过ΔFosB介导的，而不是通过Δ2ΔFosB介导的，ΔXNUMXΔFosB是Δ的交替翻译产物。FOSB 缺乏ΔFosB的N-末端的mRNA。 虽然我们以前使用的过度表达ΔFosB的工具也导致产生低水平的Δ2ΔFosB，但我们在此显示在突变形式的Δ的NAc中过表达FOSB 由于所涉及的替代起始密码子的突变而不能产生Δ2ΔFosB的mRNA概括了可卡因奖励和对先前报道的ΔFosB的社交失败压力的恢复的增加（; ）。 此外，Δ2ΔFosB本身的过表达对可卡因或应激反应没有影响。 我们还首次表明，NAc中全长FosB的过表达同样对可卡因或压力的行为反应没有影响。

虽然这些结果不排除Δ2ΔFosB作为次要蛋白质产物的可能性 FOSB 基因可能在其他大脑区域或外周组织中发挥功能作用，但我们的研究结果证实了ΔFosB在NAc奖励回路中的独特贡献，在促进可卡因奖励和压力恢复方面。

亮点

  • ΔFOSB mRNA产生ΔFosB，并且产生偶然或翻译的Δ2ΔFosB。
  • 单独ΔFosB的过表达证实了其亲奖励和促弹性表型。
  • 相反，Δ2ΔFosB对可卡因奖励或压力脆弱性没有影响。
  • 全长FosB，编码 FOSB mRNA，也不会影响奖励或恢复力。

致谢

这项工作得到了国家精神卫生研究所和国家药物滥用研究所以及石桥基金会和日本科学促进会（JSPS KAKENHI编号：24591735）的资助。

脚注

发布者的免责声明： 这是未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受发布。 作为对我们客户的服务，我们正在提供该手稿的早期版本。 在以最终的可引用形式发布之前，稿件将进行复制，排版和审查。 请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，以及适用于该期刊的所有法律免责声明。

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