(人类)对慢性可卡因的行为和结构反应需要在伏核中使用ΔFosB和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II的前馈环(2013)

J Neurosci。 2013 Mar 6;33(10):4295-4307.

罗宾逊AJ, Vialou V, Mazei-Robison M., 冯杰, Kourrich S., 柯林斯, We S, Koob G., Turecki G., Neve R, 托马斯M., Nestler EJ.

来源

Fishberg神经科学与弗里德曼脑研究所,纽约州纽约西奈山医学院,10029,明尼苏达州明尼阿波利斯市明尼苏达大学人类遗传学研究所神经科学与心理学系55455,成瘾性疾病神经生物学委员会,斯克里普斯研究所,加州拉霍亚92037抑郁障碍项目,道格拉斯心理健康大学研究所和麦吉尔大学,蒙特利尔,魁北克,加拿大,H4H 1R3,以及麻省理工学院脑与认知科学系,马萨诸塞州剑桥市02139 。

抽象

转录因子ΔFosB和富含脑钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKIIα)在伏隔核(NAc)中通过长期暴露于可卡因或其他精神兴奋药物滥用而被诱导,其中两种蛋白质介导致敏药物反应。 尽管ΔFosB和CaMKIIα均调节NAA中的AMPA谷氨酸受体表达和功能,NAc培养基多刺神经元(MSN)上的树突棘形成,以及对可卡因的运动敏化,但迄今为止尚未探索这些分子之间的直接联系。 在这里,我们证明ΔFosB在稳定蛋白质的Ser27上被CaMKIIα磷酸化,并且CaMKII是 在大鼠NAc中可卡因介导的ΔFosB积累所需的。

相反,我们证明ΔFosB对于体内CaMKIIα基因表达的可卡因诱导是必要和充分的,对D具有选择性的作用。1NAc shell子区域中的类型MSN.

此外,在NAc过表达ΔFosB后,NAc MSN上树突棘的诱导和对可卡因的行为反应性增加都是CaMKII依赖性的。

重要的是,我们首次证明了ΔFosB和CaMKII在NAc中的诱导 人类可卡因成瘾者,建议未来治疗干预的可能目标。 这些数据证实ΔFosB和CaMKII参与细胞类型和脑区特异性阳性前馈循环,作为调节响应慢性可卡因的大脑奖赏回路的关键机制。

介绍

越来越多的证据支持这样的观点,即基因表达的变化会导致药物成瘾的机制(Robison和Nestler,2011)。 这些变化的一个重要调节因子是ΔFosB,一种Fos家族转录因子(Nestler,2008)。 实际上任何滥用药物的慢性给药诱导了伏隔核(NAc)中ΔFosB的长期累积,这是一种对于奖赏行为必不可少的边缘区域。 小号uch诱导似乎特异于表达D1多巴胺受体的NAc中型多刺神经元(MSN)。 这些D1型NAc MSN中ΔFosB的诱导性过表达增加了对可卡因和吗啡的运动和奖赏反应 (Kelz等人,1999; Zachariou等,2006),包括增加可卡因自我管理(Colby等,2003). 此外,ΔFosB转录活性的遗传或病毒阻断降低了这些药物的奖赏效果(Zachariou等,2006),表明ΔFosB的这种持续诱导是慢性药物给药在NAc中诱导的持久变化的关键介质.

由于全长FosB中存在的degron结构域的截短,ΔFosB(相对于所有其他Fos家族蛋白)的异常稳定性是该分子的固有特性(Carle等,2007)和受监管的过程。 ΔFosB被磷酸化 体外体内 在Ser27,这种反应进一步稳定细胞培养和NAc中的ΔFosB,~10倍数 体内 (Ulery-Reynolds等,2009)。 尽管Ser27-ΔFosB已被证明是酪蛋白激酶-2的底物 体外 (Ulery等,2006),其机制 体内 磷酸化仍然未知。

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)是高度表达的丝氨酸/苏氨酸激酶,其α和β同种型形成十二聚体同源和异型全酶。 体内,对于多种形式的神经可塑性至关重要 (Lisman等人,2002; Colbran和Brown,2004)。 慢性安非他明在NAc壳中选择性诱导CaMKIIα(Loweth等,2010)和NAc壳中CaMKII活性的药理学阻断降低了苯丙胺的行为敏感性(Loweth等,2008)和可卡因(Pierce等人,1998),在该NAc亚区中病毒过表达CaMKIIα可增强对苯丙胺的运动致敏和自我给药(Loweth等,2010)。 CaMKIIα可能通过调节AMPA谷氨酸受体亚基影响奖赏行为(Pierce等人,1998),因为CaMKIIα活性长期与AMPA受体功能和几种神经可塑性形式的突触靶向相关(Malinow和Malenka,2002).

该文献证明了ΔFosB和CaMKII之间的几个相似之处:两者对于滥用药物的多种行为影响都是必要和充分的,都可以上调各种神经细胞类型中的树突棘。 体内 (Jourdain等,2003; Maze等,2010),两者都通过调节AMPA受体发挥其至少一些行为影响(Kelz等人,1999; Malinow和Malenka,2002; Vialou等人,2010)。 尽管存在这些相似之处,但ΔFosB和CaMKII之间没有功能联系。 在这里,我们建立ΔFosB和CaMKII之间的相互调节,并证明这两种蛋白在NAc壳中形成D1型MSN特异性前馈环,其由可卡因诱导并调节一系列可卡因反应。 体内.

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材料和方法

实验1:可卡因处理后NAc壳和核心的iTRAQ蛋白质组学分析(图1A)

成年(8周)雄性大鼠每天一次施用20 mg / kg可卡因或盐水载体IP,持续七天。 最后一次注射后的24小时,NAc壳和核被显微切割(图1A)并快速冷冻。 iTRAQ分析如前所述进行(Ross等人,2004; Davalos等,2010).

图1

图1

壳体特异性诱导可卡因在NAc中的CaMKII

实验2:量化可卡因处理后大鼠NAc核心和壳中的蛋白质变化(图1B-D)

成年(8周)雄性大鼠在运动记录室中每天一次施用10mg / kg可卡因或盐水载体IP一次,持续七天。 先前用可卡因治疗的动物(称为“慢性”)和一部分用盐水治疗的动物(称为“急性”)记录了对单次注射可卡因(5 mg / kg IP)的运动反应,以及对生理盐水的运动反应单独记录在剩余的慢性盐水处理动物(称为“盐水”)中。 如所述进行运动活性测定(Hiroi等,1997)。 简而言之,将成年雄性大鼠置于18“×24”PAS开放式野外记录盒(San Diego Instruments)中以30 min进行习惯,给予单次IP注射盐水并监测另外的30 min,并给予单次IP注射5 mg / kg可卡因并监测30 min。

在最后一次注射后的24小时,在没有麻醉的情况下将大鼠断头以避免麻醉剂对神经元蛋白质水平和磷酸化状态的影响。 将脑在1.2 mm基质(Braintree Scientific)中连续切片,并在含有蛋白酶(Roche)和磷酸酶(Sigma Aldrich)抑制剂的磷酸盐缓冲盐水中使用14计量冲头(NAc核心)和剩余的12计量冲头除去靶组织。 NAc壳的组织(见 图1A)并立即在干冰上冷冻。 通过在改良的RIPA缓冲液中光照超声均化样品:10 mM Tris碱,150 mM氯化钠,1 mM EDTA,0.1%十二烷基硫酸钠,1%Triton X-100,1%脱氧胆酸钠,pH 7.4,蛋白酶和磷酸酶抑制剂如上。 加入Laemmli缓冲液后,在4-15%聚丙烯酰胺梯度凝胶(Criterion System,BioRad)上分离蛋白质,并根据制造商的方案使用Odyssey系统(Li-Cor)进行Western印迹。

实验3:在可卡因戒断后量化大鼠NAc核心和壳中的蛋白质变化(图1E)

成年(8周)雄性大鼠每天一次施用10 mg / kg可卡因或盐水载体IP,持续七天。 最后一次注射后14天,用盐水处理的动物再给予盐水注射(称为“生理盐水”),给予用可卡因治疗的动物另外注射生理盐水(称为14天撤药或“14d WD”)或单次注射可卡因(称为“14d WD Chal”用于挑战)。 最后一次注射后1小时,将动物断头并进行Western印迹,如同 实验2.

实验4:在可卡因自我给药后量化大鼠NAc核心和壳中的蛋白质变化(图2A-C)

训练大鼠在固定比率0.5方案中在1小时内自我施用1 mg / kg /输注可卡因9天。 在九个基线期后,将大鼠分成两组,在最后两个疗程中通过可卡因摄入平衡。 允许一组大鼠在1小时的会话中自我施用可卡因(0.5 mg / kg /输注)(短途访问,ShA),而另一组大鼠在6小时的时间段内自我施用可卡因(长期访问,LgA) )再增加十天(升级会议)。

如所描述的那样处理脑切片用于免疫组织化学(Perrotti等,2004)。 在最后一次暴露于药物后,脑灌注18-24小时,导致任何残留的全长FosB蛋白的降解,使得所有剩余的免疫反应性反映ΔFosB。 通过Western印迹证实了这种降解,其显示没有针对不识别ΔFosB的全长FosB的C末端的抗体的显着染色(数据未显示)。 在切成35μm切片后,通过盲法观察者通过每只大鼠的NAc在两个切片中定量ΔFosB免疫阳性细胞的数量,然后通过每只动物的区域计算每40×场的平均值。 每只动物被认为是用于统计分析的个体观察。 使用Paxinos和Watson识别感兴趣的区域(Paxinos和Watson,2007).

使用如所述的Licor系统进行CaMKIIα免疫反应性的定量(Covington等,2009)。 用Odyssey软件测定CaMKII和GAPDH的综合强度。 结果表示为每毫米的积分强度值2 并表示为平均值±sem(n =每组4-10)。 GAPDH的值用作参考以使切片厚度和条件的CaMKII强度标准化。

图2

图2

在自我给药大鼠和人可卡因成瘾者的NAc壳中诱导CaMKII

实验5:量化可卡因依赖性人类的蛋白质水平(图2D)

程序

死后的人脑组织来自魁北克自杀脑库 (加拿大魁北克省蒙特利尔道格拉斯心理健康大学研究所)。 组织的保存基本上按照描述进行(Quirion等,1987)。 简而言之,一旦被提取,将大脑置于聚苯乙烯泡沫塑料盒中的湿冰上并冲到魁北克自杀脑库工厂。 半球立即被大脑,脑干和小脑中间的矢状切口分开。 通常从左半球切下血管,松果腺,脉络丛,半小脑和半脑干,然后在冷冻前将其冠状切割成1cm厚的切片。 在冷冻前将后半部分小脑切成切成1cm厚的切片。 将组织在-2℃下在40-甲基丁烷中快速冷冻~60秒。 将所有冷冻组织分别保存在-80°C的塑料袋中,以便长期保存。 从不锈钢板上的冷冻冠状切片中切出特定的脑区域,周围用干冰控制环境温度。 如在中所述进行蛋白质印迹 实验2.

队列

该队列由37男性和3女性受试者组成,年龄在15-66年之间。 所有受试者突然死亡,没有长期的agonal状态或长期的医学疾病. 在每种情况下,魁北克验尸官办公室确定死因,并使用组织样本进行毒理学筛查,以获得死亡时药物和非法物质使用的信息。 受试者组由符合SCID-I可卡因依赖标准的20个体组成。 对照组由20受试者组成,没有可卡因依赖史且没有重大精神病学诊断。 所有受试者突然死于对脑组织没有直接影响的原因。 将组匹配平均受试者年龄,冷藏延迟和pH。 对于所有受试者,如前所述进行心理解剖(Dumais等人,2005),使我们能够获得有关精神病史和病史的详细病例信息,以及其他相关的临床和社会人口统计学数据。 简而言之,一位训练有素的面试官进行了 DSM-IV的结构化临床访谈 精神疾病(SCID-I)与死者的一个或多个线人。 一组临床医生审查了SCID-I评估,病例报告,验尸官笔记和医疗记录,以获得一致的精神病诊断。

实验6:大鼠NAc的染色质免疫沉淀(图3A-C)

成年(8周)雄性大鼠每天一次施用10 mg / kg可卡因或盐水载体IP,持续七天。 最后一次注射后的24小时,NAc壳和核心被显微切割。 染色质免疫沉淀(ChIP)在14总组(98动物总数,7可卡因池,7盐水池)中汇集来自每组7只大鼠的壳或核的双侧NAc冲孔。 将组织交联,洗涤并在-80℃下储存,直到通过超声处理染色质剪切。 将剪切的染色质与先前与磁珠结合的抗体(Dynabeads M-280,Invitrogen)孵育过夜。 非免疫IgG用作对照。 在反向交联和DNA纯化后,qPCR用于测量CaMKIIα启动子DNA的水平。 设计引物以扩增含有在转录起始位点之前位于~1 bp的AP-450共有序列的区域(正向:ACTGACTCAGGAAGAGGGATA;反向:TGTGCTCCTCAGAATCCACAA)。

图3

图3

细胞类型和区域特异性ΔFosB诱导CaMKIIα 体内

实验7:用细胞类型特异性ΔFosB过表达测量CaMKII转录物和蛋白质表达(图3D)

雄性转基因小鼠来源于 NSE-的tTA (A行)× TetOp-ΔfosB (11行)和 NSE-的tTA (B行)× TetOp-FLAG-ΔfosB (品系11)小鼠(陈等人,1998; Kelz等人,1999; Werme等,2002; Zachariou等,2006)在100μg/ ml多西环素上构思和产生以抑制发育过程中ΔFosB的表达。 断奶仔猪在断奶时分开:一半留在多西环素上,一半转为水,几周后,当ΔFosB的转录效应最大时,动物使用8至11(Kelz等人,1999; McClung和Nestler,2003)。 对于转录分析,将小鼠快速断头,取出脑并置于冰上。 用14-gauge针刺取出NAc的解剖,并在干冰上快速冷冻直至提取RNA。 如前所述进行RNA分离,qPCR和数据分析(LaPlant等,2009)。 简言之,用TriZol试剂(Invitrogen)分离RNA,用Qiagen的RNAeasy微量试剂盒进一步纯化,用Agilent生物分析仪检查质量。 使用iScript(BioRad)进行逆转录。 用Applied Biosystems 7900HT RT PCR系统进行qPCR,其具有以下循环参数:10℃,95℃; 40循环为95°C,1 min,60°C,30 sec,72°C,30 sec; 分级加热至95°C以产生解离曲线以确认单个PCR产物。 如下所述进行ΔFosB和CaMKIIα蛋白表达的免疫组织化学分析 实验4.

实验8:NAc内D1和D2多巴胺受体拮抗剂对可卡因介导的蛋白质变化的影响(图3H)

成年(8周)雄性大鼠每天一次施用10 mg / kg可卡因或盐水载体(“载体”组)IP,持续七天。 在每次注射可卡因之前的30分钟,给大鼠IP施用D1受体拮抗剂SCH 23390(0.5 mg / kg,“D1 Ant”组)或D2受体拮抗剂依替必利(0.5 mg / kg,“D2 Ant”组)。 ,或盐水对照注射(“可卡因”组)。 最后一次注射后的24小时,将动物断头并通过Western印迹定量蛋白质 实验2.

实验9:AAV介导的ΔFosB过表达对蛋白质表达的影响(图4 A-C)

对成年雄性大鼠(8周)进行立体定向手术以注射AAV-GFP(绿色荧光蛋白)或AAV-GFP-ΔFosB(Maze等,2010)。 33针头针(Hamilton)用于所有手术,其中0.5μl纯化的高滴度病毒在5最小时间段内双侧输注,然后在输注后休息期间另外5分钟。 相对于前囟测量所有距离:10°角,AP = + 1.7 mm,Lat = 2.5 mm,DV = -6.7 mm。 手术后14天,动物在运动监测室中单次IP注射10 mg / kg可卡因,以评估ΔFosB过表达的行为效应。 在最后一次注射后的24小时,将大鼠按照斩首断头 实验2在荧光显微镜下进行组织显微切割,得到GFP阳性的NAc组织。 然后按照蛋白质印迹进行 实验2。

图4

图4

ΔFosB对NAc壳中可卡因介导的D1受体依赖性CaMKIIα诱导是必要和充分的

实验10:AAV介导的ΔJunD过表达对可卡因依赖性蛋白表达的影响(图4 D-F)

按顺序进行AAV-GFP或AAV-GFP-ΔJunD的立体定位注射 实验8。 手术后14天,在运动记录室中每天一次给动物施用10 mg / kg可卡因或盐水载体IP一次,持续七天。 记录单次注射可卡因(5 mg / kg IP)或盐水的运动反应。 在最后一次注射后24小时,将大鼠断头,收获组织,并按照如下进行蛋白质印迹 实验9。

实验11: 体外 蛋白激酶检测(图5A-D)

从昆虫细胞中纯化重组CaMKIIα和ΔFosB(Brickey等,1990; Jorissen等,2007),并进行蛋白激酶检测(Colbran,1993),如前所述。 简言之,CaMKII在冰上与2.5μM(或指示浓度)的ΔFosB,1 mM Ca预温育。2+,40 mM Mg2+,15μM钙调蛋白和200 mM HEPES pH 7.5。 通过添加200μMATP启动磷酸化,有或没有[γ-32P] ATP并允许在室温下进行10分钟(图5A和B)或冰上2分钟(图5C&D)。 通过蛋白质印迹解析产物(图5A和B)或通过放射自显影和闪烁计数(图B-D)。

图5

图5

ΔFosB是CaMKIIα的有效底物

实验12:Ser27ΔFosB磷酸化的鉴定(图5E)

体外 按照进行激酶测定 实验11通过SDS-PAGE分离蛋白质,切出对应于ΔFosB的条带并进行串联质谱分析。 所有面板中相应离子片段的m / z分配在离子峰顶部标记。 由于空间限制,并非所有碎片离子都被标记。 通常,片段离子标记的文本用黑色着色,除非它们直接证实或添加了感兴趣的磷酸化位点存在的证据,在这种情况下它们用红色标记。 骨架断裂产物的证据呈现在磷酸肽的序列读数中,检测到的磷酸化残基位点用红色表示,具有单个氨基酸字母标记。 观察到的碎片离子的数字描述也在肽序列上标记为b和y离子。 显示较低强度碎片离子的m / z轴部分的缩放因子标记在每个碎片质谱的顶部。 图H中所示的碎片离子证实了Ser27磷酸化同种型的存在,然而,在Ser28,Ser31,Ser34和Thr37位点的其他磷酸化同种型的混合物中。 pa5,pa5-P,pb5和pb5-P离子的存在唯一地证实了Ser27残基的磷酸化。

实验13:Ser27磷酸化的定量(图5F)

设计标准肽,模拟Ser27ΔFosB的磷酸和非磷酸形式。 在合成和纯化后,将每种“重”独特型肽溶解在50 / 50乙腈/水缓冲液中并送去氨基酸分析以确定合成肽储备溶液的绝对浓度。 然后将每个“重”肽直接注入4000 QTRAP质谱仪(MS)中以确定用于MS / MS碎裂和2至4个MRM转变的最佳碰撞能量。 接下来,将纯“重”肽在4000 QTRAP上进行LCMS以确保肽分离。 仪器以三重四极杆模式运行,其中Q1设定在特定前体m / z值(Q1不扫描),并且Q3设定为对应于该肽的特定片段的特定m / z值。 在MRM模式中,依次测量一系列单个反应(前体/碎片离子跃迁,其中调节碰撞能量以优化目标碎片离子的强度),并且循环(通常为1-2秒)在整个循环中循环HPLC分离的整个时间。 MRM跃迁由现有肽的MS / MS谱确定。 然后选择每个肽的两个转变,对应于高强度碎片离子,并且使用自动化软件优化碰撞能量以最大化MRM转变的信号强度。 然后比较暴露于CaMKII或对照的标准肽和ΔFosB样品产生的峰,以确定反应中每种肽形式的绝对丰度。 使用AB Multiquant 1.1软件进行LC-MRM数据的数据分析。

实验14:CaMKII过表达小鼠中ΔFosB的诱导(图5G&H)

过表达T286D CaMKII的转基因小鼠(Mayford等,1996; Kourrich等,2012并且在没有多西环素的情况下培养野生型同窝仔畜以允许转基因表达。 对于20天,每天一次给予成年小鼠14mg / kg可卡因或盐水IP。 最后一次注射后的24小时,将动物断头并进行免疫组织化学和ΔFosB表达的定量,如同 实验4.

实验15:HSV介导的ΔFosB过表达和CaMKII抑制对NAc树突棘的影响(图6A-E)

成年雄性小鼠(8周)立体定位注射NAc与HSV-GFP,HSV-GFP-ΔFosB(Olausson等人,2006),HSV-GFPAC3I,或HSV-GFPAC3I-ΔFosB。 在这些构建体中,AC3I(一种基于肽的CaMKII活性抑制剂)与GFP的C末端融合。 使用含有GFPAC3I的pMM400载体作为模板,通过PCR克隆GFPAC3I,其具有以下引物:GFP-AC3I-F:5'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3'(clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R:5'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3'(clampBspEIstop)。 使用NheI和BspEI位点将所得PCR产物插入p1005 +和p1005 +-ΔFosB载体中。 通过测序验证构建体。 立体定位坐标为:10°角,AP = + 1.6 mm,Lat = + 1.5 mm,DV = -4.4 mm(Barrot等,2002)。 按照进行灌注和脑切片 实验4.

如所述进行脊柱分析(Christoffel等人,2011)。 简而言之,从表达GFP的HSV感染的细胞中随机选择远离体细胞的树突片段50-150μm。 使用带有rayburst算法的NeuronStudio在共焦LSM 710(Carl Zeiss)上获得图像用于形态学分析。 NeuronStudio根据以下值将脊柱分类为薄,蘑菇或粗短:( 1)纵横比,(2)头颈比和(3)头部直径。 带颈部的刺可分为薄或蘑菇,没有明显颈部的刺被归类为粗短。 带有颈部的脊柱根据头部直径标记为薄或蘑菇。

图6

图6

阻断CaMKII活性可防止ΔFosB在NAc中的形态和行为影响

实验16:HSV介导的ΔFosB过表达和CaMKII抑制对可卡因反应的影响(图6F)

按照成年雄性小鼠注射病毒 实验15和按照每个5 mg / kg注射可卡因的运动反应进行测量 实验9。 运动数据表示为可卡因注射后30 min的总束断裂。

附加信息

动物房屋

将雄性Sprague Dawley大鼠(250-275 g; Charles River Laboratories)成对饲养。 将8周龄的C57BL / 6J雄性小鼠(杰克逊实验室)分组饲养,每笼最多5只动物。 在实验操作之前,所有动物在动物设施中习惯于≥1,并且在23 hr光/暗循环(在25上点亮:12 AM)的气候控制室(7-00°C)中食用,并且可以获得食物和水 随意。 根据西奈山神经科学学会和机构动物护理和使用委员会(IACUC)的指导进行实验。

毒品

将药物IP施用并溶解于无菌盐水中,包括可卡因(5-20 mg / kg,每只10μl用于小鼠,每1 ml用于大鼠,NIDA)和SCH 23390或盐酸依地洛普(0.5 mg / kg / 1 ml,Tocris) 。 对于立体定位手术,用无菌盐水中的氯胺酮(100 mg / kg)和甲苯噻嗪(10 mg / kg)(Henry Schein)的“混合物”麻醉小鼠。

抗体

CaMKIIα(总数):Upstate 05-532,1:5,000

CaMKII phospho-Thr286:Promega V111A,1:1,000

ΔFosB(总):Cell Signaling 5G4,1:250

ΔFosBpospho-Ser27:Phosphosolutions,1:500

GluA1(总计):Abcam,Ab31232,1:1,000

GluA1 phospho-Ser831:Millipore N453,1:1,000

GluA1 phospho-Ser845:Chemicon Ab5849,1:2,000

GluA2:Millipore 07-598,1:2,000

NR2A:Sigma HPA004692,1:2,500

NR2B:Millipore Ab1557P,1:1,000

统计分析

使用Prism 6软件包(GraphPad)进行所有统计学分析。 学生t检验用于所有成对比较(在给出t值的结果中指示),并且单向ANOVA用于所有多重比较(在给出F值的结果部分中指示)。

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成果

慢性可卡因诱导NAc壳中的CaMKII

许多研究表明,NAc壳和核心中的MSN对长期接触滥用药物有不同的生化和生理反应(Kourrich和Thomas,2009; Loweth等,2010并且这两个分区域在不同程度上调节了寻求毒品的行为 (Ito等,2004)。 确定可卡因对NAc壳蛋白成分的不同影响 核心,我们使用多重等压标记(iTRAQ)和串联质谱(MS / MS)。 每天给成年雄性大鼠注射可卡因(20 mg / kg)或盐水,持续7天; 最后一次注射后的24小时,NAc壳和核被显微切割(图1A)并快速冷冻。 然后使用iTRAQ定量这些样品中的蛋白质。 与核心相比,所有四种CaMKII同种型在可卡因处理后表现出大大的表达增加,其特异于NAc壳。 几种蛋白磷酸酶,包括PP1催化和调节亚基和PP2A,它们之前已与其他系统中的各种CaMKII底物相关联(Colbran,2004),遵循类似的模式。 这些发现提供了新的,无偏见的证据,证明CaMKII信号通路在NAc中以壳特异性方式受可卡因显着调节。

为了更加定量地验证这一发现,我们用可卡因(不同剂量)或盐水处理上述大鼠并测量对可卡因(5 mg / kg)或盐水攻击剂量的运动反应。 反复接触10 mg / kg可卡因导致典型的运动致敏模式(图1B)。 使用这种给药方案的进一步研究通过使用Western印迹揭示,在最终注射可卡因后,重复的可卡因在NAc壳24 hr中选择性地诱导CaMKIIα(图1C和D.; P = 0.0019; F = 7.943; DF = 29)。 此外,AMPA受体的GluA831亚基的经典CaMKII底物Ser1的磷酸化在NAc壳中显着增加而不是核心(p = 0.0261; F = 4.208; df = 28),而CaMKIIαThr286自身磷酸化具有强烈但不是仅在壳体中诱导的显着趋势(图1D)。 其他几种谷氨酸受体未受影响。 与CaMKII的这些测量相反,相同的组织样品显示在NAc的两个壳(p = 0.0260; F = 4.189; df = 29)和核心(p = 0.0350; F = 3.807; df = 29)中诱导ΔFosB。 (图1C和D.),与先前的调查结果一致(Perrotti等,2008).

由于几项先前可卡因调节AMPA受体的研究分析了从慢性可卡因中撤出~14天后的动物(见讨论),我们在这个时间点重复了这些生化分析。 我们发现,在最终注射可卡因后的14天,ΔFosB在NAc中仍然升高(p = 0.0288; F = 4.258; df = 22),而CaMKII和GluA1 Ser831的磷酸化都没有增加(图1E)。 然而,单次1 mg / kg攻击剂量的可卡因,总CaMKII水平(p = 10; F = 0.0330; df = 3.947)和GluA26 Ser1(p = 831; F = 0.0213; df = 4.509)后的27小时磷酸化水平升高到与初始慢性可卡因暴露后相似的程度(图1E)。 这些数据表明NAc壳神经元在延长的禁欲期间可能通过CaMKII基因启动子的直接引发而引发CaMKII诱导(参见讨论)。 此外,ΔFosB诱导比CaMKII诱导更持久的事实表明存在额外的机制,无论是基于染色质还是其他,对CaMKII调节施加“制动”,如讨论中所述。

为了进一步加强这些观察,我们探索了可卡因自我管理的模型,其涉及意志药物摄入。 给成年雄性大鼠短期或长期接触可卡因; 正如所料(Ahmed和Koob,1998),只有长期获取条件导致药物自我管理不断升级(图2A)。 ΔFosB被更长时间地诱导 NAc shell(p = 0.0011; F = 11.12; df = 17)和核心(p = 0.0004; F = 13.86; df = 17)对可卡因的短暂访问。 相比之下,只有长期获取可卡因才能在NAc壳中诱导CaMKIIα(图2B和C.; P = 0.0236; F = 4.957; DF = 16)。 有趣的是比较短途动物(~12 mg / kg IV),长途动物(~70 mg / kg IV)和实验动物(10 mg / kg)的每日可卡因摄入量,以及问为什么后者引发ΔFosB和CaMKII的强烈诱导,而短途访问则没有。 这种差异可能是由于可卡因峰值水平的差异(实验者给予的可卡因是单次推注IP,而自我给予的可卡因是通过多次静脉注射给药),或者是药物暴露时间长度的差异(实验者的7天数)管理,自我管理的19天数)。

尽管有关可卡因作用的ΔFosB和CaMKII的大量文献,但在人类可卡因使用者中尚未对这些蛋白质进行研究。 在这里,我们提出了第一个证据,证明ΔFosB(p = 0.0316; t = 1.921; df = 34)和CaMKII(p = 0.0444; t = 1.755; df = 32)的水平在可卡因依赖性人类的NAc中增加(图2D, 表1)。 这些数据表明我们对啮齿动物NAc中可卡因诱导的ΔFosB和CaMKII的检测与人可卡因成瘾临床相关。

表1

表1

来自人可卡因成瘾者和匹配对照组的样品的表征

ΔFosB在NAc Shell的D1型MSN中选择性调节CaMKII转录

发现CaMKII和ΔFosB都被啮齿动物NAc中的可卡因上调导致我们确定ΔFosB是否可能调节CaMKII基因的转录。 我们之前曾报道过CaMKIIα作为NAF无偏微阵列分析中ΔFosB的可能靶标(McClung和Nestler,2003),但该研究未在该研究中进一步验证。 我们首先使用定量ChIP(qChIP-ChIP,然后定量PCR)来确定ΔFosB是否与成年雄性大鼠的NAc中的CaMKIIα基因启动子结合,并且发现通过慢性可卡因施用在壳中这种结合显着增加( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12),但不是核心,次区域(图3A)。 为了进一步了解与ΔFosB与CaMKIIα启动子结合的该亚区域特异性差异相关的机制,我们使用qChIP来表征该基因组区域的组蛋白修饰状态。 之前的研究表明可卡因诱导H3乙酰化在CaMKIIα启动子的总小鼠NAc(Wang等人,2010)。 相反,我们发现可卡因在NAc核心中选择性地降低CaMKIIα启动子的H3乙酰化(图3B; P = 0.0213; T = 2.726; df = 10),在壳中没有明显变化,与超过ΔFosB结合的亚区域特异性染色质改变一致。 qChIP用于抑制标记,二甲基化H3赖氨酸9(H3K9me2),显示壳和核心亚区的降低趋势(图3C).

确定ΔFosB是否调节CaMKIIα转录 体内,我们利用了两个转基因小鼠系,特异性地在D1中诱导过表达ΔFosB D2型MSN以饮用水中强力霉素管理的方式控制(陈等人,1998; Kelz等人,1999; Werme等,2002)。 仅在D1型MSN中过表达ΔFosB的成年雄性小鼠在NAc中具有显着增加的CaMKIIαmRNA水平(p = 0.0337; t = 1.996; df = 13),这是在主要在D2型MSN中过度表达ΔFosB的小鼠中未见的效果(图3D)。 由D1型MSNs中ΔFosB表达诱导的CaMKIIαmRNA的增加伴随着NAc壳(p = 0.0030; t = 3.578; df = 14)和核心(p = 0.0392; t)中CaMKIIα蛋白的伴随增加。 = 2.275; df = 14; 图3E和F.)。 这些数据表明ΔFosB能够驱动两个亚区的D1型MSN中的CaMKIIα基因表达,尽管 图3B 表明可卡因介导的染色质在CaMKIIα启动子处的变化(例如,乙酰化降低)阻止ΔFosB在可卡因后上调核心亚区域中的CaMKII。

因为我们的转基因小鼠数据表明CaMKII基因表达的ΔFosB诱导对NAc中的D1型MSN具有特异性,所以我们接下来试图确定CaMKII的可卡因依赖性上调是否需要激活D1多巴胺受体。 成年雄性大鼠像以前一样服用慢性可卡因或生理盐水,但是在每次注射前30分钟,可卡因组的大鼠接受IP生理盐水,D1拮抗剂SCH 23390(0.5 mg / kg)或D2受体拮抗剂依替普利德(0.5 mg / kg)。 最后一次注射可卡因后24小时分析动物。 Western印迹显示,D1拮抗剂而非D2拮抗剂完全阻断了可卡因介导的ΔFosB升高(p <0.0001; F = 18.96; df = 18),如先前报道(Nye等,1995),以及CaMKII(p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; 图3G和H.)。 这些数据支持这样的假设:可卡因特异性地在NAc壳的D1型MSN中参与ΔFosB介导的CaMKII基因表达的增加。 在未来的研究中,直接证明可卡因对该脑区域内CaMKII表达的细胞类型特异性作用将是重要的。

ΔFosB对于NAc壳中CaMKII的可卡因诱导是必需的和充分的

为了补充转基因小鼠的使用,我们接下来研究了ΔFosB在通过在大鼠中使用病毒介导的基因转移介导可卡因诱导CaMKIIα的作用。 我们将腺相关病毒(AAV)颗粒双侧注射到成年雄性大鼠的NAc壳中(其中壳可以被选择性靶向)以过量表达ΔFosB加GFP或GFP单独。 然后给动物单次IP注射10 mg / kg可卡因。 与过表达单独GFP的动物相比,过表达ΔFosB/ GFP的动物表现出增加的运动反应(图4A)。 单次可卡因注射后的24小时,通过在荧光光源下解剖从这些动物切除GFP阳性NAc组织。 蛋白质组织的印迹(图4B和C.)与GFP动物相比,显示出强的ΔFosB过表达以及总CaMKIIα蛋白的显着增加(p = 0.0070; t = 2.894; df = 30),类似于用慢性可卡因施用所见的诱导。 此外,Thr286处的CaMKIIα自磷酸化(指示酶活化)通过ΔFosB过表达(p = 0.0330; t = 2.243; df = 28)增加,CaMKII底物的磷酸化,GluA831的Ser1(p = 0.0540; t = 2.012; df = 28),再次模仿慢性可卡因的作用(图1C和D.)。 Ť总之,这些数据提供了进一步的证据,即NAc壳中的ΔFosB表达足以对该可卡因的可卡因敏感和CaMKII在该亚区中的诱导和激活。

我们使用类似的方法来确定ΔFosB是否也是可卡因介导的NAc壳中CaMKIIα诱导所必需的。 AAV用于过表达截短的JunD蛋白,称为ΔJunD,它是ΔFosB转录激活的负调节因子(Winstanley等,2007)仅加GFP或GFP。 两周后,当转基因表达最大时,动物每天给予可卡因(10 mg / kg)或盐水7天,并在最后一次慢性注射后测试对可卡因激发(5 mg / kg)24 hr的运动反应(图4D)。 ΔJunD过表达阻止了对可卡因的运动致敏,并且还阻止了NAc壳中CaMKIIα的诱导和活化(图4E和F.; P = 0.0437; F = 2.997; 总df = 38),表明ΔFosB转录活性对于该子区域中可卡因介导的CaMKIIα诱导是必需的。 有趣的是,我们发现ΔJunD在盐水和可卡因处理条件下均降低了ΔFosB的水平(p = 0.0004; F = 8.110; df = 35),提高了ΔFosB依赖于其自身表达水平的AP-1活性的新概率。

CaMKII在Ser27处磷酸化ΔFosB

运用 体外 蛋白激酶测定,我们确定纯化的ΔFosB是CaMKIIα的稳健底物。 他的孵化6-ΔFosB与CaMKIIα和ATP引起ΔFosB的电泳迁移率向上移动(图5A); 几个产生的条带表明多个磷酸化位点。 类似 体外 激酶检测使用[γ-32P] ATP显示放射性标记的磷酸盐掺入移位的ΔFosB带中(图5B),证明蛋白质的直接磷酸化。 我们为先前表征的ΔFosB的Ser27产生了磷酸特异性抗体(Ulery等,2006)。 虽然这种抗体不会产生针对含有Ser27磷酸化ΔFosB的脑提取物的信号(数据未显示),但我们能够检测到Ser27磷酸化。 体外 使用CaMKII的激酶测定(图5B)。 ΔFosB的CaMKII磷酸化的动力学分析表明它是激酶的有效底物(图5C),具有明显的K.M 5.7±2.0μM和K.喵星人 2.3±0.3min - 1。 这些结果与许多已被充分表征的结果相当 体内 CaMKII的底物(Colbran和Brown,2004)。 此外,我们确定CaMKII以化学计量2.27±0.07 mol / mol磷酸化ΔFosB(图5D),表明在His内至少存在三个CaMKII磷酸化位点6-ΔFosB蛋白,符合 图5A.

为了研究磷酸化的个别位点,我们对我们的样品进行了MS分析 体外 激酶分析。 图5E 表明在先前表征的Ser27和几个另外的位点处的ΔFosB磷酸化(数据未显示)。 鉴于Ser27的先前功能特征,我们通过产生模拟Ser27的磷酸和非磷酸化状态的标记合成肽来关注该位点,然后使用已知量的这些肽作为ΔFosB的MRM分析之前和之后的标准。 体外 CaMKII的磷酸化。 随后的定量(图5F)证实Ser27是CaMKII的有效底物。 这些结果表明,在ΔFosB内的多个磷酸化残基中,Ser27是CaMKII的特别有效的底物。

CaMKII介导NAc壳中ΔFosB的可卡因积累

由于CaMKII可以使ΔFosB磷酸化 体外 在一个显着增强其稳定性的网站上 体外体内 (Ulery等,2006; Ulery-Reynolds等,2009),我们确定CaMKII活性是否控制NAc中的ΔFosB水平 体内。 为了解决这个问题,我们首先使用过表达CaMKIIα(T286D)的钙依赖性突变体的小鼠系在包括NAc在内的多个大脑区域(Mayford等,1996; Kourrich等,2012)。 我们在20天每天一次注射年龄匹配的成年雄性突变体和野生型同窝仔畜用14 mg / kg可卡因或盐水,然后在最后一次注射后一天分析动物。 我们发现在NAc壳中突变动物的ΔFosB基础水平增加(p = 0.0001; F = 9.207; df = 37),但不是核心(图5G和H.)。 令人惊讶的是,在壳和核心的突变动物中,ΔFosB的可卡因依赖性诱导被阻断,表明尽管CaMKII可以直接调节NAc壳中的ΔFosB稳定性,但它也可能位于NAc亚区中可卡因激活途径中ΔFosB的上游。 。

ΔFosB介导的结构和行为可塑性需要CaMKII活性

可卡因在NAc MSNs上诱导树突棘是这一大脑区域中最好的药物诱导适应之一,并且这种脊柱诱导与药物敏感的行为反应相关(Robinson和Kolb,2004; Russo等,2010并且据报道对D1型MSN具有选择性(Lee等人,2006)。 我们最近证明,NAc中树突棘的可卡因诱导依赖于ΔFosB及其下游转录程序(Maze等,2010)。 虽然有大量关于CaMKII参与树突棘形态学和其他大脑区域和实验系统诱导的文献(Jourdain等,2003; Penzes等,2008; Okamoto等人,2009),其在NAc MSN脊柱形成中的作用尚未研究过。 因此,我们通过利用HSV介导的与GFP融合的CaMKII抑制肽AC3I过表达来确定ΔFosB介导的MSN树突棘诱导是否需要CaMKII活性,GFP是一种先前显示抑制CaMKII活性的构建体。 体内 (Zhang等人,2005; Klug等,2012)。 成年小鼠NAc外壳中ΔFosB的病毒过度表达导致MSN树突棘密度显着增加(p <0.0001; F = 8.558; df = 59; 图6A和B.)如先前报道(Maze等,2010),这种增加主要是由瘦(p = 0.0027; F = 5.319; df = 59)和粗短(p = 0.0378; F = 2.988; df = 59)脊柱类型(均被认为是未成熟的刺)驱动的(图6C-E)。 在更成熟的蘑菇状刺上没有看到效果。 然而,当GFP-AC3I共表达时,ΔFosB诱导的脊柱被完全消除(图6A-E),表明在NAc壳中ΔFosB诱导树突棘需要CaMKII活性。

我们接下来使用相同的病毒工具来确定ΔFosB对可卡因的行为敏感性是否需要CaMKII活性。 在病毒注射到NAc壳中后72小时,给动物单次注射5 mg / kg可卡因并记录它们的运动活性。 如前所示,ΔFosB的AAV过度表达延长(图4A),HSV介导的ΔFosB过表达增加了对可卡因的运动敏感性(p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; 图6F)。 与树突棘的诱导一样,通过共表达GFP-AC3I对CaMKII活性的抑制完全阻断了ΔFosB介导的可卡因敏感性增加,表明ΔCosB诱导的可卡因行为效应改变需要CaMKII活性。

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讨论

本研究描述了一种新的前馈机制,其中可卡因诱导NAc中的ΔFosB,其在NAc壳中选择性地上调CaMKIIα基因的转录。. 随后CaMKIIα磷酸化并稳定ΔFosB,导致更大的ΔFosB积累并进一步诱导CaMKIIα(图6G)。 在长期暴露于可卡因期间,这两种蛋白质的同步水平有助于对药物敏感的行为反应的基本方式。 这是一个特别吸引人的假设,因为ΔFosB和CaMKII以前都被证明是增加对可卡因的行为反应所必需的。 (Pierce等人,1998; Peakman等人,2003),我们特别使用病毒方法在NAc壳中复制ΔFosB的这一发现(无花果4and66).

尽管D1型MSN中的转基因ΔFosB过表达可以驱动NAc壳和可卡因初生动物核心中的CaMKII诱导,但在可卡因的情况下,在两个亚区域中发生的内源ΔFosB的积累促使CaMKII特异性地在NAc壳中诱导。 。 这种差异可能与我们的转基因模型中诱导的ΔFosB水平较高有关,但也可能反映了可卡因差异改变壳中CaMKIIα启动子的能力。 核心MSN在前者中促进ΔFosB结合或在后者子区域中排除它。 事实上,我们的ChIP数据显示可卡因介导的仅在NAc核心中CaMKIIα基因启动子的组蛋白去乙酰化,支持染色质机制的可能参与。 与此假设一致,D1型MSN中的ΔFosB过表达能够在不存在可卡因的情况下驱动NAc核心中的CaMKIIα诱导(图3F),表明在慢性可卡因暴露期间存在阻止这种诱导的CaMKIIα启动子的活性修饰。 调节CaMKII启动子的染色质景观也可以解释为什么CaMKII是由可卡因在慢性可卡因戒断大鼠的NAc壳中的攻击剂量诱导的(图1E)但不是未经药物治疗的动物(图1D)。 这可能代表ΔFosB的表观遗传“基因启动”效应(Robison和Nestler,2011),因此可能是孵化可卡因渴望的一种分子机制(皮肯斯等人,2011)。 然而,由于这种染色质变化与渴望的孵化有因果关系,它必须随着时间的推移而增加。 确定是否是这种情况将是有趣的,并且研​​究其他基因是否显示可卡因对ΔFosB依赖性,亚区域特异性调节。 值得注意的是,我们描述的前馈回路不会导致CaMKII或ΔFosB的无限累积(图1E); 揭示对此负责的分子“制动”是未来研究的重要目标。

在几个实验系统和脑区域中ΔFosB和CaMKII的已知功能在许多水平上汇合 (图6F)。 两种分子都与树突棘生长密切相关:CaMKII与肌动蛋白细胞骨架相互作用(Okamoto等人,2009),调节脊柱头部大小(Matsuzaki等,2004,并且对于可塑性诱导的海马器官切片培养中丝状伪足和突触数量的增加是必要和充分的(Jourdain等,2003),w在NAc MSNs中,ΔFosB对于可卡因诱导的树突棘形成是必要和充分的(Maze等,2010)。 另外,两种分子都与AMPA谷氨酸受体的调节有关。 CaMKII不调节AMPA受体亚基的总水平,但通过在培养的海马锥体神经元中的Ser1磷酸化GluA831,驱动AMPA受体插入突触并增加AMPA通道电导。 体内 (评论于(Malinow和Malenka,2002; Colbran和Brown,2004))。 这种增加的GluA1向突触的运输也与慢性可卡因作用有关(Boudreau和Wolf,2005)。 此外,通过以D1多巴胺受体依赖性方式的CaMKIIα过表达,增强了对NAc中AMPA受体活化的行为反应(Singer等,2010)。 长期D1特异性过表达ΔFosB已被证明可诱导NAc中的GluA2转录(Kelz等人,1999),这抑制了通过GluA1介导的AMPA反应,而我们在这里显示短期ΔFosB过表达 - 以及短期可卡因暴露 - 对该亚基没有影响(图1)。 尽管如此,我们最近发现短期ΔFosB过表达降低了NAc中D1型MSN中的AMPA反应(Grueter等,2013)。 这些数据表明,时间上不同的机制可能构成对可卡因的神经适应性的时间依赖性系列,这些机制构成了成瘾进展的不同方面的基础,但尚不清楚。 在行为水平上,CaMKII和ΔFosB都是可卡因的运动致敏所必需的(见上文),并且两者都是啮齿动物持续可卡因自我给药所必需的(Colby等,2003; Wang等人,2010),表明这两种蛋白质对药物暴露的短期和长期行为适应都很重要,尽管通过部分不同的潜在机制。 据推测,ΔFosB和CaMKII通过NAc突触功能的变化来调节这种复杂的行为适应,尽管需要进一步的工作来直接将突触现象与行为改变联系起来。

CaMKII全酶同时与多种突触相关蛋白相互作用(Robison等,2005)它被认为可以调节其对突触后密度(PSD)的定位,这种现象被认为对突触可塑性很重要。 特别是,最近显示CaMKII与NMDA型谷氨酸受体的GluN2B亚基的相互作用调节突触可塑性和学习(Halt等,2012)。 虽然AC3I肽模拟CaMKII的自身抑制结构域,从而抑制酶催化活性,但它也阻断了多种蛋白质 - 蛋白质相互作用(Strack等,2000; Robison等,2005)。 因此,这里报道的HSV-GFP-AC3I的行为和形态学效应可能通过减少CaMKII靶蛋白的磷酸化,CaMKII靶向的变化或CaMKII在突触中提出的结构作用的变化而发生(Lisman等人,2002).

所提出的ΔFosB-CaMKII环对NAc壳的限制是特别值得注意的,因为最近的工作已经证明NAc壳和核心之间在可卡因给药方面存在几种生理差异,这一概念由我们的无偏iTRAQ(表S1)数据证实。 NAc壳中的MSN显示持续数周的慢性可卡因后的放电容量降低,而来自相同动物的核心MSN显示出​​短暂的(1-3天)放电容量增加,在2周内恢复到基础水平(Kourrich和Thomas,2009)。 此外,许多突触蛋白在NAc壳中受到差异调节 接触慢性可卡因的动物核心,包括GluA2(Knackstedt等,2010)。 由于慢性安非他明在NAc壳中特异性诱导CaMKIIα(Loweth等,2010),我们发现与可卡因有类似的效果也就不足为奇了。 然而,由于慢性可卡因在NAc壳和核心诱导ΔFosB(Perrotti等,2008由于我们证明壳中的CaMKIIα诱导是ΔFosB依赖性的,我们的发现为这两个亚区之间的CaMKIIα启动子的不同转录机制提供了新的证据,其负责选择性诱导壳中的CaMKIIα。

最近的大量工作都集中在描绘D1-和D2型NAc MSN之间的差异。 尽管D1和D2受体都参与了可卡因的奖赏效应 (自我,2010), 最近的研究表明,D1型MSN的光遗传激活会增加对可卡因的行为反应,而D2型MSN激活会产生相反的效果(Lobo等,2010)。 根据这些发现,D1受体敲除小鼠缺乏可卡因自我管理的获得(Caine等人,2007),虽然D2淘汰赛没有 (Caine等人,2002)。 直接进入NAc的D1激动剂可以在恢复范例中触发可卡因寻求行为(自我,2010)。 有趣的是,这种效应需要D1受体依赖性增加NAc壳中的CaMKII活性,但不是核心(Anderson等,2008),结果与这里提出的D1和壳特定的ΔFosB-CaMKII环很好地吻合。

我们以前报道过ΔFosB中的Ser27可被酪蛋白激酶-2磷酸化(Ulery等,2006然而,我们在这里建立的CaMKII在这个和其他位点磷酸化ΔFosB具有更大的动力学和化学计量,并且可以复制更高的表观Mr 观察ΔFosB(图5A)与可卡因接触 体内 (Nestler,2008)。 我们已经知道Ser27磷酸化增加ΔFosB的稳定性和转录活性(Ulery等,2006; Ulery和Nestler,2007; Ulery-Reynolds等,2009)。 今后的工作将集中于本研究所指出的ΔFosB磷酸化新位点的鉴定和功能后果。

这里描述的前馈回路提供了似乎合理的新机制,通过该机制,重复施用可卡因驱动NAc中的进行性异常。 因此,该生化途径可以为将来成瘾性疾病的治疗干预提供重要目标。 因为CaMKII普遍存在并且需要许多基础神经元和行为功能,所以已经避免直接使用CaMKII抑制剂作为成瘾治疗。 我们的数据表明,对于单个细胞类型和大脑奖赏回路的子区域特异性的CaMKII诱导机制的更微妙的靶向可以提供避免全身性CaMKII抑制的并发症的治疗靶标。

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致谢

这项工作得到了国家药物滥用研究所(EJN),NIDA-Yale蛋白质组学中心DA018343(AJR和EJN)和哈特韦尔基金会(AJR)的资助。 作者要感谢Gabby Rundenko为纯化的ΔFosB和Roger Colbran慷慨赠送纯化的CaMKIIα。

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