Proc Natl Acad Sci US A. 2005二月1; 102(5)：1737 1742。
抽象
可卡因是一种滥用药物，通过阻断轴突末端的多巴胺再摄取，增加纹状体中的突触多巴胺水平。 已经发现细胞周期蛋白依赖性激酶5（Cdk5）及其活化剂p35（参与有丝分裂后神经元中底物磷酸化的蛋白质）在长期暴露于可卡因后被上调。 为了进一步检查Cdk5和p35诱导对纹状体多巴胺信号传导的影响，我们产生了两个独立的转基因小鼠系，其中Cdk5或p35在神经元中特异性过表达。 我们在此报道，由于p5而不是Cdk35过表达导致Cdk5活性增加，导致可卡因介导的多巴胺信号传导减弱。 在Thr-5处Cdk32介导的多巴胺磷酸化和cAMP调节的磷蛋白，分子量32 kDa（DARPP-75）增加，伴随着Thr-32处DARPP-34的磷酸化降低。 在Thr-5处Cdk1介导的细胞外信号调节激酶激酶286的磷酸化增加伴随着细胞外信号调节激酶1 / 2的活化减少。 这些作用有助于减少可卡因诱导的cAMP反应元件结合蛋白的磷酸化以及减少纹状体中c-fos的诱导。 这些结果支持Cdk5活性参与长期暴露于可卡因后改变的基因表达的观点，因此影响可卡因成瘾的神经元功能的长期变化。
可卡因增加纹状体中的突触多巴胺水平，并通过激活细胞内途径来改变多巴胺能神经元中的基因表达，所述细胞内途径将多巴胺D1受体的初始信号传播至细胞核（1）。 慢性接触可卡因会上调几种转录因子，从而导致基因表达的长期变化，这种变化被认为是可卡因成瘾神经元适应的基础（2）。 ΔFosB，被鉴定为这样的转录因子（3），已被证明可以增强动物对可卡因的行为反应（4, 5）。 因此，预期通过ΔFosB诱导调节的靶基因的鉴定有助于更好地理解可卡因成瘾的分子机制。 最近，已经显示用可卡因慢性治疗动物通过诱导ΔFosB上调细胞周期蛋白依赖性激酶5（Cdk5）及其激活剂p35在纹状体中的表达（6, 7).
Cdk5是丝氨酸/苏氨酸激酶的Cdk家族的成员。 与作为细胞周期进展的主要调节因子的其他Cdk不同，Cdk5主要参与有丝分裂后神经元中底物的磷酸化。 (8）。 Cdk5活性的神经元特异性通过与其激活剂p35或p39的结合来实现，pXNUMX或pXNUMX主要在有丝分裂后神经元中表达（8）。 除了Cdk5在大脑发育中的重要作用（9, 10），我t也与出生后大脑的多巴胺能传递有关（11, 12）。 抑制Cdk5活性导致纹状体中多巴胺释放增加，表明Cdk5作为多巴胺释放的负调节因子的突触前功能 (11）。 此外，Cdk5通过在Thr-32磷酸化多巴胺和cAMP调节的磷蛋白，分子量32 kDa（DARPP-75）来调节突触后多巴胺信号传导的功效，其将DARPP-32转化为cAMP依赖性激酶（PKA）的抑制剂。 （12).
这些观察结果表明，Cdk5和p35是长期暴露于可卡因并因此导致可卡因成瘾后多巴胺信号传导延长激活的下游调节因子。 为了进一步解决Cdk5在纹状体多巴胺信号传导中的作用，我们产生了两个转基因小鼠系，其中Cdk5或p35在p35启动子控制下的神经元中特异性过表达。 我们的研究结果表明，随着p5蛋白水平的增加，Cdk35活性上调，而Cdk5蛋白没有上调，这表明p35蛋白的水平对Cdk5活性具有限速性。 我们在这里提供 体内 由于p5过表达导致Cdk35活性增加的证据导致可卡因介导的多巴胺信号通过抑制PKA和细胞外信号调节激酶（ERK）级联而减弱到细胞核。
材料和方法
抗体。 Cdk5（C-8）和p35（C-19）的多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology。 依赖于ERK激酶（MEK）1 / 2，ERK1 / 2和cAMP-应答元件结合蛋白（CREB）的磷酸化依赖性和非依赖性抗体获自Cell Signaling Technology（Beverly，MA）。 抗磷酸化Thr-34 DARPP 32的抗体（13），磷酸-Thr-75 DARPP-32（12），总DARPP-32（12）和c-fos（14如所述使用。 肌动蛋白抗体购自Sigma。
实验动物。 我们之前克隆了小鼠p35基因 Cdk5r1，编码p35蛋白，并表征其基因组结构（15）。 为了产生具有神经元过表达p35（Tgp35）的转基因小鼠，6-kb 生态RI-生态将含有1.2-kb启动子区的RI片段亚克隆到pGEM9Z（ - ）质粒中，并将源自SV45的40-bp标签插入到pGEMXNUMXZ（ - ）质粒中。 KPN我站在聚合物的下游（A.+）信号（图。 1A）。 标签包含一个 SPE我站点进行动物基因分型。 从质粒切下6-kb片段并纯化，然后原核注射转基因以产生转基因小鼠。 检查在1.2-kb p35启动子的调节控制下转基因的表达谱 体内通过使用两步育种策略进一步产生双转基因小鼠（Tgp35; p35 - / - ），其中Tgp35小鼠在内源性p35-null背景中再生。 本研究中使用的其他小鼠模型包括p35 +/-，p35 - / - ，Cdk5 +/-，以及具有Cdk5神经元过表达的转基因小鼠（TgCdk5）（9, 16, 17）。 通过对从尾部活组织检查分离的基因组DNA进行Southern印迹分析或PCR来确定这些小鼠的基因型。 将小鼠圈养在12-h light / 12-h黑暗循环下。 所有护理均符合美国国立卫生研究院关于实验室和实验动物护理和使用的指导原则。
Southern印迹分析。 从尾部活组织检查中提取的基因组DNA用 生态RI和 SPEI，在0.9％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜上。 将膜与随机引发的杂交 32P标记的探针在42℃下过夜。 通过使用以下引物通过PCR产生用于p485敲除（p35 - / - ）和Tgp35小鼠的基因分型的35-bp探针：5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3'和5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'。 将杂交的膜在2×SSC / 0.1％SDS中在42℃下洗涤两次，持续10 min，在0.1×SSC / 0.1％SDS中在65℃下洗涤两次，持续20 min，并暴露于X射线胶片。
药物治疗。 将可卡因（Sigma）溶解在无菌盐水中。 在15月龄时给动物腹膜内注射可卡因（3 mg / kg）或等体积的盐水，并在注射后在不同时间点（15，30，60和120 min）通过断头处死。 迅速取出脑并在冰冷的PBS中冷冻。 然后解剖出纹状体并进行Northern或Western印迹分析。 对于免疫组织化学分析，在注射后从小鼠2 h获得纹状体切片。
Northern印迹分析。 用TRIzol试剂（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA）从纹状体中提取总RNA，并如所述进行Northern印迹分析（18）。 为了检测c-fos mRNA，使用小鼠c-fos cDNA的189-bp片段作为探针（如上所述）（19）。 通过使用具有图像软件1.62的图像分析系统，通过测量特定条带的光密度来定量c-fos mRNA的水平。
蛋白质印迹分析。 将纹状体组织在1％SDS中超声处理并煮沸10 min。 通过BCA蛋白质测定（Pierce）测定每个样品中的蛋白质浓度。 通过SDS / PAGE分离等量的蛋白质，然后转移到硝酸纤维素膜上。 将膜在含有1％脱脂乳和5％Tween 0.05的20×PBS中封闭，并与第一抗体在4℃下孵育过夜。 在室温下用过氧化物酶缀合的抗小鼠或兔IgG（Sigma）孵育60 min。 通过增强的化学发光（Pierce）检测信号，并如上所述量化条带的光密度。
Cdk5激酶测定。 用裂解缓冲液制备纹状体裂解物，所述裂解缓冲液由50 mM Tris·HCl，pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1％Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM苯甲基磺酰氟/1μg/ ml抑肽酶/1μg/组成。 ml亮抑蛋白酶/磷酸酶抑制剂（磷酸酶抑制剂混合物I和II，Sigma）。 用抗Cdk5（C-8）或抗p35（C-19）抗体免疫沉淀裂解物。 通过将5μl裂解物（对应于300μg蛋白质）与抗Cdk300抗体（5μg）在3℃温育过夜，然后用4μl蛋白A-琼脂糖珠（25）进一步孵育来制备Cdk50免疫沉淀物。裂解缓冲液中的浆液％; Santa Cruz Biotechnology）在3℃下4 h。 为了制备p35免疫沉淀物，将500μl裂解物（对应于1 mg蛋白质）与如上所述的抗p35抗体（3μg）一起温育。 用裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物两次，用由50 mM Tris·HCl，pH 7.4 / 5 mM MgCl组成的激酶缓冲液洗涤两次。2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT，重悬于60μl激酶缓冲液中。 通过使用组蛋白H1作为底物测量激酶活性（18).
免疫组化。 通过腹膜内注射阿佛丁（250 mg / kg，Fluka）麻醉小鼠，并用0.1 M磷酸钠缓冲液，pH 7.4经心脏灌注，然后用Streck Tissue Fixative（Streck Laboratories，La Vista，NE），非交联固定剂灌注。 将解剖的脑在37℃下在相同的固定剂中进一步固定过夜。 然后，将脑包埋在石蜡中，切成5-μm厚的冠状切片，并使用抗生物素蛋白 - 生物素 - 过氧化物酶复合物技术（Vector Laboratories）以二氨基联苯胺作为底物进行免疫组织化学。 将切片与亲和纯化的针对c-fos的多克隆抗体在4℃下孵育过夜。 通过省略一抗来评估染色特异性。
成果
具有神经元过表达p35的转基因小鼠的产生。 用于实现p35神经元表达增加的转基因包含克隆的小鼠p6基因的35-kb片段，该基因含有1.2-kb启动子和p35的完整编码序列（图。 1 A）。 通过使用设计用于区分p35 - / - 和Tgp35小鼠与野生型小鼠的探针，通过Southern印迹分析测定小鼠的基因型（图。 1 A 和 B)。 为了检查在1.2-kb p35启动子控制下的转基因表达，我们产生了双转基因小鼠（Tgp35; p35 - / - ），其中p35表达仅由转基因驱动。 TgX35; p35 - / - 小鼠中的p35表达仅在脑中观察到（图。 1C），其中空间表达模式类似于野生型小鼠（图。 1D）。 缺乏p35已被证明会导致小鼠大脑皮质和海马的异常分层结构（10）。 然而，Tgp35; p35 - / - 小鼠显示完全拯救p35 - / - 脑表型（图。 1E）。 这些数据表明1.2-kb p35启动子控制转基因的表达，其具有与来自内源性p35基因的p35相似的表达谱。
p35蛋白水平对于Cdk5活性的上调是限速的。 我们检测了编码p35和Cdk5的基因对来自p35 - / - ，p35 +/-，野生型，Tgp35，Cdk5 +/-和TgCdk5小鼠的纹状体提取物中蛋白质表达的基因 - 剂量效应，所述小鼠在3月龄时。 p35和Cdk5蛋白的水平分别与基因剂量相关（图。 2 A 和 B）。 与野生型小鼠相比，Tgp35小鼠显示p1.6蛋白水平的≈35倍增加，而Cdk5蛋白水平不受p35蛋白的不同水平的影响。 与野生型小鼠相比，TgCdk5小鼠显示Cdk1.9蛋白水平增加约15倍，而p35蛋白水平不受不同水平的Cdk5蛋白的影响。 为了检查不同量的p35蛋白对Cdk5活性的影响，用抗Cdk5抗体从纹状体提取物中免疫沉淀Cdk5，并测量激酶活性。 同样地，为了检查不同量的Cdk5蛋白对激酶活性的影响，用抗p35抗体从纹状体提取物中免疫沉淀p35，并测量激酶活性。 Cdk5活性与p35蛋白水平相关，但与Cdk5蛋白水平无关（图。 2 C 和 D）。 这些结果表明p35蛋白的量是Cdk5活性的限速因子。 因此，我们使用Tgp35小鼠来研究增加的Cdk5活性对纹状体多巴胺信号传导的影响。
可卡因诱导的Thr-32中DARPP-34的磷酸化在Tgp35小鼠中被减毒。 DARPP-32的功能取决于其在多个位点的磷酸化状态（20）。 PKA使Thr-32处的DARPP-34磷酸化，而Cdk5使Thr-32处的DARPP-75磷酸化。 因此，我们检测了来自野生型和Tgp32小鼠的纹状体提取物中DARPP-35的磷酸化状态。 Tgp75小鼠中磷酸化Thr-32 DARPP-35的水平较高（图。 3A; 1.6±0.2倍于野生型小鼠的值）。 我们接下来评估了增加的Cdk5活性对纹状体多巴胺信号传导的影响。 我们通过分析Thr-35处DARPP-32的磷酸化状态检查了Tgp34小鼠中可卡因诱导的PKA活化。 注射可卡因后，野生型小鼠34 min中磷酸化Thr-32 DARPP-15水平升高（图。 3B; 1.8±0.2-高于基础水平）。 然而，可卡因对DpPP-34的Thr-32磷酸化的作用在Tgp35小鼠中减弱（1.2±0.3-倍于基础水平）。 这些结果表明，Cdk5活性的增加可能通过Thr-32处的DARPP-75磷酸化减弱可卡因诱导的PKA活化（6, 12）。 突触前Cdk5活性的增加也可能导致多巴胺释放减少，并且这有助于降低可卡因的作用。 值得注意的是，单次注射可卡因不会影响p35和Cdk5蛋白的水平以及激酶活性（图。 3 C 和 D）。 这与先前的研究相反，后者已显示长期暴露于可卡因可上调p35和Cdk5的表达（6).
Cdk5活性的上调减弱了可卡因诱导的ERK1 / 2活化。 最近的证据表明，纹状体中的多巴胺受体激活也激活了其他信号级联，包括ERK通路（21, 22），在对可卡因的行为反应中起重要作用（23）。 因此，我们检查了Cdk5活性是否可能影响可卡因诱导的ERK途径激活。 在野生型小鼠的纹状体提取物中注射可卡因后，观察到ERK途径的激活，这可通过Ser-1和Ser-2（217±221倍于基础水平）和ERK1.5的MEK0.2 / 1磷酸化显着增加来证实。 / 2在Thr-202和Tyr-204（ERK2磷酸化：1.5±0.2倍于基础水平）（图。 4 A 和 B）。 然而，可卡因诱导的MEK1 / 2激活（1.2±0.2倍于基础水平）和ERK1 / 2（ERK2磷酸化：1.2±0.2倍于基础水平）在Tgp35小鼠中减弱（图。 4 A 和 B）。 此外，Tgp1小鼠中磷酸-ERK2 / 35的基础水平较低（0.8±0.2-折叠低于野生型小鼠的值），而这种趋势没有统计学意义。 后一结果可能归因于Thr-5处的MEK1的Cdk286依赖性磷酸化，导致催化活性降低（24）。 为了评估这种可能性，我们检测了Thr-1中MEK286的磷酸化状态，发现来自Tgp286小鼠的纹状体提取物中存在更高水平的磷酸化Thr-1 MEK35（图。 4C; 1.3±0.1倍于野生型小鼠的值）。 此外，Thr-1的MEK286的磷酸化状态未被单次注射可卡因改变，这与Cdk5活性不受治疗影响的发现一致（图。 3D).
Cdp5活性增加可减弱多巴胺信号向细胞核的传播。 可卡因诱导的涉及PKA和ERK的多个信号级联激活导致随后通过其在Ser-133处的磷酸化激活细胞核中的转录因子CREB（22, 25）。 为了研究Cdk5介导的对PKA和ERK活化级联的抑制作用是否可以收敛于细胞核中的CREB磷酸化，我们检测了来自野生型和Tgp133小鼠的纹状体提取物中Ser-35处CREB的磷酸化状态。 Tgp35小鼠的磷酸化CREB基础水平较低（野生型小鼠0.7±0.1倍）（图。 5）。 在注射可卡因后，野生型小鼠纹状体磷酸化CREB水平升高（1.5±0.1倍于基础水平），但对Tgp35小鼠的可卡因反应减弱（1.2±0.1-折叠在基础水平之上）（图。 5).
Ser-133上CREB的磷酸化通过某些基因（包括c-fos基因）启动子区域中的cAMP反应元件增强其转录活性（26）。 因此，我们检测了可卡因注射后野生型和Tgp35小鼠纹状体中c-fos的诱导。 在野生型小鼠中，c-fos mRNA水平在注射可卡因后增加至峰值（1.8±0.2倍于基础水平）30 min，并且随后在注射后通过120 min返回基础水平（图。 6 A 和 B）。 然而，Tgp30小鼠的c-fos mRNA水平比野生型小鼠低约17NUMX％，直至注射后35分钟（图。 6 A 和 B）。 通过免疫组织化学进一步证实了Tgp35小鼠中c-fos的较低诱导作用（图。 6 C–F）。 在野生型和Tgp35小鼠中，可卡因给药增加了c-fos免疫反应性，在纹状体的背内侧 - 背侧中部强烈增强，而在外侧部分则弱。 然而，可卡因诱导的c-fos免疫阳性细胞数量的增加在Tgp35小鼠的纹状体中显着减弱（图。 6G）。 总之，这些结果表明在Tgp35小鼠中可卡因介导的纹状体多巴胺向细胞核的信号传导受到抑制，这可能是Cdk5活性增加的结果。
讨论
Cdk5及其激活剂p35已被鉴定为长期暴露于可卡因上调的靶基因 (6). 我们在这里报告证据表明，由于p5上调而不是Cdk35上调，Cdk5活性增加导致纹状体神经元中可卡因介导的多巴胺信号传导减弱。 为了检查上调Cdk5或p35的表达对纹状体多巴胺信号传导的影响，分析了两种转基因小鼠系，TgCdk5和Tgp35小鼠。 我们发现Cdk5活性与p35蛋白水平升高成比例上调，但不受Cdk5蛋白水平升高的影响。 我们之前的报告还证明，当使用Cdk5免疫沉淀物测量活性时，TgCdk5小鼠脑中的Cdk5活性低于野生型小鼠脑中的CdkXNUMX活性（17），表明如果p5水平没有增加，Cdk5过表达导致单体Cdk35水平增加。 这些结果表明p35蛋白的水平是Cdk5活性的限速因子。
在急性注射可卡因后，Tgp35小鼠在纹状体中表现出较弱的CREB磷酸化和c-fos诱导，表明纹状体对可卡因的反应受到Cdk5活性增加的抑制。 Tgp35小鼠中可卡因介导的多巴胺信号传导的减弱可能是通过Cdk5介导的涉及DARPP-32，PKA和ERK的多个信号级联的抑制来实现的。 在野生型小鼠中，可卡因给药增加了Thr-32处DARPP-34的PKA磷酸化，而这种应答在Tgp35小鼠中减弱。 在Thr-32中DARPP-34的PKA磷酸化已显示抑制蛋白磷酸酶1（PP1）的活性，PPNNXX是负责CREB的Ser-133去磷酸化的酶（27）。 因此，在Tgp1小鼠中不会通过DARPP-32 / PP1途径拮抗PP35活性。
在Tgp1小鼠中，可卡因诱导的ERK2 / 35活化也减弱。 Cdk5可以通过几种不同的机制抑制可卡因诱导的ERK1 / 2活化。 首先，在Thr-5处的DARPP-32的Cdk75依赖性磷酸化可以抑制PKA，导致随后抑制ERK1 / 2活化所需的任何PKA介导的MEK1 / 2激活。 最近的一项研究还发现DARPP-32在Thr-34的磷酸化是可卡因介导的ERK1 / 2激活的必需途径，涉及间接调节MEK活化的多种途径，以及涉及调节富含纹状体的磷酸酶，即酪氨酸直接作用于ERK1 / 2的磷酸酶（28）。 在Tgp1小鼠中，在Ser-2和Ser-217中可卡因诱导的MEK221 / 35磷酸化被废除的发现表明了对这种可能性的支持。 另一种可能的途径是通过Thr-5的MEK1的Cdk286依赖性磷酸化，这将导致其催化活性降低并导致ERK1 / 2活性的抑制（24).
已显示抑制纹状体中的Cdk5活性可加强动物中慢性可卡因治疗的行为效应（6）。 符合以下假设：Cdk5活性的上调可能有助于神经元适应以抵消重复可卡因给药的影响 (6），我们发现Cdk5介导的DARPP-32和MEK1的磷酸化有助于减少可卡因诱导的ERK1 / 2活化，导致纹状体中CREB磷酸化和c-fos的诱导较少。 我们的研究结果支持这样的观点，即由于p5上调，增加的Cdk35活性可能在长期暴露于可卡因后改变纹状体中的基因表达。 这可能通过转录因子如CREB和c-fos的活性变化而发生。 因此，Cdk5激活剂p35凭借其对Cdk5活性的限速作用，可能导致可卡因成瘾的神经元功能的长期变化。.
致谢
我们感谢Drs。 Mary Jo Danton，Philip Grant和Sashi Kesavapany对手稿的批判性阅读。 这项工作得到了美国国立卫生研究院资助Z01DE00664-05（ABK），美国公共卫生服务基金DA10044以及西蒙斯基金会，Peter J. Sharp基金会和Picower基金会（PG）的资助。
缩写：Cdk5，细胞周期蛋白依赖性激酶5; ERK，细胞外信号调节激酶; DARPP-32，多巴胺和cAMP调节的磷蛋白，分子量32 kDa; PKA，cAMP依赖性激酶; MEK，ERK激酶; CREB，cAMP-反应元件结合蛋白。
参考资料
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