公共科学图书馆之一。 2010; 5(10)：e15401。
抽象
模式完成，检索由部分线索启动的完整存储器的能力，是存储器过程的关键特征。 然而，关于该过程的分子和细胞机制知之甚少。 为了研究多巴胺在记忆回忆中的作用，我们分析了多巴胺转运蛋白杂合基因敲除小鼠（DAT+/-），并发现虽然这些小鼠在完全提示条件下具有正常的学习，巩固和记忆记忆，但在部分提示条件下它们的模式完成表现出特定的缺陷。 低剂量的多巴胺拮抗剂氟哌啶醇可以逆转多巴胺转运蛋白杂合基因敲除小鼠中的这种记忆回忆缺陷，可以进一步证实不能恢复记忆模式是多巴胺失衡的结果。 因此，我们的研究结果表明，对大脑多巴胺水平的精细控制对于联想记忆回忆中的模式完成至关重要。
介绍
记忆回忆涉及对先前获得的信息的重述 [1], [2]。 根据召回条件的状态，记忆检索可以与学习相关的大多数或所有先前遇到的线索发生（例如，同时看到一个人并听到他的声音，或重新访问变化不大的家乡等）。 另一方面，在许多情况下，通常仅在最初提示的子集存在时才进行内存检索（例如，在只有几个旧地标保持不变的情况下重建家乡的旧街道地图）。 这被称为模式完成，其中大脑从部分外部线索或自我启动的内部过程中重建并检索整个记忆模式。 目前，关于记忆记忆模式完成的实际分子和细胞机制知之甚少。 然而，新兴研究表明，单胺信号传导可能在记忆恢复中发挥作用 [3].
在这项研究中，我们开始研究调节性神经递质多巴胺如何在部分线索回忆期间调节记忆模式完成中发挥作用。 多巴胺是一种重要的神经递质，可影响认知，情绪和运动。 多巴胺能传递异常与许多精神病和神经病有关，包括注意力缺陷和多动症（ADHD），精神分裂症和帕金森氏病 [4]–[8]。 虽然多巴胺能神经元仅起源于腹侧被盖区和黑质致密区，但它们的输出几乎遍布大脑的任何部位，包括前额叶皮层，内侧颞叶和海马区，已知在记忆检索期间被激活的区域l [3], [9]–[14].
还应该注意的是，多巴胺被认为对于由大脑区域介导的注意力和工作记忆在功能上是至关重要的 [15]–[18]，这两者都是在部分线索条件下的记忆检索过程中暗示的 [19]. 作为终止多巴胺信号传导的主要细胞机制，位于神经元突触前末梢的多巴胺转运蛋白（DAT）将多巴胺从突触间隙重新吸收回多巴胺能神经元。 因此，DAT是调节多巴胺突触水平的关键分子，并因此确定局部神经回路上多巴胺作用的持续时间。 实际上，多巴胺转运蛋白基因的基因敲除导致严重的损伤。 纯合DAT-KO小鼠患有明显的异常，包括生长迟缓，强烈的运动机能亢进和许多其他损伤，包括习惯性和社交互动缺陷以及肠道蠕动受损，呼吸控制等。 [6], [20], [21]。 纯合DAT-KO小鼠的整体缺陷使其不太适合探测多巴胺在调节记忆过程中的作用。
有趣的是，杂合子敲除小鼠（DAT+/- 仍然具有功能性DAT基因的等位基因的小鼠，其总体行为似乎非常正常 [6], [20], [21]。 因此，DAT+/- 小鼠可以为研究一些微妙但重要的表型提供有价值的模型，例如联想记忆过程，以及由多巴胺能电路调节的相关机制。 在这里，我们使用一组行为范例来评估多巴胺不平衡对联合记忆回忆期间模式完成的功能影响。
成果
为了研究多巴胺在记忆恢复中的作用，我们使用了杂合多巴胺转运蛋白敲除小鼠（DAT+/-）。 我们采用了一系列基本的行为测量来评估他们的开放场运动活动（图1A），旋转杆表演（图1B和1C），并发现这些杂合基因敲除小鼠是完全正常的。 我们也确认了DAT+/- 通过高架十字迷宫测量，小鼠在焦虑水平上表现出难以区分的表现（图1D).
此外，我们评估了DAT中的基本学习和记忆功能+/- 老鼠。 首先，我们使用新的物体识别测试并观察到这些小鼠在1日保留测试中显示出与其野生型同窝对照相比完全正常的行为表现（图1E）。 此外，这些小鼠也表现出正常的1天恐惧条件保留，这与其野生型对照小鼠无法区分（图1F）。 因此，这些结果表明了DAT+/- 在这两种形式的主记忆测试中，小鼠具有正常的学习和记忆功能。
空间参考存储器测试先前已用于评估存储器调用的模式完成。 我们接受了DAT+/- 小鼠和野生型控制这项任务。 使用先前描述的空间参考存储器协议 [22]，我们将这些老鼠训练在隐藏平台的水迷宫中。 培训包括每天四次试验，试验间隔一小时。 我们发现了DAT+/- 小鼠和野生型小鼠在10日期和相似的游泳速度下显示出相当的学习和记忆巩固（图2A和2B).
接下来，我们在最后一次培训课程结束后的第一天，在1日使用探针测试（P11）检查了他们对隐藏平台位置的记忆。 通过象限占用来衡量，两者都是DAT+/- 小鼠和他们的对照同窝小鼠能够在完全提示的情况下将他们的搜索集中在目标象限中（图3A）。 而且，DAT+/- 小鼠在幻影平台区域也表现出强烈的偏好，与对照组的平台占用相比没有差异（图3B）。 此外，正如预期的那样，都是DAT+/- 小鼠和野生型同窝小鼠的交叉数量显着增加（图3C）。 因此，所有这些测量都表明DAT+/- 小鼠可以正常学习这个任务，并且通常在全提示条件下检索这个联想记忆。
为了确定多巴胺的微妙平衡对于部分提示条件下的模式完成是否必不可少，我们在第二天通过去除四个远端线索中的三个（第2天）进行第二次探针测试（P12）。 为避免先前召回会议可能消失，在P4探针测试后1小时再进行一次（1试验）培训。 在这个部分线索探针试验期间，当对照小鼠继续将其搜索时间集中在目标象限而不是其他象限时，DAT+/- 通过目标象限占用率测量的小鼠仅表现出机会水平的表现（图3D）。 此外，测量虚拟平台区域的占用率进一步证实了这些DAT+/- 小鼠在记住平台位置时受损（图3E）。 平台过境数量的增加也表明这种检索缺陷（图3F），而野生型同窝小鼠完全有能力进行部分线索记忆回忆。 因此，这些数据表明了DAT+/- 小鼠缺乏在部分提示条件下检索空间参考记忆。
最后，我们询问是否可以在这些DAT中恢复模式完成+/- 小鼠使用药理学方法。 据报道，低剂量的多巴胺拮抗剂氟哌啶醇可用于缓解某些多巴胺紊乱 [20]。 基本原理是，低剂量的氟哌啶醇可能在一定程度上抑制由于正常多巴胺转运蛋白基因的一个等位基因缺失而导致多巴胺再摄取不足的杂合小鼠中升高的多巴胺的作用。 我们将同一组小鼠应用于救援实验。 在第13天和第14天，我们使上述小鼠在全提示条件下进行第三次探针试验（P3），并在部分提示条件下进行第四次探针试验（P4）。 同样，为了抵消探针试验期间可能发生的任何灭绝，我们在完成P4或P1探针测试后再进行了一次训练2小时的阻断（3试验）。 我们对P3探针测试中目标象限占用率的测量结果显示了DAT+/- 小鼠和对照同窝小鼠在有完整线索的情况下将搜索集中在目标象限中（图4A）。 此外，平台占用率的测量再次证明了他们正常的记忆回忆（图4B）以及平台过境点的数量（图4C）。 因此，这些突变小鼠完全能够在全提示条件下检索空间记忆。
在14当天，我们移除了四个远端线索中的三个并在部分线索条件下进行了第四次探针试验（P4）。 我们注入了DAT+/- 小鼠腹腔注射低剂量氟哌啶醇（0.002 mg / kg体重），保留试验前30分钟。 野生型同窝仔畜接受盐水注射作为对照。 我们发现了DAT+/- 小鼠将其搜索时间集中在目标象限中，并且与野生型对应物相比，显示出统计学上相似的表现（图4E）。 此外，虚拟平台区域的占用率的测量进一步证实了这些DAT+/- 老鼠可以回想起平台的位置（图4F）。 他们正常的记忆回忆再次通过平台交叉数量的增加得到证实，平台交叉数量与野生型小鼠的数量相同（图4G）。 因此，这些实验表明最初在DAT中观察到的模式完成缺陷+/- 小鼠可能由多巴胺不平衡引起。
为了排除在P4探针试验中注射氟哌啶醇的表型的结果是由于在重复探针试验期间过度训练的可能性，我们使用另一组DAT+/- 并控制同窝仔并重复整个实验。 正如预期的那样，都是DAT+/- 小鼠及其野生型小鼠在10日训练期间表现出良好的学习率（图5A）。 在11当天，我们对这些小鼠进行全线回忆测试，DAT之间的记忆保持测试结果没有显着差异+/- 通过象限占用测量的小鼠和对照同窝小鼠（图5B），目标象限占用率（图5C），以及平台过境点的数量（图5D）。 完成全提示探针测试后一小时，我们再训练这些小鼠再进行一次训练，以防止任何消退效应。 在第12天，对这些小鼠进行部分提示回忆测试。 在部分线索试验前几分钟，将对照组的低剂量氟哌啶醇（或盐水）注射到小鼠腹膜内30中。 我们发现这种治疗确实导致突变小鼠的正常表现。 突变体和对照小鼠在象限占用中表现出相当的表现（图5E），目标象限占用率（图5F），以及平台过境点的数量（图5G）。 他们的游泳速度的测量也显示没有差异（图5H）。 因此，这些数据清楚地证明了DAT中获救的部分线索检索缺陷+/- 氟哌啶醇小鼠不是由于在多次探针试验中反复过度训练。
讨论
众所周知，多巴胺系统对许多认知过程的调节至关重要 [8], [16]–[18], [23]–[25]，我们目前的研究首次提供证据表明，由于正常多巴胺转运蛋白基因的一个等位基因的丢失而导致的多巴胺失衡导致在关联空间记忆回忆期间模式完成的特定缺陷。 这种记忆回忆缺陷仅在部分空间线索条件下才会明显，但在全线条条件下则不然。 此外，这种记忆回忆缺陷似乎反映了高度特异性的记忆缺陷形式，因为基本行为（开放场运动，旋转杆和焦虑）和其他形式的记忆（如情境恐惧条件反射和新物体识别）的广泛方面仍然正常。
有几种潜在的分子和细胞情景可能共同促成观察到的空间部分线索引发的回忆缺陷，其中多巴胺被认为是这种记忆过程的主要候选分子，这是因为注意力和工作记忆，主要由据报道，多巴胺信号对于检索空间记忆至关重要 [15]–[18], [26]。 众所周知，仅来自腹侧被盖区和黑质致密部的多巴胺能神经元投射到大脑的几乎所有地方，包括前额叶皮质，内侧颞叶和海马。 [5], [19], [27]–[28]，已知在记忆检索期间被激活的区域以及注意过程 [3], [9]–[14], [29], [30]。 鉴于大量证据表明多巴胺对注意力和工作记忆至关重要 [15]–[18] 并且认为DAT基因中的遗传多态性与ADHD有关 [31]–[33]，注意力和工作记忆都可能在部分提示条件下通过DAT介导的多巴胺调节在记忆检索的模式完成中发挥作用。 因此，在DAT杂合突变小鼠中观察到的记忆模式完成缺陷可能是由于小鼠无法满足因突触多巴胺干扰引起的基于部分提示的记忆回忆期间增加的注意力需求。
根据在帕金森氏病患者中观察到的临床痴呆，我们的发现多巴胺失衡导致记忆恢复不足也很有趣。 这些患者通常似乎保留学习，巩固和储存新记忆的能力，但在记忆的获取方面受到极大的损害，尤其是在部分外部线索或自我引发的回忆下 [34], [35]。 当没有明确的线索时，这种赤字尤为严重 [8], [23], [34]–[36]，从而进一步表明多巴胺可能参与了记忆调用过程。 帕金森氏病患者的这些记忆力缺陷类型与其他神经递质系统的记忆力缺陷形成鲜明对比 [37] 或阿尔茨海默氏病患者的早期痴呆症，这些患者通常在学习和巩固新记忆时受损，同时保留了回忆旧记忆的能力 [34], [35]。 这说明了开发不同治疗策略的需要，因为存储器电路中不同的分子和时间过程存在不同的脆弱性。
我们的证据表明，在回忆时通过注射haloperiodol可以完全挽救模式完成，这强化了关于平衡多巴胺水平在记忆检索中的作用的想法。 该药理学拯救实验提供了导致基于部分线索的回忆缺陷的时间特异性的额外证据。 应注意DAT中的多巴胺功能障碍+/- 小鼠和帕金森病患者之间的差异很大，但是两者都导致模式检索缺陷。 这种共通性为以下观点提供了集体支持：多巴胺系统的微妙平衡对于记忆检索至关重要，并且任一方向（向上或向下）的不平衡都会导致召回期间记忆模式完成的不足。 重要的是，我们要指出，我们目前的分析不应被解释为使用DAT突变小鼠作为帕金森氏病模型的证据。 另一方面， 体内 DAT纯合基因敲除小鼠中多巴胺的测量显示由爆发刺激引发的多巴胺释放显着减少 [38]–[40]。 这表明在敲除小鼠的各个大脑区域中，将神经活动爆发转化为多巴胺信号的能力可能不足。 可以想象，减少的多巴胺比变化会导致记忆过程所涉及的神经回路内放电模式的生理变化发生改变。 目前，尚不清楚在DAT杂合敲除小鼠中还是在帕金森氏病患者中是否也发生了类似的改变。
虽然关于在空间记忆回忆期间激活的神经回路知之甚少，但它很可能会招募多个区域，包括前额叶皮层，内侧颞叶皮层和海马体。 这非常符合解剖学证据，即腹侧被盖区域的多巴胺能输出大量突出到腹侧CA1区域和内嗅皮质[13], [28]。 这种前额叶 - 海马 - VTA环可能在产生情境熟悉方面起着至关重要的作用，反过来，通过促进多巴胺调节的注意力，促进基于部分线索的空间记忆回忆期间的模式完成 [3], [14], [26], [28]。 在未来的研究中，进一步确定观察到的模式完成缺陷所源自的解剖位点将是重要的。 使用药理学，遗传学和大规模体内记录技术研究候选位点，如前扣带皮层，颞叶皮层和海马体将特别有趣 [11], [41]–[44]。 评估遗传补偿或突变脑中的缓慢变化是否有助于观察到的回忆缺陷也很重要。 还有迹象表明，其他神经递质系统也可能在记忆检索的调节中起到关键作用 [3], [37], [45], [46]，检查和比较部分线索触发模式完成和完全基于线索的内存检索之间的动态交互将是非常有趣的。 总之，我们的研究表明多巴胺水平的微妙平衡对于联合空间记忆回忆期间的模式完成至关重要。
材料和方法
道德声明
该研究中描述的所有动物工作均根据NIH指南进行，并由佐治亚州医学院的机构IACUC委员会批准（批准AUP号：BR07-11-001）。
突变小鼠的生产和基因分型
DAT小鼠是芝加哥大学肖小庄博士实验室的慷慨捐赠。 DAT杂合敲除小鼠的繁殖和基因分型与所述相同 [6]。 对于我们的实验，雄性和雌性小鼠同样以1的比例使用![[比]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
1。 用于DAT的PCR+/- 按照描述的方案跟踪小鼠 [6]。 将所有小鼠维持在佐治亚医学院动物设施的标准条件（23.1℃，50.5％湿度）下。 所有实验均在隔音和专业行为室进行。 所有实验者都对个体动物的基因型视而不见。
新型目标识别任务
实验方案与前面描述的相同 [37], [47]。 简言之，将小鼠单独习惯于开放场盒（20×20×10高英寸）3天。 在训练期间，将两个新物体放置在露天场地中，并允许动物探索15 min。 记录了探索每个物体所花费的时间。 在一小时的召回测试中，将动物放回到同一个盒子中，其中一个熟悉的物体在训练期间被一个新物体取代，并允许自由探索15 min。 使用偏好指数，探索两个对象（训练会话）中的任何一个（训练会话）或新探对象（保留会话）所花费的时间与探索两个对象所花费的总时间的比率，用于测量识别记忆。
开场和旋杆测试
协议与描述的相同 [48]。 为了测量旷场活动，将小鼠置于由14×14英寸黑盒子制成的开放场中。 盒子用2×2英寸小方格网格标记（7方格7方格，总共49方格）。 通过小鼠在3分钟期内通过的杂交数测量动物的开放野外活动。 为了测量Rota-rod测试，将小鼠置于加速旋转的木杆上。 该棒长12，直径1英寸。 初始转速为4 rpm，然后稳定加速至40 rpm。 通过在五分钟或一小时召回测试期间小鼠设法保持在旋转杆上的时间量（以秒为单位）来测量性能。
高架加迷宫测试
协议与描述的相同 [49]。 高架十字迷宫由不锈钢制成，漆成哑光黑色，由四个臂组成（两个开口没有墙壁，两个由15.25厘米高墙围住）30厘米长，5厘米宽。 迷宫的每个臂都连接到坚固的金属腿上，使得它在其搁置的桌子上方高出40厘米。 通过在迷宫上方放置231 cm的数码相机（Logitech Camera，型号N130）记录活性。 测试在昏暗的光线下进行（一个40-W和一个60-W软白色灯泡，两者都成角度以在迷宫上产生间接照明）在昼夜周期的光照阶段（在0900 h和1400 h之间）。 在测试之间用5％乙酸清洁迷宫。 白噪声（30 dB）掩盖了无关的背景噪声。 在测试当天，将动物放入其家笼中的测试室中，然后将每对动物从其家笼中取出并放置在单独的保持笼中用于5 min，然后将其放置在迷宫上。 将动物单独放置在迷宫的中心，在小鼠之间平衡头部位置，并记录5 min的行为。 记录并分析在开放臂和闭合臂上花费的时间（当啮齿动物的所有四个爪子都在开放或闭合的臂上时）。
背景恐惧条件
如前所述进行恐惧调节 [45]。 该实验在恐惧调节系统中进行，该系统位于声音衰减盒中，在天花板上具有室内灯和不锈钢网格地板（Coulbourn Instruments，Whitehall，PA）。 网格地板连接到震动发生器，并且听觉信号源自连接在腔室壁上的扬声器。 使用具有图形状态程序的个人计算机自动控制所有刺激。 将摄像机放在笼子前面以记录行为。 处理小鼠3天，然后习惯于训练室5 min。 使用的条件刺激（CS）是在85 kHz处的2.8 dB声音，而无条件刺激（US）是在0.8 mA处针对2 s的连续扰乱的足部震动。 在单次共同终止CS / US配对后，动物留在腔室中用于另一个30用于测量立即冷冻。 在保留测试期间，将每只小鼠放回到相同的室中，并记录5 min的冷冻响应（情境冷冻响应）。 所有测试都在红灯下录像。 测量总冷冻时间作为恐惧记忆的指标。 冻结行为被定义为完全缺乏运动，不包括呼吸。 通过软件（Coulbourn Instruments）对冷冻行为进行评分并转换为冷冻响应[冷冻响应 
= （总冻结时间/总测试时间）×100％]。
空间参考内存测试
空间参考记忆测试是隐藏平台水迷宫。 我们遵循Nakazawa等人先前描述的方案。 [22]。 培训包括每天四次试验，试验间隔一小时。 通过摄像机跟踪小鼠的运动并通过软件（Noldul Information Technology，Netherlands）测量。 记录和分析平台的逃逸延迟以及象限占用和平台交叉。 该池的直径为118 cm，平台直径为9.5 cm。 进行了四次探针测试。 第一次探针测试（P1）在最后一次训练期后的第二天在全提示条件下进行（第11天）。 第二次探针测试（P2）在部分提示条件下在12天进行（通过去除悬挂在黑色幕墙上的四个视觉提示中的三个）。 对于DAT+/- 小鼠，我们在3日在全提示条件下进行第三次探针试验（P13），并在部分提示条件下在第4天进行第四次探针试验（P14）。 在P4，P1和P1探针测试后分别在2小时后再进行一次（3试验）训练，以抵消探针试验期间可能发生的任何灭绝。 此外，为了排除在P4之前可能过度训练的复合效应（使用部分线索和氟哌啶醇注射的探针测试），我们进行另一组DAT+/- 小鼠及其对照野生型同窝仔进行两次额外的探针测试（P3'和P4'试验）。 P3'探针测试是在完全训练条件下（第10天）在最后一次训练后一天进行的。 P4'探针测试是在第11天在部分提示条件下进行的。 在我们所有的探针测试过程中，均将平台移开，并使小鼠在池中游泳的时间与训练期间所用的时间相同（60秒）。 记录在每个象限中花费的时间。 恢复多巴胺水平 [6], [20], [21]来自DAT的老鼠+/- 在进行P0.002和P30'探针试验前4分钟，所有对照组和对照组均腹膜内注射氟哌啶醇（4 mg / kg体重）或生理盐水。
数据分析
为了解释重复测量之间的动物内相关性，采用线性混合模型来估计Morris水迷宫中的行为表现，新物体识别，背景恐惧条件反射和旋转杆测试。 Tukey-Kramer方法用于确定DAT之间那些行为测量的重要性+/- 小鼠和对照同窝仔。 在旷野和高架迷宫测试中，单向方差分析和事后邓尼特测试用于确定基因型效应。 连续变量表示为平均值和平均值的标准误差（SEM）。 使用SPSS 13.0版（SPSS Inc.，Chicago，IL）分析数据。 当P ＜0.05时，差异被认为是显着的。
脚注
利益争夺： 作者宣称没有竞争利益存在。
资金： 这项研究得到了NIMH（MH060236），NIA（AG024022，AG034663和AG025918），USAMRA00002，乔治亚州研究联盟和上海市科学技术委员会（10140900500）（全部归JZT）的资助。 国家科学基金（81000592），上海市科学技术委员会（10DZ2272200、09DZ2200900、10PJ1407500和10JC1411200），上海市教委（11ZZ103）分别为FL和XMS。 资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿方面没有任何作用。
;
