多巴胺D2受体在肥胖大鼠中的成瘾样奖赏功能障碍和强迫性进食（2010）

评论： 这项研究表明，当给动物无限的访问权时，强大的天然增强剂（非常刺激性的食物）会导致D2受体下降。 这种下降几乎在所有大鼠中都可以看到，并且发生得非常快。 当去除“高度可口”的食物时，老鼠拒绝吃普通的食物。 尽管将电击与“高度可口”的食物消耗配对，但老鼠仍继续暴饮暴食。

• 全面研究

Nat Neurosci。 2010 May; 13(5)：635 641。 在线发布2010 March 28。 DOI：  10.1038 / nn.2519

抽象

我们发现肥胖的发展伴随着神经奖励反应中逐渐恶化的缺陷的出现。 可卡因或海洛因引起的奖赏稳态的类似变化被认为是引发从临时服用药物到强迫药物服用过渡的关键。 因此，我们在肥胖而非瘦大鼠中检测到类似强迫症的摄食行为，测量为可厌恶的食物消耗，其抵抗厌恶条件刺激的破坏。 纹状体多巴胺D2受体（D2Rs）在肥胖大鼠中被下调，正如在人类对药物上瘾中所报道的那样。 此外，慢病毒介导的纹状体D2R的敲低迅速加速了类似成瘾的奖励缺陷的发展以及在延长获得可口的高脂肪食物的大鼠中寻求强迫性食物的开始。 这些数据表明，过度食用可口食物可引发大脑奖赏回路中的成瘾性神经适应性反应，并推动强迫性进食的发展。 因此，常见的享乐机制可能是肥胖和吸毒成瘾的基础。

介绍

进食受享乐和报酬的影响，获得食物报酬可以有力地刺激消费1、2。尽管如此，导致肥胖的享乐机制仍知之甚少。 在患有先天性瘦素缺乏症的食欲亢进的人中，作为食物奖励的图像，大脑奖励回路的核心组成部分-背侧和腹侧纹状体中的活性显着增加，瘦素替代疗法减弱了纹状体活动和自我报告的对食物的“喜好” 3 。 这表明纹状体在进食行为的享乐方面很重要。 最近显示，与瘦对照相比，肥胖个体中响应高度可口食物的纹状体激活减弱。 此外，DRD3–ANKK4基因位点的TaqIA等位基因个体中，背纹功能减退和长期体重增加最为明显，这导致纹状体D2R表达降低，并已被证明易患物质依赖性疾病1，2这些和类似的观察结果提出了这样的建议，即奖励过程中的缺陷可能是肥胖发展的重要风险因素，并且肥胖的人可能会强迫性地食用可口的食物以弥补奖励的敏感性低下4。 值得注意的是，尚不清楚奖励过程中的缺陷是否是构成性的并且是在肥胖之前发生的，还是不清楚食用过量的可口食品是否会导致奖励功能障碍，从而导致饮食引起的肥胖。

超重和肥胖个体的一个明显特征是，尽管众所周知的负面健康和社会后果，他们仍然会吃得过饱。 事实上，许多超重的人表达了限制食物消费的愿望，但却难以控制他们的摄入量并反复消耗超过他们的能量需求7，8。 对负面结果不敏感的摄食行为的发展类似于人类吸毒成瘾者中的强迫性吸毒行为，其同样不受负面影响9的影响。 在这里，我们研究了延长获得可口的高脂肪饮食对大鼠脑奖励系统敏感性的影响。 我们还研究了饮食诱导的特征性失调与强迫性食物寻求的出现之间的联系。 最后，我们研究了纹状体D2R在这些类似成瘾的行为反应中的作用。

肥胖大鼠的成瘾样奖励缺陷

为了测试限制或延长食用可口的高脂饮食的影响，我们准备了雄性Wistar大鼠（300-350 g），在下丘脑外侧带有双极刺激电极，并在离散试验中训练了10-14 d当前阈值脑刺激奖励（BSR）程序，直到建立稳定的奖励阈值为止。 在BSR程序中，大鼠通过留置刺激电极做出有力的反应以获得奖励性的电自我刺激，维持自我刺激行为的最小刺激强度被称为奖励阈值4。 由于奖励阈值在基线条件下长时间保持稳定并且不会改变，因此该程序可提供灵敏的大脑奖励系统响应度的度量。 建立稳定的BSR阈值（定义为连续三个会话的阈值变化<10％）后，我们将大鼠分为三组，每组之间的平均体重或奖励阈值无差异。 这三组人分别获得了“自助餐厅式”饮食，其中包括可口的能量密集食品，可供人们食用（见在线方法）。 每天有10小时（仅成年大鼠； n = 0），9小时（有限制访问的大鼠； n = 1）或11–18 h（有扩展访问的大鼠； n = 23）获得饮食连续11天。 食堂饮食会导致饮食引起的肥胖症40。 所有大鼠还可以随意进入标准实验室食物，并记录了奖励阈值，体重增加和热量摄入。

与仅食物或限制进入组相比，长期进入食堂饮食的大鼠体重显着增加（图1a）。 与仅饲料的大鼠相比，限制性大鼠的体重也趋于增加，但这种效果没有达到统计学意义。 延长接触大鼠肥胖的发展与脑奖励功能的不良恶化密切相关，反映在逐渐升高的BSR阈值（图1b）。 由于在三组中没有观察到BSR的反应潜伏期的差异（补充图1），行为表现的缺陷不能解释这一观察结果。 在已经延长但不限制获得静脉内可卡因或海洛因自我施用12，13，14的大鼠中已经报道了类似的脑奖励功能缺陷。 因此，长期接触可口的高脂肪食物可能会导致大脑奖励功能中的成瘾性缺陷，被认为是可能驱动暴饮暴食并促进肥胖症发展的重要动力来源1，6。

图1：长期进入食堂饮食的大鼠体重增加和奖励功能障碍。

（a）仅通行，受限通行和延长通行的大鼠的平均（±sem）体重增加（通行×天互动：F39,702 = 7.9，P <0.0001; * P <0.05与仅通行组相比，事后测试）。 （b）相对于基线奖励阈值的平均（±sem）百分比变化（访问次数×时间交互作用：F78,1092 = 1.7，P <0.0005； * P <0.05，与仅纯熟组相比，事后检验）。

当我们详细检查喂养行为时（图2），我们发现每日热量和限制性接触大鼠的每日总热量摄入相似（图2a，d）。 相比之下，具有延长通路的大鼠的总热量摄入几乎是限制进入和仅食物大鼠的两倍（图2a，d）。 虽然限制性接触和仅限食物的大鼠保持大致相同的每日卡路里摄入量（图2a，d），限制性接触大鼠仅从食物中获得其每日卡路里的~33％（图2b，d），表明他们在66进入食堂饮食1（图15d）的过程中产生了类似暴食的摄食行为，并消耗了每日卡路里摄入量的~2％。 延长接触大鼠仅从食物中获得其总热量摄入的一小部分（~5％）（图2b）; 他们几乎完全消耗了食堂饮食（图2d）。 限制和延长接种组的饮食偏好的变化也反映在脂肪摄入量的显着增加与仅食物大鼠相比（图2c和补充图2）。 与先前的报道16一致，在长期接触大鼠中，食堂饮食的消费趋势随着时间的推移而降低。 这可能反映了随着时间推移作为自助餐饮食的一部分提供的食品适口性的耐受性的发展。 然而，在这些大鼠中，食堂饮食与标准食物的偏好一直保持较高（补充图3）。 这些数据表明，延长但不受限制地获得可口的高脂肪饮食会导致类似成瘾的奖励缺陷，暴饮暴食和丧失稳态能量平衡。 相比之下，对可口食物的限制使用会产生类似狂欢的消费模式，但不会破坏稳态能量平衡和脑回报功能。 然而，限制进入自助餐厅饮食超过40连续几天可能会导致显着的体重增加和大脑奖励功能的中断。

图2：延长获得食堂饮食的大鼠消费模式。

（a）仅通行，受限访问和扩展访问的大鼠的平均（±sem）日热量摄入（访问：F1,324 = 100.6，P <0.0001;时间：F18,324 = 7.8，P <0.0001;访问×时间交互作用：F18,324 = 4.6，P <0.0001； * P <0.05，与仅纯熟组相比，事后检验。 （b）日常平均热量摄入量（±sem）（进食：F2,504 = 349.1，P <0.0001;时间：F18,504 = 5.9，P <0.0001;进食×时间交互作用：F36,504 = 3.52，P <0.0001; * P <0.05与仅进行纯熟的组相比，事后检验）。 （c）脂肪的平均每日热量摄入量（±sem）（摄入量：F2,486 = 118.7，P <0.0001;时间：F18,486 = 8.8，P <0.0001;摄入量×时间相互作用：F36,486 = 6.2，P <0.0001； * P <0.05，与仅纯熟组相比，事后检验）。 （d）在整个使用40天期间的平均（±sem）总卡路里摄入量和仅通过食物消耗的卡路里的比较（访问：F2,54 = 25.0，P <0.0001;卡路里来源：F2,54 = 1235.2，P <0.0001；访问方式×卡路里源交互：F2,54 = 485.7，P <0.0001； *** P <0.001与仅纯食物组的总卡路里相比，### P <0.001与纯卡路里组的总卡路里同一组大鼠，进行事后检验）。

40天后，不再允许大鼠进食可口的饮食，但继续自由进食标准实验室食物。 在此强制性“禁欲”期间，我们每天评估奖励阈值和食物消费量。 当延长接触的大鼠不再获得可口的饮食时，其奖励阈值的升高至少持续了两周（图2a）。 这与自禁服可卡因的大鼠中报告的奖励功能相对短暂的（〜3 h）缺陷形成对照。 在禁欲期间，延长摄入量大鼠的卡路里摄入量显着减少（图48b），体重逐渐降低（图13c），而在禁欲期大鼠中体重减轻程度较小（图3b），与先前的报道[3，11]。禁欲15天后，处死大鼠，并通过甲酚紫染色确定电极位置（图14d）。

图3：在延长获得食堂饮食的大鼠禁欲期间持续的奖赏功能障碍和食欲减退。

（a）禁食高脂饮食时与基线奖励阈值（±sem）相比的平均百分比变化（获取率：F2,112 = 3.7，P <0.05;时间：F4,112 = 2.3，P> 0.05; * P与仅进行过纯熟的组相比，<0.05，事后检验）。 （b）获得高脂饮食（基线）的最后一天和禁欲14天（只有标准食物时）的平均热量摄入量（±sem）（访问：F2,168 = 41.7，P <0.0001 ；时间：F6,168 = 65.6，P <0.0001；访问×时间交互作用：F12,168 = 38.3，P <0.0001； * P <0.05，与仅纯熟组相比，事后检验）。 （c）在获得高脂饮食（基线）的最后一天和仅提供标准食物的禁欲14天期间，平均体重（±sem）与体重的变化（访问：F1,126 = 37.2，P <0.0001;时间：F7,126 = 3.1，P <0.01;交互×时间交互作用：F7,126 = 40.9，P <0.0001; * P <0.05 （d）仅大鼠（三角形），受限通道（正方形）和扩展通道（圆形）大鼠的下丘脑外侧BSR刺激电极位置的组织学重建。

肥胖大鼠中的纹状体D2R：在奖励缺陷中的作用

接下来，我们检验了以下假设：过度食用可口的自助餐厅饮食可能会降低纹状体D2R密度，从而导致成瘾样奖励低敏性的发展。 允许新的仅允许饮食，限制访问和扩展访问的大鼠进入食堂饮食，直到与仅允许饮食的组相比，扩展访问大鼠的体重有统计学上的显着增加（P <0.05 ；图4a）。 据报道，D70R的重度糖基化（〜2 kDa）膜结合形式的纹状体表达在长距离访问大鼠中比在受限访问或仅咀嚼的大鼠中要低（图4b；参见在线方法）。 当我们根据体重的中位数划分（轻或重）将每个进入组的大鼠分为两个亚组时，我们发现体重与纹状体D2R表达之间存在明显的逆向关系（图4a，c）。 我们未检测到D39R的未糖基化未成熟（〜51 kDa）和中间糖基化胞质（〜2 kDa）形式的表达有统计学显着下降（补充图4）17，这表明延长访问大鼠中的纹状体D2R表达可能通过转录后机制进行调控。

图4：体重增加与纹状体D2R水平成反比。

（a）根据体重的中位数划分，将仅纯种，限制访问和扩展访问的大鼠分为两种组：轻（L）或重（H）。 （b）从所有大鼠收集整个纹状体复合物，并通过蛋白质印迹法测量每组中的D2R水平。 膜相关的D2R条带在70 kDa分离，蛋白质负载对照显示在下面（β-actin，43 kDa）。 全长免疫印迹显示在补充图12中。（c）通过光密度法对仅成年，受限访问和扩展访问的大鼠纹状体中D2R的相对含量进行定量（F2,6 = 5.2，P <0.05，主要的影响； * P <0.05和** P <0.01，与仅普通L组相比）。

接下来，为了测试饮食诱导的纹状体D2R减少与脑奖励功能的功能相关性，我们设计并验证了慢病毒载体以递送短发夹干扰RNA（shRNA）以击倒D2R（Lenti-D2Rsh;图。 5和补充图（5）。 在允许长期进入食堂饮食的情况下，几乎立即用Lenti-D2Rsh治疗的大鼠的奖励阈值开始增加，而在相对较短的时期内用空慢病毒载体（Lenti-control）治疗的延长接触大鼠的奖励阈值保持不变进入食堂饮食（14 d;图6a）。 两组大鼠的反应潜伏期都没有改变，表明这种效应并不是任务表现缺陷的继发因素（补充图6）。 在用Lenti-D2Rsh或Lenti-对照治疗的大鼠中，奖励阈值也未改变，该大鼠仅在相同时期内接近食物（图6b）。

当所有大鼠仅接触标准食物时，阈值在额外的15禁欲期间保持持续升高（补充图7）。 因此，纹状体D2R的敲减增加了饮食诱导的奖励功能减退的易感性，但没有改变脑奖励系统的基线活动。

图5：慢病毒介导的纹状体D2R表达的敲低。

（a）Lenti-D2Rsh过表达的纹状体区域的图形表示。 左纹状体半球中的绿色圆圈代表了病毒输注的目标位置。 右纹状体半球中的绿色染色是Lenti-D2Rsh大鼠大脑中绿色荧光蛋白（GFP）的代表性免疫化学染色。 （b）Lenti-D2Rsh大鼠纹状体中D2R表达降低的代表性免疫印迹。 全长免疫印迹显示在补充图13中。（c）通过光度法定量的Lenti-control和Lenti-D2Rsh大鼠纹状体中D2R的相对量（事后检验，与Lenti-Control组相比，* P <0.05） ）。 （d）未检测到Lenti-D2Rsh载体感染纹状体中的神经胶质细胞。 绿色染色是来自病毒的GFP。 红色是星形胶质细胞标记神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）； DAPI染色以蓝色突出显示细胞核。 白色箭头表示仅在纹状体中的病毒注射部位发现了胶质增生的局部区域，而在病毒扩散到的周围组织中则没有。 即使在这个区域，星形胶质细胞都不是GFP阳性的。 放大图像中的黄色箭头突出显示了检测到的典型GFP阴性星形胶质细胞。 （e）Lenti-D2Rsh载体在纹状体中发生高水平的神经元感染。 绿色染色是来自病毒的GFP。 红色是神经元核标记NeuN； DAPI染色以蓝色突出显示细胞核。 放大图像中的黄色箭头突出了纹状体中的GFP阳性和NeuN阳性神经元。 （f）Lenti-D2Rsh大鼠纹状体中被病毒感染（GFP阳性）神经元的放大倍数高的图像，显​​示了中型多刺神经元的典型形态特征。

图6：纹状体D2R的敲减增加了对延长获得食堂饮食的大鼠的奖赏功能障碍的脆弱性。

（a）连续2天连续进入自助餐厅的Lenti对照和Lenti-D14Rsh大鼠的基线奖励阈值的平均（±sem）百分比变化（病毒：F1,156 = 5.9，P <0.05;时间： F13,156 = 2.2，P <0.05;病毒×时间相互作用：F13,156 = 2.2，P <0.05; #P <0.05，相互作用效应）。 （b）在仅提供食物的Lenti对照和Lenti-D2Rsh大鼠中，与基线奖励阈值相比的平均（±sem）百分比变化。 （c）仅在连续14 d的食物或延长的进食期间大鼠的平均（±sem）热量摄入（进食：F2,28 = 135.6，*** P <0.0001）。 （d）仅14周食物或延长使用时间的平均（±sem）体重增加（进入：F2,28 = 96.4，P <0.0001; *** P <0.001，进入的主要作用）。

我们发现，热量摄入（图6c）和体重增加（图6d）分别在伦蒂-D2Rsh和相应的Lenti-对照组相似食物只或延长访问条件下（补充图8和9）。 因此，当可口食物可自由消费时，纹状体D2R敲低改变了对食堂饮食的偏好和总热量摄入。

肥胖大鼠的强迫性进食：纹状体D2R的作用

接下来，我们检验了以下假设：在长期进食自助餐的大鼠中可能出现强迫性进食，纹状体D2R信号转导不足可能是这种作用的假说。 允许新的仅允许食物，限制访问和扩展访问的大鼠进入食堂饮食> 40 d，直到在扩展大鼠中发生统计学上显着的体重增加（与仅允许访问的大鼠相比，P <0.05）；数据没有显示）。 然后将所有三组大鼠每天仅在手术室中进行食堂饮食30分钟，持续5-7 d，直到达到稳定的摄入量（定义为每天摄入量的<10％变化）。 然后在每种进入条件下将一半大鼠暴露于光照（条件刺激）下并与足部电击配对配对（惩罚组），而每组中其余的大鼠在没有脚底冲击的情况下暴露于提示光（未经惩罚组） ）。 在测试当天，我们检查了仅提示光照射对可口食物消耗的影响（图7；参见在线方法）。 我们发现，仅咀嚼和限制进入的大鼠在30分钟基线训练期间的平均卡路里摄入量高于延伸进入的大鼠（图7a，b）。 这表明，只进食或进食受限的大鼠在间歇性30分钟的进食期间进食了可口的食物，这反映在以下事实：这些大鼠消耗了其每日热量摄入的40％至50％，通常为100 kCal，在这些会议期间（图7a，b）。 相比之下，长时间接触的老鼠似乎对这种暴饮暴食的行为有抵抗力，这也许是因为它们连续40天内几乎无限制地获得可口食物的历史建立了相对不易改变的进食方式。 在测试当天，与基线期间的摄入量相比，仅咀嚼，限制进入或延长进入组的未惩罚大鼠的提示光重放对食物消耗没有统计学上的显着影响（图7a）。 因此，仅提示灯就没有激励作用。 在受惩罚的大鼠中，仅对成年大鼠和受限进入的大鼠，电击配对的提示灯显着降低了可口的食物摄入。 然而，提示光对延长接触大鼠的可口食物摄取没有影响，表明它们的食用对预测逆境的厌恶环境提示不敏感。 延长访问的大鼠的基线能量摄入低于其他组。 但是，由于相似时期内的食物摄入量要低得多（图7d），所以这不太可能代表“地板效应”，这会混淆我们的发现。 总之，我们的数据支持这样的想法，即强迫性进食行为可以以类似于在具有长期使用药物史的大鼠中看到的强制性可卡因服用的方式出现在长时间接触的大鼠中18。

图7：对可口食物的强迫性反应。

（a）在30分钟的基线试验期间以及在试验日，当大鼠暴露于先前没有与有害的足部休克配对的中性条件刺激下，未受惩罚的大鼠的平均（±sem）适口饮食摄入量（访问：F2,20 = 5.2，P <0.05；与仅成年大鼠相比，＃P <0.05）。 （b）在30分钟的基线试验期间以及在试验日，当大鼠暴露于先前与有害的足部休克配对的条件刺激下，受罚大鼠的平均（±sem）适口饮食消耗（访问：F2,21 = 3.9 ，P <0.05;提示：F1,21 = 8.6，P <0.01;访问×提示交互作用：F2,21 = 4.7，P <0.05; * P <0.05与基线期间的摄入量相比，#P <0.05与仅限成年大鼠）。 （c）在过去仅可以吃或长期使用自助餐厅饮食的Lenti对照和Lenti-D30Rsh大鼠中，在2分钟的基准测试期间和测试当天的平均（±sem）适口饮食摄入量（提示：F1,26， 29.7 = 0.0001，P <0.05； * P <0.01，** P <30，与基线阶段的摄入量相比，事后检验）。 （d）过去仅吃过食物或长期进食自助饮食的Lenti对照和Lenti-D2Rsh大鼠在1,26分钟的基准测试期间和测试当天的平均（±sem）消耗的食物（提示：F44.9 = 0.0001，P <0.05; * P <0.01，** P <XNUMX与基线试验期间的摄入量相比，事后检验）。

最后，我们检查了惩罚配对的条件刺激对以前只能进食或长期使用自助餐厅饮食的Lenti-Control和Lenti-D2Rsh大鼠食物摄取的影响（图6中的大鼠）。 我们发现，在所有四个组中，基线30分钟内的基线可口食物摄入量均相似（〜40 kCal）（图7c）。 此外，在调节期间和试验当天，所有四组大鼠之间的总日常食物消耗（在笼中）相似（补充图10）。 因此，事先获得食堂饮食的14天不足以阻止暴食样的饮食行为，其方式类似于在> 40 d延长食堂饮食的大鼠中观察到的方式（图7a，b）。 厌恶性提示光刺激破坏了以前只能吃食物的Lenti对照和Lenti-D2Rsh大鼠的可口食物摄入（图7c）。 同样，厌恶性条件刺激破坏了慢肠对照组大鼠的可口食物摄入，该组大鼠先前已获得食堂饮食延长14天。 相比之下，厌恶性条件刺激对Lenti-D2Rsh大鼠的可口食物消耗没有影响，而Lenti-D14Rsh大鼠此前已经有7天延长了自助餐厅的饮食时间（图48c）。 测试后XNUMX小时记录这些大鼠的BSR阈值仍显着升高，而其他三组大鼠的BSR阈值则保持稳定且未改变

（补充图11）。 为了验证Lenti-D2Rsh扩展获取大鼠对条件性刺激诱导的可口食物摄入抑制的抵抗力不是继发于经典调节过程中的损伤，我们测试了厌恶条件刺激对不太可口的标准食物的消耗的影响。所有四组大鼠。 与可口食物的狂欢消费相反，我们发现所有四组大鼠在2 min基线期间（图30d）消耗少量食物（~7 kCal）并且所有四组中的食物摄入量被中断。暴露于厌恶条件刺激时的相似幅度（图7d）。 这些数据表明，纹状体D2R的敲低显着加速了可口食物的强迫性食用的出现，但仅限于具有延长获取史的大鼠。 此外，由于仅在具有升高的BSR阈值的Lenti-D2Rsh大鼠中检测到强迫性进食，因此饮食诱导的奖赏功能减退可能是强迫性食物寻求出现的必要前提。

讨论

易于获得可口的高脂肪食物被认为是肥胖的重要环境风险因素19。 我们发现，延长获得高度可口的食堂式饮食导致暴饮暴食和体重增加，同时逐渐提高大鼠的BSR阈值。 这种对BSR阈值的影响可以通过逐渐降低脑回报回路的响应性来解释，这种解释与食物限制和体重减轻可以增加20的事实一致，而急性过度喂食可以瞬时降低21，响应大鼠的BSR。 这一发现代表了工作的延伸，表明通过胃内喂养管21急性过量喂养大鼠，以及模仿餐后饱腹感的胃扩张或静脉注射胰高血糖素22，23，24，降低了对下丘脑外侧BSR的反应，并增加了对类似反应的反应。 stimulation25。 以前的工作还表明，通过胃内管反复强制喂养大鼠直到它们的体重增加~200 g同样降低了对BSR的反应率，这种效果持续到体重已经正常化的XNXX。 正如在大鼠中的这些发现中一样，通过先前喂食饱食的23抑制猫对侧下丘脑BSR的反应，表明脑奖励功能和代谢状态之间的相互作用是保守的，因此也可能在人类中发生。 在西方社会26中，人们认为易于获取和随之而来的人类食堂式饮食过量饮食是当前肥胖流行的重要环境因素。 我们的数据显示，奖励功能减退出现在老鼠身上，它会过度饮食与人类消费相似的可口食堂饮食，并且随着体重的增加，这种效果会逐渐恶化。 值得注意的是，所有具有奖励阈值升高≥19％的大鼠的BSR电极位于穹窿背侧的~20μm范围内。 食物限制以对脂肪来源的激素瘦素敏感的方式增加该区域中奖赏相关神经元的敏感性，并且该脑区域被认为是食物奖励500的重要底物。 调节食物享乐的大脑回路因此被预测饱腹感的后消化信号所抑制，这与最近的人类成像研究结果一致，显示胃扩张27和肠道来源的餐后因子肽YY28-3（PYY）36调节大脑区域的活动。参与奖励处理。 此外，奖励系统也受到体重过度增加的抑制。 最近的报道表明，循环瘦素是能量平衡的关键调节因子，可以渗透到脑组织中并抑制奖赏回路29，3，27，30的活性。

超重大鼠的奖励不足可能反映了大脑奖励回路基线敏感性的适应性下降，以抵制可口食物对它们的过度刺激。 这种饮食诱导的奖励功能减退可能通过增加食用高奖励“致肥胖”饮食的动机来避免肥胖，从而减轻肥胖的发生6、32。这可能是肥胖症的发展原因。当撤回可口食物并且只有可口食物较少的食物时，在限制进入的大鼠中程度较低。 这种情况也与人脑影像学研究的数据一致，在该研究中，对高度可口食物的响应，尤其是在遗传多态性降低了纹状体D2R表达的个体中，纹状体的钝化激活与长期体重增加有关4。 尚不清楚肥胖个体中的这种奖赏敏感性过低是否在肥胖症发展之前就已经表现出来并且仅与遗传因素（“奖赏缺乏综合症”）有关，还是暴饮暴食会导致奖赏过程中断。 我们的数据表明，延长食用可口的高能量食品以及随后暴饮暴食会刺激敏感性，因此可能代表了促进肥胖症发展的重要享乐机制。 在具有长期使用静脉注射可卡因或海洛因自我给药史的肥胖大鼠中，也发现了与此处报道的肥胖大鼠类似的奖赏功能障碍，但在具有受限访问史的大鼠中则未发现12、13、14。有人提议从偶然性到强迫性寻求药物是试图减轻这种药物引起的奖励功能障碍引起的奖励减少的持续状态的结果[12，32，33]。因此，我们的数据表明，肥胖和药物成瘾可能具有潜在的享乐机制。

纹状体D2R表达的下调是对可食用食物过度消耗的显着神经适应性反应。 实际上，在超重个体2，4和啮齿动物34，35中观察到纹状体D36R密度的降低。 相反，患有神经性厌食症的个体具有升高的纹状体D2R37，并且肥胖症（胃旁路）手术后肥胖个体的体重减轻与纹状体D2R密度28升高相关。 被称为TaqIA A1等位基因的基因多态性导致纹状体D2R密度降低，并且携带该等位基因的个体在肥胖群体4中过量表达。 TaqIA等位基因也增加了对酒精，阿片类药物和精神运动兴奋剂成瘾38的易感性。 因此，通过组成型遗传因素或过量暴食导致的纹状体D2R密度的降低可能有助于肥胖的神经生物学机制。 我们发现70 kDa D2R同种型的纹状体水平被认为反映了与膜相关的D2R，与来自仅限食物，限制进入和扩展进入组的大鼠的体重呈负相关（图4）。 纹状体D2R表达的敲减，最突出的是背外侧纹状体（图5），导致BSR阈值在接触食堂饮食后几乎立即增加。 因此，纹状体D2R表达的减少迅速加速了大量获得高度可口食物的大鼠奖励功能减退的发生，这一发现与人脑成像数据一致，表明纹状体D2R密度缺陷有助于肥胖个体4的奖励功能减退。

Lenti-D2Rsh大鼠的三个特征也值得注意。 首先，尽管纹状体D2R敲低与延长的适口饮食相结合导致BSR阈值升高，但与对照大鼠相比，这些大鼠的热量摄入或体重增加没有差异。 这可能反映了这样一个事实，即老鼠只有14 d可以进入食堂饮食; 较长时间的进入可能导致随着时间的推移体重增加更高，类似于在纹状体D2R信号传导4缺陷的人中观察到的对体重增加的更高敏感性。 然而，限制进入食堂饮食仅限于14 d的优点是具有延长通路的敲除大鼠是唯一显示BSR阈值升高的组，这使我们能够评估奖励功能减退在强迫发展中的潜在作用。吃（见下文）。 其次，BSR阈值在只能进入食物的敲除大鼠中保持稳定且不变。 这表明单独减少的纹状体D2R表达不足以诱导奖赏低敏感性; 相反，它似乎与过度消费可口食物相互作用，以加速这种降低奖励敏感度的状态的出现。 因此，大脑奖励回路中的其他适应性反应可能引发大鼠延伸进入食堂饮食的奖励低敏感性。 考虑到这一点，我们注意到D2R激动剂溴隐亭降低leptin39的循环水平，并且瘦蛋白至少部分地通过抑制控制对食物3，30，31的快感反应的纹状体区域来抑制摄食。 因此，有可能响应于体重增加而下调纹状体D2R增加瘦蛋白信号传导，从而增强该脂肪因子对脑奖励系统的抑制作用。 最后，我们注意到我们将慢病毒载体靶向背外侧纹状体。 这主要是出于技术原因，因为用于将病毒递送到纹状体中的套管的横向放置使得我们还能够容纳用于BSR阈值确定的留置下丘脑刺激电极。 因此，有可能靶向D2R用于在纹状体的其他区域中击倒，特别是背内侧和腹侧区域（伏隔核和壳核），即使在没有适口饮食的情况下也可能具有升高的BSR阈值。

背侧纹状体与刺激-反应习惯类型的学习密切相关，这反映在消费行为的发展上，这种消费行为对先食饱食或与有害刺激物配对不贬值不敏感40。 通过主要针对背侧纹状体，我们可能已经击倒了D2R种群，这些种群调节了大鼠对强迫性进食的发展的脆弱性。 为了与纹状体D2R在强迫行为中的作用保持一致，人类DRD2–ANKK1基因位点的TaqIA等位基因-导致纹状体D2R密度低5，响应于可口食物4钝化纹状体激活4并增加了对肥胖症的易感性41 –学习避免采取负面后果的行动方面的缺陷18。 丧失对行为可能具有负面结果的抑制控制能力是肥胖和药物成瘾的特征之一，尽管有负面的社会，健康或经济后果，但其消费行为仍然存在。 在具有大量药物摄入史的大鼠中，服用可卡因的行为可能会变得僵化，并且对预测不良结果（足部电击）的反感条件刺激具有抵抗力（42）。 同样，与没有饮食习惯的小鼠相比，以前可以食用高脂肪饮食的小鼠在厌恶环境（明亮的灯光）下将花费更多的时间来获得可口食物。 我们发现，延长食堂饮食摄入量的大鼠对可口食物的摄取对厌恶性条件刺激同样不敏感。 与纹状体D2Rs在这种作用中的作用一致，在纹状体D2R敲除大鼠中发现了强迫性进食，该大鼠先前有14天的时间可以进食堂饮食，但对照组中没有。 从神经回路的角度来看，延长获得可口食物的途径可能会触发皮质口纹糖通路的可塑性，从而使动物更容易出现强迫性行为，纹状体D2R信号缺陷会增强这一过程。 确实，肥胖个体的纹状体D2R密度降低与前额皮质和眶额皮质区域43的新陈代谢降低有关，从而对行为产生抑制作用44。

值得注意的是，仅在先前已经延长进入食堂饮食的击倒大鼠中检测到可口食物的强迫性消费，而不是在相同时间段内延伸进入食堂饮食的对照大鼠，也没有仅限食物。 具有先前扩展通路的敲除大鼠与其他组之间的主要差异是它们持续升高的BSR阈值。 这可能反映了奖励功能减退的共同神经生物学起源和强迫性饮食的出现，这些是时间上重合而又独立的现象。 或者，饮食诱导的奖励功能减退可以作为负强化的基质，促进强迫性饮食14，32，33的发展。 无论潜在的机制是什么，我们的研究结果表明，肥胖大鼠可能会出现对可口食物的成瘾性强迫性反应，并表明纹状体D2R信号传导的缺陷增加了对这种行为发展的脆弱性。

总之，我们发现，通过过量食用可口的，能量密集的食物来过度刺激大脑奖励系统会引起一种深刻的奖励过敏反应和强迫性饮食的发展。 肥胖大鼠的这些适应不良的行为反应可能源于饮食诱导的纹状体D2R信号传导缺陷。 过度消费滥用药物同样会降低纹状体D2R密度，诱发严重的奖励功能减退状态，并引发类似强迫症的吸毒行为。 因此，我们的研究结果支持以前的工作4，19，42，45，46，47，表明肥胖和药物成瘾可能来自大脑奖励回路中类似的神经适应性反应。

方法

大鼠。

在Charles River获得在实验开始时称重300-350 g的雄性Wistar大鼠。 到达后，将大鼠在恒定温度下单独圈养在12-h光 - 暗循环上（在2200 h点亮）。 在实验期间允许大鼠随意获得标准实验室饲料和水。 所有程序均由佛罗里达州斯克里普斯的机构动物护理和使用委员会批准，并且根据美国国立卫生研究院关于动物护理原则的指导方针处理大鼠。

外科手术。

用BSR刺激电极制备的大鼠首先通过在氧气中吸入1-3％异氟烷麻醉并置于立体定位框架（Kopf）中。 将双极BSR电极（11 mm长）植入后下丘脑后部（前后位，前囟-0.5 mm;中侧，中线±1.7 mm;腹侧，硬脑膜8.3 mm;切牙条至耳间线上方5 mm） ）47。 接种病毒注射的大鼠也用双侧导管（23 gauge，14 mm long）制备，位于纹状体上方（前后位，距前囟2.8 mm;中侧，中线±3.1 mm;背腹，2.4 mm，硬脑膜）48并填充使用14-mm探针。 四个不锈钢颅骨螺钉和牙科丙烯酸将电极和套管固定到位。 在手术后12 d每5 h一次用外用抗生素治疗手术伤口。 允许大鼠7-10 d从手术中恢复，然后在BSR阈值程序中训练。

BSR程序。

根据类似于其他地方描述的离散试验电流阈值程序训练大鼠响应BSR刺激10，14。 简言之，在5-μA步骤中，BSR电流水平以交替下降和上升系列变化。 在每个测试环节中，呈现了四个交替的下降/上升系列。 每个系列的阈值定义为两个连续电流强度之间的中点，其中大鼠在五个试验中的至少三个中响应，并且两个连续电流强度，其中大鼠在五个试验中的三个或更多个中没有响应。 会话的总体阈值被定义为四个单独系列的阈值的平均值。 每个测试会话的持续时间约为30分钟。 稳定的BSR阈值被定义为10连续天的阈值≤5％变化，通常在训练的10-14 d之后建立。 每个测试阶段的响应延迟定义为所有试验期间发生阳性反应的平均响应潜伏期。

病毒包装和交付。

使用pRNAT-U6.2 / Lenti载体系统（GenScript）递送并发短发夹RNA。 根据制造商的方案制备病毒颗粒。 简而言之，用含有shRNA插入片段的载体（293'-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-5'）或空载体，再加上ViraPower包装混合物（Invitrogen），将HEK 3FT细胞转染72小时（24小时后更换培养基）。 然后收集上清液，并通过超速离心（76,755g，Beckman Coulter SW 32 TI转子，90分钟，4°C）进行浓缩，并根据制造商的说明通过荧光激活的细胞分选确定病毒滴度。 将病毒等分并保存在-80°C的避光盒中直至使用。

具有稳定BSR阈值的大鼠在每个脑半球的纹状体中的三个位点接受双侧病毒注射（每次注射2μl，1μlmin-1，注射之间的1 min，每只大鼠总共六次注射）。 在恢复BSR阈值评估之前，允许大鼠从纹状体内注射中至少恢复2-3 d。 在病毒注射后，每日BSR阈值评估持续33 d，以确保在允许大鼠进入食堂饮食之前实现最大纹状体D2R敲低。 在这些2 d期间，Lenti-control和Lenti-D33Rsh大鼠之间的BSR阈值没有差异（数据未显示）。

免疫印迹。

在定期进入食堂饮食后大鼠大约1小时被杀死，并迅速取出大脑。 使用冠状脑基质（1-mm切片间隔; Plastics One）在冰块上制备~2-1 mm厚度的脑切片，并拍摄背侧纹状体的组织穿孔（前囟：~2.2至-0.26mm）。 快速收集纹状体组织穿孔，快速冷冻并在-80℃下储存直至使用。 将各个样品在冰上解冻，并基于接入组的重量依赖性中值分裂（每个池7-10大鼠）合并等量的纹状体组织。 在均质化之前，将组织重悬于含有原钒酸钠，磷酸酶混合物抑制剂500和1（Sigma-Aldrich），亮抑酶肽和胃蛋白酶抑制剂的2μl冰冷RIPA缓冲液（Thermo Scientific）中。 将组织裂解物在样品缓冲液中煮沸10 min，并加载到4％-20％或10％Tris-甘氨酸SDS凝胶（Invitrogen）上。 将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，在~1-23℃下封闭25 h（5％脱脂奶粉和PBS中的0.2％Tween-20，pH 7.4），并在一抗中在4℃温育过夜。 在封闭溶液中稀释以下一抗：D2R小鼠单克隆（Santa Cruz，1：100）或β-肌动蛋白小鼠单克隆（Santa Cruz，1：200）。 在与辣根过氧化物酶缀合的二抗（Amersham，1：2,000）温育后加入化学发光ECL试剂。 将成熟的膜相关形式的D2DR（~70 kDa）17，49标准化为蛋白质加载对照（β-肌动蛋白; 43 kDa），并使用NIH Image J软件通过光密度测定法定量。

免疫化学分析。

将大鼠麻醉并用PBS中的4％多聚甲醛（pH 7.6）经心脏灌注。 取出脑，后固定过夜并储存在蔗糖（PBS中的30％溶液，pH 7.4）中至少72 h。 从切片机收集冷冻组织切片（30μm厚度）并在~3-5℃下封闭（0.3％BSA，100％正常山羊血清和PBS中的1％Triton X-23）25 h。 将下列一抗加入封闭溶液中并在4℃下孵育过夜：鸡多克隆至GFP（Abcam，1：1,000）; 兔单克隆抗体GFAP（Millipore，1：1,000）; 小鼠单克隆抗体NeuN（Millipore，1：1,000）。 将切片与荧光染料偶联的二抗在~23-25°C孵育：抗鸡-488-nm染料（Jackson ImmunoResearch，1：1,000），抗兔-594-nm染料（Invitrogen，1：1,000） ）和抗小鼠-594-nm染料（Invitrogen，1：1000）。 用含有DAPI（Vector Labs）的Vectashield封固剂封固切片并盖上盖玻片。 使用Olympus BX61荧光显微镜（×2物镜）或Olympus共聚焦显微镜（×10和×100物镜）拍摄图像。

喂食程序。

将大鼠单独圈养在纸垫（α垫; Shepherd Specialty Papers）上，以防止食品被松散的垫料弄脏。 自助餐饮食包括培根，香肠，芝士蛋糕，磅蛋糕，糖霜和巧克力，它们在供大鼠使用之前单独称重。 食堂减肥食品以小金属容器交付。 所有食品，包括标准实验室食物，在完成喂食期后再次称重。 使用制造商提供的营养信息计算来自各种常量营养素的热量摄入。

提示诱导抑制摄食行为。

进料步骤在与BSR实验中使用的尺寸相同的减声操作室中进行。 将大鼠放入手术室，并在30分钟内获得食堂饮食或食物。 食品在小金属容器中交付。 在喂食之前和之后的所有食物都进行称重，这是在大鼠正常喂食期间进行的。 通过食用45毫克与大鼠家笼提供的食物成分相同的食物颗粒来评估食物的消耗量。 然后允许大鼠每天30分钟获得食堂饮食直到达到稳定的摄入量（定义为每日摄入量的<10％变化），需要5-7 d。 在此基线期间可口的食物摄入量稳定之后，将每种进入条件下的大鼠分为两组：受惩罚的（受到脚震的人）和不受惩罚的（不遭受脚震的人）。 然后，在连续的几天中，在大鼠先前可食用的同一个手术室内对大鼠进行四次调节。 在30分钟的调节过程中，提示灯（调节刺激）被激活10分钟，然后关闭10分钟，然后再次打开10分钟。 受到惩罚的大鼠仅在提示光出现时（0.5 mA持续1.0 s； 10次刺激，间隔约1分钟）受到足部电击。 对未受惩罚的大鼠以相同的方式提供提示灯，但不传递足部电击。 在测试日，即最后一次调节后的第二天，受罚组中的大鼠受到间歇性的脚底电击（总共五次刺激），并伴有提示灯的激活，持续5分钟。 在没有足部电击的情况下，将未受惩罚的大鼠再次暴露于提示光下。 在5分钟的惩罚期之后，在断断续续地激活条件刺激（30分钟提示灯亮，10分钟提示灯灭，10分钟提示灯亮）的条件下刺激10分钟后，允许所有大鼠进入可口食物。

统计分析。

基线奖励阈值被定义为在进入每个受试者的食堂饮食之前5 d的平均阈值。 奖励阈值表示为与基线阈值的百分比变化。 通过双因素，重复测量方差分析，访问（仅限食物，限制访问或扩展访问），卡路里来源（分析基线奖励阈值，体重增加，热量消耗和脂肪热量消耗的百分比数据）标准食物或食堂饮食），病毒（Lenti-control或Lenti-D2Rsh）和提示（配对或不配对惩罚）作为主体间因素和时间作为受试者内因素。 适当时，Bonferroni事后检验进一步分析了方差分析的主要影响。 使用GraphPad Prism软件进行所有统计学分析。

参考资料

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通讯对象：

·保罗·肯尼（[电子邮件保护])