Front Endocrinol（洛桑）。 2017; 8：216。
在线发布2017 Aug 29。 DOI： 10.3389 / fendo.2017.00216
PMCID：PMC5581815
抽象
围产期母亲食用能量密集的食物会增加儿童肥胖的风险。 这与为其享乐特性消耗的可口食物的过度消费有关。 将围产期母亲饮食和后代对脂肪的偏好联系起来的潜在机制仍然知之甚少。 在这项研究中，我们的目的是研究母亲高脂肪/高糖饮食喂养[西方饮食（WD）]在妊娠期和哺乳期对控制从出生到性成熟的大鼠后代喂养的奖励途径的影响。 我们在三个关键时期（儿童期，青春期和成年期）对WD和对照后代进行了纵向随访，并着重研究围产期暴露于可口饮食对（i）脂肪偏好的影响，（ii）基因表达谱，和（iii）中脑边缘多巴胺能网络的神经解剖学/结构变化。 我们发现限制在围产期的WD喂养对稳态和享乐大脑回路的组织有明显的长期影响，但对脂肪偏好没有影响。 我们证明了我们与特定脑分子特征相关的脂肪偏好的特定时期演变。 在来自WD喂养的水坝的后代中，我们在儿童时期观察到脂肪偏好的存在与多巴胺（DA）系统中涉及的关键基因的更高表达相关; 在青春期，对两组的高脂肪偏好，在WD组的3天试验期间逐渐减少，并且与WD组的DA系统中涉及的关键基因表达减少有关，这可能表明保护它们的补偿机制来自进一步的高脂肪暴露; 最后，在成年期，对脂肪的偏好与对照大鼠相同，但与参与γ-氨基丁酸网络的关键基因，5-羟色胺受体和下丘脑的聚唾液酸-NCAM依赖性重塑有关。 总而言之，这些数据显示，限制在围产期的母体WD对生命后期的能量稳态和脂肪偏好没有持续影响，即使发生了与进食行为有关的下丘脑稳态和奖赏途径的强烈重塑。 需要进一步的功能实验来理解这些电路重构的相关性。
介绍
早期的生活环境和事件现在被公认为有助于生命后期的健康和疾病倾向（1–3）。 已经提出代谢印迹的概念来描述围产期期间营养和激素环境的变化如何能够使后代易于导致肥胖及其相关的病理学。 我们西方生活方式的一个重要问题是能量密集食物消耗导致的营养过剩。 事实上，接触母体摄入此类食物的个体患肥胖症和代谢综合征的风险更高（4, 5）。 许多研究表明，通过妊娠和哺乳的母亲高脂肪饮食（HFD）对后代代谢有长期影响（6–8）。 除了涉及代谢调节的途径外，脑奖励系统在喂养行为中也起着重要作用（9, 10）。 中度多巴胺（DA）神经传递，在奖赏和成瘾的背景下进行深入研究，在人类饮食诱导的肥胖中发生改变（11–13）和动物（14–16）。 DA预测在很大程度上是在出生后发展的（17）因此，他们的发育可能会受到早期饮食的影响。 在过去几年中，对啮齿动物的实验证明，母亲的HFD摄入可以增强后代的享乐喂养（18, 19）。 尽管这一观察涉及DA系统功能的一些变化（20–22），关于个体发育和早期生活中奖励途径重塑的有限数据（21）。 此外，没有记录是否以及如何奖励系统的非DA信号传导部分如GABA（γ-氨基丁酸）系统可能受到围产期营养压力的影响。 实际上，GABA神经元似乎在奖赏和厌恶中起着关键作用。 腹侧被盖区（VTA）GABA神经元接受来自不同脑区的相似输入模式（23），最近基于光遗传学的行为研究强调了VTA GABA在条件性位置厌恶中的主要作用（24）和奖励完成行为（25）。 伏隔核（NAc）主要由GABAergic中型多刺神经元的投射构成，并作为边缘 - 运动界面，整合来自边缘系统的信号并将其转化为动作 通过 输出到腹侧苍白球（VP）和其他运动效应器（26）。 最后，由LH中的众多GABA连接构成的下丘脑（27）和弓状核，整合饥饿和饱腹感（10).
这项研究旨在确定母亲西方饮食（WD）摄入从出生到性成熟的大鼠后代（i）对脂肪偏好的影响（ii）对DA系统的基因表达谱，GABA能系统和下丘脑的可塑性的影响，（iii）同期中脑边缘多巴胺能网络的神经解剖学/结构变化。 因此，我们通过纵向研究（从断奶，P25，性成熟，P45和成年，P95）评估母体WD对断奶后常规饲料中保持的体重增长和后代脂肪组织发育的影响。 同时，我们进行了脂肪偏好测试，随后进行了专门的转录组学分析和随后的主成分分析（PCA），选择了食物摄入，选择和激励监管系统的标记。 我们的结果显着丰富了最近关注DA系统营养规划的结果。
材料和方法
道德声明
所有实验均按照当地动物福利委员会，欧盟（指令2010 / 63 / EU），法国巴黎国家农业研究所（法国巴黎）和法国兽医部门（A44276）。 实验方案经机构伦理委员会批准，并在APAFIS 8666注册。 采取一切预防措施，以尽量减少压力和每一系列实验中使用的动物数量。
动物和饮食
将动物维持在12 h / 12 h光/暗循环中，22±2°C，食物和水 随意。 妊娠日240（G290）的32只雌性Sprague-Dawley大鼠（体重：1-1 g）直接购自Janvier（Le Genest Saint Isle，France）。 将它们单独圈养并喂食对照饮食（CD）（5％牛肉脂肪和0％蔗糖）用于16或WD（21％牛肉脂肪和30％蔗糖）用于16在妊娠期和哺乳期（见表 Table1：1：来自荷兰ABdiet Woerden的饮食成分百分比kcal。 出生时，将窝产仔数调整为每窝8只幼仔，1：1雄性与雌性比例。 我们将12从16水坝中分离出来，每组包含一个由4雄性和4雌性组成的垫料。 在断奶（P21）时，将CD和WD水坝所生的后代保持在标准食物上直到实验结束（图 （Figures1A，B）.1A，B）。 在出生时记录小狗体重，此后每天在10：00 am记录直至P21（断奶）。 断奶后直至实验结束，每3天对大鼠进行称重。 我们仅提供有关雄性后代的数据。 雌性大鼠用于另一项研究（图 （Figure11).
行为（两瓶选择测试）
研究了三个关键的发育期（P21至P25：幼年，P41至P45：青春期和P91至P95：年轻成人）。 24雄性幼崽（n =每组12个），随机放入一个笼子中进行无两瓶选择的测试（图 （Figures1A，B）1A，B）（28–30）。 该试验用于通过将其与甜味分离并尽可能地从卡路里摄入的代谢效应中分离来特异性地研究对脂肪味道的吸引力。 实际上，1％玉米油溶液消耗仅与0.09 kcal / ml的摄入相关。 在适应两瓶的存在一天后，在P2的25天和P4和P41的91天进行测试（图 （Figure1A）.1一个）。 详细地说，在断奶（P21）时，24幼仔被单独圈养2天（图 （Figure1A）：1A）：当天1，适应期，第2天，在1％黄原胶（Sigma Aldrich，St。Quentin Fallavier，France）和黄原胶溶液中的0.3％玉米油乳液之间给予大鼠两瓶自由选择（ 0.3％）。 在P41和P91，使用24幼崽并连续三天提出两瓶自由选择。 每天在1：11 am记录00天（P3和P45）的黄原胶溶液和味道溶液（玉米油95％）的消耗。 每天倒置两个瓶子的位置以防止位置偏好偏差。 脂肪偏好分数计算为消耗的“脂肪溶液”体积与24 h中消耗的总体积的比率。 在整个行为测试中，将所有大鼠维持在标准食物饮食下。
组织采集和血液采样
在两瓶自由选择测试的最后一天后的一天，一半的大鼠（n = 6组）在CO的09:00和12:00 am之间被快速安乐死2 吸入。 血液用EDTA（LaboratoiresLéoSA，法国圣昆丁恩伊夫林省）收集，并在2,500离心 g 对于15 min，4°C。 将血浆在-20℃冷冻。 解剖器官和个体腹膜后脂肪库并加权。 迅速取出脑并置于脑基质（WPI，Sarasota，FL，USA大鼠300-600 g）中。 首先解剖下丘脑[根据Paxinos的图册坐标：-1.0至-4.5 mm来自Bregma（31然后，对于每只大鼠，获得两个在NAc水平处的2 mm厚度的冠状切片和在VTA水平的另一个冠状切片。 使用两个不同的活检穿孔器（Stiefel Laboratories，Nanterre，France）快速获得右侧和左侧NAc以及右侧和左侧VTA的样品（每只动物总共四个样品）（NAc和4 mm的3 mm直径）对于腹侧中脑）。 将样品在液氮中快速冷冻并储存在-80℃，随后通过TaqMan低密度阵列（TLDA）测定基因表达。
其他大鼠（n 每组= 6）用戊巴比妥（150 mg / kg ip ip）深度麻醉，并进行经心生理盐水灌注，然后在pH 4的磷酸盐缓冲液（PB）中冰冷的7.4％多聚甲醛灌注。 将大脑迅速移出，在1°C下浸入相同的固定剂中4 h，最后在25％PB蔗糖中保存24–48 h。 然后将大脑在-60°C的异戊烷中冷冻，最后储存在-80°C直至使用。 用低温恒温器（Microm，Microtech，Francheville，法国）将NAc，下丘脑和VTA切成20 µm连续冠状切片。 每个大脑区域进行两到三个系列的10片载有4-6个切片的载玻片。 对于每个载玻片，串联部分的间距为200 µm（图 （Figure66).
生化等离子体分析
在P25，P45和P95大鼠上收集的EDTA血浆用于测量血浆葡萄糖，NEFA（非酯化脂肪酸），胰岛素和瘦蛋白。 使用比色酶促反应用特定试剂盒（葡萄糖和NEFA PAP 150试剂盒，BioMérieux，Marcy-l'Etoile，France）测量葡萄糖和NEFA。 按照制造商关于胰岛素和瘦蛋白（大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒，大鼠瘦蛋白ELISA试剂盒，Linco Research，St.Charles，MO，USA）的说明，用特异性ELISA试剂盒测定激素。
免疫组化
首先封闭含有连续VTA和NAc切片的载玻片用于3-4 h，然后在4℃下与以下抗体的混合物孵育过夜：小鼠抗NeuN（1：500; IgM; Millipore Bioscience Research Reagents，Merk，美国）和兔抗-TH（1：1,000; Millipore Bioscience Research Reagents，Merk，USA）。 与一抗孵育并随后用PB洗涤后，将切片在二抗的混合物中孵育：Alexa 488缀合的驴抗小鼠IgM和Alexa 568缀合的驴抗兔IgG（1：500; Invitrogen，ThermoFisher Scientific，Waltham） ，MA，USA）for 2 h。 将切片置于超级冰层加金载玻片（ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA）中，空气干燥，并用ProLong TM Gold抗褪色试剂（Invitrogen，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA）盖上盖玻片。
TH神经元计入VTA
对于每只大鼠，如前所述计数TH阳性细胞（32）在VTA的三个不同的rostrocaudal水平：在第三神经的出口水平（相对于前囟的距离：-5.3 mm），200μm嘴和200μm尾部达到这个水平（图 （Figures6A）.6一个）。 对于左侧和右侧，使用NanoZoomer-XR数字幻灯片扫描仪的×40放大倍数获得包括从附件终端区域到中脑侧边缘的整个VTA的数字化图片。 C12000 （日本滨松）。 每个部分围绕VTA的周边绘制一条线。 通过检查细胞的形状并参考Paxinos和Watson地图集来选择边界。 多巴胺能神经元被定义为NeuN（+）/ TH（+）免疫反应性细胞体，具有清晰可见的细胞核。 使用NIH Image J软件（细胞计数器插件），NeuN（+）/ TH（+）细胞由两个不同的人计数，不知道动物组。 使用Abercrombie的公式修正了分裂细胞计数错误（32），哪里 N = n[t/(t + d）]（N =细胞总数； n =计数的细胞数； t =截面厚度； 和 d =泡孔直径），该校正因子为0.65。 数据表示为平均值[左VTA和右VTA中的NeuN（+）/ TH（+）]±SEM。
THc中的纤维密度
通过TH免疫标记切片的解剖密度测定分析估计NAc的多巴胺能神经末梢中的TH蛋白含量。 沿着NAc的rostrocaudal轴（Bregma 2.20，1.70和1.20 mm）在三个任意水平定量TH纤维密度（图 （Figure6B）.6B）。 简言之，使用NanoZoomer-XR数字幻灯片扫描仪的×40放大倍数获得的包含整个纹状体和NAc的数字化图片 C12000 （日本滨松）获得。 对于给定的NAc，在整个核周围绘制一条线以定义光密度（OD）测量的区域（图3） （Figure6B）.6B）。 使用NIH Image J软件，用从相同切片的胼um体（未用TH免疫化学染色的区域）绘制的圆形区域测量的OD值标准化获得的值。 数据表示为OD比的平均值（NAc中的OD值/三个切片的胼call体中的OD值）±SEM。
TLDA和TaqMan的基因表达
使用NucleoSpin RNA /蛋白质试剂盒（Macherey-Nagel，Hoerdt，France）从快速冷冻的NAc，富含VTA的样品和下丘脑中分离RNA。 按照制造商的说明对总RNA进行DNA酶消化，通过260 / 280 nm UV吸光度估算量，并使用Agilent 2100生物分析仪系统评估质量，然后计算RNA完整性数（RIN）。 丢弃RIN低于8的样品。 使用高容量RT试剂盒（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）将1微克总RNA逆转录成cDNA，总体积为10μl。
如前所述（33），TLDA是384-well微流体卡，其上可以进行384同时实时PCR（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）。 我们使用专门设计的TLDA来覆盖与可塑性和食物摄入调节相关的不同基因家族。 每个定制卡配置为包含2×4反应室的2×48样品加载线（参考：96a）。 92基因组（表 S1 在补充材料中）和四个管家基因（18S，Gapdh，Polr2a和Ppia）进行了研究。 使用Life Technologies TaqMan试剂进行实时PCR，并在ABI Prism 7900HT序列检测系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）上运行。 使用SDS 2.3软件（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）通过PCR收集原始荧光数据，其进一步产生阈值循环Ct，同时自动确定基线和阈值。 使用ThermoFisher cloud App（ThermoFisher，USA）过滤以区分异常PCR运行后，每个样品的分析结果为 n = 6（n = WD组在P5时为25）。 然后使用ThermoFisher Cloud App（美国ThermoFisher）对数据进行相对定量分析。 基因表达（RQ）的相对定量基于比较Ct方法，使用等式RQ = 2-ΔΔCT其中一个基因靶标的ΔΔCt是从校准样品中减去的其自身的Ct变异，并用内源对照标准化。 准确地说，我们使用geNorm算法（ThermoFisher Cloud App RQ，ThermoFisher，USA）确定了最稳定的管家基因。 在四个管家基因中，Gapdh被定义为NAc和下丘脑的内源性对照，而Ppia被定义为VTA，这对于所分析的三个时间段的所有样本都是如此。 手动设计基因表达的图形表示以指定相对于CD组的基因表达的10％增量的一种颜色。 使用非参数Wilcoxon符号秩检验的显着变化用星号表示。
统计分析
结果表示为表格和图中的平均值±SEM。 Mann-Whitney非参数检验用于分析不同时间点的体重，脂肪偏好和从免疫组织化学获得的OD比。
为了评估3天脂肪偏好的重要性，我们对每天进行了柱统计分析。 对于每组，使用非参数Wilcoxon的符号秩检验测试脂肪溶液和对照溶液的消耗。 我们将偏好平均值与假设的50％（红色虚线）进行了比较。 用红色星号注意到显着的变化。 我们使用相同的测试进行qPCR RQ值分析; 我们将平均RQ值与1的假设值进行了比较。 用星号记录了显着的变化（图 （Figure44).
对于血浆样品分析，我们进行了非参数Mann和Whitney检验。 用双向ANOVA分析TH阳性细胞的数量 p 价值计算。 由于实施的测试的多样性，Bonferroni 事后 仅在该测试之后应用校正。 使用Prism 6.0软件（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，USA）进行统计学分析。
对于每个脑活检拳（VTA，NAc和下丘脑），在不同时间点首先对130参数（TLDA，行为和血浆数据）进行无监督的PCA，以可视化数据集的一般结构（即，三个全局PCA）每个时间点）。 PCA可以被定义为数据在较低维度线性空间上的正交投影，使得投影数据的方差在子空间中最大化。 我们首先筛选出未表达或略微表达的基因（图 （Figure5）.5）。 来自CD喂养的水坝和WD喂养的水坝的后代的值在各个PCA图中以不同的颜色出现，以可视化这两个实验组是否被无监督的PCA组分很好地分开。 该分析分离了在两组后代之间差异表达的基因组。 随后，在不同的mRNA标记簇上进行聚焦的PCA：可塑性（细胞粘附，细胞骨架，神经营养因子，突触发生和转录调节），DA途径，GABA能途径，表观遗传调节剂（组蛋白脱乙酰酶和组蛋白乙酰转移酶）。 这些集中的PCA允许人们同时可视化母体饮食与某些标记之间的相关性以及特定家族基因之间的相关性。 定性量表用于分析PCA和聚焦PCA：+++：非常好的分离; ++：在PCA分离的错误一侧与一只大鼠良好分离; +：与两只大鼠（每组中的一组）在错误的一侧进行相当好的分离， - ：没有明显的分离。
成果
体重和生长
妊娠期母体WD摄入量（从G1到G21）不影响出生时幼仔的体重（图 （Figure2）2）（CD：6.55±0.07 g vs WD：6.54±0.05 g p = 0.9232）（数字 （Figures2A，B）.2A，B）。 从出生到断奶的体重增加在WD水坝出生的后代中比在CD水坝中出生的后代从CD水坝的后代高出21％，在WD水坝出生的后代断奶时体重明显更高（36.19±0.90 g对比47.32±1.48 g p <0.001）（图 （Figure2C）.2C）。 从断奶到实验结束（P95），给大鼠喂食标准饲料，并且来自WD水坝的后代的体重保持高于来自CD水坝后代的后代。 详情：青春期（P39）（数字 （Figures2A，d），2A，D），CD：176.8±3.3 g vs WD：192.2±3.3 g p = 0.0016和P93（年轻人）（数字 （Figures2A，E）2A，E）CD：478±9.9 g vs WD：508.6±10.3 g p = 0.0452。
不同时期的激素和代谢标志物
在P25，P45和P95测量血浆瘦素，胰岛素，葡萄糖和NEFA浓度。 在所有年龄段，WD后代的血浆葡萄糖，NEFA和瘦素水平与CD后代没有统计学差异（表 （Table2,2, n =每组6个）。 我们观察到仅在P25时，WD喂养大坝的后代的脂肪沉积（腹膜后脂肪质量比）显着增加（p = 0.0327，Mann和Whitney检验）。
围产期WD对断奶至成年期脂肪偏好的影响
为了探讨WD对脂肪偏好的影响，我们在生长期间的三个不同时间点使用了两瓶选择范例。 该试验用于通过尽可能多地避免其摄入的代谢作用来特异性地研究对脂肪味道的偏好。我们发现来自瓶子（在P25，P45和P95）的“额外”卡路里摄入的差异在统计学上不显着组之间（图 S1补充材料中的A-C）。 此外，1％玉米油溶液的消耗量导致P1的WD大鼠的卡路里增加25％（WD：4.9％对CD：摄入的卡路里的3.9％）和CDN大鼠的P0.5的45％（WD： 2％vs CD：摄入的卡路里的2.5％）（数字 S1补充材料中的D-F）。 在P25，来自CD水坝的幼崽对脂肪没有偏好（44.87±9.8％， p = 0.339）； 在相对的WD大鼠上，脂肪偏爱（75.12±8.04％， p = Wilcoxon符号秩检验后为0.039，红色星号）。 此外，两组之间存在统计学差异 p = 0.0347（Mann和Whitney检验，黑色哈希标签）（图 （Figure33一个）。
在P45和P95，两组对脂肪有显着偏好，即与50％的理论值显着不同（在P45，CD：80.68±2.2％ p = 0.0005和WD：78.07±3.25％ p = 0.0005; 在P95时，CD：74.84±8.4％ p = 0.0425和WD：69.42±8.9％ p = Wilcoxon符号秩检验后为0.109，红色星号）（图 （Figure3A）.3一个）。 在一天的味道呈现后（P45，两组）的值无法区分 p = 0.7857和P95 p = 0.9171曼-惠特尼检验）（图 （Figure33一个）。
为了了解大鼠如何随着时间的推移调节脂肪消耗，我们在P45和P95连续三天重复脂肪呈现（数字） （Figures3B，C）.3公元前）。 有趣的是，在P45，只有WD大坝的男性逐渐失去了对脂肪溶液的偏好（图 （Figure3B）3B）（第三天：53.12±8.36％ p = Wilcoxon符号秩检验后为0.851）。 但是，在P95（成年）时，所有动物都偏爱脂肪，在3天的测试中没有任何变化（图 （Figure33C）。
总之，在这个模型中，我们在早期（儿童时期）观察到对WD大鼠喂养的大鼠的脂肪偏好，在青春期随着时间的推移逐渐不感兴趣。 我们观察到成年期两组大鼠之间没有差异。
脑内可塑性的分子特征和GABA电路在下丘脑和奖励途径中的重塑
为了确定妊娠期和哺乳期母体WD的摄入是否对后代的下丘脑和奖赏途径产生影响，我们测量了大脑可塑性，脑模型以及与食物摄入和表观遗传有关的神经元回路标记的几个关键因素的相对表达。监管机构。 我们使用TLDA分析他们在不同脑区（即下丘脑，VTA和NAc）的丰度（表 S1 在补充材料中）在三个时间段。 在P25，P45和P95进行两瓶选择测试后进行筛选（图2） （Figure1）1来自WD喂养的水坝出生的6名男性和从CD喂养的水坝出生的6名男性。
在下丘脑的P25中，来自十三个不同类别的五个基因显示出显着较低的mRNA表达水平，主要在塑料标记物和GABA标记物中，在来自WD喂养的水坝的幼鼠中与-20％（Gfap）和-40％（Gabra5）相比，来自大鼠。 CD喂水坝。 在奖励途径活组织检查（VTA和NAc）中，两个基因在NAc中显示出统计学上更高的mRNA表达水平（D2R和Gabra1），即DA信号传导和GABA受体以及一个基因表达较低（Hcrtr2）（即，食欲素2受体）。而四种基因在VTA中显示出显着更高的mRNA表达水平（Map2，Gabara1，Hcrtr1和Hcrtr2）（即可塑性标记，GABA受体和5-羟色胺能受体）（图 （Figure44).
在下丘脑的P45中，来自十三个不同类别的五个基因显示较低的mRNA表达水平，范围在来自WD喂养的母鼠的幼崽中的-20％（Fos）和-50％（FosB）之间，与来自CD喂养的水坝的大鼠相比。 在P45的奖赏途径活组织检查中，4个基因在NAc中表达较高的mRNA表达水平（Gfap，Dat，Cck2r和Kat5）和2个基因表达较低（Fos和FosB），而3个基因表现出较低的mRNA表达水平（Arc， FOSB和Th）以及VTA中更高水平的一个基因（Gabrg2）。
在下丘脑的P95中，来自13个不同类别的20基因显示出较高的mRNA表达水平，范围在+ 20和+ 40％（Syt4至Gjd2）之间，并且3基因在WD的幼崽中显示较低的mRNA表达（FosB，D1r和Gabarb1）。与CD喂养的水坝大鼠相比，饲喂水坝。 在P95的奖赏途径活检中，12基因显示出更高的mRNA表达水平，范围在+ 20和+ 40％（Syn1至Hcrt1）和1基因在NAc中的较低表达（Th），6基因显示更高的mRNA表达水平（Ncam1） ，Gja1，Gjd2，Gabra5，Htr1a和Htr1b）和6基因在VTA中显示较低的mRNA表达水平（Cntf，Igf1，Fos，Socs3，Gabrb2和Hdac3）。
然后，我们使用所有量化参数（即，血浆剂量，行为数据和mRNA表达变化）进行对应于三个脑活组织检查的三个无监督PCA。 对于NAc和VTA，仅在P95处获得两组的清楚分离（表 （Table33).
根据PCA相关性循环和TLDA数据（代表本PCA中包含的大部分变量），我们定义了可能负责分离的基因家族并进行了有针对性的PCA（图 （Figures5A，B，5例如，A，B）。 聚焦的PCA显示在NAN的P25 DA标记和下丘脑的可塑性标记可以分离两组后代（表 （Table33 总结）。 然后在P45没有获得这种歧视。 然而，P95的相同分析显示，NAc和下丘脑中GABA系统的不同标记，加上可塑性标记物（下丘脑，NAc和VTA）和表观遗传调节因子（仅在NAc中）有助于将两组动物分开（数字 （Figure5; 5; 表 Table33).
该分析揭示了围产期饮食对GABA能标志物的长期影响以及与摄食行为有关的稳态和奖赏途径中的可塑性和表观遗传标记。
TH细胞的免疫组织化学证实转录物分析
因为我们在不同发育阶段观察到NAc和VTA中TH mRNA的一些变异，我们旨在将这些结果与TH免疫染色相关联。 在多巴胺能细胞体所在的VTA中分析TH / NeuN阳性细胞的数量，并且在位于NAc的神经末梢中定量TH免疫标记的OD。 与仅在P45的CD大鼠相比，WD的VTA中TH（+）细胞较少（图 （Figures6A，C，E; 6高手; 数字 S2A补充材料）。 截面水平与三个时期的TH / NeuN量化之间没有显着的相互作用（P25 p = 0.9991，P45 p = 0.9026和P95 p = 0.9170）。 仅在P45时，两个后代组之间存在统计学差异（p = 0.0002）（图 （Figure6E）.6E）。 此外，我们观察到两组间P25和P45的NAc中TH免疫染色的OD没有差异（P25的OD比值：CD中的1.314±0.022与WD中的1.351±0.026， p = 0.2681; P45处的OD比值：CD为1.589±0.033，而WD为1.651±0.027， p = 0.1542）。 然而，在P95时，WD组NAc的THc神经末梢的OD明显降低（CD时OD比值：CD中为95±1.752，而WD为0.041±1.550， p = 0.0037）（数字 （Figures6B，d，F; 6B，d，F; 数字 S2B在补充材料中）。
讨论
在这项研究中，我们假设产妇围产期过度营养会影响参与能量稳态，食物选择和后代食物摄入的奖励途径的发展计划。 我们广泛研究了从出生到断奶的母体WD摄入对儿童到成年后代的特定脑区（VTA，NAc和下丘脑）的GABA，5-羟色胺和DA途径的影响。 我们的研究结果表明，使用富含脂肪和甜味的饮食，严格限制在围产期，对后代早期脂肪偏好（儿童期）的影响与基因表达谱的变化和中脑边缘的神经解剖学/结构变化有关。多巴胺能网络。 然而，当后代保持低食量时，我们观察到青少年WD喂养的大鼠逐渐丧失对脂肪的吸引力，这与DA系统的基因表达减少和VTA中TH阳性神经元的轻微减少相关。 。 尽管GADAergic网络和下丘脑的能量稳态网络的重要可塑性在WD喂养的水坝中被鉴定出来，但是生命晚期的脂肪偏好并没有差异（图 （Figure77).
我们在这项研究中观察到的围产期WD摄入的第一个影响是断奶时后代的体重增加但出生时没有差异。 实际上，在吸吮期结束时，WD组的动物比CD的重量增加21％。 以前的研究提供了关于WD喂养大坝后代出生体重变化的相互矛盾的结果：更高的体重（19, 34），体重较轻（18, 21, 35）或没有区别（6, 22）。 我们的数据与最近的元回归分析一致（36）在171实验性出版物上进行的研究得出结论，母体HFD暴露不影响后代出生体重，但在哺乳期结束时诱导体重增加。 WD后代的较高体重可能反映了牛奶成分和/或产奶量的变化，这在以前的出版物中有所说明（37, 38）。 根据其较高的体重，WD后代的腹膜后脂肪比率显着高于哺乳期结束时的CD后代（P25，表 Table2），2），这也与以前的研究一致（18, 21）。 然而，P45和P95没有持续较高的肥胖，胰岛素，NEFA和葡萄糖血浆等其他代谢参数在各组之间没有差异。 我们的研究结果表明，在妊娠和哺乳期间没有明显的母体肥胖，饮食本身不足以在后代中诱导持久的代谢作用（22, 39, 40).
据报道，围产期HFD摄入量与后代对可口食物的偏好正相关（41）。 在我们的研究中，我们进行了一项纵向研究，旨在测试在常规食物上断奶的后代的脂肪偏好。
围产期WD对儿童期（断奶后）的影响
啮齿动物幼崽出生后几天吃固体食物19-20（42）当他们的大脑奖励途径尚未成熟时（17）。 因此，研究他们对脂肪的早期偏好并将这种早期偏好与脑转录分析相关联是非常有趣的。 在断奶后，我们观察到WD后代对脂肪的偏好，这在CD大鼠中没有得到证实。 这与其他报告一致，显示围产期营养不良与可口食物偏好之间存在联系，对照组大鼠早期脂肪偏好较低（43).
全球PCA不允许在该年龄区域对母亲的饮食进行区分。 然而，当进行限制于DA标记的靶向PCA时，我们获得了良好的组分离。 实际上，WD幼崽中NAc中D2受体mRNA的表达显着增加。 这种突触后D2在NAc过度表达可能部分涉及更高的脂肪动力（44）。 与CD幼崽相比，在WD幼崽中很少修饰其他转录物，例如NAc和VTA中α1GABAA亚基的增加和下丘脑中α5GABAA亚基的减少，这表明这些细胞核中GABAA受体的重组。
围产期WD对青春期的影响
在P45，我们在发病的第一天观察到两组的高脂肪偏好，但有趣的是，WD大鼠在反复出现后逐渐失去了对脂肪的兴趣。 青春期是终身认知加工所必需的神经行为重组的关键时期（45），各种研究显示脂肪饮食的有害认知效应明显易受影响（46–48）。 这一结果与Muhlhausler小组先前的工作明显矛盾（21, 35其中幼年大鼠（6周）显示出对垃圾食品的明显偏好。 然而，在他们的出版物中，实验范例是不同的，因为大鼠可以自由获取从断奶到牺牲的标准食物和垃圾食物（6周）。
同时，我们测量了NAc中Dat mRNA的增加和VTA中Th mRNA的减少，这通过免疫组织化学证实，其显示WD大鼠的VTA中TH（+）细胞数量减少。 在断奶后DA系统的转录组活性升高后，P45的活性降低可能解释了我们WD大鼠观察到的可口食物的低兴趣。 还应注意，我们分析的各种细胞核中Fos和FosB mRNA表达的系统性降低可能是母体WD暴露后脑活动减少的标志。
青少年WD大鼠对脂肪表现出更快的不感兴趣，这与他们之前的行为相反。 在儿童时期使用“正常”饮食似乎可以“保护”他们在青春期时对于夸大的脂肪偏好。 相反，当断奶后老鼠可以自由获取垃圾食品时，如参考文献 （21, 35），他们在青春期表现出对脂肪的强烈偏好。 这一结果表明，断奶后3周食物饮食可以重新编程回路并使青少年后代对急性脂肪挑战不那么敏感。
围产期WD对成人的影响
成年大鼠不再表现出对脂肪的偏好差异，即使在已经描述的反复脂肪呈现后（22, 35）。 同时，我们观察到NAc中Th mRNA和蛋白质的减少，以及VTA中Dat mRNA表达减少的趋势。 Naef和同事（20）已经报道了在围产期喂养HFD的成年大鼠DA系统活性较低，用微透析测量苯丙胺的DA反应减弱，增加了脂肪奖励的动机（见表总结了该模型的最新qPCR数据，表 S2 在补充材料）。 NAc中TH定量（mRNA和免疫组织化学）的一个限制来自NAc细胞也可以表达Th mRNA和蛋白质然后可以偏向DA纤维定量的事实（49, 50）。 然而，在NAc中使用TH免疫染色主要揭示了来自中脑DA神经元（VTA和SNc）的致密轴突末端。 通常，纹状体和NAc中表达TH的神经元只能在高度DA损伤的动物中辨别（51）因此在我们的免疫切片中几乎检测不到。 在这项研究中，我们还观察到NAc中μ阿片受体的强烈增加，其他不同模型的组在早期接触HFD的大鼠腹侧纹状体中表达减少（哺乳期和妊娠期）（19, 21）或没有变化（35）。 这些修饰仅在mRNA水平上测量，可以反映DA电路的轻微低活性与较高的阿片类药物敏感性相关（52）这可能不足以对我们进行的行为测试产生影响。 需要使用功能方法来确认这些假设。 在最近的一篇论文中，使用类似的模型，Romani-Perez等人未能观察到HFD后代的操作性条件盒的动机显着增加，但观察到在跑道测试范例中达到目标框的延迟更短（22）。 尽管在我们的实验条件下缺乏持久的脂肪偏好，我们发现围产期母体WD摄入对其他大脑回路具有长期影响，主要是由NAc和下丘脑中的GABA重塑介导的。 NAc被认为是完成行为的“感觉哨兵”（52）。 最近的研究表明，通过抑制释放GABA的LH神经元来抑制食物摄入（53）。 奥康纳等人。 表明NAc D1R神经元（GABAergic投射神经元）选择性抑制LH VGAT神经元停止食物摄入（54）。 这些实验揭示了可能负责控制行为反应的GABA回路（NAc /下丘脑）。 这个腹侧纹状体 - 下丘脑系统补充了另一个涉及床核条纹末端的电路，GABA释放VGAT将神经元投射到谷氨酸释放Vglut LH神经元并直接抑制LH vglut2引起摄食（55）。 涉及NAc壳的食欲调节回路的另一个重要组成部分是对VP的GABA释放抑制投射（56）。 这些数据突出了GABA信号在下丘脑和NAc之间相互作用促进摄食中的关键作用。 在我们的研究中，我们无法区分GABA重塑中涉及的神经元群体以及这些修改如何改变网络。 然而，GABA电路的核心作用值得更多关注。 特别是，使用电生理学方法对这些GABA电路进行进一步的功能实验将是非常有趣的（57）。 我们还观察到所研究的三个核中5HT1a和5HT1b受体的mRNA转录物的全局上调。 大多数突出的5-羟色胺纤维来自背中缝核（DRN）和中缝中层核（MRN）。 最近的数据来自 体内 录音和影像学研究表明5HT在奖励方面发挥了积极作用（58）。 来自DRN的5HT纤维参与脉冲控制（59）。 增加VTA中的5HT1a和NAc可能是一种可以控制冲动的补偿机制。 在下丘脑，药理学研究表明，5HT1a受体亚型可能抑制5-羟色胺刺激诱导的摄食行为（60, 61）。 下丘脑中5HT1a和b受体的增加可以增强5-羟色胺的摄食抑制作用，因此可以构成代偿机制。 需要通过执行适当的功能实验来验证这些假设。
这些网络变化与作为Ncam mRNA的可塑性标记的修饰相关。 在成年大鼠的下丘脑中，我们观察到Ncam1和St8sia4转录物的增加表明并增加了聚唾液酸（PSA）信号传导。 PSA是一种细胞表面聚糖，可调节细胞与细胞的相互作用。 细胞粘附蛋白的多聚唾液酸化涉及中枢神经系统中各种突触可塑性依赖性过程，并且据报道在急性正能量平衡期间供给电路的自适应突触可塑性需要（33, 62）。 此外，细胞相互作用和突触发生的其他调节因子可能与这种下丘脑可塑性有关。
总之（图 （Figure7），7），母体WD摄入量对调节后代饮食行为的稳态和享乐电路的组织有长期影响。 通过对三个关键时间段的分析，我们能够显示与特定脑分子特征相关的脂肪偏好的明确进化。 在儿童时期，对脂肪的偏好可能与DA系统的较高活动相关。 以脂肪偏好反转为特征的青春期与DA系统标志物的低表达相关，表明有补偿机制。 一个非常有趣的要点是，在这个模型中，断奶后的均衡饮食可以通过减少对脂肪的需求来保护青少年免受有害的喂养习惯。 尽管在成年期，两组对脂肪的偏好相似，但来自WD喂养的水坝的大鼠表现出对GABA回路的深刻重塑。 这种持久可塑性的后果是什么？ 在青春期，夸大的致肥胖饮食会重新激活这种迟钝的奖励制度吗？ 这些问题可能与西方国家新生儿和儿童的营养跟踪有关。
道德声明
所有实验均按照当地动物福利委员会，欧盟（指令2010 / 63 / EU），法国巴黎国家农业研究所（法国巴黎）和法国兽医部门（A44276）。 实验方案经机构伦理委员会批准，并在APAFIS 8666注册。 采取一切预防措施，以尽量减少压力和每一系列实验中使用的动物数量。
作者贡献
JP和PB进行了实验并参与讨论和写作。 TM执行了PCA并参与了讨论和写作。 SN有助于实验的设计并参与讨论。 PP参与了实验的设计，参与了讨论，并撰写了手稿。 VP设计并完成了实验，分析了数据，并撰写了手稿。
致谢
作者要感谢Guillaume Poupeau和Blandine Castellano在整个研究期间照顾动物，Anthony Pagniez在mRNA提取和TLDA方面提供帮助，Isabelle Grit帮助他进行血浆样本分析，Alexandre Benani和Marie-Chantal Canivenc他们的有益讨论和TLDA设计。
脚注
资金。 该研究得到了卢瓦尔地区的资助PARIMAD（VP），LCL基金会资助（VP和PP），SanteDige基金会（VP）和INRA Metaprogram DIDIT（SN，VP，PP）的支持。
补充材料
本文的补充材料可在网上找到 http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fendo.2017.00216/full#supplementary-material.
图S1
含玉米油瓶子的总能量摄入量。 （A） 来自西方饮食（WD）喂养的水母和来自对照饮食（CD）喂养的水坝的幼仔的P24的玉米油瓶中的25 h的卡路里摄入量。 （B） 在P24（瓶试验的第三天）从玉米油瓶中摄取45 h的卡路里。 （C） 在P24（瓶试验的第三天）从玉米油瓶中摄取95 h的卡路里。 对于面板 （A-C），数据表示为平均值±SEM，无统计学差异（p 在进行了Mann和Whitney非参数测试后，所有年龄段的人均观察到> 0.05）。 （D） 玉米油瓶中卡路里摄入的百分比与WD幼崽和CD幼崽的P24中25 h的总卡路里摄入量（玉米油瓶+标准饲料）相比。 （E） 在WD幼崽和CD幼崽的P24（瓶试验的第三天）中，玉米油瓶的卡路里摄入量与总卡路里摄入量（玉米油瓶+标准饲料）的比例相比。 （六） 玉米油瓶中卡路里摄入量的百分比与WD幼崽和CD幼崽的P24（瓶试验的第三天）的95 h的总卡路里摄入量（玉米油瓶+标准饲料）相比较。 对于面板 （d，E），数据以总卡路里摄入量的百分比表示，无统计学差异（p 在所有年龄段，均采用卡特方差分析（Yates校正）进行卡方检验后，观察到> 0.05）。
图S2
在三个不同时间点的伏隔核（NAc）和腹侧被盖区（VTA）中TH免疫染色的代表性显微照片。 （A） 在VTA水平上TH / NeuN免疫染色的显微照片，来自前囟的-5.30 mm。 红色标签用于NeuN，绿色用于TH。 白色箭头显示第三个神经的出口。 （B） THg水平的TH免疫染色的显微照片，来自前囟的+ 1.70 mm。 绿色标签适用于TH。 白色箭头显示前连合。
表S2
关于多巴胺途径转录物表达的已发表数据的总结。 红色字符对应于童年时期，蓝色字符对应于青春期，黑色字符对应于成人时期。 =：对应于组间相似的转录表达，+：对应于来自高热量饮食[垃圾食品，西方饮食（WD）或高脂肪饮食（HFD）]饲喂水坝的幼崽中较高的转录物表达，以及 - ：对应于来自高热量饮食（垃圾食品，WD或HFD）喂养的水坝的幼崽中较低的转录物表达。
参考资料
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