hypocretin（orexin）在男性性行为中的作用（2007）

J Neurosci. 2007 年 3 月 14 日；27(11):2837-45。

Muschamp JW 1 , Dominguez JM , Sato SM , Shen RY , Hull EM。

抽象

hypocretin（orexin; hcrt / orx）神经元在唤醒调节中的作用已得到很好的证实。

最近，hcrt / orx涉及食品奖励和寻求毒品的行为。 我们在此报道，在雄性大鼠中，hcrt / orx神经元中的Fos免疫反应性（ir）在交配期间显着增加，而去势导致hcrt / orx神经元细胞计数和蛋白质水平在与交配行为的后期损伤一致的时间过程中降低。

雌二醇替代可逆转这种作用。 雄激素（AR）和雌激素（ER alpha）受体的免疫标记显示hcrt / orx与AR没有共定位，并且很少有表达ER alpha的hcrt / orx神经元，这表明hcrt / orx表达的激素调节来自包含这些受体的神经元的传入。 我们还证明了orexin-1受体拮抗剂SB 334867 [N-（2-甲基-6-苯并恶唑基）-N” -1,5-萘吡啶-4-基脲]的全身给药会损害交配行为。 hcrt / orx的性欲影响的一个部位可能是腹侧被盖区（VTA）。 我们在这里显示hcrt-1 / orx-A在体内产生剂量依赖性增加射击速度和VTA多巴胺（DA）神经元的人口活动。 交配过程中hcrt / orx的激活，进而由hcrt / orx激发VTA DA神经元，可能有助于以前在男性性行为中观察到的伏伏核DA的强劲增加。 随后的前VTA中的三重免疫标记显示，与hcrt / orx纤维连接的酪氨酸羟化酶阳性神经元中的Fos-ir在交配过程中增加。

总之，这些数据支持这样的观点，即hcrt / orx肽可以以类固醇敏感的方式起作用，以通过激活中脑边缘DA系统促进对性的自然奖励的激励追求。

介绍

自 20 世纪 90 年代被发现以来（de Lecea 等，1998；Sakurai 等，1998），下丘脑泌素（食欲素；hcrt/orx）系统主要在觉醒和摄食行为的背景下进行研究（Sutcliffe 和 de Lecea，2002；Siegel，2004）。hcrt/orx 信号传导受损的突变小鼠表现出不均匀的觉醒模式，其特征是睡眠和觉醒之间频繁转换（Mochizuki 等，2004）。人们认为，hcrt/orx肽通过向脑干中觉醒活跃的胺能细胞群（例如蓝斑、中缝核）发出强烈的投射，促进持续的觉醒状态（Peyron等人，1998；Nambu等人，1999；Saper等人，2005）。除了投射到调节警觉和觉醒的部位外，hcrt/orx神经元还投射到腹侧被盖区（VTA）中脑边缘多巴胺（DA）通路的起始部位（Fadel和Deutch，2002）。这种连接模式促使许多研究小组评估了 hcrt/orx 在与奖励相关的强化中的作用（DiLeone 等人，2003 年；Harris 等人，2005 年；Harris 和 Aston-Jones，2006 年）。

对自由活动动物的研究表明，在精力充沛的探索行为期间，下丘脑泌素/食欲素（hcrt/orx）神经元的放电频率会增加（Mileykovskiy等，2005），并且脑室内注射hcrt/orx后增强的运动输出会被多巴胺受体阻断剂减弱（Nakamura等，2000）。其他研究也证实，hcrt/orx在体外可增加多巴胺能细胞的活性（ Korotkova等，2003），并且在体内将hcrt/orx应用于腹侧被盖区（VTA）后，伏隔核（NAc）的多巴胺释放也会增加（Narita等，2006）。最近的行为研究发现，hcrt/orx系统的激活可能是滥用药物动机的重要组成部分（Boutrel等人，2005；Harris等人，2005；Borgland等人，2006），以及由下丘脑结构稳态决定的天然食物奖励的动机的重要组成部分（Hoebel，1969；Rolls等人，1980；Fulton等人，2000；Thorpe等人，2005）。

正如外源性hcrt/orx可以增强摄食和觅食行为（Kotz，2006）一样，下丘脑内注射hcrt/orx也能促进雄性大鼠的性行为（Gulia等，2003）。鉴于经典研究表明，电刺激下丘脑外侧区（LHA）的特定区域（该区域现在已知含有hcrt/orx神经元）可以诱发摄食或雄性交配行为（Vaughan和Fisher，1962；Caggiula和Hoebel，1966；Swanson等，2005），我们试图寻找证据来证明交配过程中hcrt/orx神经元的激活，以及食欲素-1受体（OX1）阻断是否会损害这种行为。我们还通过测量去势和激素替代疗法对中枢hcrt/orx含量的影响，以及对hcrt/orx和类固醇激素受体进行双重免疫标记，评估了hcrt/orx系统的神经内分泌调控。最后，我们评估了hcrt/orx在体内激活中脑边缘多巴胺系统的程度，以及接受hcrt/orx输入的腹侧被盖区（VTA）多巴胺能神经元在交配过程中是否表现出Fos免疫反应性（ir）增强。

材料和方法

Fos免疫组织化学，行为和细胞计数。

成年（约325克）、性成熟的雄性Long-Evans大鼠（Harlan公司，印第安纳州印第安纳波利斯）的饲养和使用均符合美国国立卫生研究院《实验动物饲养和使用指南》，所有实验程序均经大学机构动物护理和使用委员会批准。在测试前一周，所有动物均被允许与一只卵巢切除的雌性大鼠进行四次、每次1小时的性交体验。该雌性大鼠通过皮下注射苯甲酸雌二醇（10微克）诱导发情，并在48小时后皮下注射孕酮（400微克；测试前4小时注射；Sigma公司，密苏里州圣路易斯）。所有实验的行为测试均在动物通常夜间活动开始2小时后进行，测试地点为动物的笼内，光照光源为一盏40瓦的红色白炽灯泡。在交配实验中，一组（n =6）雄性大鼠被允许在其笼内与一只处于发情期的雌性大鼠交配至一次射精，之后将雌性大鼠移走。所有动物几乎立即爬跨，并在4分钟内完成交配。该组的平均射精潜伏期为632.6 ± 169.64秒（平均值 ± 标准误；n = 6）。设置对照组（n = 6）以控制活动水平。对这些动物进行目视监测，以确保它们在15分钟内保持清醒和活跃状态，该时间段与实验组的交配测试时间一致。在15分钟的开始和结束时打开和关闭笼盖，除此之外，不打扰动物。在此期间保持静止的对照组动物不被使用。如果动物侧卧或头部向下，则判定其处于静止状态（改编自Espana等人，2003）。在交配或对照观察开始60分钟后，用戊巴比妥钠（100 mg/kg）对动物进行深度麻醉，并用0.1 M PBS（pH 7.4）和4%多聚甲醛PBS溶液灌注。将脑组织置于20%蔗糖-PBS溶液中进行低温保护，并从下丘脑hcrt/orx细胞群附近每隔一个40 μm的冰冻切片（每只动物30张）中，分别用3′,3′-二氨基联苯胺（DAB）和镍增强DAB对prepro-hcrt/orx（1:100；Millipore，Billerica，MA）和Fos（1:10,000；EMD Biosciences，San Diego，CA）进行免疫标记，具体方法参照先前描述的免疫组织化学步骤（Espana等，2003；Sato等，2005）。使用奥林巴斯（日本东京）显微镜和相机，在高倍率下对同一切片进行细胞计数，切片位于一致的前后方向水平（见图1 B、C）（距前囟后2.45 mm）（Swanson，2004）。在每个半球中，由一位对实验条件不知情的实验人员使用数字图像分析软件（Image-Pro Plus；Media Cyber​​netics，Silver Spring，MD）标记位于两个470 × 630 μm计数视野内的细胞。在两个半球中，外侧计数视野以穹窿为内侧边界，内侧计数视野以穹窿为外侧边界。记录仅表达Fos、仅表达hcrt/orx以及同时表达hcrt/orx和Fos免疫反应性的双标记细胞的数量。

图1。 

交配过程中 hcrt/orx 神经元中 Fos 免疫反应性增强。A ，右侧 hcrt/orx 神经元显示 Fos 免疫反应性。比例尺：25 μm。B ，非交配对照雄性左半球右侧计数视野的代表性显微照片。比例尺（A中）：200 μm。C ，交配雄性的显微照片。比例尺：200 μm。箭头指示显示 Fos 免疫反应性的 hcrt/orx 神经元；星号指示非 hcrt/orx 细胞中 Fos 免疫反应性的细胞核；fx，穹窿。

阉割实验和免疫印迹。

成年雄性（实验开始时体重约325克）Long-Evans大鼠经麻醉（75毫克/千克氯胺酮盐酸盐和10毫克/千克盐酸赛拉嗪盐酸盐，腹腔注射）后进行去势。术后分别给予动物7、14或28天的存活时间，之后再次麻醉灌注，并按上述方法对脑组织进行prepro-hcrt/orx免疫标记（所有组，n =5）。将这些动物与假手术组进行比较，假手术组在相同的麻醉条件下进行阴囊切口（n =5）。假手术组也在28天后处死。细胞计数在较低放大倍率下，于相同的冠状切面进行，方法同上。

在另一项实验中，将28日龄去势小鼠（n =5）和假手术对照组小鼠（n =5）用戊巴比妥钠（100 mg/kg）深度麻醉，取出脑组织，并迅速置于干冰冷却的2-甲基丁烷中冷冻。然后，对冷冻的下丘脑进行两次冠状切口，一次切口穿过内侧视前区（mPOA），位于前连合交叉点前方；另一次切口穿过后下丘脑核，位于第三脑室分为下丘脑隐窝和乳头隐窝后方。随后，在两侧大脑脚内侧端进行两次矢状切口，并在第三脑室下丘脑隐窝背侧端进行一次水平切口，对脑组织块进行修整。将组织块超声匀浆后，用改良的放射免疫沉淀缓冲液（pH 8.0，含蛋白酶抑制剂，Roche Complete Mini蛋白酶混合物；Roche Diagnostics，印第安纳州印第安纳波利斯）提取蛋白质，离心后分装。测定每份样本提取物的总蛋白浓度后，取每只动物40 μg蛋白分别上样至15% SDS-PAGE凝胶的独立孔中。电泳分离后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，Bio-Rad，Hercules，CA），并按照Laemmli法（Cleveland等，1977）进行免疫标记。首先使用1:1000稀释的抗prepro-hcrt/orx抗体，随后使用1:2000稀释的抗β-actin抗体（Sigma）和1:5000稀释的山羊抗兔IgG抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA），所有抗体均溶于含5%脱​​脂奶粉的Tris缓冲盐溶液中。蛋白条带采用增强型化学发光试剂盒（ECL；GE Healthcare，Piscataway，NJ）和Kodak（Rochester，NY）BioMax胶片进行显影。胶片曝光40秒后进行数字化扫描，并使用ImageJ软件测量光密度值。对每只动物，测定 hcrt/orx 的光密度值占 β-actin 上样对照的百分比，并进行统计分析。

在第三个实验中，如上所述，雄性大鼠接受假手术（n = 3）或去势，并每隔一天皮下注射二氢睾酮（500 μg；n = 4）、苯甲酸雌二醇（20 μg；n = 3）或油性溶剂（0.1 μl；n = 3），持续28天。两种激素均购自Sigma公司。激素剂量的选择基于既往研究中维持去势大鼠交配能力的实验结果（Putnam等，2005）。术后第28天，处死动物，并阻断其下丘脑，用于通过Western印迹法测定前促肾上腺皮质激素/催产素（prepro-hcrt/orx）的含量，方法如上所述。

类固醇激素受体和hcrt / orx双标记免疫组化。

取完整、未发生性行为的成年雄性（约350克）Long-Evans大鼠下丘脑外侧区（LHA）的脑切片，用镍增强DAB进行雄激素受体（AR）（1:750；n = 6；Santa Cruz Biotechnology）或雌激素受体（ERα）（1:2500；n = 9；Santa Cruz Biotechnology）的免疫标记。随后，对AR标记的切片进行prepro-hcrt/orx双重标记（如上所述），对ERα标记的切片进行prepro-hcrt/orx双重染色（n = 5）。切片封片后，使用显微镜下的描图器附件，在与Swanson（2004）图谱中LHA四个冠状层之一最接近的切片上进行手绘，并标记每个切片中的双标记和单标记细胞。使用 Adob​​e Illustrator（加利福尼亚州圣何塞）对图示进行数字化扫描，并将其叠加到图谱上，然后将每种细胞群映射到图谱插图上（Swanson，2004）。对于 ERα+hcrt/orx 标记的切片，统计了双标记和单标记 hcrt/orx 神经元的数量。

药理学和交配行为。

成年雄性（实验开始时体重约350克）Long-Evans大鼠（n =9）在行为测试前一周内，与处于性成熟期的雌性大鼠进行了四次每次1小时的性交体验。在最后一次测试的前30分钟内未射精一次的动物被排除在实验之外。性交体验和行为测试均在动物进入夜间活动期2小时后，于40瓦红光照射下进行。交配行为测试在雄性大鼠的笼内进行，持续30分钟。由一位对实验处理不知情的观察者使用定制的计算机软件记录每次行为事件的频率和潜伏期数据，对雄性交配行为的特征（例如，爬跨、插入和射精）进行评分。在行为测试前30分钟，动物分别注射OX1受体拮抗剂N- (2-甲基-6-苯并恶唑基)-N ″ -1,5-萘啶-4-基脲（SB 334867）（20 mg/kg，腹腔注射）或DMSO溶剂（0.5 ml/kg）。实验采用简单的组内平衡设计，即第一天测试时，5只动物接受药物注射，其余4只动物接受溶剂注射。经过48小时的药物清除期后，第一天接受药物治疗的动物接受溶剂注射，反之亦然。

电。

成年雄性Sprague Dawley大鼠（约350 g）用水合氯醛（诱导麻醉剂量400 mg/kg，腹腔注射；之后维持麻醉剂量100 mg·kg⁻¹ · h⁻¹ ）麻醉后，固定于立体定位仪上。去除颅骨和覆盖脑干区域（包含腹侧被盖区VTA）的硬脑膜。每只动物首先接受人工脑脊液（aCSF）灌注[0.5 μl/5 min；从λ点，前后方向+2.6或+3.4 mm；内外侧方向±0.8 mm；背腹方向-7.0 mm；根据立体定位图谱（Paxinos和Watson，1998）确定平颅位置]，使用32号Hamilton注射器（0.5 μl/5 min）灌注至VTA的一侧。10分钟后，在同侧VTA进行细胞/轨道取样。接下来，将hcrt-1/orx-A（0.014 nmol，n = 4；1.4 nmol，n = 5；或140 nmol，n = 6，溶于人工脑脊液；American Peptide公司，加利福尼亚州桑尼维尔市）注入对侧腹侧被盖区（VTA），之后在该侧重复进行细胞计数实验。注射剂量按半球和注射部位（前部或后部）进行平衡。使用单管玻璃微电极（拉制前外径1.5 mm；World Precision Instruments公司，佛罗里达州萨拉索塔市）进行细胞外单单位记录，电极内填充2 mol/L氯化钠溶液，并进行反向折断处理。电极阻抗在135 Hz频率下为2至4 MΩ。多巴胺（DA）神经元的识别依据是其正负性细胞外动作电位，这些动作电位通常具有明显的起始段/胞体树突（IS/SD）断点、较宽的动作电位持续时间、较慢的放电频率以及不规则的单次放电或簇状放电模式（Grace和Bunney，1983）。为了进行每条电极轨道上的细胞数实验，记录电极被系统地穿过腹侧被盖区（VTA）立体定位定义的区域（位于λ点前方2.8-3.4 mm；中线外侧0.6-1.0 mm；脑表面下方6.5-8.5 mm），重复六次。使用Chart数据采集系统（AD Instruments，Mountain View，CA）在线记录每个识别出的DA神经元2-5分钟。每只动物每条电极轨道上遇到的自发活动DA神经元的平均数量（每条电极轨道上的细胞数）作为VTA DA神经元群体活动的指标。DA神经元的平均放电频率由每组所有动物采集的所有DA神经元样本计算得出。

为了检测140 nmol hcrt/orx组的去极化失活情况，在完成hcrt-1/orx-A后采样后立即腹腔注射阿扑吗啡盐酸盐（20 μg/kg；n = 4；Sigma）。注射阿扑吗啡10分钟后，在之前接受hcrt-1/orx-A处理的VTA侧，额外采集了6条电极轨迹。

行为，三标记免疫组织化学和细胞计数。

成年雄性Long-Evans大鼠（约300克）与处于发情期的雌性大鼠进行四次每次1小时的性交体验，具体方法如上所述。在麻醉、灌注和组织制备（用于免疫标记）前1小时，允许动物（n =6）交配至单次射精。如上所述，动物几乎立即爬跨并插入，该组的平均射精潜伏期为588.50±85.03秒（平均值±标准误）。实验组与未与发情期雌性大鼠交配的、具有性经验的对照组（n =6）进行比较。如上所述，测试在动物通常夜间活动期开始2小时后，于红光照射下进行。动物处死、固定并进行冷切片（如上所述）后，从每只动物中选取代表腹侧被盖区（VTA）四个前后方向水平的四个切片进行免疫组织化学分析。各层级细胞计数所用的受试者数量 ( n )见表 4。切片用 DAB 法（1:7500；Santa Cruz Biotechnology）进行 Fos 标记，方法同上。随后，切片用花菁染料标记的荧光二抗（1:200；分别为 Cy3 和 Cy2；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）进行 prepro-hcrt/orx（1:500）和酪氨酸羟化酶 (TH；1:2000；Millipore ）标记。细胞计数在Leica（Nussloch，Germany）DM 4000B 显微镜下进行，使用Stereo Investigator软件（MBF Bioscience，Williston，VT），由一位对处理条件不知情的实验人员操作。Stereo Investigator软件用于定义包含 VTA 各层级所有 DA 细胞的计数视野。在 VTA 的四个前后水平的单个焦距下，标记了五种细胞类型：TH 阳性神经元、显示 Fos-ir 的 TH 阳性神经元、显示 hcrt/orx 纤维直接（到胞体质膜上）贴附的 TH 阳性神经元、显示 Fos-ir 和 hcrt/orx 贴附的 TH 阳性神经元，以及最后，不在 TH 神经元中的单独 Fos 阳性细胞核。

数据分析。

采用独立样本t检验比较Fos实验中细胞计数的组均值和首次此类实验中Western blot的光密度值。对OX1拮抗剂行为实验的均值进行配对样本t检验。对去势实验、三标记实验中的细胞计数以及平均放电率和每条轨道上的细胞数进行方差分析。

功能验证

交配增加hcrt / orx神经元中的Fos免疫反应性

各组间表达 Fos 免疫反应的 hcrt/orx 免疫反应细胞百分比存在显著差异，交配组动物的 hcrt/orx 细胞中 Fos 免疫反应显著升高（t (10) = 7.71；p < 0.01）（表 1，图 1）。双标记 hcrt/orx 的平均数量在各组间也存在显著差异（t (10) = 6.03；p < 0.001）。值得注意的是，在交配组动物中，内侧和外侧计数视野中 Fos 阳性 hcrt/orx 神经元的数量没有差异（数据未显示）（Harris 和 Aston-Jones，2006）。交配动物中 Fos-ir 核（仅 Fos 标记和双标记 hcrt/orx 神经元）的总平均数明显高于非交配对照组（t (10) = 16.97；p < 0.001）（表 1）。

表1。 

在雄性大鼠的hcrt / orx神经元交配期间Fos-ir增加

阉割降低下丘脑中的hcrt / orx免疫反应性和蛋白质

与假手术对照组相比，去势后28天，hcrt/orx免疫反应阳性神经元的计数显著降低（图2A ）（F (3,16) = 7.60；p < 0.005）。这相当于观察到的细胞群数量减少了31.8%。事后（Tukey）检验显示，假手术组大鼠与去势7天或14天的大鼠之间，hcrt/orx免疫反应阳性神经元的计数无显著差异。随后对下丘脑前体hcrt/orx进行Western印迹分析发现，与假手术对照组相比，去势28天的大鼠下丘脑中hcrt/orx条带的平均光密度显著降低（图2B ）（t (8) = 2.99；p < 0.05）。

图2。 

去势降低了雄性大鼠下丘脑中 hcrt/orx 的免疫反应性。A ，代表性显微照片显示，去势后 28 天，一侧半球 hcrt/orx 标记神经元的细胞数量显著减少。插图数值为两侧半球的平均细胞计数 ± 标准误；** p < 0.005。比例尺，200 μm；fx，穹窿。B ，Western 印迹分析显示，去势 28 天的大鼠下丘脑中 prepro-hcrt/orx 的表达显著降低。每条条带代表两组中各一只动物的信号。数值为 hcrt/orx 相对于 β-actin 的平均光密度 (od) 值 ± 标准误；* p < 0.05。C，对去势28天的小鼠进行免疫印迹分析显示，与油处理对照组相比，E2处理组小鼠下丘脑hcrt/orx前体含量与假手术组相当。标有相同小写字母的组间差异无统计学意义（p < 0.05）。

雌二醇恢复下丘脑hcrt / orx蛋白水平

去势或假手术后28天，油剂处理组动物的促激素释放激素/催产素原（prepro-hcrt/orx）水平显著低于假手术组和雌二醇（E2 ）处理组（F (3,9) = 8.47; p < 0.005）（图2C ）。单因素方差分析（ANOVA）及事后（Tukey）检验发现，假手术组和E2处理组动物的促激素释放激素/催产素原水平无显著差异，且E2处理组与二氢睾酮（DHT）处理组动物的促激素释放激素/催产素原水平也无显著差异。

ERα与hcrt / orx共同延伸，并在解剖学上不同的hcrt / orx神经元群体中共表达

核内雄激素受体（AR）从主要的下丘脑泌素/食欲素（hcrt/orx）神经元群腹侧分离，并从弓状核向内外侧扩散至视束。在任何情况下，均未发现核内AR和hcrt/orx存在于同一神经元中（数据未显示）。尽管雌激素受体α（ERα）在下丘脑腹侧的分布模式相似，但ERα标记在腹内侧核更为广泛。在更背侧，ERα标记存在于从不确定带下方的内囊向内侧延伸至背内侧下丘脑（DMH）的锥形细胞带中。在hcrt/orx神经元中很少发现ERα标记（<1%的检测神经元群）。当观察到ERα与hcrt/orx共定位时，通常位于DMH内部或紧邻DMH前方的神经元中（图3）。因此，尽管下丘脑中表达 ERα 的 hcrt/orx 神经元非常少，但位于 DMH 内或附近的神经元中，有很高比例（约 65%）表达 ERα（图 3）。

图3。 

ERα与hcrt / orx共同延伸。 ERα核由闭环表示，hcrt / orx神经元由空心圆表示，双标记ERα加hcrt / orx细胞由星形表示。 前囟的数字以毫米为单位。 AHN，下丘脑前核; fx，fornix; 视神经; PVN，室旁核; VMH，腹内侧下丘脑; 3v，第三脑室。

Hcrt / orx受体阻断会损害交配

与载体组相比，OX1受体拮抗剂SB 334867预处理可延长平均插入潜伏期并降低平均射精频率（表2）。配对样本t检验显示，SB 334867对插入潜伏期（ t (8) = 3.31；p < 0.05）和射精频率（t (8) = 2.40；p < 0.05）均有显著影响。药物处理似乎也导致平均爬跨潜伏期和射精潜伏期略有延长，以及平均插入次数略有减少（表2）。

表2。 

OX1拮抗剂SB 334867会损害雄性交配行为

Hcrt-1 / orx-A增加VTA DA神经元放电率和群体活性并诱导去极化失活

与载体处理的对照相比，最低剂量的hcrt-1 / orx-A（0.014 nmol）增加了平均VTA DA神经元放电率（图 4B,C）（成对比较; F(1,18) = 13.83， p <0.01； 在混合2×3方差分析之后 F(1,10) = 13.67， p <0.005），但没有其他剂量的hcrt-1 / orx-A具有此作用。 该剂量似乎是导致hcrt / orx对2×3方差分析中检测到的放电速率具有重大影响的主要原因。 一种 事后 （Tukey）试验显示aCSF处理的对照组在剂量之间的比率没有显着差异。 1.4 nmol剂量的hcrt-1 / orx-A显着增加VTA DA神经元群体活性（在每个电极轨迹中检测到的自发活跃神经元的数量（图 4D）（成对比较， F(1,24) = 6.42， p <0.05； 经过2×3混合方差分析的显着相互作用后， F(2,10) = 16.71， p <.001）。 经测试的最高剂量的hcrt-1 / orx-A剂量（140 nmol）显着降低了DA神经元的种群活动（每个磁道的细胞数）（图 4D）（140 nmol剂量的单向重复测量方差分析， F(2,6) = 12.20; p <0.01）。 全身阿扑吗啡注射液可逆转这种下降（Tukey's 事后 测试）。

图4。 

体内hcrt/orx调节VTA多巴胺能神经元的活性。A图：典型的VTA多巴胺能神经元波形，显示出特征性的宽动作电位和IS/SD间期转换。B图：上图：同一载体处理神经元的放电频率和模式，显示出典型的爆发性放电活动；下图：局部注射0.014 nmol hcrt-1/orx-A后观察到的快速放电神经元（n = 4）。C 、D图：局部注射hcrt-1/orx-A对VTA多巴胺能神经元放电频率和群体活性的剂量关系。1.4 nmol hcrt-1/orx-A（n = 5）可增加群体活性。全身注射阿扑吗啡（20 μg/kg）可逆转140 nmol hcrt-1/orx-A（n = 4）后群体活性的降低。每个柱状图内的数字表示记录的神经元数量。图中所示为平均值±标准误。 * p < 0.05；** p < 0.01。

具有hcrt / orx并置的TH阳性VTA神经元显示交配后Fos-ir的增加

非TH阳性神经元中Fos-ir核平均数的双因素方差分析显示治疗效果显着（F(1,38) = 38.88; p <0.001）和解剖学水平（F(7,38) = 12.59; p <0.001），以及这两个因素之间的显着相互作用（F(7,38) = 7.45; p <0.001），表明在交配过程中诱导的Fos优先出现在前计数水平上。 随后的单向方差分析和 事后 （Tukey）测试，显示两个最前面的水平（“rostral”和“中间1”），以显着更多的Fos阳性细胞核（F(3,24) = 9.48; p <0.001）。 对于未交配的对照品则并非如此，其中基础Fos-ir的水平没有差异（表3）。 具有hcrt / orx并置的TH标记神经元的百分比通过实验处理没有差异; 然而，这一测量结果确实显示出明显的rostrocaudal梯度，其中最大的延髓水平在两组中具有显着更高的这些神经元百分比（表4）（F(3,38) = 133.57; p <0.001）。 这一发现与我们在前VTA中观察到的hcrt / orx纤维的更高密度是一致的。 显示Fos-ir（但不具有hcrt / orx并置）的TH标记神经元的百分比在治疗方法或后尾神经水平上均无差异。 同时显示Fos和hcrt / orx并置的TH神经元的百分比显示出显着的治疗效果（F(1,38) = 8.62; p <0.01），水平（F(3,38) = 4.53; p <0.01），以及它们之间的相互作用（F(3,38) = 4.53; p <0.01）。 来自实验组的方法的单向方差分析表明，交配诱导的hcrt / orx并置的TH神经元中的Fos-ir最明显地出现在位于鼻端VTA的细胞内（F(3,24) = 4.85; p <0.05）。

表3。 

4个rostrocaudal水平的VTA非TH阳性细胞中Fos-ir核的数量

表4。 

显示hcrt / orx并置，Fos或两者的TH神经元的百分比

讨论

交配后下丘脑外侧区（LHA）中hcrt/orx神经元Fos免疫反应性的增强表明，这些细胞的激活伴随雄性生殖行为（Morgan和Curran，1991）。这些数据与早期2-脱氧葡萄糖研究的结果一致，该研究报道了暴露于发情期雌性气味后LHA代谢活性增强（Orsini等，1985）。这种效应可能反映了hcrt/orx神经元末端区域（如mPOA）中hcrt/orx信号传递的增强，而hcrt/orx已被证明能够促进雄性交配行为（Gulia等，2003）。hcrt/orx神经元中与性别相关的Fos诱导与hcrt/orx神经元对天然强化物敏感的观点相符。最近一项研究表明，在对食物奖励进行条件反射训练的大鼠中，下丘脑泌素/食欲素（hcrt/orx）神经元的Fos免疫反应性（Fos-ir）水平升高，且这种Fos-ir水平的升高与动物在条件性位置偏好范式中的偏好得分呈正相关（Harris等，2005）。hcrt/orx神经元的激活可能是一种与奖励相关的现象，因为上述研究表明，在暴露于新奇物体刺激的动物中，hcrt/orx神经元的Fos-ir水平并未出现显著升高。这些作者还报告了hcrt/orx神经元中基础Fos-ir表达（15%）、新奇刺激诱导Fos-ir表达（18%）和食物条件反射诱导Fos-ir表达（50%）的百分比，这些百分比与我们在此报告的数值（基础Fos-ir表达12%，交配诱导Fos-ir表达40%）相符。这些观察结果表明，hcrt/orx神经元会被食物和性等自然奖励激活。

本文描述的雌激素对下丘脑泌素/泌乳素（hcrt/orx）的调控为下丘脑泌素能系统可能控制雄性性行为提供了进一步的证据。值得注意的是，本文报道的hcrt/orx丢失的时间进程与经典的行为学数据相符，这些数据表明雄性性行为在去势后需要数周时间才会下降，而且恢复性行为需要雌二醇（E2）而非二氢睾酮（DHT）（Hull等人，2006 ）。在没有进一步实验的情况下，我们只能推测在缺乏E2的情况下hcrt/orx持续存在的机制。最简单的解释可能是，hcrt/orx水平下降的滞后时间与囊泡中神经递质储存量明显减少的潜伏期相对应。如下文所述，hcrt/orx神经元中雌激素受体（ER）的缺失表明，hcrt/orx的表达受到含有这些受体的神经元输入的调控。由于神经肽的合成（Enyeart等人，1987）、运动（Shakiryanova等人，2005）和释放都是活动依赖性现象（Fulop等人，2005），因此去势后hcrt/orx神经元兴奋性的任何降低（Smith等人，2002）都可能对这些过程产生负面影响，减缓肽的释放动力学，以至于合成水平的降低可能在一段时间内都难以察觉。无论机制如何，类固醇的作用很可能是维持肽基础水平的复杂级联反应的第一步。

正如hcrt/orx神经元似乎能够响应与能量平衡相关的体液因子来调节食物摄入（Olszewski等人，2003；Burdakov等人，2006 ）一样，hcrt/orx神经元似乎也对激素环境敏感，并可能以类似的方式促进生殖行为。本文数据表明，基础hcrt/orx表达由雌二醇（E2 ）维持。在性腺功能完整的动物中，如果表达完整的hcrt/orx，这种神经递质可能有助于处理对雄性性行为和奖赏至关重要的结构中的信息。下丘脑泌素/食欲素神经元与内侧视前区（mPOA）、终纹床核（BNST）和腹侧被盖区（VTA）等区域存在大量的相互联系（Peyron等，1998；Sakurai等，2005），这些区域已知对雄性性行为的表达至关重要（综述见Hull等，2006）。去势后下丘脑泌素/食欲素水平的降低预计会减少这些结构的重要兴奋性输入来源，从而损害行为。

ER激活维持基础hcrt/orx表达的方式尚待进一步研究；然而，它很可能是由投射至LHA的表达ERα的脑区传入纤维驱动的（Simerly等人，1990；Yoshida等人，2006），特别是那些具有兴奋性投射的结构[例如，BNST和mPOA（Georges和Aston-Jones，2002；Henny和Jones，2006）]。我们未发现AR与hcrt/orx共定位，并且，尽管少数hcrt/orx神经元ERα免疫阳性，但这些细胞数量不足以解释去势的显著影响，也与去势后hcrt/orx含量降低的细胞不符（图2A ，图3）。我们还发现，ERα免疫反应阳性细胞核与hcrt/orx神经元经常相邻，这提示邻近的含ERα细胞可能对hcrt/orx神经元及其基因表达活性进行局部调控。这种类型的兴奋性局部回路活动的重要性已在hcrt/orx系统中得到证实（Li et al., 2002）。然而，在必要的解剖学实验证实含ERα细胞与hcrt/orx神经元之间存在兴奋性突触之前，尚不能断定hcrt/orx的表达受激素依赖性传入神经驱动。Hcrt的表达存在昼夜波动（Taheri et al., 2000）、妊娠期波动（Kanenishi et al., 2004）以及对各种饮食干预的反应（Cai et al., 1999 ; Griffond et al., 1999）。调控hcrt表达动态的分子机制尚未被阐明，因此，目前很难追踪从细胞核到细胞膜的路径，并命名可能影响 hcrt/orx 表达的候选信号分子。

催产素/食欲素信号通路参与强化性行为等行为的观点也得到了数据的支持，这些数据表明，使用食欲素受体1拮抗剂SB 334867治疗后，雌性动物的性行为会受到损害（表2）。在与阻断应激诱导的可卡因自我给药行为恢复所用剂量相似的剂量下（Boutrel等人，2005），SB 334867显著延长了插入潜伏期并减少了射精次数，这表明阻断催产素/食欲素信号通路可能影响发情期雌性动物的性动机。

多巴胺（DA）是奖赏、激励动机和适应性行为的重要神经递质（Berridge和Robinson，1998；Ikemoto和Panksepp，1999；Wise，2004）。我们观察到hcrt/orx对腹侧被盖区（VTA）DA神经元活性具有显著的剂量依赖性兴奋作用。这一发现支持hcrt/orx在强化作用中的作用，并提示中脑边缘DA系统是mPOA之外的一个区域，hcrt/orx的投射可能在此发挥作用，增强雄性性行为。在最低测试剂量（0.014 nmol）下，hcrt/orx增加了神经元的放电频率，但未影响神经元群体活性（细胞/轨道）（图4C ）。在中等剂量（1.4 nmol）下，DA神经元群体活性增加，表明先前处于静息状态的超极化神经元被激活（图4D ）。在最高剂量（140 nmol）下，VTA DA神经元的群体活性降低。有趣的是，急性给予DA激动剂阿扑吗啡可逆转hcrt/orx诱导的VTA DA神经元群体活性降低（图4D ）。在正常动物中，阿扑吗啡通过激活自身受体使DA神经元超极化，并降低其放电频率和群体活性。然而，在长期抗精神病药物治疗或反复滥用药物治疗后，阿扑吗啡可以逆转药物引起的群体活性降低（Grace等，1997；Shen和Choong，2006）。阿扑吗啡被认为是通过使过度兴奋的细胞复极化以恢复放电来逆转去极化失活。综上所述，这些数据表明hcrt/orx对VTA DA神经元具有剂量依赖性的兴奋作用，这与之前的体外研究结果一致（Korotkova等，2003）。

多项实验探讨了从下丘脑外侧区（LHA）到腹侧被盖区（VTA）的下行通路的重要性（Bielajew和Shizgal，1986；Shizgal，1989；You等人，2001）。这些数据表明，在下丘脑介导的动机行为（如交配（Pfaus等人，1990；Wenkstern等人，1993）或进食（Hernandez和Hoebel，1988；Rada等人，2005））期间，伏隔核（NAc）多巴胺（DA）的增加可能依赖于这些下行投射。一些实验也支持这些投射包含人促肾上腺皮质激素（hcrt）/食欲素（orx），这些实验发现，在VTA内注射hcrt/orx后，NAc DA的释放增加（Narita等人，2006）。在下丘脑中，血清素[5-羟色胺(5-HT)]能有效超极化外侧下丘脑(LHA)中的hcrt/orx神经元（Li et al., 2002）。选择性血清素再摄取抑制剂或5-HT本身，通过逆向透析注入LHA中hcrt/orx表达细胞的主要分布区域，可降低伏隔核(NAc)基础多巴胺(DA)释放和雌性诱导的多巴胺释放，并损害交配行为（Lorrain et al., 1997 , 1999）。鉴于上述数据表明交配过程中hcrt/orx神经元被激活，以及腹侧被盖区(VTA)多巴胺(DA)神经元被hcrt/orx激活，我们认为投射至VTA的hcrt/orx下行通路可能介导与性别相关的NAc多巴胺释放。此外，LHA 内 5-HT 对这些投射的抑制可能解释了 5-HT 对 NAc DA 释放和性行为的抑制作用。

我们发现，TH阳性的VTA神经元受hcrt/orx系统支配，并且在接触交配等奖励性刺激后Fos免疫反应性增强（图5，表4），这表明hcrt/orx-DA相互作用存在解剖学基础。这种效应具有行为相关性和空间特异性，因为在交配动物的前VTA中，仅在与hcrt/orx相邻的TH神经元中检测到Fos诱导。这种激活模式出现在VTA的这一区域或许并不奇怪，因为该区域的DA细胞位于hcrt/orx神经元主要群体的尾侧，这些神经元的下行纤维穿过该区域，然后扩散到脑干更远端的靶点（Peyron等人，1998）。

图5。 

交配诱导腹侧被盖区（VTA）多巴胺能神经元中HCRT/ORX受体结合位点的Fos免疫反应性表达。A图：显微照片显示VTA中酪氨酸羟化酶（TH）、HCRT/ORX受体结合位点和Fos标记。箭头指示HCRT/ORX受体结合位点的Fos阳性TH神经元；星号标记无受体结合位点的双标记神经元。比例尺：45 μm。B图：Fos阳性TH神经元的细节图，箭头指示HCRT/ORX受体结合位点的突触小体位置。C图：冠状切片显示用于计数的VTA前后方向水平（深色阴影部分）。每个切片左上角的数字表示距前囟的毫米数。右上角的数字表示该水平细胞密度的平均值±标准误差。方框指示A图中显微照片的区域。

这些数据提示了一种新的途径，性腺类固醇可能通过该途径影响下丘脑对多巴胺系统的输入，而该系统与动机行为有关（图 6）。此外，它们还将性行为添加到由下丘脑促肾上腺皮质激素/食欲素调节的行为列表中，该列表还包括性唤起、摄食行为和药物渴求。

图6。 

hcrt / orx通过性腺类固醇和VTA DA调节hcrt / orx的模型。 由芳香化酶的性腺睾酮合成的雌二醇作用于BNST，mPOA和LHA中含有ERα的神经元。 这些结构投射到下丘脑hcrt / orx神经元。 来自这些结构的兴奋性投射可以以类固醇敏感的方式影响hcrt / orx神经元和基因表达活性。 对VTA的Hcrt / orx预测增强了男性性行为期间的中脑DA神经元活动。 5-HT的LHA内输注可以阻止这种作用，其抑制hcrt / orx活性，损害性行为和NAc DA释放。

脚注

  • 收到四月21，2006。
  • 修订于1月23，2007收到。
  • 接受二月8，2007。

  • 这项工作得到了美国公共卫生服务机构MH073314（JWM），MH40826和MH01714（EMH）以及AA12435（R.-YS）的支持。 我们感谢Samir Haj-Dahmane博士的建议，以及Zuoxin Wang博士提供的显微镜设备。

  • 通讯应发给佛罗里达州立大学心理学系John Muschamp，佛罗里达州塔拉哈西32306-1270。 [email protected]
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文章引用了这篇文章

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  • 食欲素/ Hypocretin调节腹侧被盖多巴胺神经元对前额叶激活的反应：昼夜影响 神经科学杂志，17十一月2010，30（46）：15585-15599
  • Orexin A / Hypocretin-1有选择地促进积极增强剂的动机 神经科学杂志，9九月2009，29（36）：11215-11225
  • Orexin刺激的MAP激酶级联通过人类H295R肾上腺皮质细胞中的多种G蛋白信号传导途径激活：食欲素A和B的不同作用 Journal of Endocrinology，1 August 2009，202（2）：249-261