Cdk5 phosphorylates Dopamin D2-Rezeptor und Attenuates Downstream Signaling (2013)

Zitat: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S., Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 phosphoryliert Dopamin D2-Rezeptor und dämpft die Downstream-Signalgebung. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, Universität von North Dakota, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: Mai 20, 2013; Akzeptiert: November 14, 2013; Veröffentlicht am: 31. Dezember 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen des Creative Commons Attribution License, die uneingeschränkte Nutzung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, dass der ursprüngliche Autor und die Quelle gutgeschrieben werden.

Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch die Zuwendungen (NRF-2012R1A2A2A01012923 und NRF-2012R1A4A1028200) von der koreanischen Regierung (MSIP) und auch im Rahmen des internationalen Zusammenarbeit Programms verwaltet von NRF Korea (2012K2A1A2033117) und das Korea Brain Research Institute (KBRI) unterstützt unterstützt Grundlagenforschungsprogramm von MSIP (2031-415). SKP erhielt die Young Investigator Awards der 2004 und 2006 National Alliance zur Erforschung von Schizophrenie und Depression (NARSAD). Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, bei der Datensammlung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Einleitung

Die Dopamin-Signalübertragung ist an verschiedenen Gehirnfunktionen beteiligt, einschließlich motorischer Koordination, Stimmungskontrolle und Belohnungsmechanismen [1]. Eine Hauptkomponente von Dopamin-Signalgebung in Vertebraten durch striatale mittelgroß Projektionsneuronen (MSN) ausgeübt wird, die selektiv eine Untergruppe der Dopamin-Rezeptoren exprimieren und dopaminerge Eingang hauptsächlich aus dem ventralen tegmentalen Bereich (VTA) und die Substantia nigra (SN erhalten) [2]. Dopaminrezeptoren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) mit sieben Transmembrandomänen und bestehen aus zwei Subtypen, D1-ähnliche und D2-ähnliche Rezeptoren, die Wechselwirkungen in der Dopamin-Signalübertragung vermitteln [1]. Zum Beispiel, Dopamin D1-like Rezeptoren (D1, D5) aktivieren Adenylylcyclase durch G_αs und erhöhen das intrazelluläre Niveau von cAMP, aber Dopamin D2-ähnliche Rezeptoren (D2, D3, D4) hemmen Adenylylcyclase durch G_αi und verringern die intrazelluläre Ebene von cAMP [1], [3].

Unter den Dopaminrezeptoren ist der D2-Rezeptor (DRD2) an der Pathophysiologie mehrerer schwerer psychiatrischer Störungen einschließlich Schizophrenie und Drogenabhängigkeit beteiligt [4], so dass viele Antipsychotika zumindest teilweise auf DRD2 zielen. Es ist auch bekannt, dass die DRD2-Aktivität gut mit den Verhaltensfolgen von Missbrauchsdrogen in Tiermodellen korreliert [5]. Antidepressiva und Stimmungsstabilisator-Wirksamkeit wurden auch mit Veränderungen in der Zelloberflächenexpression von DRD2 oder stromabwärts intrazellulärer Signalgebung, vermittelt durch PKA, ERK und GSK3, in Verbindung gebracht [1], [4], [6]. Trotz dieser wichtigen Rollen für DRD2 im Gehirn sind die detaillierten regulatorischen Mechanismen, die den DRD2-Eigenschaften Heterogenität und Komplexität verleihen, nicht vollständig verstanden.

Übereinstimmende Beweislinien weisen darauf hin, dass mehrere posttranslationale Modifikationen an der Feinabstimmung der DRD2-Aktivität beteiligt sind. Eine extensive Glykosylierung von DRD2 wurde in frühen Photoaffinitätsmarkierungsstudien gezeigt [7]und Disulfidbrückenbildung innerhalb von DRD2 wurde ebenfalls als eine wichtige Modifikation für die Ligandenbindung identifiziert [8]. Darüber hinaus wurden Phosphorylierungsstellen von DRD2 anfänglich durch in vitro Assay mit Radioisotopen, die Wege für verschiedene Regulationswege bereitstellen, die durch verschiedene Kinasen vermittelt werden [9]. Tatsächlich reguliert die Proteinkinase C (PKC) die DRD2-vermittelte Mobilisierung von intrazellulärem Calcium und moduliert die Wechselwirkung von DRD2 mit Zytoskelettproteinen [10]. Die Phosphorylierung durch die GPCR-Kinase 2 (GRK2) reguliert Agonist-induzierte Resensibilisierungsmuster von DRD2 [11].

Cyclin-abhängige Kinase 5 (Cdk5) ist eine Prolin-gerichtete Serin / Threonin-Kinase, die aufgrund der hirnspezifischen Expression ihrer essentiellen Aktivatoren eine bevorzugte Aktivität aufweist, p35 und p39 [12]. Cdk5 ist an verschiedenen neuronalen Prozessen beteiligt, einschließlich neuronaler Migration und Axonführung, und Cdk5- und p35-Null-Mäuse zeigen Defekte in der kortikalen Schichtung [13]. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung von WAVE1 und Ephexin durch Cdk5 die dendritische Wirbelsäulenmorphogenese reguliert [14]. Darüber hinaus reguliert Cdk5 auch die Oberflächenexpressionsniveaus der NMDA-Rezeptor-, NR2B- und NR2A-vermittelten NMDA-Ströme [15], [16]. Es ist bemerkenswert, dass mehrere Beweise für eine intime Beziehung zwischen Cdk5 und dem Dopamin-System sprechen. Cdk5 phosphoryliert die Tyrosinhydroxylase (TH), reguliert ihre Stabilität und erhält so die dopaminerge Homöostase aufrecht [17]. In postsynaptischen Neuronen, wenn der T75 Rest von Dopamin und cyclisches AMP-regulierten Phosphoprotein-32kD (DARPP-32) durch Cdk5 phosphoryliert wird, kann es PKA-Aktivität hemmen und somit Dopamin DRD1 PKA-vermittelte Signalgebung antagonisieren [18]. Interessanterweise, wenn Kokain, ein indirekter Agonist von Dopaminrezeptoren, chronisch in Ratten verabreicht wird, nehmen mRNA- und Proteinspiegel von Cdk5 in mittleren stacheligen Neuronen zu [19]. Insgesamt scheint Cdk5 an medikamenteninduzierten synaptischen Anpassungen beteiligt zu sein. In dieser Studie zeigen wir eine funktionelle Interaktion von DRD2 und Cdk5, die die Rolle von Cdk5 in der Dopamin-Signalübertragung weiter ausbaut.

Materialen und Methoden

Antikörper

Anti-Kaninchen-Seren wurden gegen Peptide erzeugt, die Phospho-Serin 321 (pS321) der dritten intrazellulären Schleife von DRD2 (D2i3) enthielten. Phospho-Peptid, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), wurde verwendet, um eine Peptid-konjugierte Säule zur Affinitätsreinigung (20401, PIERCE) herzustellen. Anti-pS321-Antikörper wurde durch ein Affinitätsreinigungssystem nach den Anweisungen des Herstellers angereichert. Gereinigter Phospho-Antikörper wurde in PBS mit 0.1% Natriumazid und 0.1% Gelatine gelagert. Anti-Maus-anti-Cdk5-Antikörper (sc-249) und anti-Kaninchen-anti-p35-Antikörper (sc-820) wurden für das Western-Blotting und die Immunocytochemie von Cdk5 / p35 verwendet. Anti-Maus-Anti-GFP-Antikörper (sc-9996) wurde für die Immunpräzipitation und Western-Blotting von DRD2-GFP verwendet. Anti-Kaninchen-Anti-FLAG-Antikörper (sc-807), Anti-Kaninchen-Anti-HA-Antikörper (sc-805), Anti-Maus-Anti-GST-Antikörper (sc-138) und Anti-Maus-Anti-GAPDH-Antikörper (sc- 32293) wurden von Santa Cruz Biotechnologies erworben.

Tiere

Die p35-Knockout-Maus war ein Geschenk von Dr. Katsuhiko Mikoshiba vom RIKEN Brain Science Institute in Japan und wurde für die primäre Neuronenkultur verwendet. Primersätze für die Genotypisierung waren 5'-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC und 5'-TCCATCT GCACGAGACTAGT, wie zuvor beschrieben [20]. ICR-Mäuse und Sprague-Dawley-Ratten wurden zur Herstellung von Gehirnlysaten verwendet. Alle tierischen Verfahren wurden von der Pohang Universität für Wissenschaft und Technologie für Tierpflege und -einsatz genehmigt.

Plasmidkonstrukte

Human DRD2 lange Isoform in einem EGFP-N1 Plasmidvektor und die dritte intrazelluläre Schleife von DRD2 (212-373 Aminosäureresten einschließlich der 29 zusätzlichen Aminosäurereste einzigartigen lange Isoform DRD2) in einem pFLAG-CMV-2 Plasmidvektor wurden verwendet. Menschliches Cdk5 wurde in einen pCMV-HA-Plasmidvektor insertiert, und menschliches p35 wurde in einen pcDNA-3.1-Plasmidvektor inseriert. Human Cdk5 wurde in einem pcDNA 35 Vektor zusammen mit menschlichen p3.1 unter einem Cytomegalovirus (CMV) -Promotor eingefügt, um ein dual-Expressionskonstrukt (Cdk5 / p35) für Immunzytochemie, Rezeptor-Internalisierung Assay zu machen [³⁵S] -GTP_γS-Bindungsassay, Radioliganden-Bindungsassay und cAMP-Enzymimmunoassay.

In-vitro- Kinase-Assay

IP-verknüpft in vitro Kinase-Assay wurde wie folgt durchgeführt. Eine ganze Gehirn der Maus wurde in 3 mL lysierten Erythrozyten-Lyse-Puffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) durch 20 Schlägen eines Dounce-Homogenisator homogenisiert brain Lysaten erhalten . Die Lysate wurden für 30 min auf Eis inkubiert, beschallt und bei 16,000 x zentrifugiert g für 10 min. Die Überstände wurden mit anti-Kaninchen-anti-p35-Antikörper immunopräzipitiert, um einen aktiven Cdk5 / p35-Komplex zu erhalten. Cdk5 / p35-Komplex und gereinigtes GST-Fusionsprotein wurde mit Adenosin 5'-Triphosphat gemischt, [& ggr;³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) und inkubiert in Kinase-Puffer (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl)₂, 0.2 mM DTT) für 1 h bei Raumtemperatur [18], [21]. Der gereinigte Cdk5 / p25-Komplex (14-516, Millipore) wurde ebenfalls verwendet für in vitro Kinase-Assay wie oben beschrieben. Der 2 × Probenladepuffer wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben und bei 100 ° C gekocht. Die Proben wurden dann einer SDS-PAGE unterzogen und das getrocknete Gel wurde durch Autoradiographie beurteilt.

Flüssigkeitschromatographie (LC) -Massenspektrometrie (MS) / MS-Analyse

Das rekombinante GST-D2i3-Protein wurde mittels LC-MS / MS nach IP-Verknüpfung analysiert in vitro Kinase-Assay. Wir führten Peptididentifikation von LC-MS / MS Daten unter Verwendung von X !! Tandem (Version Dec-01-2008) durch. Jede RAW-Datendatei wurde zuerst unter Verwendung der trans-proteomischen Pipeline (TPP; Version 4.3) in mzXML konvertiert. MS / MS-Scans in den konvertierten mzXMLs wurden dann der Suche nach der UniProt-Maus-Proteinsequenzdatenbank (Release 2010_07) einschließlich der GST-D2i3-Sequenz unter Verwendung von X !! Tandem unterzogen. Die Toleranz wurde auf 3 Da für Vorläufer-Ionen und 2 Da für Fragment-Ionen eingestellt. Die Enzymspezifität für Trypsin wurde verwendet. Variable Modifizierungsoptionen wurden für die Carbamidomethylierung von Cystein (57.021 Da), die Oxidation von Methionin (15.995 Da), die Hydrolyse von Asparagin (0.987 Da) und die Phosphorylierung von Serin (79.966 Da) verwendet.

Immunpräzipitation

Die Immunpräzipitation wurde an Zelllysaten in ELB-Lysepuffer durchgeführt. Anti-GFP-Antikörper wurde zu den Lysaten gegeben und für 3h bei 4 ° C inkubiert. Immunkomplexe wurden unter Verwendung von Protein-A-Agarose gereinigt. Die Präzipitate wurden mit SDS-Probenladepuffer für 30 min bei 37 ° C inkubiert und SDS-PAGE und Western-Blots unterzogen.

GST-Pull-down-Assay

10 & mgr; g gereinigtes GST und GST-D2i3 wurden mit Rattenhirnlysat für 1.5 h bei 4 ° C inkubiert. 30 & mgr; l Glutathion (GSH) -konjugierte Sepharose 4B-Kügelchen (17-0756-01, GE Healthcare), äquilibriert mit Lysepuffer, wurde zugegeben und für zusätzliches 1 h inkubiert. Die Kügelchen wurden durch Zentrifugation bei 2,000 × gesammeltg und mit Lysepuffer 4 mal gespült [22], [23]. Präzipitate wurden mittels Western-Blot unter Verwendung von Anti-Cdk5- und Anti-p35-Antikörpern analysiert.

Immunozytochemie

Transfizierte HEK 293-Zellen und striatale Neuronen, die auf Deckgläschen kultiviert wurden, wurden einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und durch Eintauchen in kaltes 4% Paraformaldehyd / PBS für 30 min fixiert. Der primäre Antikörper wurde in der Blockierungslösung (2% Pferdeserum und 1% Triton X-100 in PBS) verdünnt. Alexafluor-647-konjugierter Anti-Maus-Antikörper (A20990, Invitrogen) und Alexafluor-568-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper (A11011, Invitrogen) wurden als sekundäre Antikörper verwendet. Hoechst wurde zur Kernfärbung verwendet. Bilder wurden durch konfokale Mikroskopie (Olympus, FluoView-1000) erhalten.

Rezeptor-Internalisierungstest

24 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit 1 & mgr; M Quinpirol (Q102, Sigma) für 30 min und 90 min bei 37 ° C behandelt. Die Zellen wurden in 2 mL kaltem PBS resuspendiert und 200 & mgr; l Aliquots wurden für jede Reaktion verwendet. Arzneimittelbehandlungen wurden bei Raumtemperatur für 3h bei den folgenden Konzentrationen durchgeführt; 3 nM [³H] -Spiperon (NET-565, PerkinElmer), 3 & mgr; M Sulpirid (895, TOCRIS), 10 & mgr; M Haloperidol (H1512, Sigma). Hydrophob [³H] -Spiperon wurde verwendet, um die gesamten exprimierten Rezeptoren zu markieren, und hydrophiles Sulpirid wurde verwendet, um den membranständigen Rezeptor-gebundenen Rezeptor zu ersetzen.³H] -Spiperon-Signale. Membran-assoziierte Rezeptorsignale wurden berechnet, indem intrazelluläre Rezeptorwerte von den gesamten exprimierten Rezeptorwerten subtrahiert wurden. Die Zellen wurden auf einem GF / B-Filter (Millipore) filtriert und 3-Male mit Waschpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) gewaschen. Die Filter wurden ausgetrocknet und die restliche Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers gemessen [24].

Zellmembranpräparation

Konfluente Zellen in 100 mm-Kulturschalen nach der Transfektion wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und in 1 ml HME-Puffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl) geerntet₂, 1 mM EDTA). Homogenisierte Lysate wurden mit 500 × g für 15 min zentrifugiert und die Überstände wurden anschließend mit 36,000 × g für 30 min zentrifugiert. Pellets, die in HME-Puffer resuspendiert wurden, wurden für Assays verwendet.

[³⁵S] -GTP_γS Bindungsassay

Zellmembranfraktionen wurden mit 1 & mgr; M Quinpirol (Q102, Sigma) in dem Testpuffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl) vorinkubiert₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0.01 mM GDP) für 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) wurde zu der Endkonzentration von 3 nM in 30 & mgr; L zugegeben und weiter für 90 min inkubiert. 170 & mgr; l eiskalter Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂und 0.1 mM GTP) wurde zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Membranen wurden auf einem GF / B-Filter (Millipore) filtriert und 3-Male mit Waschpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) gewaschen. Die Filter wurden getrocknet und die Radioaktivität wurde unter Verwendung des Szintillationszählers gemessen [25], [26].

Radioliganden-Bindungsassay

Vorbereitete Zellmembranen wurden mit 0.01 nM inkubiert [³H] -Spiperon (NET-565, PerkinElmer) und zunehmende Konzentrationen von Quinpirol (Q102, Sigma) für 30 min im Testpuffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl)₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Die Membranen wurden auf einem GF / B-Filter (Millipore) filtriert und 3-Male mit Waschpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) gewaschen. Die Reaktion wurde durch schnelle Filtration durch GF / C-Filter beendet. Die verbleibende Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers gemessen [27]-[29].

cAMP-Enzymimmunoassay

Transfizierte HEK 293-Zellen wurden mit 10 & mgr; M Rolipram (R6520, Sigma) für 1 h vorbehandelt und dann mit 0.1 & mgr; M Forskolin (F6886, Sigma) und steigenden Konzentrationen von Quinpirol (Q102, Sigma) für 30 min behandelt. Primäre kultivierte striatale Neuronen wurden mit 10 & mgr; M Rolipram für 1 h und dann mit 1 & mgr; M Dopamin für 1 h behandelt [22]. Zelllysate wurden mit 0.1 M HCl hergestellt und die cAMP-Spiegel wurden durch den cAMP-Enzymimmunoassay-Kit (Sapphire Bioscience) nach den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen.

Primäres kultiviertes striatales Neuron

Der striatale Bereich wurde aus dem embryonalen Maushirn (E15) isoliert. Dissektiertes Gewebe wurde in minimal essentiellen Medien (MEM) (11095, Invitrogen) dissoziiert, die 0.25% Trypsin (T4549-100, Sigma) und 0.1% DNase I für 6 min bei 37 ° C enthielten. Die Zellen wurden in den Plattierungsmedien (MEM mit 0.01 M HEPES (pH 7.4) und 10% (Vol / Vol) Pferdeserum (16050-122, GIBCO)) erneut suspendiert. Neuronen wurden für 7-Tage kultiviert in vitro (DIV 7) in MEM mit B27-Supplement (17504-044, Invitrogen) vor der Anwendung auf cAMP-Enzymimmunoassays.

Die Ergebnisse

Cdk5 phosphoryliert Serin 321 in der dritten intrazellulären Schleife von DRD2 in vitro

Um neue Cdk5-Substrate zu identifizieren, führten wir eine systematische Suche unter Verwendung von (S / T) PX (K / H / R) als Cdk5-Erkennungskonsensussequenzen durch [30] und identifizierte DRD2 als ein Kandidatensubstrat. Die Konsensussequenz, einschließlich Serin 321, befindet sich in der dritten intrazellulären Schleife von DRD2 (D2i3), wo verschiedene Regulationsmechanismen in Zusammenhang gebracht wurden [3], [10], [11]. Die Sequenz ist in Wirbeltieren in DRD2 evolutionär konserviert, was auf eine funktionelle Bedeutung des Restes hinweist (Abb. 1A).

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Abbildung 1. Cdk5 phosphoryliert Serin 321 in der dritten intrazellulären Schleife von DRD2 in vitro.

(A) Aminosäuresequenz-Alignment zeigt konservierte Regionen des DRD2 aus verschiedenen Spezies (schattiert). Die potentielle Cdk5-Phosphorylierungsstelle ist durch ein Sternchen gekennzeichnet. (B) IP-verknüpft in vitro Kinase-Assay mit rekombinanten GST-D2i3- und GST-D2i3-Mutantenproteinen. Cdk5 / p35-Komplex, angereichert aus Mausgehirn-Extrakt durch Anti-p35-Immunpräzipitation, wurde für Kinase-Reaktionen verwendet. Ein Autoradiogramm von phosphorylierten Proteinen ist zusammen mit Coomassie-Brilliantblau-Färbung des gleichen Gels gezeigt. Pfeilspitze zeigt radioaktives Signal an, das GST-D2i3s entspricht, und offene Pfeilspitze zeigt radioaktive Signale von p35 an. (C) MS / MS-Spektrum des phosphorylierten Peptidfragments von D2i3. Die theoretischen Fragmentierungsmuster sind unterhalb des Spektrums gezeigt. Unter allen Fragmentionen sind die detektierten y- und b-Ionen im Spektrum angegeben. Sie₆ und y₇ Ionen zeigen stark die Phosphorylierung von Serin 321 an. (D) In vitro Kinase-Assay mit gereinigtem Cdk5 / GST-p25-Komplex unter Verwendung von GST-D2i3- und GST-D2i3-Mutantenproteinen. Phosphorylierte Proteine ​​wurden in einem Autoradiogramm zusammen mit Coomassie-Brilliantblau-Färbung gezeigt. Pfeilspitze zeigt radioaktives Signal entsprechend GST-D2i3 und offene Pfeilspitze zeigt radioaktive Signale von GST-p25 an.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Um die Kapazität von Cdk5 zu bestimmen, um D2i3 zu phosphorylieren, führten wir IP-verknüpft durch in vitro Kinasetests unter Verwendung eines aktiven Cdk5 / p35-Komplexes, angereichert aus Maushirnlysat durch p35-Immunpräzipitation mit gereinigten rekombinanten GST-D2i3 (Aminosäureresten 212-373) -Proteinen als Substrate. Wir beobachteten Phosphorylierungssignale in den gereinigten GST-D2i3- und GST-D2i3 S297A-Proteinen, aber das Signal wurde signifikant unter Verwendung von GST-D2i3 S321A (Abb. 1B). Um die Phosphorylierung von Serin 321 in der GST-D2i3 weiter zu verifizieren, führten wir eine LC-MS / MS-Analyse der Proben von IP-verknüpft durch in vitro Kinase-Assays unter Verwendung von LTQ XL-Massenspektrometrie. Konsequenterweise wurden Phospho-Peptide, die der Masse von Phospho-Serin-321-Peptiden entsprachen, gewonnen (Abb. 1C). Wenn man bedenkt, dass die datenabhängige Erfassung während der LC-MS / MS-Analyse dazu neigt, reichlich vorhandene Proteine ​​in der Probe nachzuweisen [31]Diese Daten legen nahe, dass der 321-Rest von Serin die dominante Phosphorylierungsstelle von Cdk5 in der D2i3-Region ist. Um die direkte Phosphorylierung von Serin 321 in der GST-D2i3 von Cdk5 zu beweisen, in vitro Kinase-Assay unter Verwendung von gereinigtem Cdk5 / GST-p25-Komplex mit gereinigten rekombinanten GST-D2i3-Proteinen wurde durchgeführt. Wir identifizierten ein signifikantes Phosphorylierungssignal in der GST-D2i3, das in der GST-D2i3 S321A fehlte (Abb. 1D). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass der D2i3 S321-Rest ein bevorzugtes Ziel für die Cdk5-vermittelte Phosphorylierung ist.

Cdk5 phosphoryliert Serin 321 in der dritten intrazellulären Schleife von DRD2 in Zellen

Um die Phosphorylierung von Serin 321 zu identifizieren, haben wir Antikörper produziert, die spezifisch für Phospho-Serin 321 (pS321) sind. Proben aus dem IP-Link in vitro Kinase-Assay wurde durch Western-Blotting unter Verwendung von Anti-pS321-Antikörper analysiert. Die Blots zeigten eine deutliche Bande in der Kinasereaktion, die von GST-D2i3 abhängig war (Abb. 2A). Um die potentielle Phosphorylierung von Serin 321 in DRD2 durch Cdk5 in Zellen zu überprüfen, wurden Anti-GFP-Immunpräzipitate von HEK 293-Zellen, die DRD2-GFP und DRD2 S321A-GFP mit oder ohne HA-Cdk5 und p35 exprimieren, mittels Western-Blot unter Verwendung von Anti-GFP analysiert Anti-pS321-Antikörper. Charakteristisch verschmierte Bandsignale durch Anti-GFP-Antikörper, von denen bekannt ist, dass sie auf übermäßiger Glykosylierung von DRD2 beruhen, werden nur in Gegenwart von DRD2-GFP beobachtet, und Anti-pS321-Antikörper detektierten ähnliche DRD2-Signale nur mit Cdk5 / p35 co-Expression (Abb. 2B) [7]. Um die Phosphorylierung von Serin 321 durch Cdk5 weiter zu verifizieren, wurden D2i3 (FLAG-D2i3) und mutierte Form von D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) erzeugt. FLAG-D2i3 und FLAG-D2i3 S321A, exprimiert mit oder ohne HA-Cdk5 und p35 in HEK 293-Zellen, wurden durch einen SDS-Gel Mobility Shift-Assay analysiert. Eine signifikante Cdk5-abhängige Mobilität Verschiebung wurde für FLAG-D2i3 beobachtet, aber nicht für FLAG-D2i3 S321A (Abb. 2C). Wir haben auch den Phosphorylierungsgrad von DRD2 bei Ser321 nach Agonistenstimulation untersucht. HEK 293-Zellen, die DRD2-GFP und Cdk5 / p35-Komplex exprimieren, wurden durch Chinpirol stimuliert, und Anti-GFP-Immunpräzipitate aus den Zelllysaten wurden durch Western-Blotting unter Verwendung von Anti-GFP- und Anti-pS321-Antikörpern analysiert. Wir fanden, dass Cdk5-vermittelte Phosphorylierung von DRD2 bei Ser321 wurde nicht durch Agonist Stimulation beeinflusst, die sich von GRK-und PKC-vermittelten Phosphorylierungen (Abb. 2D) [32], [33]. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass Cdk5 den Serin-321-Rest von DRD2 in der zellulären Umgebung phosphorylieren kann.

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Abbildung 2. Cdk5 phosphoryliert Serin 321 in der dritten intrazellulären Schleife von DRD2 in Zellen.

Cdk5-vermittelte Phosphorylierung von Serin 321 wurde unter Verwendung von Anti-pS321-Antikörper analysiert. (A) Proben von IP-verknüpft in vitro Kinase-Assay unter Verwendung von GST-D2i3-Proteinen wurde durch Western Blotting (WB) mit angegebenen Antikörpern analysiert. Pfeilspitzen zeigen GST-D2i3s an. (B) DRD2-GFP und DRD2 S321A-GFP wurde mit oder ohne HA-Cdk5 und p35 in HEK 293-Zellen exprimiert. Anti-GFP-Immunopräzipitate wurden durch Western-Blotting unter Verwendung von Anti-GFP- und Anti-pS321-Antikörpern analysiert. Die Klammer zeigt DRD2-Signale an und die offene Pfeilspitze zeigt unspezifische Signale von den Anti-GFP-Immunopräzipitaten an. "% Input" ist% Volumen des gesamten Lysats für eine IP-Reaktion. Schwache endogene Cdk5-Signale wurden durch Sternchen angezeigt. (C) Gelmobilitäts-Shift-Assay HEK 293-Zellen, die wie angegeben transfiziert wurden, wurden durch Western-Blotting analysiert. (D) Transfizierte HEK 293-Zellen wurden mit Chinpirol behandelt und Anti-GFP-Immunopräzipitate wurden durch Western-Blotting mit Anti-GFP- und Anti-pS321-Antikörpern analysiert. Die offene Pfeilspitze zeigt unspezifische Signale von Anti-GFP-Immunopräzipitaten an.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex und DRD2 sind physikalisch zugeordnet

Wir untersuchten die mögliche physikalische Interaktion zwischen dem Cdk5 / p35-Komplex und DRD2, da viele Cdk5-Substrate bekanntermaßen physikalisch mit dem Cdk5 / p35-Komplex assoziiert sind [23], [34], [35]. Zuerst wurde das GST-Pull-Down-Experiment durchgeführt. Gereinigtes rekombinantes GST-D2i3-Protein wurde mit Rattenhirnlysat inkubiert und GST-Pull-Down-Präzipitate wurden auf Western-Blotting analysiert. Wie gezeigt in Abb. 3AIn den Pulldown-Präzipitaten wurden endogenes Cdk5 und p35 identifiziert, was auf eine physikalische Interaktion zwischen DRD2 und dem Cdk5 / p35-Komplex hinweist (Abb. 3A). Darüber hinaus wurden HA-Cdk5 und p35 in den anti-GFP Immunopräzipitaten von HEK 293 Zelllysaten nachgewiesen, die DRD2-GFP und Cdk5 / p35 (Abb. 3B). Darüber hinaus führten wir immunzytochemische Analysen durch und beobachteten, dass DRD2-GFP, HA-Cdk5 und p35 signifikante Kolokalisations-Signale an der Membranfläche von HEK 293-Zellen zeigen (Abb. 3C, obere Platten). Wir untersuchten auch die Co-Lokalisierung von DRD2 und Cdk5 / p35 im neuronalen Kontext. Konsequenterweise zeigte DRD2-GFP auch eine signifikante Kolokalisation mit endogenem Cdk5 und p35 in den kultivierten striatalen Neuronen (DIV7), was weitere funktionelle Verbindungen zwischen DRD2 und Cdk5 / p35 (Abb. 3C, Bodenplatten). Die Ergebnisse zeigen, dass DRD2 und Cdk5 / p35 einen Komplex bilden können und somit die Vorstellung unterstützen, dass DRD2 ein physiologisches Substrat von Cdk5 ist.

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Abbildung 3. Cdk5 / p35 kann einen Komplex mit DRD2 bilden.

(A) GST-Pull-down-Assay unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem GST-D2i3-Protein mit Rattengehirnextrakt. GST-Pull-down-Präzipitate wurden Western-Blot-Analysen unterzogen. "Bead" bezeichnet den Pulldown-Niederschlag ohne GST-Proteine. (B) Immunpräzipitation von DRD2 und Cdk5 / p35-Komplex. Anti-GFP-IP aus Lysaten von transfizierten Zellen wurde Western-Blot-Analysen unterzogen. Die Klammer zeigt DRD2-Signale an und die offene Pfeilspitze zeigt unspezifische Signale von den Anti-GFP-Immunopräzipitaten an. Ein überbelichteter Blot für Eingaben wird ebenfalls rechts angezeigt. (C) Immunzytochemische Analysen von DRD2 und Cdk5 / p35. HEK 293-Zellen, die DRD2-GFP und Cdk5 / p35 exprimierten, wurden mit Anti-Cdk5- und Anti-p35-Antikörpern gefärbt (obere Felder). DRD2-GFP wurde allein in den kultivierten striatalen Neuronen exprimiert und mit anti-Cdk5- und anti-p35-Antikörpern gefärbt (untere Felder). Hoechst wurde zur Kernfärbung verwendet. Der Maßstabsbalken ist 5 μm. Alle Bilder wurden konfokalmikroskopisch aufgenommen (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-vermittelte Phosphorylierung von DRD2 dämpft die Rezeptoraktivität

Es wurde berichtet, dass die Phosphorylierung kritische Eigenschaften von GPCRs wie G-Protein-Kopplung, Rezeptor-Internalisierung, intrazelluläre Lokalisierung und Assoziation mit Modulator-Proteinen moduliert [9], [11], [24]. EineDie Gonist-induzierte Rezeptorinternalisierung ist ein kritischer Regulierungsprozess der Signaltransduktion. Wir untersuchten die Cdk5-vermittelte Modulation der DRD2-Internalisierung. HEK 293-Zellen, die DRD2-GFP und DRD2 S321A-GFP mit oder ohne Cdk5 / p35 exprimieren, wurden mit 1 & mgr; M Quinpirol inkubiert, um eine Agonist-stimulierte DRD2-Internalisierung zu induzieren (Abb. 4A). [³H] -Spiperon-Signale von DRD2-GFP-exprimierenden Zellen wurden bei 30 min-Quinpirol-Behandlung signifikant reduziert und bei 90 min wiederhergestellt. Interessanterweise [³H] -Spiperon-Signale von DRD2-GFP- und Cdk5 / p35-exprimierenden Zellen wurden ebenfalls bei Behandlung mit 30 min-Chinpirol reduziert, aber nicht bei 90 min (Abb. 4A, zweiter Abschnitt). Auf der anderen Seite, [³H] -Spiperon-Signale von DRD2 S321A-GFP-exprimierenden Zellen wurden bei 30 min reduziert und unabhängig von der Koexpression mit Cdk90 / p5 bei 35 min wiederhergestellt. Frühere Studien haben gezeigt, dass das internalisierte DRD2 bei längerer Agonistenstimulation wieder in die Plasmamembran zurückfließt [11]. TEs scheint, dass die Cdk5-vermittelte Phosphorylierung von DRD2 an den Resensibilisierungsprozessen nach Agonist-induzierter DRD2-Internalisierung beteiligt ist.

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Abbildung 4. Die Cdk5-vermittelte Phosphorylierung dämpft die DRD2-Oberflächenexpression und die Downstream-Signalgebung.

(A) DRD2-Oberflächenexpression gemessen durch [³H] -Spiperon-Bindungsassay. Transfizierte HEK293-Zellen wurden mit 1 & mgr; M Quinpirol für die angegebene Zeit stimuliert und geerntet, gefolgt von 3 nM [³H] -Spiperonbehandlung für 3 h. Die Radioaktivität wurde gemessen und Oberflächensignale berechnet. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SE dar (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Einweg-ANOVA mit Dunnett-Post-Hoc-Test: Vergleichen Sie alle Spalten mit der Kontrollsäule). (B) [³⁵S] -GTP_γS-Bindungsassay. Zellmembranen wurden aus den wie angegeben transfizierten Zellen hergestellt. Die Membranpräparationen wurden mit 1 & mgr; M Quinpirol gefolgt von 3 nM [inkubiert].³⁵S] -GTP_γS für 90 min. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SE dar (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Einweg-ANOVA mit Bonferroni-Post-Hoc-Test: Vergleichen Sie alle Spaltenpaare). (C) Quinpirol-konkurrierend [³H] -Spiperon-Bindungsassay. Membranpräparationen aus transfizierten Zellen wurden mit 0.01 nM inkubiert [³H] -Spiperon und steigende Chinpirolkonzentrationen für 30 min. Die nichtlineare Regression wurde mit GraphPad erhalten. Fehlerbalken geben den Mittelwert ± SE an (n = 3). (D) cAMP-Enzymimmunoassays in transfizierten HEK 293-Zellen. Transfizierte Zellen wurden 10 h mit 1 uM Rolipram vorbehandelt und anschließend 0.1 min mit 30 uM Forskolin und ansteigenden Konzentrationen von Chinpirol co-behandelt. Die nichtlineare Regression wurde mit GraphPad erhalten. Fehlerbalken repräsentieren den Mittelwert ± SE (n = 4; ** p <0.01; zweiseitig t-Tests). (E) Kultivierte striatale Neuronen von Wildtyp- und p35-Knockout-Embryonen (DIV 7) wurden mit 10 & mgr; M Rolipram für 1 h behandelt, gefolgt von 1 & mgr; M Dopamin für 1 h. Fehlerbalken repräsentieren Mittelwert ± SE (n = 4; **p<0.01; zweiseitig t-Tests).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Wir untersuchten ferner eine mögliche Veränderung der Agonisten-stimulierten G-Protein-Kopplung an DRD2, die mit Cdk5-vermittelter Phosphorylierung assoziiert ist, unter Verwendung von [³⁵S] -GTP_γS-Bindungsassay [25], [26]. DRD2-GFP und DRD2 S321A-GFP mit oder ohne Cdk5 / p35 wurden in HEK 293-Zellen exprimiert. Membranen wurden präpariert und stimuliert mit 1 & mgr; M Quinpirol und weiter erlaubt [³⁵S] -GTP_γS Eingliederung. DRD2-GFP und Cdk5 / p35-exprimierende Zellmembran zeigte signifikant beeinträchtigt [³⁵S] -GTP_γS-Bindung im Vergleich zu allen anderen Zellmembranen (Abb. 4B). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Cdk5-vermittelte Phosphorylierung die Agonisten-stimulierte G-Protein-Bindung bei DRD2 herabreguliert.

Zusätzlich Quinpirol-Wettbewerb [³H] -Spiperon-Bindungsassays wurden durchgeführt, um eine mögliche Änderung der Agonistenaffinität bei DRD2 durch Cdk5-vermittelte Phosphorylierung zu untersuchen. Wettbewerbsbindung von [³H] -Spiperon wurde nach Behandlung von zunehmenden Konzentrationen von Quinpirol an die Membranpräparation von transfizierten Zellen gemessen. Konkurrierende Bindung von Chinpirol und [³H] -Spiperon bei DRD2-GFP und DRD2 S321A-GFP machte ähnliche logK_i Werte (-9.789 für DRD2-GFP; -9.691 für DRD2 S321A-GFP), was darauf hinweist, dass die Affinität des Liganden zu DRD2 durch Cdk5-vermittelte Phosphorylierung bei DRD2 nicht signifikant beeinflusst wird (Abb. 4C).

Cdk5-vermittelte Phosphorylierung reguliert den DRD2-cAMP Signalweg ab

Als nächstes untersuchten wir, ob die Modifikation von DRD2 durch Cdk5 die Signalwege stromabwärts beeinflusst. Wir überwachten die DRD2-vermittelte Hemmung der Forskolin-stimulierten cAMP-Produktion durch Adenylylcyclase in den Zellen, die DRD2-GFP und DRD2 S321A-GFP exprimieren, unter Verwendung des cAMP-Enzymimmunoassays. DRD2-exprimierende Zellen zeigten in Abhängigkeit von Chinpirol dosisabhängig verminderte cAMP-Spiegel. Bemerkenswerterweise reduzierte die Co-Expression von Cdk5 / p35 die maximale Hemmung der cAMP-Bildung (Abb. 4D, linkes Feld). Auf der anderen Seite wurden in den DRD2 S321A-GFP-exprimierenden Zellen die cAMP-Formationen unabhängig von der Expression von Cdk5 / p35 als Reaktion auf die Chinpirol-Behandlung wirksam gehemmt (Abb. 4D, rechtes Feld). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Cdk5-vermittelte Phosphorylierung von DRD2 die inhibitorische Aktivität von DRD2 auf dem stromabwärtigen cAMP-Signalweg abschwächt. Um die Phänomene in einer physiologisch relevanteren Umgebung weiter zu bestätigen, verwendeten wir primäre kultivierte Neuronen von Knockout-Embryonen, denen p35 fehlt, einem essentiellen Cdk5-Aktivator. Primäre kultivierte striatale Neuronen wurden mit 1 & mgr; M Dopamin behandelt und mittels cAMP-Enzymimmunoassay analysiert. Neuronen aus p35-Knockout-Mäusen zeigten reduzierte cAMP-Spiegel im Vergleich zu Wildtyp-Neuronen, wenn sie mit Dopamin stimuliert wurden (Abb. 4E). TZusammengefasst folgerten wir, dass die Cdk5-vermittelte Phosphorylierung von DRD2 zu einer Abnahme des inhibitorischen Tons auf dem cAMP-Signalweg führt, der von DRD2 ausgeübt wird.

Diskussion

Wir identifizierten DRD2 als ein neues Substrat von Cdk5. Die Phosphorylierung scheint die DRD2-Oberflächenexpression herabzuregulieren, indem sie das Schicksal von DRD2 nach der Rezeptorinternalisierung beeinflusst, wodurch DRD2 G reduziert wird_i-coupling und downstream cAMP-Signalweg. Da der Phosphorylierungsrest S321 sowohl in langen als auch kurzen DRD2-Isoformen existiert, könnte der in dieser Studie vorgeschlagene Mechanismus eine allgemeine Art der Regulation bei der DRD2-vermittelten Signalisierung sein.

DRD2 in mittelgroßen stacheligen Neuronen wurde nicht nur als ein bedeutender Dopamin-Rezeptor-Subtyp angesehen, sondern wurde auch für seine Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen der Verfügbarkeit als Antwort auf Umweltreize erkannt. Agonist-induzierte Desensibilisierung und Resensibilisierung von DRD2 wurden ausgiebig untersucht [11], [24]. Insbesondere haben eine Reihe von Studien gezeigt, dass die Auswirkungen chronischer Psychostimulanzien wie Kokain und Amphetamin, die den extrazellulären Dopaminspiegel in der striatalen Synapse erhöhen, von dynamischen Veränderungen von DRD2 postsynaptisch begleitet werden [36]. In der Tat ist bekannt, dass chronische Kokainkonsumenten die DRD2-Spiegel im striatalen Bereich reduziert haben und die DRD2-Verfügbarkeit im Nucleus accumbens (NAcc) zeigt eine negative Korrelation mit dem Sucht- und Verstärkungsverhalten von Mäusen und Primaten [37]-[39]. Diese Befunde zeigen, dass die Funktionalität von DRD2 sehr anfällig für adaptive oder kompensatorische Regulation als Antwort auf verschiedene Stimuli einschließlich chronischer Arzneimittelexposition ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der S321-Rest in der dritten intrazellulären Schleife von DRD2 durch Cdk5 phosphoryliert werden kann, was zu einer Abnahme des inhibitorischen Einflusses von DRD2 auf den cAMP-Signalweg führt. Diese Interaktion schlägt einen neuartigen Regulationsmechanismus vor, der mit Cdk5 in dopaminorezeptiven Neuronen assoziiert ist und mit der dynamischen Natur der DRD2-Oberflächenverfügbarkeit verbunden sein könnte.

Es sollte beachtet werden, dass Cdk5 bekanntermaßen eine Schlüsselkomponente bei der Vermittlung adaptiver Veränderungen der neuronalen Umgebung ist. Zum Beispiel sind strukturelle und funktionelle Veränderungen von dendritischen Stacheln in den Neuronen des limbischen Kreislaufs eine der Folgen wiederholter Exposition durch Psychostimulanzien [40]. Diese Veränderungen werden von verschiedenen molekularen Veränderungen begleitet, einschließlich der Induktion von cAMP-Response-Element-bindendem Protein (CREB) und ΔFosB, Transkriptionsfaktoren, die eine dauerhafte Hochregulierung als Reaktion auf chronische Kokain-Verabreichung zeigen [41], [42]. Wichtig ist, Cdk5 ist ein Ziel von ΔFosB [19], und viele kritische Komponenten, die an der dendritischen Wirbelsäulendynamik beteiligt sind, wie PSD-95, p21-aktivierte Kinase (PAK), β-Catenin und Spinophilin, wurden als Cdk5-Substrate beschrieben [43]-[46]. Konsequenterweise induzieren genetische oder pharmakologische Manipulationen der Cdk5-Aktivität Veränderungen der dendritischen Wirbelsäulenmorphologie und Verhaltensreaktionen auf Kokain, was kritische Rollen für Cdk5 bei den molekularen und morphologischen Veränderungen der mesolimbischen Dopamin-Schaltkreise bedeutet [47], [48]. Unsere Ergebnisse, die zeigen, dass DRD2 ein neues Ziel von Cdk5 ist, liefern zusätzliche Einblicke in die adaptiven Veränderungen des Dopaminsystems als Antwort auf chronische Arzneimittelexpositionen, da die nachfolgende ΔFosB-vermittelte Hochregulation von Cdk5 einen tonischen Anstieg der Phosphorylierung von DRD2 induzieren kann . Darüber hinaus ist bekannt, dass DRD2 zahlreiche zelluläre Prozesse beeinflusst, einschließlich der Regulation von cAMP- und MAP-Kinase-Signalwegen und stromabwärts liegenden Transkriptionsereignissen [42], [49]. Die Ergebnisse dieser Studie könnten daher nicht nur eine direkte Regulation von DRD2 durch Cdk5 darstellen, sondern auch einen neuen Einblick in die adaptiven Reaktionen des Dopaminsystems auf chronische Arzneimittelexposition liefern.

Autorenbeiträge

Konzipiert und gestaltet die Experimente: JJ YUP DH SKP. Führte die Experimente durch: JJ YUP DKK YK. Analysiert die Daten: JJ YUP DKK SLYK SALHL YSG DH SKP. Mitwirkende Reagenzien / Materialien / Analysewerkzeuge: YHS. Schrieb das Papier: JJ SKP.