Effekt der ΔFosB-Überexpression auf die Opioid- und Cannabinoidrezeptor-vermittelte Signalisierung im Nucleus accumbens (2011)

Neuropharmakologie. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ, Cassidy MP, Sparta A, Zacharius V, Nestler EJ, Selley DE.

Quelle

Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie und Institut für Arzneimittel- und Alkoholstudien, School of Medicine der Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298, USA.

Abstract

Der stabile Transkriptionsfaktor ΔFosB wird im Nucleus Accumbens (NAc) durch chronische Exposition gegenüber verschiedenen Missbrauchsdrogen induziert, und die transgene Expression von ΔFosB im Striatum verstärkt die belohnenden Eigenschaften von Morphin und Cocaine. Die mechanistische Basis für diese Beobachtungen ist jedoch nicht vollständig verstanden. Wir verwendeten ein bitransgenes Mausmodell mit induzierbarer Expression von ΔFosB in Dopamin D (1) -Rezeptor / Dynorphin-enthaltende striatale Neuronen zur Bestimmung der Auswirkung der ΔFosB-Expression auf die Signalübertragung von Opioid- und Cannabinoidrezeptoren in der NAc. Die Ergebnisse zeigten, dass mu-Opioid-vermittelte G-Protein-Aktivität und Hemmung der Adenylylcyclase in der NAc von Mäusen, die ΔFosB exprimierten, verstärkt waren. In ähnlicher Weise war die Kappa-Opioid-Hemmung der Adenylylcyclase in den ΔFosB-exprimierenden Mäusen verstärkt. Im Gegensatz dazu unterschied sich die durch Cannabinoidrezeptoren vermittelte Signalgebung nicht zwischen Mäusen, die ΔFosB überexprimieren, und Kontrollmäusen. TDiese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Signalisierung des Opioid- und des Cannabinoidrezeptors durch Expression von ΔFosB differentiell moduliert wird, und deutet an, dass die Expression von ΔFosB einige ihrer Wirkungen über das verstärkte Mu- und Kappa-Opioidrezeptorsignal in NAc hervorrufen könnte.

Stichwort: G-Protein, Adenylylcyclase, Striatum

1. Einleitung

Opioidrezeptoren und Cannabinoid-CB₁ Rezeptoren (CB₁R) sind die neurobiologischen Ziele für zwei weit verbreitete Wirkstoffklassen, zu denen Morphin, Heroin und verschreibungspflichtige Opioide und Marihuana (Δ⁹-tetrahydrocannabinol (THC)). Die akuten Wirkungen von Opioiden und Cannabinoiden werden durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren vermittelt, die hauptsächlich G aktivieren_{I / O} Proteine und produzieren nachgelagerte Effektorantworten wie die Hemmung der Adenylylcyclase (Childers, 1991, Childers et al., 1992, Howlett et al., 2002). Die motorischen, Gedächtnisstörungen und psychoaktiven Wirkungen von Δ⁹-THC werden von CB hergestellt₁R (Huestis et al., 2001, Zimmer et al., 1999), die im Gehirn weit verbreitet sind, mit hohen Konzentrationen in den Basalganglien, im Hippocampus und im Kleinhirn (Herkenham et al., 1991). Die analgetischen und belohnenden Wirkungen der meisten klinisch relevanten und missbräuchlichen Opioid-Medikamente werden hauptsächlich durch Mu-Opioid-Rezeptoren (MOR) vermittelt (Matthes et al., 1996), die im limbischen System und Hirnstamm (Mansour et al., 1994). Das mesolimbische System, bestehend aus dopaminergen Projektionen vom ventralen Tegmentalbereich (VTA) zum Nucleus Accumbens (NAc), spielt eine wichtige Rolle bei der Belohnung von Opioiden und Cannabinoiden (Bozarth und Weise, 1984, Vaccarino et al., 1985, Zangen et al., 2006) sowie andere Drogenmissbrauch (Koob und Volkow, 2010). Darüber hinaus sind endogene Opioid- und Cannabinoidsysteme an der lohnenden Wirkung mehrerer Klassen psychoaktiver Arzneimittel beteiligt (Maldonado et al., 2006, Trigo et al., 2010). Daher ist es wichtig, Mechanismen aufzuklären, durch die Opioid und CB₁Die R-Signalisierung wird in der NAc geregelt.

Eine zentrale Frage auf dem Gebiet des Drogenmissbrauchs bestand darin, Proteine zu identifizieren, die den Übergang von akuten zu langfristigen Wirkungen von psychoaktiven Medikamenten vermitteln. Der AP-1-Transkriptionsfaktor ΔFosB ist besonders interessant, da er ein stabiles verkürztes Spleißvariantenprodukt der ist fosb Gen, das sich bei wiederholter Exposition mit Missbrauchsdelikten oder natürlichen Belohnungen ansammelt (McClung et al., 2004, Nestler, 2008, Nestler et al., 1999). Wir haben gefunden, dass ΔFosB im Gehirn nach wiederholter Exposition mit Morphin Δ induziert wird⁹-THC, Kokain oder Ethanol, wobei jedes Medikament ein einzigartiges regionales Muster der ΔFosB-Expression erzeugt (Perrotti et al., 2008). Ein konsistenter Befund bei allen Arzneimitteln war, dass ΔFosB im Striatum stark induziert wurde, wo alle vier Arzneimittel ΔFosB im NAc-Kern und alle außer Δ induzierten⁹-THC induzierte signifikant die Expression in der NAc-Schale und im Caudat-Putamen.

Pharmakologische Studien zeigten, dass die gleichzeitige Verabreichung von Dopamin D₁ Rezeptor (D₁Der Antagonist SCH 23390 von R) blockierte die ΔFosB-Induktion in NAc und Caudate-Putamen nach intermittierender Kokain- oder Morphiumverabreichung, was auf die potenzielle Bedeutung von D schließen lässt₁R-exprimierende Neuronen (Müller und Unterwald, 2005, Nye et al., 1995). Die Wirkung der ΔFosB-Induktion auf medikamentenvermitteltes Verhalten wurde mit Bitransgenmäusen untersucht, die ΔFosB in bestimmten neuronalen Populationen des NAc und des dorsalen Striatum exprimieren (Chen et al., 1998). Mäuse, die ΔFosB in Dynorphin / D exprimieren₁R-positive Neuronen im NAc- und dorsalen Striatum (Linie 11A) zeigen veränderte Reaktionen auf Drogenmissbrauch, insbesondere eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber den belohnenden Wirkungen von Kokain oder Morphin (Colby et al., 2003, Kelz et al., 1999, Zachariou et al., 2006). Diese Veränderungen traten in Abwesenheit von Änderungen in den Konzentrationen von MOR oder verschiedenen G-Protein-Untereinheiten auf. Dynorphin-mRNA-Spiegel waren jedoch in der NAc von ΔFosB-exprimierenden Mäusen reduziert (Zachariou et al., 2006), was darauf hindeutet, dass ein Ziel von ΔFosB ein Gen ist, das ein endogenes Opioidpeptid kodiert. Die FFosB-Induktion könnte auch Verhaltensänderungen durch Regulierung der Rezeptorsignalisierung in der NAc hervorrufen, diese Möglichkeit wurde jedoch nicht untersucht. Daher wurde in den vorliegenden Studien das bitransgene Mausmodell verwendet, um zu bestimmen, ob eine Überexpression von ΔFosB in Dynorphin / D vorliegt₁Striatale Neuronen enthaltende R verändern die MOR-vermittelte G-Protein-Aktivität und die MOR- und KOR-vermittelte Adenylylcyclase-Hemmung in der NAc. Die Wirkung von ΔFosB auf CB₁Die R-vermittelte G-Protein-Aktivität wurde auch bewertet, weil Δ⁹-THC-Verabreichung induziert ΔFosB in der NAc (Perrotti et al., 2008) und das Endocannabinoidsystem ist dafür bekannt, die Belohnungskreise im Gehirn zu regulieren (Gardner, 2005, Maldonado et al., 2006), aber die Wirkung von ΔFosB auf das Endocannabinoidsystem wurde nicht untersucht.

2. Materialen und Methoden

2.1. Reagenzien

[³⁵S] GTPγS (1250 Ci / mmol), [α-³²P] ATP (800 Ci / mmol) und [³H] cAMP (26.4 Ci / mmol) wurde von PerkinElmer (Shelton, CT) erworben. ATP, GTP, GDP, cAMP, Rinderserumalbumin, Kreatinphosphokinase, Papaverin, Imidazol und WIN-55212-2 wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. GTPγS wurde von Roche Diagnostic Corporation (Chicago, IL) erworben. DAMGO wurde vom Drug Supply Program des National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD) bereitgestellt. Econo-1-Szintillationsflüssigkeit wurde von Fisher Scientific (Norcross, GA) erhalten. Ecolite-Szintillationsflüssigkeit wurde von ICN (Costa Mesa, CA) erhalten. Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma Aldrich oder Fisher Scientific bezogen.

2.2. Mäuse

Männliche bitransgene Mäuse, die von NSE-tTA (Linie A) × TetOp-ΔFosB (Linie 11) abgeleitet wurden, wurden wie in Kelz et al. (Kelz et al., 1999). Bitransgene Mäuse wurden mit Doxycyclin (100 ug in Trinkwasser) zur Unterdrückung der Transgenexpression konzipiert und gezüchtet. Im Alter von 8 wurde Doxycyclin für die Hälfte der Mäuse aus dem Wasser weggelassen, um die Transgenexpression zu ermöglichen, während verbleibende Mäuse auf Doxycyclin gehalten wurden, um das Transgen zu unterdrücken. Gehirn wurde 8 Wochen später gesammelt, der Zeitpunkt, zu dem die transkriptionellen Wirkungen von ΔFosB maximal sind (McClung und Nestler, 2003). Eine zweite transgene Mauslinie wurde verwendet, in der Δc-Jun, ein dominanter negativer Antagonist von c-Jun, in D exprimiert wird₁R / Dynorphin und D₂R / Enkephalin-Zellen des Striatum, des Hippocampus und des Parietalkortex (Peakman et al., 2003). C-Jun und verwandte Proteine der Jun-Familie dimerisieren mit Proteinen der Fos-Familie und binden an die AP-1-Stelle der Zielgene, um die Transkription zu regulieren. Die Verkürzung des N-Terminus von c-Jun (Δc-Jun) macht den Komplex jedoch inaktiv und kann die DNA-Bindung aktiver AP-1-Komplexe blockieren. Männliche bitransgene Mäuse, die von NSE-tTA (Linie A) × TetOp-FLAG-Δc-Jun (Linie E) abgeleitet wurden, wurden wie in Peakman et al. (Peakman et al., 2003). Bitransgene Mäuse wurden mit Doxycyclin (100 ug in Trinkwasser) zur Unterdrückung der Transgenexpression konzipiert und gezüchtet. Welpen wurden nach 3-Wochen abgesetzt, genotypisiert und in Gruppen aufgeteilt, wobei die Hälfte auf Doxycyclin-haltigem Wasser und die Hälfte auf normalem Trinkwasser gehalten wurde, um die Expression von FLAG-Δc-Jun zu induzieren. 6 Wochen später wurde das Gehirn gesammelt, der Zeitpunkt, zu dem die maximalen FLAG-Δc-Jun-Werte gemessen wurden (Peakman et al., 2003). Alle Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

2.3. Membranvorbereitung

Die Gehirne wurden bis zum Tag des Tests bei -80 ° C gelagert. Vor dem Test wurde jedes Gehirn aufgetaut und der NAc wurde auf Eis präpariert. Jede Probe wurde in 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl homogenisiert₂1 mM EGTA, pH 7.4 (Membranpuffer) mit 20-Hüben aus einem Glashomogenisator bei 4 ° C. Das Homogenat wurde bei 48,000 × zentrifugiert g bei 4 ° C für 10 min in Membranpuffer resuspendiert, erneut bei 48,000 × zentrifugiert g bei 4 ° C für 10 min und resuspendiert in 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl₂0.2 mM EGTA, 100 mM NaCl, pH 7.4 (Assaypuffer). Die Proteingehalte wurden nach der Methode von Bradford bestimmt (Bradford, 1976) unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standard.

2.4. Agonisten-stimuliert³⁵S] GTPγS-Bindung

Die Membranen wurden 10 Minuten bei 30 ° C mit Adenosindeaminase (3 mU / ml) in Assaypuffer vorinkubiert. Membranen (5-10-µg-Protein) wurden dann für 2 h bei 30 ° C in Assaypuffer inkubiert, der 0.1% (w / v) BSA, 0.1 nM enthielt.³⁵S] GTPγS, 30 µM GDP und Adenosindeaminase (3 mU / ml) mit und ohne geeignete Konzentrationen von DAMGO oder WIN55,212-2. Die nichtspezifische Bindung wurde mit 20 μM GTPγS gemessen. Die Inkubation wurde durch Filtration durch GF / B-Glasfaserfilter beendet, gefolgt von 3-Waschvorgängen mit 3 ml eiskaltem 50 mM Tris-HCl, pH 7.4. Die gebundene Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationsspektrophotometrie nach Extraktion der Filter in Econo-1-Szintillationsflüssigkeit über Nacht bestimmt.

2.5. Adenylylcyclase-Assay

Membranen (5-25-µg-Protein) wurden wie oben beschrieben mit Adenosindeaminase vorinkubiert und anschließend bei 15 ° C in Gegenwart oder Abwesenheit von 30µM-Forskolin mit oder ohne DAMGO, U1H oder WIN50,488-55,212 in Assay-Ablage inkubiert 2 µM ATP, [α-³²P] ATP (1.5 µCi), 0.2 mM DTT, 0.1% (w / v) BSA, 50 µM cyclisches AMP, 50 µM GTP, 0.2 mM Papaverin, 5 mM Phosphocreatin, 20-Einheiten / ml Kreatinphosphokinase und Adenosin Deamin / ml) in einem Endvolumen von 3 µl. Unter diesen Bedingungen ist insgesamt [α-³²Das gewonnene P] cAMP betrug im Allgemeinen weniger als 1% der Gesamtmenge an zugesetztem [α-³²P] ATP in jeder Probe. Die Reaktion wurde durch Kochen für 3 min beendet und [³²P] Cyclisches AMP wurde durch das Doppelsäulenverfahren (Dowex und Aluminiumoxid) von Salomon (Salomon, 1979). [³H] cAMP (10,000 dpm) wurde vor der Säulenchromatographie als interner Standard in jedes Röhrchen gegeben. Die Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationsspektrophotometrie (45 -% - Wirkungsgrad für ³H) nachdem 4.5 ml des Eluats in 14.5 ml Ecolite-Szintillationsflüssigkeit gelöst wurden.

2.6. Datenanalyse

Sofern nicht anders angegeben, sind die Daten als Mittelwerte ± SE der 4-8-Einzelexperimente angegeben, die jeweils dreifach durchgeführt wurden. Netz-stimuliert³⁵Die S] GTPγS-Bindung wird als Agonisten-stimulierte Bindung minus Basalbindung berechnet. Die Netto-Forskolin-stimulierte Adenylylcyclase-Aktivität wird als Forskolin-stimulierte Aktivität - Basisaktivität (pmol / mg / min) definiert. Die prozentuale Hemmung der Forskolin-stimulierten Adenylylcyclase-Aktivität wird definiert als (Netto-Forskolin-stimulierte Aktivität in Abwesenheit von Agonist - Netto-Forskolin-stimulierte Aktivität in Gegenwart von Agonist / Netto-Forskolin-stimulierter Aktivität in Abwesenheit von Agonist) × 100. Alle Kurvenanpassungs- und statistischen Analysen wurden unter Verwendung von Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) durchgeführt. Konzentrations-Effekt-Kurven wurden durch iterative nichtlineare Regression analysiert, um EC zu erhalten₅₀ und E_max Werte. Die statistische Signifikanz der Konzentrations-Effekt-Daten wurde durch Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, wobei die Agonistendosis und die Geninduktion (ein oder aus) als Hauptfaktoren verwendet wurden. Statistische Signifikanz von Kurvenanpassungswerten (E_max oder EC₅₀) wurde durch den nicht gepaarten zweiseitigen Student-t-Test unter Verwendung der Welch-Korrektur oder der Quadratwurzel-Transformation der Daten bestimmt, wo dies erforderlich war, um ungleiche Varianzen (durch F-Test festgestellt) in EC zu korrigieren₅₀ Werte.

3. Ergebnisse

3.1. Effekt der ΔFosB-Expression auf die Opioid- und Cannabinoidrezeptor-vermittelte G-Protein-Aktivierung

Um zu bestimmen, ob MOR- oder CB₁Die R-vermittelte G-Protein-Aktivierung wurde durch induzierbare transgene Expression von ΔFosB in der NAc, Agonist-stimuliert [³⁵Die S] GTPγS-Bindung wurde in isolierten Membranen untersucht, die aus dieser Region von bitransgenen Mäusen hergestellt wurden, die das ΔFosB-Transgen bedingt exprimieren (ΔFosB on) oder nicht (ΔFosB off) exprimieren (ΔFosB off). Das MOR-selektive Enkephalin-Analogon DAMGO wurde zur Aktivierung von MOR verwendet und das Cannabinoid-Aminoalkylindol WIN55,212-2 wurde zur Aktivierung von CB verwendet₁R. Diese Liganden waren zuvor bei MOR und CB volle Agonisten₁Bzw. R (Breivogel et al., 1998, Selley et al., 1997). Es war nicht möglich, die KOR-vermittelte G-Protein-Aktivität zu untersuchen, da das Signal im Nagerhirn zu niedrig ist (Childers et al., 1998). Die Ergebnisse zeigten eine konzentrationsabhängige Stimulation der G-Protein-Aktivität durch DAMGO und WIN55,122-2 in NAc von ΔFosB off und ΔFosB an Mäusen (Figure 1). Für DAMGO-stimulierte Aktivität (Abbildung 1A) zeigte eine Zweiwege-ANOVA der Konzentrations-Effekt-Daten signifikante Haupteffekte des ΔFosB-Status (p <0.0001, F = 22.12, df = 1) und der DAMGO-Konzentration (p <0.0001, F = 29.65, df = 5) mit Nr signifikante Wechselwirkung (p = 0.857, F = 0.387, df = 5). Eine nichtlineare Regressionsanalyse der Konzentrations-Wirkungs-Kurven ergab einen signifikant höheren DAMGO E._max Wert in ΔFosB an Mäusen (E_max = 73 ± 5.2% Stimulation) relativ zu ΔFosB von Mäusen (E_max = 56 ± 4.1% Stimulation; p <0.05 verschieden von ΔFosB an Mäusen durch Student-t-Test). DAMGO EC₅₀ Die Werte unterschieden sich nicht zwischen ΔFosB-On- und ΔFosB-Off-Mäusen (302 ± 72 nM vs. 212 ± 56 nM bzw. p = 0.346).

Einfluss der ΔFosB-Expression auf Agonisten-stimulierte [³⁵S] GTPγS-Bindung in der NAc. Membranen von ΔFosB-exprimierenden (ΔFosB on) oder Kontrollmäusen (ΔFosB off) wurden getestet, wie in Methods beschrieben, wobei unterschiedliche Konzentrationen verwendet wurden ...

Im Gegensatz zu Ergebnissen, die mit dem MOR-Agonisten DAMGO erhalten wurden, wurden mit dem Cannabinoid-Agonisten WIN55,212-2 keine ΔFosB-Zustandsunterschiede bei der Aktivierung von G-Protein beobachtet (Abbildung 1B). Die Zweiwege-ANOVA der WIN55,212-2-Konzentrationseffektdaten ergab einen signifikanten Haupteffekt der WIN55,212-2-Konzentration (p <0.0001, F = 112.4, df = 7), jedoch nicht des ΔFosB-Status (p = 0.172) , F = 1.90, df = 1) und es gab keine Wechselwirkung (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). In ähnlicher Weise gab es keine Auswirkung des ΔFosB-Status auf WIN55,212-2 E._max Werte (103 ± 6% vs. 108 ± 8% Stimulation in ΔFosB-On- und Off-Mäusen, p = 0.813 nach Student-t-Test) oder EC₅₀ Werte (103 ± 20 nM vs. 170 ± 23 nM in ΔFosB-On- und Off-Mäusen, p = 0.123).

Basierend auf der Form der Kurven und der Tatsache, dass unsere früheren Studien zweiphasige WIN55,212-2-Konzentrations-Wirkungs-Kurven im Gehirn gezeigt haben (Breivogel et al., 1999, Breivogel et al., 1998) wurden auch die WIN55,212-2-Kurven mit einem Zwei-Standorte-Modell analysiert. Die Analyse der gemittelten Daten zeigte eine leichte Verbesserung der Anpassungsgüte unter Verwendung des Zwei - Standort - Modells (R² = 0.933 und 0.914, Summe der Quadrate = 3644 und 5463 in ΔFosB-On- und Off-Mäusen) im Vergleich zum Single-Site-Modell (R² = 0.891 und 0.879, Summe der Quadrate = 6561 und 6628 in ΔFosB-On- und Off-Mäusen). Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen ΔFosB-on- und off-Mäusen in den E gefunden_max oder EC₅₀ Werte der Standorte mit hoher oder niedriger Potenz (Zusatztabelle 1), obwohl ein Trend zu einer niedrigeren EG zu verzeichnen war₅₀ Wert an der hochwirksamen Stelle in Mäusen mit ΔFosB an (EC₅₀Highs = 28.0 ± 10.6 nM) im Vergleich zu denen mit ΔFosB off (EC₅₀Highs = 71.5 ± 20.2 nM; p = 0.094). Darüber hinaus gab es keinen Einfluss des ΔFosB-Status auf basale [³⁵S] GTPγS-Bindung in NAc-Membranen (253 ± 14 vs. 226 ± 14 fmol / mg in ΔFosB-On- und Off-Mäusen, p = 0.188). Diese Daten zeigen, dass die induzierbare transgene Expression von ΔFosB in der NAc von Mäusen die MOR-vermittelte G-Protein-Aktivierung steigerte, ohne CB signifikant zu beeinflussen₁R-vermittelte oder basale G-Protein-Aktivität.

3.2. Wirkung von ΔFosB auf die Opioid- und Cannabinoidrezeptor-vermittelte Hemmung der Adenylylcyclase

Die Auswirkung der induzierbaren transgenen Expression von ΔFosB auf die Modulation der stromabwärts gelegenen Effektoraktivität durch MOR und CB zu bewerten₁R, die Inhibierung der 1-µM-Forskolin-stimulierten Adenylylcyclase-Aktivität wurde in NAc-Membranen untersucht. Neben MOR- und CB₁R-vermittelte Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität, Auswirkungen der KOR-Aktivität wurden auch mit dem KOR-selektiven Vollagonisten U50,488 (Zhu et al., 1997), weil frühere Ergebnisse zeigten, dass Dynorphin-mRNA ein Ziel von ΔFosB im bitransgenen Modell war (Zachariou et al., 2006). Die Ergebnisse zeigten, dass DAMGO, U50,488 und WIN55,212-2 die konzentrationsabhängige Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität sowohl in ΔFosB off als auch in ΔFosB an Mäusen produzierten (Figure 2). Zweiweg-ANOVA von DAMGO-Daten zu Konzentrationswirkungen (Abbildung 2A) zeigten signifikante Haupteffekte des ΔFosB-Status (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) und der DAMGO-Konzentration (p <0.0001, F = 29.61, df = 6), jedoch keine signifikante Wechselwirkung (p = 0.441, F = 0.986) , df = 6). Eine nichtlineare Regressionsanalyse der DAMGO-Konzentrations-Effekt-Kurven ergab eine signifikant niedrigere DAMGO-EC₅₀ Wert in ΔFosB bei Mäusen (101 ± 11 nM) im Vergleich zu ΔFosB bei Mäusen (510 ± 182 nM, p <0.05 nach t-Test des Schülers). Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied bei DAMGO E._max Werte (20.9 ± 1.26% gegen 19.8 ± 1.27% Hemmung in ΔFosB-On- und Off-Mäusen, p = 0.534).

Einfluss der ΔFosB-Expression auf die Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität in der NAc. Membranen von & Dgr; FosB-exprimierenden (& Dgr; FosB on) oder Kontrollmäusen (& Dgr; FosB off) wurden wie in Methods in Gegenwart von 1 & mgr; M beschrieben untersucht ...

Die Hemmung der KOR-vermittelten Adenylylcyclase unterschied sich auch als Funktion der induzierbaren transgenen Expression von ΔFosB (Abbildung 2B). Die Zweiwege-ANOVA von U50,488-Konzentrationseffektdaten zeigte signifikante Haupteffekte des ΔFosB-Status (p = 0.0006, F = 14.53, df = 1) und der U50,488-Konzentration (p <0.0001, F = 26.48, df = 3). ohne signifikante Wechselwirkung (p = 0.833, F = 0.289, df = 3). Eine nichtlineare Regressionsanalyse von Konzentrationseffektkurven ergab einen größeren U50,488 E._max Wert in ΔFosB bei Mäusen (18.3 ± 1.14% Hemmung) im Vergleich zu ΔFosB bei Mäusen (12.5 ± 2.03% Hemmung; p <0.05 verschieden von ΔFosB bei durch Student-t-Test), ohne signifikanten Unterschied in U50,488 EC₅₀ Werte (310 ± 172 nM vs. 225 ± 48 nM in ΔFosB-On- und Off-Mäusen, p = 0.324).

Im Gegensatz zu den mit MOR und KOR beobachteten Effekten gab es keinen signifikanten Effekt der induzierbaren transgenen ΔFosB-Expression auf die Hemmung der Adenylylcyclase durch den Cannabinoidagonisten WIN55212-2 (Abbildung 2C). Eine Zweiwege-ANOVA von WIN55,212-2-Konzentrations-Effekt-Daten zeigte einen signifikanten Effekt der Arzneimittelkonzentration (p <0.0001, F = 23.6, df = 2), jedoch nicht des ΔFosB-Status (p = 0.735, F = 0.118, df = 1) noch gab es eine signifikante Wechselwirkung (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). Darüber hinaus gab es keine Auswirkung des ΔFosB-Status auf die basale oder Forskolin-stimulierte Adenylylcyclaseaktivität in Abwesenheit eines Agonisten. Die basale Adenylylcyclaseaktivität betrug 491 ± 35 pmol / mg / min in ΔFosB bei Mäusen im Vergleich zu 546 ± 44 in ΔFosB außerhalb von Mäusen (p = 0.346 nach Student's t-Test). Ebenso betrug die Adenylylcyclaseaktivität in Gegenwart von 1 uM Forskolin 2244 ± 163 pmol / mg / min in ΔFosB bei Mäusen gegenüber 2372 ± 138 pmol / mg / min in ΔFosB außerhalb von Mäusen (p = 0.555).

3.3. Wirkung von ΔcJun auf die Opioid- und Cannabinoidrezeptor-vermittelte Hemmung der Adenylylcyclase

Da die induzierbare transgene Expression von ΔFosB die inhibitorische Signaltransduktion von MOR und KOR zu Adenylylcyclase in der NAc verstärkte, war es von Interesse zu bestimmen, ob ein dominanter negativer Inhibitor der ΔFosB-vermittelten Transkription die Opioidrezeptorsignalisierung auf entgegengesetzte Weise moduliert. Um diese Frage zu beantworten, wurde die Hemmung der Forskolin-stimulierten Adenylylcyclase-Aktivität durch DAMGO und U50,488 in Membranen untersucht, die aus dem NAc von bitransgenischen Mäusen hergestellt wurden, die ΔcJun bedingt exprimieren. Die Ergebnisse zeigten keine signifikante Wirkung der ΔcJun-Expression auf die Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität durch MOR oder KOR (Figure 3). Die Zweiwege-ANOVA der DAMGO-Konzentrations-Wirkungs-Kurven zeigte einen signifikanten Haupteffekt der DAMGO-Konzentration (p <0.0001, F = 20.26, df = 6), jedoch nicht des ΔcJun-Status (p = 0.840, F = 0.041, df = 1). und es gab keine signifikante Wechselwirkung (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). In ähnlicher Weise gab es keinen signifikanten Unterschied in E._max oder EC₅₀ Werte zwischen Mäusen mit ΔcJun an (E_max = 23.6 ± 2.6%; EC₅₀ = 304 ± 43 nM) oder ΔcJun aus (E_max = 26.1 ± 2.5%, p = 0.508; EC₅₀ = 611 ± 176 nM, p = 0.129). Ähnliche Ergebnisse wurden mit U50,488 beobachtet, so dass eine Zweiwege-ANOVA der Konzentrationseffektkurven einen signifikanten Effekt der Konzentration (p <0.0001, F = 11.94, df = 6), jedoch nicht des ΔcJun-Status (p = 0.127) zeigte , F = 2.391, df = 1) und es gab keine signifikante Wechselwirkung (p = 0.978, F = 0.190, df = 6). Ebenso gab es keine signifikanten Unterschiede in E._max oder EC₅₀ Werte zwischen Mäusen mit ΔcJun an (E_max = 14.8 ± 2.9%; EC₅₀ = 211 ± 81 nM) oder aus (E_max = 16.7 ± 1.8%, p = 0.597; EC₅₀ = 360 ± 151 nM, p = 0.411).

Wirkung der ΔcJun-Expression auf die Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität in der NAc. Membranen aus ΔcJun exprimierenden (ΔcJun on) oder Kontrollmäusen (ΔcJun off) wurden in Gegenwart von DAMGO (A), U50,488H (B) oder WIN55,212-2 inkubiert ...

Die ΔcJun-Expression hatte auch keinen signifikanten Einfluss auf die Hemmung der Adenylylcyclase in der NAc durch den Cannabinoidagonisten. Die Zweiwege-ANOVA der WIN55,212-2-Konzentrationseffektkurven zeigte einen signifikanten Haupteffekt der WIN55,212-2-Konzentration (p <0.0001, F = 15.53, df = 6), jedoch nicht des Genotyps (p = 0.066, F =) 3.472, df = 1) und es gab keine signifikante Wechselwirkung (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). Ebenso gab es keine signifikanten Unterschiede bei WIN55,212-2 E._max Werte (13.0 ± 2.3% und 13.6 ± 0.9% Hemmung in ΔcJun gegenüber Off-Mäusen, p = 0.821) bzw. EC₅₀ Werte (208 ± 120 nM und 417 ± 130 nM in ΔcJun an versus Mäusen jeweils, p = 0.270). Obwohl es einen leichten Trend zur Verringerung der Wirksamkeit von WIN55,212-2 in Mäusen gab, die ΔcJun exprimierten, veränderte das Transgen die Cannabinoid-Hemmung der Adenylylcyclase daher nicht signifikant. Darüber hinaus gab es keinen Einfluss des ΔcJun-Status auf die Basal- oder Forskolin-stimulierte Adenylylcyclase-Aktivität. Die Aktivität der basalen Adenylylcyclase betrug 1095 ± 71 pmol / mg / min und 1007 ± 77 pmol / mg / min (p = 0.403) in Mäusen mit ΔcJun an bzw. aus. Die durch 1 & mgr; M Forskolin stimulierte Adenylylcyclase-Aktivität betrug 4185 ± 293 pmol / mg / min gegenüber 4032 ± 273 pmol / mg / min (p = 0.706) in Mäusen mit ΔcJun an bzw. aus.

3.4. Diskussion

Die Ergebnisse dieser Studie zeigten eine verstärkte MOR-vermittelte G-Protein-Aktivierung und Hemmung der Adenylylcyclase in der NAc von Mäusen mit einer induzierbaren transgenen Expression von ΔFosB in Dynorphin / D₁R enthaltende Neuronen. Die KOR-vermittelte Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität war auch in der NAc von ΔFosB-exprimierenden Mäusen erhöht, was darauf hindeutet, dass ΔFosB das endogene Opioidsystem in der NAc reguliert. Der DAMGO E_max Wert war für MOR-stimulierte [³⁵S] GTPγS-Bindung und dessen EC₅₀ Der Wert für die Hemmung der Adenylylcyclase war niedriger, in ΔFosB-überexprimierenden Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen. Diese Ergebnisse legen die Möglichkeit einer Rezeptorreserve für die Effektormodulation nahe, nicht aber die Aktivierung von G-Protein unter den untersuchten Testbedingungen. Die Feststellung, dass die maximale Hemmung der Adenylylcyclase durch den KOR-Agonisten durch die ΔFosB-Expression beeinflusst wurde, deutet auf eine geringe Rezeptorreserve für die KOR-vermittelte Antwort hin, was mit den niedrigen KOR-Bindungsstellen im Gehirn von Mäusen übereinstimmt (Unterwald et al., 1991). Im Gegensatz dazu ist CB₁R-vermittelte G-Protein-Aktivität und Hemmung der Adenylylcyclase wurden durch die Expression von ΔFosB nicht beeinflusst. was darauf schließen lässt, dass sich die Opioid- und Cannabinoidsysteme in diesen NAc-Neuronen in ihrer Reaktion auf ΔFosB unterscheiden.

Die Wirkung von ΔFosB auf die Opioidrezeptor-vermittelte Signalgebung stimmt mit unserem vorherigen Bericht überein, dass die Expression von ΔFosB im Striatum die akuten und chronischen Auswirkungen von Morphin (Zachariou et al., 2006). Ein Ergebnis dieser Studie war, dass Mäuse mit transgener Expression von ΔFosB in Dynorphin / D₁R-striatale Neuronen waren bei der Konditionierung an Ort und Stelle empfindlicher als Morphiumkontrollen. Darüber hinaus wurde dieser Effekt durch viral vermittelte Expression von ΔFosB durch ortsspezifische Injektion in die NAc nachgeahmt. Diese Beobachtungen stimmen mit den aktuellen Ergebnissen überein, die eine verbesserte MOR-Signalisierung in der NAc zeigen.

Wir haben zuvor das kodierende Gen identifiziert Dynorphin als Ziel von ΔFosB und schlug vor, dass reduziertes Dynorphin mit verbesserten belohnenden Eigenschaften von Morphin in bitransgenen ΔFosB-Mäusen übereinstimmen würde (Zachariou et al., 2006). Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die KOR-vermittelte Hemmung der Adenylylcyclase in der NAc in ΔFosB-exprimierenden Mäusen verstärkt wird, was möglicherweise einen kompensatorischen Anstieg der KOR-Empfindlichkeit nach einem reduzierten Dynorphin widerspiegelt. Frühere Studien haben gezeigt, dass KOR in bestimmten Hirnregionen von Prodynorphin-Knockout-Mäusen hochreguliert wurde, einschließlich NAc (Clarke et al., 2003).

Im Gegensatz zu ΔFosB veränderte die induzierbare transgene Expression von ΔcJun, der dominanten negativen verkürzten Mutante des ΔFosB-Bindungspartners cJun, die Hemmung der Adenylylcyclase durch MOR- oder KOR-Agonisten nicht. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die relativ niedrigen Basalwerte der ΔFosB-Expression keine signifikante Rolle bei der Aufrechterhaltung der Opioidrezeptorsignalisierung bei diesem Signaltransduktionsniveau in der NAc spielen. Die Tatsache, dass der konditionierte belohnende Effekt von Morphin in unserer vorherigen Studie durch die Expression von ΔcJun verringert wurde (Zachariou et al., 2006) legt nahe, dass die Morphininduktion von ΔFosB während des Konditionierungsverfahrens für die Regulierung der Verhaltensreaktionen auf den Wirkstoff wichtig ist, oder dass die transkriptionellen Wirkungen von ΔFosB, die nicht die proximale Signalgebung durch Opioidrezeptoren beeinflussen, die Opioidbelohnung beeinflussen könnten. In jedem Fall zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie eindeutig, dass wenn die ΔFosB-Expression in striatalem Dynorphin / D über die Basiswerte hinaus ansteigt₁Bei R-exprimierenden Neuronen gibt es eine robuste Zunahme der Kopplung von MOR und KOR an die Hemmung der Adenylylcyclase in der NAc.

Die Mechanismen, durch die die MOR- und KOR-vermittelte Signalgebung durch ΔFosB-Überexpression verstärkt wird, sind unklar. Wir haben jedoch bereits gezeigt, dass die MOR-Spiegel nach [³Die Bindung von H] Naloxon unterscheidet sich in der NAc von ΔFosB nicht von Mäusen (Zachariou et al., 2006). Dieselbe Studie ergab, dass Gα_iDie 1- und 2-Proteingehalte wurden in dieser Region nicht durch die ΔFosB-Expression beeinflusst. Vorhergehende Genexpressionsarray-Analysen zeigten jedoch, dass Gα_o mRNA wurde in NAc von ΔFosB an Mäusen hochreguliert (McClung und Nestler, 2003). In zukünftigen Studien wird es von Interesse sein, die Auswirkung der transgenen ΔFosB-Expression auf die Expression von G-Protein-Untereinheiten auf Proteinebene sowie auf die Expression vieler G-Protein-Modulationsproteine umfassend zu untersuchen.

Es ist interessant, dass die ΔFosB-Expression die CB nicht erhöht₁R-vermittelte Signalisierung in der NAc. Es ist möglich, dass Änderungen in CB₁Die R-Signalisierung tritt in einer diskreten Population von Neuronen auf, die in der gesamten NAc-Präparation verdeckt sind. Zum Beispiel die Verabreichung von Δ⁹- THC induzierte signifikant ΔFosB im Kern, aber nicht in der Hülle des NAc (Perrotti et al., 2008). ichIn der Folge wurde gezeigt, dass die Herausforderung mit Δ⁹-THC nach wiederholter Verabreichung von Δ⁹-THC erhöhte die Dopaminfreisetzung im NAc-Kern, verringerte jedoch die Freisetzung in der Hülle (Cadoni et al., 2008). Es ist auch wichtig anzumerken, dass die 11A-Linie von bitransgenen Mäusen ΔFosB nur in Dynorphin / D exprimiert₁R positive mittlere stachelige Neuronen des Striatum, aber CB₁R sind in beiden Dynorphin / D ausgedrückt₁R und Enkephalin / D₂R positive striatale Neuronen (Hohmann und Herkenham, 2000) sowie an Terminals kortikaler Afferenzen (Robbe et al., 2001). Die Expression des dominanten negativen Reglers der ΔFosB-vermittelten Transkription, ΔcJun, hatte ebenfalls keine signifikante Wirkung auf die Signalgebung des Cannabinoidrezeptors, obwohl ΔcJun in beiden D induzierbar exprimiert wird₁ und D₂-populationen von mittelstacheligen Neuronen in diesen Mäusen (Peakman et al., 2003). Es ist jedoch möglich, dass die basale ΔFosB-Expression so niedrig ist, dass ΔcJun die Rezeptorsignalisierung nicht beeinflusst, wie die Ergebnisse mit MOR und KOR nahe legen. Es ist auch möglich, dass CB₁Die R-Signalisierung wird durch die basale ΔFosB-Expression geringfügig verstärkt, so dass eine weitere Erhöhung der ΔFosB-Expression oder das Blockieren ihrer Wirkungen mit ΔcJun nur geringe Auswirkungen hatte, die nicht das Niveau der statistischen Signifikanz erreichten. Indirekte Unterstützung für diese Interpretation ist durch den Vergleich von WIN55,212-2 EC ersichtlich₅₀ Werte zwischen Mäusen, die ΔcJun gegenüber ΔFosB ausdrücken. Das Verhältnis des WIN55,212-2 EC₅₀ Wert für die Hemmung der Adenylylcyclase in Mäusen mit induzierter Expression von ΔcJun gegenüber seiner EC₅₀ Der Wert für die G-Protein-Aktivierung in Mäusen mit induzierter Expression von ΔFosB war 4.0, während das gleiche Verhältnis in Mäusen ohne Induktion eines der Transgen 1.2 war.

Alternativ können Cannabinoide die ΔFosB-Expression ohne direkte Wirkung auf CB induzieren₁R Signalisierung. In diesem Szenario könnten Cannabinoide die Reaktion auf die psychoaktiven Wirkungen anderer Medikamente durch die durch ΔFosB vermittelte Transkriptionsregulation modulieren. ichn Tatsache, Verwaltung von Δ⁹-THC bewirkt eine Kreuzsensibilisierung gegen Opioide und Amphetamin (Cadoni et al., 2001, Lamarque et al., 2001), im Einklang mit dieser Hypothese. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die wiederholte Verabreichung des Cannabinoid-Agonisten CP55,940 die MOR-vermittelte G-Protein-Aktivierung in der NAc erhöht, ähnlich wie Mäuse, die in der vorliegenden Studie & Dgr; FosB induzierbar exprimieren (Vigano et al., 2005). Die Auswirkung der ΔFosB-Expression auf Δ⁹THC-vermittelte Verhaltensweisen wurden nicht bewertet, aber die vorliegenden Ergebnisse schließen eine Interaktion nicht aus. Die Ergebnisse dieser und unserer vorherigen Studie (Zachariou et al., 2006) zeigen ΔFosB-induzierte Veränderungen in MOR und KOR / Dynorphin im Striatum. Die lohnende Wirkung von Δ⁹-THC, gemessen an der Ortspräferenz, wird in MOR-Nullmäusen aufgehoben, wohingegen die Deletion von KOR das Δ verringert⁹-THC-Ortsneigung und enthülltes Δ⁹-THC-Platzpräferenz (Ghozland et al., 2002). In ähnlicher Weise konditionierte Ortsabneigung gegen Δ⁹-THC fehlt im Pro-Dynorphin-Knockout im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (Zimmer et al., 2001). Diese Daten legen nahe, dass Δ⁹-THC könnte nach der ΔFosB-Induktion und der daraus folgenden Induktion der MOR-Signalisierung mit Verringerung der Dynorphinexpression lohnender sein.

Zusammenfassendy, die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die Expression von ΔFosB in D₁R / Dynorphin-positive striatale Neuronen verstärkten die MOR- und KOR-vermittelte Signalisierung auf der Ebene der G-Protein-vermittelten Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität in der NAc. Dieser Befund steht im Einklang mit Studien, die gezeigt haben, dass das endogene Opioidsystem für die Belohnung eine Rolle spielt (Trigo et al., 2010) und bieten einen potenziellen Mechanismus für ΔFosB-vermittelte Effekte auf die Belohnung. Im Gegensatz dazu ist CB₁Das r-vermittelte Signalisieren in der NAc wurde durch die striatale ΔFosB-Expression unter den untersuchten Bedingungen nicht signifikant beeinflusst, obwohl weitere Studien zur Bestimmung der Wirkung der ΔFosB-Induktion auf das Endocannabinoidsystem erforderlich sind.

Forschungshighlights

Das MOR-Signal wird in den Nucleus Accumbens von Mäusen, die ΔFosB exprimieren, verstärkt
Die KOR-Hemmung der Adenylylcyclase wird auch bei Mäusen verstärkt, die ΔFosB exprimieren
Die Expression von ΔFosB verändert CB nicht₁R Signalisierung im Nucleus Accumbens

Ergänzungsmaterial

01

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Danksagungen

Die Autoren danken Hengjun He, Jordan Cox und Aaron Tomarchio für die technische Unterstützung bei der³⁵S] GTPγS-Bindungsassays. Diese Studie wurde von den USPHS Grants DA014277 (LJS), DA10770 (DES) und P01 DA08227 (EJN) unterstützt.

Fußnoten

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