Effekt der ΔFosB-Überexpression auf die Opioid- und Cannabinoidrezeptor-vermittelte Signalisierung im Nucleus accumbens (2011)

Neuropharmacology. 2011 Dez;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ , Cassidy MP , Sparta A , Zachariou V , Nestler EJ , Selley DE.

Quelle

Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie und Institut für Arzneimittel- und Alkoholstudien, School of Medicine der Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298, USA.

Abstract

Der stabile Transkriptionsfaktor ΔFosB wird im Nucleus accumbens (NAc) durch chronischen Konsum verschiedener Drogen induziert, und die transgene Expression von ΔFosB im Striatum verstärkt die belohnenden Eigenschaften von Morphin und Kokain . Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Wir verwendeten ein bitransgenes Mausmodell mit induzierbarer Expression von ΔFosB in Dopamin- D(1)-Rezeptor/Dynorphin-haltigen Striatumneuronen, um den Einfluss der ΔFosB-Expression auf die Opioid- und Cannabinoidrezeptor-Signalwege im NAc zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass die μ-Opioid-vermittelte G-Protein-Aktivität und die Hemmung der Adenylylcyclase im NAc von Mäusen, die ΔFosB exprimierten, verstärkt waren. Ebenso war die κ-Opioid-Hemmung der Adenylylcyclase in den ΔFosB-exprimierenden Mäusen verstärkt . Im Gegensatz dazu unterschied sich die Cannabinoidrezeptor-vermittelte Signalübertragung nicht zwischen Mäusen mit ΔFosB-Überexpression und Kontrollmäusen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Opioid- und Cannabinoidrezeptor-Signalübertragung durch die Expression von ΔFosB unterschiedlich moduliert wird und dass die ΔFosB-Expression einige ihrer Effekte möglicherweise über eine verstärkte μ- und κ-Opioidrezeptor-Signalübertragung im Nucleus accumbens (NAc) vermittelt.

Stichwort: G-Protein, Adenylylcyclase, Striatum

1. Einleitung

Opioidrezeptoren und Cannabinoid-CB₁ Rezeptoren (CB₁R) sind die neurobiologischen Ziele für zwei weit verbreitete Wirkstoffklassen, zu denen Morphin, Heroin und verschreibungspflichtige Opioide und Marihuana (Δ⁹-tetrahydrocannabinol (THC)). Die akuten Wirkungen von Opioiden und Cannabinoiden werden durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren vermittelt, die hauptsächlich G aktivieren_{I / O} Proteine und produzieren nachgelagerte Effektorantworten wie die Hemmung der Adenylylcyclase (Childers, 1991, Childers et al., 1992, Howlett et al., 2002). Die motorischen, Gedächtnisstörungen und psychoaktiven Wirkungen von Δ⁹-THC werden von CB hergestellt₁R (Huestis et al., 2001, Zimmer et al., 1999), die im Gehirn weit verbreitet sind, mit hohen Konzentrationen in den Basalganglien, im Hippocampus und im Kleinhirn (Herkenham et al., 1991). Die analgetischen und belohnenden Wirkungen der meisten klinisch relevanten und missbräuchlichen Opioid-Medikamente werden hauptsächlich durch Mu-Opioid-Rezeptoren (MOR) vermittelt (Matthes et al., 1996), die im limbischen System und Hirnstamm (Mansour et al., 1994). Das mesolimbische System, bestehend aus dopaminergen Projektionen vom ventralen Tegmentalbereich (VTA) zum Nucleus Accumbens (NAc), spielt eine wichtige Rolle bei der Belohnung von Opioiden und Cannabinoiden (Bozarth und Weise, 1984, Vaccarino et al., 1985, Zangen et al., 2006) sowie andere Drogenmissbrauch (Koob und Volkow, 2010). Darüber hinaus sind endogene Opioid- und Cannabinoidsysteme an der lohnenden Wirkung mehrerer Klassen psychoaktiver Arzneimittel beteiligt (Maldonado et al., 2006, Trigo et al., 2010). Daher ist es wichtig, Mechanismen aufzuklären, durch die Opioid und CB₁Die R-Signalisierung wird in der NAc geregelt.

Eine zentrale Frage im Bereich des Drogenmissbrauchs ist die Identifizierung von Proteinen, die den Übergang von akuten zu Langzeitwirkungen psychoaktiver Substanzen vermitteln. Der AP-1-Transkriptionsfaktor ΔFosB ist von besonderem Interesse, da es sich um ein stabiles, verkürztes Spleißvariantenprodukt des fosb -Gens handelt, das sich bei wiederholtem Konsum von Drogen oder natürlichen Belohnungen anreichert ( McClung et al., 2004 ; Nestler, 2008 ; Nestler et al., 1999 ). Wir haben festgestellt, dass ΔFosB im Gehirn nach wiederholter Exposition gegenüber Morphin, Δ9-THC, Kokain oder Ethanol induziert wird ^, wobei jede Substanz ein spezifisches regionales Expressionsmuster von ΔFosB hervorruft ( Perrotti et al., 2008 ). Ein übereinstimmender Befund bei allen untersuchten Substanzen war, dass ΔFosB im Striatum stark induziert wurde, wobei alle vier Substanzen ΔFosB im NAc-Kern induzierten und alle außer Δ ⁹ -THC die Expression in der NAc-Schale und im Caudatum-Putamen signifikant induzierten.

Pharmakologische Studien zeigten, dass die gleichzeitige Verabreichung von Dopamin D₁ Rezeptor (D₁Der Antagonist SCH 23390 von R) blockierte die ΔFosB-Induktion in NAc und Caudate-Putamen nach intermittierender Kokain- oder Morphiumverabreichung, was auf die potenzielle Bedeutung von D schließen lässt₁R-exprimierende Neuronen (Müller und Unterwald, 2005, Nye et al., 1995). Die Wirkung der ΔFosB-Induktion auf medikamentenvermitteltes Verhalten wurde mit Bitransgenmäusen untersucht, die ΔFosB in bestimmten neuronalen Populationen des NAc und des dorsalen Striatum exprimieren (Chen et al., 1998). Mäuse, die ΔFosB in Dynorphin / D exprimieren₁R-positive Neuronen im NAc- und dorsalen Striatum (Linie 11A) zeigen veränderte Reaktionen auf Drogenmissbrauch, insbesondere eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber den belohnenden Wirkungen von Kokain oder Morphin (Colby et al., 2003, Kelz et al., 1999, Zachariou et al., 2006). Diese Veränderungen traten in Abwesenheit von Änderungen in den Konzentrationen von MOR oder verschiedenen G-Protein-Untereinheiten auf. Dynorphin-mRNA-Spiegel waren jedoch in der NAc von ΔFosB-exprimierenden Mäusen reduziert (Zachariou et al., 2006), was darauf hindeutet, dass ein Ziel von ΔFosB ein Gen ist, das ein endogenes Opioidpeptid kodiert. Die FFosB-Induktion könnte auch Verhaltensänderungen durch Regulierung der Rezeptorsignalisierung in der NAc hervorrufen, diese Möglichkeit wurde jedoch nicht untersucht. Daher wurde in den vorliegenden Studien das bitransgene Mausmodell verwendet, um zu bestimmen, ob eine Überexpression von ΔFosB in Dynorphin / D vorliegt₁Striatale Neuronen enthaltende R verändern die MOR-vermittelte G-Protein-Aktivität und die MOR- und KOR-vermittelte Adenylylcyclase-Hemmung in der NAc. Die Wirkung von ΔFosB auf CB₁Die R-vermittelte G-Protein-Aktivität wurde auch bewertet, weil Δ⁹-THC-Verabreichung induziert ΔFosB in der NAc (Perrotti et al., 2008) und das Endocannabinoidsystem ist dafür bekannt, die Belohnungskreise im Gehirn zu regulieren (Gardner, 2005, Maldonado et al., 2006), aber die Wirkung von ΔFosB auf das Endocannabinoidsystem wurde nicht untersucht.

2. Materialen und Methoden

2.1. Reagenzien

[ ^³⁵S ]GTPγS (1250 Ci/mmol), [α- ^³²P ]ATP (800 Ci/mmol) und [ ^³H ]cAMP (26.4 Ci/mmol) wurden von PerkinElmer (Shelton, CT, USA) bezogen. ATP, GTP, GDP, cAMP, Rinderserumalbumin, Kreatinphosphokinase, Papaverin, Imidazol und WIN-55212-2 wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. GTPγS wurde von Roche Diagnostic Corporation (Chicago, IL, USA) bezogen. DAMGO wurde vom Drug Supply Program des National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD, USA) bereitgestellt. Econo-1-Szintillationsflüssigkeit wurde von Fisher Scientific (Norcross, GA, USA) bezogen. Ecolite-Szintillationsflüssigkeit wurde von ICN (Costa Mesa, CA, USA) bezogen. Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich oder Fisher Scientific bezogen.

2.2. Mäuse

Männliche bitransgene Mäuse, hervorgegangen aus der Kreuzung von NSE-tTA (Linie A) × TetOp-ΔFosB (Linie 11), wurden wie in Kelz et al. ( Kelz et al., 1999 ) beschrieben generiert. Die bitransgenen Mäuse wurden gezeugt und mit Doxycyclin (100 µg im Trinkwasser) aufgezogen, um die Transgenexpression zu unterdrücken. Im Alter von 8 Wochen wurde das Doxycyclin bei der Hälfte der Mäuse aus dem Trinkwasser entfernt, um die Transgenexpression zu ermöglichen, während die übrigen Mäuse weiterhin Doxycyclin erhielten, um das Transgen zu unterdrücken. Die Gehirne wurden 8 Wochen später entnommen, dem Zeitpunkt, an dem die transkriptionellen Effekte von ΔFosB maximal sind ( McClung und Nestler, 2003 ). Eine zweite transgene Mauslinie wurde verwendet, in der Δc-Jun, ein dominant-negativer Antagonist von c-Jun, in D<sub> ₁ </sub> R/Dynorphin- und D<sub> _2</sub> R/Enkephalin-Zellen des Striatums, Hippocampus und Parietalkortex exprimiert wird ( Peakman et al., 2003 ). C-Jun und verwandte Proteine der Jun-Familie dimerisieren mit Proteinen der Fos-Familie und binden an die AP-1-Bindungsstelle von Zielgenen, um die Transkription zu regulieren. Die Verkürzung des N-Terminus von c-Jun (Δc-Jun) führt jedoch dazu, dass der Komplex transkriptionell inaktiv wird und die DNA-Bindung aktiver AP-1-Komplexe blockiert. Männliche bitransgene Mäuse, die aus der Kreuzung von NSE-tTA (Linie A) und TetOp-FLAG-Δc-Jun (Linie E) hervorgegangen sind, wurden wie von Peakman et al. beschrieben generiert ( Peakman et al., 2003 ). Bitransgene Mäuse wurden gezeugt und mit Doxycyclin (100 µg im Trinkwasser) aufgezogen, um die Transgenexpression zu unterdrücken. Die Jungtiere wurden im Alter von 3 Wochen entwöhnt, genotypisiert und in Gruppen aufgeteilt. Die eine Hälfte erhielt Doxycyclin-haltiges Trinkwasser, die andere Hälfte normales Trinkwasser, um die Expression von FLAG-Δc-Jun zu induzieren. Sechs Wochen später wurden die Gehirne entnommen, da zu diesem Zeitpunkt die maximalen FLAG-Δc-Jun-Werte gemessen wurden ( Peakman et al., 2003 ). Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health für die Haltung und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

2.3. Membranvorbereitung

Die Gehirne wurden bis zum Tag der Analyse bei −80 °C gelagert. Vor der Analyse wurde jedes Gehirn aufgetaut und der Nucleus accumbens (NAc) auf Eis präpariert. Jede Probe wurde in 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, pH 7.4 (Membranpuffer) mit 20 Hüben eines Glashomogenisators bei 4 °C homogenisiert _. Das Homogenat wurde 10 min bei 4 °C und 48,000 × g zentrifugiert , in Membranpuffer resuspendiert, erneut 10 min bei 4 °C und 48,000 × g zentrifugiert und in 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl₂, _0.2 mM EGTA, 100 mM NaCl, pH 7.4 (Analysepuffer) resuspendiert . Die Proteinwerte wurden nach der Methode von Bradford ( Bradford, 1976 ) unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standard bestimmt.

2.4. Agonisten-stimuliert³⁵S] GTPγS-Bindung

Die Membranen wurden 10 Minuten bei 30 °C mit Adenosin-Deaminase (3 mU/ml) in Assaypuffer vorinkubiert. Anschließend wurden die Membranen (5–10 µg Protein) 2 Stunden bei 30 °C in Assaypuffer inkubiert, der 0.1 % (w/v) BSA, 0.1 nM [<sup> ^35</sup> S]GTPγS, 30 µM GDP und Adenosin-Deaminase (3 mU/ml) enthielt, jeweils mit und ohne geeignete Konzentrationen von DAMGO oder WIN55,212-2. Die unspezifische Bindung wurde mit 20 µM GTPγS gemessen. Die Inkubation wurde durch Filtration über GF/B-Glasfaserfilter und anschließendes dreimaliges Waschen mit je 3 ml eiskaltem 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, beendet. Die gebundene Radioaktivität wurde mittels Flüssigszintillationsspektrophotometrie nach Extraktion der Filter über Nacht in Econo-1 Szintillationsflüssigkeit bestimmt.

2.5. Adenylylcyclase-Assay

Membranen (5–25 µg Protein) wurden wie oben beschrieben mit Adenosin-Deaminase vorinkubiert und anschließend 15 min bei 30 °C in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 µM Forskolin, mit oder ohne DAMGO, U50,488H oder WIN55,212-2, in einem Assaypuffer inkubiert, der 50 µM ATP, [α- ³² P]ATP (1.5 µCi), 0.2 mM DTT, 0.1 % (w/v) BSA, 50 µM cyclisches AMP, 50 µM GTP, 0.2 mM Papaverin, 5 mM Phosphokreatin, 20 Einheiten/ml Kreatinphosphokinase und Adenosin-Deaminase (3 mU/ml) in einem Endvolumen von 100 µl enthielt. Unter diesen Bedingungen betrug die Gesamtmenge an [α-<sup> ^32</sup> P]cAMP in der Regel weniger als 1 % der Gesamtmenge an zugesetztem [α-<sup> ^32</sup> P]ATP in jeder Probe. Die Reaktion wurde durch 3-minütiges Kochen gestoppt, und [<sup> ^32</sup> P]Cyclisches AMP wurde mittels der Doppelsäulenmethode (Dowex und Aluminiumoxid) nach Salomon ( Salomon, 1979 ) isoliert. [<sup> ³ </sup>H]cAMP (10,000 dpm) wurde vor der Säulenchromatographie jedem Reaktionsgefäß als interner Standard zugesetzt. Die Radioaktivität wurde mittels Flüssigszintillationsspektrophotometrie (45 % Effizienz für <sup> ³ </sup>H) bestimmt, nachdem 4.5 ml des Eluats in 14.5 ml Ecolite-Szintillationsflüssigkeit gelöst worden waren.

2.6. Datenanalyse

Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwerte ± Standardfehler aus 4–8 unabhängigen Experimenten dargestellt, die jeweils in Dreifachbestimmung durchgeführt wurden. Die Netto-stimulierte [ ^³⁵S ]GTPγS-Bindung wurde als Differenz zwischen Agonisten-stimulierter und basaler Bindung berechnet. Die Netto-Forskolin-stimulierte Adenylylcyclase-Aktivität ist definiert als Differenz zwischen Forskolin-stimulierter und basaler Aktivität (pmol/mg/min). Die prozentuale Hemmung der Forskolin-stimulierten Adenylylcyclase-Aktivität ist definiert als (Netto-Forskolin-stimulierte Aktivität ohne Agonist – Netto-Forskolin-stimulierte Aktivität mit Agonist / Netto-Forskolin-stimulierte Aktivität ohne Agonist) × 100. Alle Kurvenanpassungen und statistischen Analysen wurden mit Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) durchgeführt. Konzentrations-Wirkungs-Kurven wurden mittels iterativer nichtlinearer Regression analysiert, um EC₅₀- _und E _<sub>max </sub>-Werte zu ermitteln. Die statistische Signifikanz der Konzentrations-Wirkungs-Daten wurde mittels zweifaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, wobei die Agonistendosis und die Geninduktion (an/aus) als Hauptfaktoren dienten. Die statistische Signifikanz der Kurvenanpassungswerte (E<sub> _max</sub> oder EC<sub> _50</sub> ) wurde mittels ungepaartem zweiseitigem t-Test nach Student ermittelt. Gegebenenfalls wurden die Daten mittels Welch-Korrektur oder Quadratwurzeltransformation korrigiert, um ungleiche Varianzen (nachgewiesen durch F-Test) der EC<sub> ₅₀ </sub>-Werte auszugleichen.

3. Ergebnisse

3.1. Effekt der ΔFosB-Expression auf die Opioid- und Cannabinoidrezeptor-vermittelte G-Protein-Aktivierung

Um zu bestimmen, ob die MOR- oder CB1R _- vermittelte G-Protein-Aktivierung durch die induzierbare transgene Expression von ΔFosB im NAc verändert wird, wurde die Agonisten-stimulierte [ ^³⁵S ]GTPγS-Bindung in isolierten Membranen aus dieser Region bitransgener Mäuse untersucht, die das ΔFosB-Transgen konditional exprimierten (ΔFosB an) oder nicht (ΔFosB aus). Das MOR-selektive Enkephalin-Analogon DAMGO wurde zur Aktivierung von MOR und das Cannabinoid-Aminoalkylindol WIN55,212-2 zur Aktivierung von CB1R verwendet. _Diese Liganden sind bekanntermaßen vollständige Agonisten an MOR bzw. CB1R ₍ Breivogel et al., 1998 ; Selley et al., 1997 ). Die Untersuchung der KOR-vermittelten G-Protein-Aktivität war aufgrund des zu schwachen Signals im Gehirn von Nagetieren nicht möglich ( Childers et al., 1998 ). Die Ergebnisse zeigten eine konzentrationsabhängige Stimulation der G-Protein-Aktivität durch DAMGO und WIN55,122-2 im Nucleus accumbens (NAc) von ΔFosB-off- und ΔFosB-on-Mäusen ( Abbildung 1 ). Die zweifaktorielle ANOVA der Konzentrations-Wirkungs-Daten für die DAMGO-stimulierte Aktivität ( Abbildung 1A ) ergab signifikante Haupteffekte des ΔFosB-Status (p < 0.0001, F = 22.12, df = 1) und der DAMGO-Konzentration (p < 0.0001, F = 29.65, df = 5) ohne signifikante Interaktion (p = 0.857, F = 0.387, df = 5). Die nichtlineare Regressionsanalyse der Konzentrations-Wirkungs-Kurven ergab einen signifikant höheren DAMGO-E<sub> _max</sub> -Wert bei ΔFosB-behandelten Mäusen (E _{<sub>max</sub>} = 73 ± 5.2 % Stimulation) im Vergleich zu ΔFosB-unbehandelten Mäusen (E _{<sub>max</sub>} = 56 ± 4.1 % Stimulation; p < 0.05, Unterschied zu ΔFosB-behandelten Mäusen, Student-t-Test). Die DAMGO-EC<sub> ₅₀ </sub>-Werte unterschieden sich nicht zwischen ΔFosB-behandelten und ΔFosB-unbehandelten Mäusen (302 ± 72 nM bzw. 212 ± 56 nM, p = 0.346).

Einfluss der ΔFosB-Expression auf Agonisten-stimulierte [³⁵S] GTPγS-Bindung in der NAc. Membranen von ΔFosB-exprimierenden (ΔFosB on) oder Kontrollmäusen (ΔFosB off) wurden getestet, wie in Methods beschrieben, wobei unterschiedliche Konzentrationen verwendet wurden ...

Im Gegensatz zu den mit dem MOR-Agonisten DAMGO erzielten Ergebnissen wurden mit dem Cannabinoid-Agonisten WIN55,212-2 keine ΔFosB-Status-abhängigen Unterschiede in der G-Protein-Aktivierung beobachtet ( Abbildung 1B ). Eine zweifaktorielle ANOVA der Konzentrations-Wirkungs-Daten von WIN55,212-2 ergab einen signifikanten Haupteffekt der WIN55,212-2-Konzentration (p < 0.0001, F = 112.4, df = 7), jedoch keinen signifikanten Haupteffekt des ΔFosB-Status (p = 0.172, F = 1.90, df = 1). Es zeigte sich keine Interaktion (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). Ebenso wenig hatte der ΔFosB-Status einen Einfluss auf die E _max- Werte von WIN55,212-2 (103 ± 6 % bzw. 108 ± 8 % Stimulation bei ΔFosB on- bzw. off-Mäusen, p = 0.813 nach Student's t-Test) oder die EC _50- Werte (103 ± 20 nM bzw. 170 ± 23 nM bei ΔFosB on- bzw. off-Mäusen, p = 0.123).

Aufgrund des Kurvenverlaufs und der Tatsache, dass unsere früheren Studien biphasische Konzentrations-Wirkungs-Kurven für WIN55,212-2 im Gehirn gezeigt haben ( Breivogel et al., 1999 ; Breivogel et al., 1998 ), wurden die WIN55,212-2-Kurven auch mithilfe eines Zwei-Bindungsstellen-Modells analysiert. Die Analyse der gemittelten Daten ergab eine leichte Verbesserung der Anpassungsgüte durch das Zwei-Bindungsstellen-Modell (R² ⁼ 0.933 und 0.914; Quadratsumme = 3644 bzw. 5463 bei ΔFosB-on- bzw. -off-Mäusen) im Vergleich zum Ein-Bindungsstellen-Modell (R² ⁼ 0.891 und 0.879; Quadratsumme = 6561 bzw. 6628 bei ΔFosB-on- bzw. -off-Mäusen). Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen ΔFosB-aktivierten und -inaktivierten Mäusen hinsichtlich der E<sub> _max</sub> - oder EC _<sub>50 </sub>-Werte an den Stellen mit hoher bzw. niedriger Wirkstärke gefunden ( siehe Ergänzungstabelle 1 ). Allerdings zeigte sich ein Trend zu einem niedrigeren EC<sub> ₅₀ </sub>-Wert an der Stelle mit hoher Wirkstärke bei Mäusen mit ΔFosB-Aktivierung (EC _<sub>50hoch</sub> = 28.0 ± 10.6 nM) im Vergleich zu Mäusen ohne ΔFosB-Aktivierung (EC _<sub>50hoch</sub> = 71.5 ± 20.2 nM; p = 0.094). Darüber hinaus hatte der ΔFosB-Status keinen Einfluss auf die basale [ ^<sup>35 </sup>S]GTPγS-Bindung in NAc-Membranen (253 ± 14 bzw. 226 ± 14 fmol/mg bei ΔFosB-aktivierten bzw. -inaktivierten Mäusen; p = 0.188). Diese Daten deuten darauf hin, dass die induzierbare transgene Expression von ΔFosB im NAc von Mäusen die MOR-vermittelte G-Protein-Aktivierung erhöhte, ohne die CB ₁ R-vermittelte oder basale G-Protein-Aktivität signifikant zu beeinflussen.

3.2. Wirkung von ΔFosB auf die Opioid- und Cannabinoidrezeptor-vermittelte Hemmung der Adenylylcyclase

Um den Effekt der induzierbaren transgenen Expression von ΔFosB auf die Modulation der nachgeschalteten Effektoraktivität durch MOR und CB1R zu untersuchen _, wurde die Hemmung der durch 1 µM Forskolin stimulierten Adenylylcyclase-Aktivität in NAc-Membranen analysiert. Zusätzlich zur MOR- und CB1R _- vermittelten Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität wurden auch Effekte der KOR-Aktivität mithilfe des KOR-selektiven Vollagonisten U50,488 ( Zhu et al., 1997 ) untersucht, da frühere Ergebnisse gezeigt hatten, dass Dynorphin-mRNA im bitransgenen Modell ein Ziel von ΔFosB ist ( Zachariou et al., 2006 ). Die Ergebnisse zeigten, dass DAMGO, U50,488 und WIN55,212-2 jeweils eine konzentrationsabhängige Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität sowohl in ΔFosB-off- als auch in ΔFosB-on-Mäusen bewirkten ( Abbildung 2 ). Die zweifaktorielle ANOVA der DAMGO-Konzentrations-Wirkungs-Daten ( Abbildung 2A ) ergab signifikante Haupteffekte des ΔFosB-Status (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) und der DAMGO-Konzentration (p < 0.0001, F = 29.61, df = 6), jedoch keine signifikante Interaktion (p = 0.441, F = 0.986, df = 6). Die nichtlineare Regressionsanalyse der DAMGO-Konzentrations-Wirkungs-Kurven zeigte einen signifikant niedrigeren EC<sub> ₅₀ </sub>-Wert für DAMGO bei ΔFosB-on-Mäusen (101 ± 11 nM) im Vergleich zu ΔFosB-off-Mäusen (510 ± 182 nM, p < 0.05, t-Test nach Student). Allerdings gab es keinen signifikanten Unterschied in den DAMGO E _max -Werten (20.9 ± 1.26 % bzw. 19.8 ± 1.27 % Hemmung bei ΔFosB on- bzw. off-Mäusen, p = 0.534).

Einfluss der ΔFosB-Expression auf die Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität in der NAc. Membranen von & Dgr; FosB-exprimierenden (& Dgr; FosB on) oder Kontrollmäusen (& Dgr; FosB off) wurden wie in Methods in Gegenwart von 1 & mgr; M beschrieben untersucht ...

Die KOR-vermittelte Hemmung der Adenylylcyclase variierte auch in Abhängigkeit von der induzierbaren transgenen Expression von ΔFosB ( Abbildung 2B ). Eine zweifaktorielle ANOVA der Konzentrations-Wirkungs-Daten von U50,488 zeigte signifikante Haupteffekte des ΔFosB-Status (p = 0.0006, F = 14.53, df = 1) und der U50,488-Konzentration (p < 0.0001, F = 26.48, df = 3), jedoch keine signifikante Interaktion (p = 0.833, F = 0.289, df = 3). Eine nichtlineare Regressionsanalyse der Konzentrations-Wirkungs-Kurven ergab einen höheren U50,488 E _max- Wert bei ΔFosB on-Mäusen (18.3 ± 1.14 % Hemmung) im Vergleich zu ΔFosB off-Mäusen (12.5 ± 2.03 % Hemmung; p < 0.05 Unterschied zu ΔFosB on laut Student's t-Test), wobei kein signifikanter Unterschied in den U50,488 EC _50- Werten festgestellt wurde (310 ± 172 nM gegenüber 225 ± 48 nM bei ΔFosB on- bzw. off-Mäusen, p = 0.324).

Im Gegensatz zu den mit MOR und KOR beobachteten Effekten hatte die induzierbare transgene ΔFosB-Expression keinen signifikanten Einfluss auf die Hemmung der Adenylylcyclase durch den Cannabinoid-Agonisten WIN55212-2 ( Abbildung 2C ). Die zweifaktorielle ANOVA der Konzentrations-Wirkungs-Daten von WIN55,212-2 zeigte einen signifikanten Effekt der Wirkstoffkonzentration (p < 0.0001, F = 23.6, df = 2), jedoch keinen signifikanten Effekt des ΔFosB-Status (p = 0.735, F = 0.118, df = 1). Auch eine signifikante Interaktion wurde nicht festgestellt (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). Darüber hinaus hatte der ΔFosB-Status in Abwesenheit eines Agonisten keinen Einfluss auf die basale oder Forskolin-stimulierte Adenylylcyclase-Aktivität. Die basale Adenylylcyclase-Aktivität betrug 491 ± 35 pmol/mg/min in ΔFosB-on-Mäusen im Vergleich zu 546 ± 44 pmol/mg/min in ΔFosB-off-Mäusen (p = 0.346, Student-t-Test). Ebenso betrug die Adenylylcyclase-Aktivität in Gegenwart von 1 µM Forskolin 2244 ± 163 pmol/mg/min in ΔFosB-on-Mäusen gegenüber 2372 ± 138 pmol/mg/min in ΔFosB-off-Mäusen (p = 0.555).

3.3. Wirkung von ΔcJun auf die Opioid- und Cannabinoidrezeptor-vermittelte Hemmung der Adenylylcyclase

Da die induzierbare transgene Expression von ΔFosB die inhibitorische Signaltransduktion von MOR und KOR zur Adenylylcyclase im NAc verstärkte, war es von Interesse zu untersuchen, ob ein dominant-negativer Inhibitor der ΔFosB-vermittelten Transkription die Opioidrezeptor-Signalübertragung in entgegengesetzter Weise modulieren würde. Um diese Frage zu klären, wurde die Hemmung der Forskolin-stimulierten Adenylylcyclase-Aktivität durch DAMGO und U50,488 in Membranen aus dem NAc bitransgener Mäuse untersucht, die ΔcJun konditional exprimierten. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Effekt der ΔcJun-Expression auf die Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität durch MOR oder KOR ( Abbildung 3 ). Eine zweifaktorielle ANOVA der DAMGO-Konzentrations-Wirkungs-Kurven ergab einen signifikanten Haupteffekt der DAMGO-Konzentration (p < 0.0001, F = 20.26, df = 6), jedoch keinen signifikanten Haupteffekt des ΔcJun-Status (p = 0.840, F = 0.041, df = 1). Es gab keine signifikante Interaktion (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). Ebenso gab es keinen signifikanten Unterschied in den E _max- oder EC _50- Werten zwischen Mäusen mit ΔcJun an (E _max = 23.6 ± 2.6 %; EC ₅₀ = 304 ± 43 nM) oder ΔcJun aus (E _max = 26.1 ± 2.5 %, p = 0.508; EC ₅₀ = 611 ± 176 nM, p = 0.129). Ähnliche Ergebnisse wurden mit U50,488 beobachtet, wobei eine zweifaktorielle ANOVA der Konzentrations-Wirkungs-Kurven einen signifikanten Effekt der Konzentration zeigte (p < 0.0001, F = 11.94, df = 6), nicht aber des ΔcJun-Status (p = 0.127, F = 2.391, df = 1), und es gab keine signifikante Interaktion (p = 0.978, F = 0.190, df = 6). Ebenso gab es keine signifikanten Unterschiede in den E _max- oder EC _50- Werten zwischen Mäusen mit ΔcJun an (E _max = 14.8 ± 2.9 %; EC ₅₀ = 211 ± 81 nM) oder aus (E _max = 16.7 ± 1.8 %, p = 0.597; EC ₅₀ = 360 ± 151 nM, p = 0.411).

Wirkung der ΔcJun-Expression auf die Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität in der NAc. Membranen aus ΔcJun exprimierenden (ΔcJun on) oder Kontrollmäusen (ΔcJun off) wurden in Gegenwart von DAMGO (A), U50,488H (B) oder WIN55,212-2 inkubiert ...

Die ΔcJun-Expression hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Hemmung der Adenylylcyclase im NAc durch den Cannabinoid-Agonisten. Eine zweifaktorielle ANOVA der Konzentrations-Wirkungs-Kurven von WIN55,212-2 zeigte einen signifikanten Haupteffekt der WIN55,212-2-Konzentration (p < 0.0001, F = 15.53, df = 6), jedoch keinen signifikanten Haupteffekt des Genotyps (p = 0.066, F = 3.472, df = 1). Es gab keine signifikante Interaktion (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). Ebenso zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in den E _<sub>max </sub>-Werten von WIN55,212-2 (13.0 ± 2.3 % bzw. 13.6 ± 0.9 % Hemmung in ΔcJun-exprimierenden bzw. -defizienten Mäusen, p = 0.821) und auch nicht in den EC<sub> ₅₀ </sub>-Werten (208 ± 120 nM bzw. 417 ± 130 nM in ΔcJun-exprimierenden bzw. -defizienten Mäusen, p = 0.270). Obwohl sich somit ein leichter Trend zu einer verringerten Wirksamkeit von WIN55,212-2 in ΔcJun-exprimierenden Mäusen abzeichnete, veränderte das Transgen die Cannabinoid-Hemmung der Adenylylcyclase nicht signifikant. Darüber hinaus hatte der ΔcJun-Status keinen Einfluss auf die basale oder Forskolin-stimulierte Aktivität der Adenylylcyclase. Die basale Adenylylcyclase-Aktivität betrug 1095 ± 71 pmol/mg/min bzw. 1007 ± 77 pmol/mg/min (p = 0.403) bei Mäusen mit aktiviertem bzw. deaktiviertem ΔcJun. Die durch 1 µM Forskolin stimulierte Adenylylcyclase-Aktivität lag bei 4185 ± 293 pmol/mg/min bzw. 4032 ± 273 pmol/mg/min (p = 0.706) bei Mäusen mit aktiviertem bzw. deaktiviertem ΔcJun.

3.4. Diskussion

Die Ergebnisse dieser Studie zeigten eine verstärkte MOR-vermittelte G-Protein-Aktivierung und eine Hemmung der Adenylylcyclase im Nucleus accumbens (NAc) von Mäusen mit induzierbarer transgener Expression von ΔFosB in Dynorphin/D<sub> ₁ </sub>R-haltigen Neuronen. Auch die KOR-vermittelte Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität war im NAc von ΔFosB-exprimierenden Mäusen verstärkt, was darauf hindeutet, dass ΔFosB das endogene Opioidsystem im NAc reguliert. Der DAMGO-E <sub> _max </sub>-Wert für die MOR-stimulierte [ ^<sup>35 </sup>S]GTPγS-Bindung war höher, der EC _<sub>50 </sub>-Wert für die Adenylylcyclase-Hemmung hingegen niedriger bei ΔFosB-überexprimierenden Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen. Diese Befunde legen nahe, dass unter den untersuchten Testbedingungen eine Rezeptorreserve für die Effektormodulation, nicht aber für die G-Protein-Aktivierung, besteht. Die Beobachtung, dass die maximale Hemmung der Adenylylcyclase durch den KOR-Agonisten von der ΔFosB-Expression beeinflusst wird, deutet auf eine geringe Rezeptorreserve für die KOR-vermittelte Antwort hin, was mit der geringen Anzahl an KOR-Bindungsstellen im Mausgehirn übereinstimmt ( Unterwald et al., 1991 ). Im Gegensatz dazu blieben die _CB1R -vermittelte G-Protein-Aktivität und die Hemmung der Adenylylcyclase von der ΔFosB-Expression unbeeinflusst, was darauf hindeutet, dass sich das Opioid- und das Cannabinoidsystem in ihrer Reaktion auf ΔFosB in diesen NAc-Neuronen unterscheiden.

Die Wirkung von ΔFosB auf die Opioidrezeptor-vermittelte Signalübertragung steht im Einklang mit unserer früheren Beobachtung, dass die ΔFosB-Expression im Striatum die akuten und chronischen Effekte von Morphin verändert ( Zachariou et al., 2006 ). Eine Erkenntnis dieser Studie war, dass Mäuse mit transgener Expression von ΔFosB in Dynorphin/D<sub> _1</sub> R-Striatumneuronen im Vergleich zu Kontrolltieren empfindlicher auf Morphin in der Ortskonditionierung reagierten. Dieser Effekt konnte durch viral vermittelte Expression von ΔFosB mittels ortsspezifischer Injektion in den Nucleus accumbens (NAc) nachgeahmt werden. Diese Beobachtungen stimmen mit den vorliegenden Ergebnissen überein, die eine verstärkte MOR-Signalübertragung im NAc zeigen.

Wir identifizierten zuvor das Dynorphin-kodierende Gen als Zielgen von ΔFosB und postulierten, dass ein reduzierter Dynorphinspiegel mit den verstärkten belohnenden Eigenschaften von Morphin in ΔFosB-bitransgenen Mäusen vereinbar wäre ( Zachariou et al., 2006 ). Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die KOR-vermittelte Hemmung der Adenylylcyclase im Nucleus accumbens (NAc) in ΔFosB-exprimierenden Mäusen verstärkt ist, was eine kompensatorische Steigerung der KOR-Sensitivität infolge des reduzierten Dynorphinspiegels widerspiegeln könnte. Frühere Studien haben gezeigt, dass KOR in bestimmten Hirnregionen von Prodynorphin-Knockout-Mäusen, einschließlich des NAc, hochreguliert ist ( Clarke et al., 2003 ).

Im Gegensatz zu ΔFosB veränderte die induzierbare transgene Expression von ΔcJun, der dominant-negativen, verkürzten Mutante des ΔFosB-Bindungspartners cJun, die Hemmung der Adenylylcyclase durch MOR- oder KOR-Agonisten nicht. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die basalen Expressionsniveaus von ΔFosB, die relativ niedrig sind, keine signifikante Rolle bei der Aufrechterhaltung der Opioidrezeptor-Signalübertragung auf dieser Ebene der Signaltransduktion im Nucleus accumbens (NAc) spielen. Die Tatsache, dass die konditionierte Belohnungswirkung von Morphin durch die Expression von ΔcJun in unserer vorherigen Studie ( Zachariou et al., 2006 ) verringert wurde, deutet entweder darauf hin, dass die Morphin-induzierte Expression von ΔFosB während der Konditionierung für die Regulation der Verhaltensreaktionen auf das Medikament wichtig ist, oder dass transkriptionelle Effekte von ΔFosB, die nicht die proximale Signalübertragung durch Opioidrezeptoren beeinflussen, die Opioidbelohnung beeinflussen könnten. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen jedenfalls deutlich, dass bei einer Erhöhung der ΔFosB-Expression über den Basalwert hinaus in striatalen Dynorphin/D ₁ R-exprimierenden Neuronen eine starke Steigerung der Kopplung von MOR und KOR an die Hemmung der Adenylylcyclase im NAc stattfindet.

Die Mechanismen, durch die die MOR- und KOR-vermittelte Signalübertragung durch ΔFosB-Überexpression verstärkt wird, sind unklar. Wir konnten jedoch bereits zeigen, dass die MOR-Konzentrationen, bestimmt durch [ ^³H ]Naloxon-Bindung, im Nucleus accumbens (NAc) von ΔFosB-on- und -off-Mäusen nicht unterschiedlich sind ( Zachariou et al., 2006 ). Dieselbe Studie ergab, dass die Proteinspiegel von Gαi ₁ und 2 in dieser Region durch die ΔFosB-Expression nicht beeinflusst werden. Frühere Genexpressionsanalysen zeigten jedoch, dass die Gαo _- mRNA im NAc von ΔFosB-on-Mäusen hochreguliert war ( McClung und Nestler, 2003 ). Zukünftige Studien sollten daher den Effekt der transgenen ΔFosB-Expression auf die Expression von G-Protein-Untereinheiten auf Proteinebene sowie auf die Expression zahlreicher G-Protein-modulatorischer Proteine umfassend untersuchen.

Es ist interessant, dass die ΔFosB-Expression die CB nicht erhöht₁R-vermittelte Signalisierung in der NAc. Es ist möglich, dass Änderungen in CB₁Die R-Signalisierung tritt in einer diskreten Population von Neuronen auf, die in der gesamten NAc-Präparation verdeckt sind. Zum Beispiel die Verabreichung von Δ⁹- THC induzierte signifikant ΔFosB im Kern, aber nicht in der Hülle des NAc (Perrotti et al., 2008). ichIn der Folge wurde gezeigt, dass die Herausforderung mit Δ⁹-THC nach wiederholter Verabreichung von Δ⁹-THC erhöhte die Dopaminfreisetzung im NAc-Kern, verringerte jedoch die Freisetzung in der Hülle (Cadoni et al., 2008). Es ist auch wichtig anzumerken, dass die 11A-Linie von bitransgenen Mäusen ΔFosB nur in Dynorphin / D exprimiert₁R positive mittlere stachelige Neuronen des Striatum, aber CB₁R sind in beiden Dynorphin / D ausgedrückt₁R und Enkephalin / D₂R positive striatale Neuronen (Hohmann und Herkenham, 2000) sowie an Terminals kortikaler Afferenzen (Robbe et al., 2001). Die Expression des dominanten negativen Reglers der ΔFosB-vermittelten Transkription, ΔcJun, hatte ebenfalls keine signifikante Wirkung auf die Signalgebung des Cannabinoidrezeptors, obwohl ΔcJun in beiden D induzierbar exprimiert wird₁ und D₂-populationen von mittelstacheligen Neuronen in diesen Mäusen (Peakman et al., 2003). Es ist jedoch möglich, dass die basale ΔFosB-Expression so niedrig ist, dass ΔcJun die Rezeptorsignalisierung nicht beeinflusst, wie die Ergebnisse mit MOR und KOR nahe legen. Es ist auch möglich, dass CB₁Die R-Signalisierung wird durch die basale ΔFosB-Expression geringfügig verstärkt, so dass eine weitere Erhöhung der ΔFosB-Expression oder das Blockieren ihrer Wirkungen mit ΔcJun nur geringe Auswirkungen hatte, die nicht das Niveau der statistischen Signifikanz erreichten. Indirekte Unterstützung für diese Interpretation ist durch den Vergleich von WIN55,212-2 EC ersichtlich₅₀ Werte zwischen Mäusen, die ΔcJun gegenüber ΔFosB ausdrücken. Das Verhältnis des WIN55,212-2 EC₅₀ Wert für die Hemmung der Adenylylcyclase in Mäusen mit induzierter Expression von ΔcJun gegenüber seiner EC₅₀ Der Wert für die G-Protein-Aktivierung in Mäusen mit induzierter Expression von ΔFosB war 4.0, während das gleiche Verhältnis in Mäusen ohne Induktion eines der Transgen 1.2 war.

_{Alternativ könnten Cannabinoide die ΔFosB-Expression induzieren, ohne die CB1R} -Signalübertragung direkt zu beeinflussen . In diesem Fall könnten Cannabinoide die Ansprechbarkeit auf die psychoaktiven Wirkungen anderer Substanzen über die ΔFosB-vermittelte Transkriptionsregulation modulieren. Tatsächlich führt die Verabreichung von Δ9 ^- THC zu einer Kreuzsensibilisierung gegenüber Opioiden und Amphetamin ( Cadoni et al., 2001 ; Lamarque et al., 2001 ), was diese Hypothese stützt. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die wiederholte Gabe des Cannabinoid-Agonisten CP55,940 die MOR-vermittelte G-Protein-Aktivierung im Nucleus accumbens (NAc) erhöht, ähnlich wie bei Mäusen, die in der vorliegenden Studie ΔFosB induzierbar exprimieren ( Vigano et al., 2005 ). Der Einfluss der ΔFosB-Expression auf Δ<sup> ⁹ </sup>-THC-vermittelte Verhaltensweisen wurde bisher nicht untersucht, die vorliegenden Ergebnisse schließen jedoch eine Interaktion nicht aus. Die Ergebnisse dieser und unserer vorherigen Studie ( Zachariou et al., 2006 ) zeigen ΔFosB-induzierte Veränderungen von MOR und KOR/Dynorphin im Striatum. Die belohnende Wirkung von Δ<sup> ⁹ </sup>-THC, gemessen anhand der Ortspräferenz, ist in MOR-Null-Mäusen aufgehoben, während die Deletion von KOR die Δ ^<sup>9 </sup>-THC-Ortsaversion abschwächte und eine Δ<sup> ⁹ </sup>-THC-Ortspräferenz offenbarte ( Ghozland et al., 2002 ). Ebenso fehlt die konditionierte Ortsaversion gegenüber Δ<sup> ⁹ </sup>-THC in Pro-Dynorphin-Knockout-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen ( Zimmer et al., 2001 ). Diese Daten legen nahe, dass Δ ⁹ -THC nach ΔFosB-Induktion und der daraus resultierenden Induktion der MOR-Signalgebung mit einer Reduktion der Dynorphin-Expression möglicherweise lohnender ist.

Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse dieser Studie, dass die Expression von ΔFosB in D<sub> _1</sub> R/Dynorphin-positiven Striatumneuronen die MOR- und KOR-vermittelte Signalübertragung auf der Ebene der G-Protein-vermittelten Hemmung der Adenylylcyclase-Aktivität im Nucleus accumbens (NAc) verstärkte. Dieser Befund steht im Einklang mit Studien, die eine Rolle des endogenen Opioidsystems bei der Belohnungsverarbeitung nachgewiesen haben ( Trigo et al., 2010 ) und liefert einen möglichen Mechanismus für die ΔFosB-vermittelten Effekte auf die Belohnung . Im Gegensatz dazu wurde die CB<sub> ₁ </sub>R-vermittelte Signalübertragung im NAc unter den untersuchten Bedingungen durch die striatale ΔFosB-Expression nicht signifikant beeinflusst. Weitere Studien sind jedoch erforderlich, um den Effekt der ΔFosB-Induktion auf das Endocannabinoid-System zu bestimmen.

Forschungshighlights

Das MOR-Signal wird in den Nucleus Accumbens von Mäusen, die ΔFosB exprimieren, verstärkt
Die KOR-Hemmung der Adenylylcyclase wird auch bei Mäusen verstärkt, die ΔFosB exprimieren
Die Expression von ΔFosB verändert CB nicht₁R Signalisierung im Nucleus Accumbens

Ergänzungsmaterial

01

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Danksagungen

Die Autoren danken Hengjun He, Jordan Cox und Aaron Tomarchio für die technische Unterstützung bei den [ ^³⁵S ]GTPγS-Bindungsassays. Diese Studie wurde durch USPHS-Fördergelder DA014277 (LJS), DA10770 (DES) und P01 DA08227 (EJN) unterstützt.

Fußnoten

Haftungsausschluss des Verlags: Dies ist eine PDF-Datei eines unredigierten Manuskripts, das zur Veröffentlichung angenommen wurde. Wir stellen unseren Kunden diese Vorabversion des Manuskripts zur Verfügung. Das Manuskript wird vor der Veröffentlichung in seiner endgültigen, zitierfähigen Form redaktionell bearbeitet, gesetzt und Korrektur gelesen. Bitte beachten Sie, dass während des Produktionsprozesses Fehler entdeckt werden können, die den Inhalt beeinflussen können. Es gelten die rechtlichen Hinweise der Zeitschrift.

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