Proc Natl Acad Sci USA A. 2005 Februar 1; 102(5): 1737-1742.
Abstrakt
Kokain, ein Drogenmissbrauch, erhöht die synaptischen Dopaminspiegel im Striatum, indem es die Wiederaufnahme von Dopamin an Axonenden blockiert. Die Cyclin-abhängige Kinase 5 (Cdk5) und ihr Aktivator p35, Proteine, die an der Phosphorylierung von Substraten in postmitotischen Neuronen beteiligt sind, wurden nach chronischer Kokainexposition als hochreguliert identifiziert. Um die Effekte der Cdk5- und p35-Induktion auf die Striatum-Dopamin-Signalübertragung weiter zu untersuchen, generierten wir zwei unabhängige transgene Mauslinien, in denen Cdk5 oder p35 spezifisch in Neuronen überexprimiert wurde. Wir berichten hier, dass erhöhte Cdk5-Aktivität, als Folge von p35, aber nicht von Cdk5-Überexpression, zu einer Abschwächung der Kokain-vermittelten Dopamin-Signalgebung führt. Erhöhte Cdk5-vermittelte Phosphorylierung von Dopamin und cAMP-regulierten Phosphoprotein, molekulare Masse 32 kDa (DARPP-32) bei Thr-75, wurde von einer verringerten Phosphorylierung von DARPP-32 bei Thr-34 begleitet. Die erhöhte Cdk5-vermittelte Phosphorylierung der extrazellulären Signal-regulierten Kinasekinase 1 an Thr-286 wurde von einer verminderten Aktivierung der extrazellulären Signal-regulierten Kinase 1 / 2 begleitet. Diese Effekte trugen zur Abschwächung der Kokain-induzierten Phosphorylierung des cAMP-Response-Element-bindenden Proteins sowie zu einer geringeren Induktion von c-fos im Striatum bei. Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass die Cdk5-Aktivität an einer veränderten Genexpression nach chronischer Kokainexposition beteiligt ist und somit die lang andauernden Veränderungen der neuronalen Funktion, die der Kokainsucht zugrunde liegen, beeinflusst.
Kokain erhöht die synaptischen Dopaminspiegel im Striatum und verändert die Genexpression in den dopaminoceptiven Neuronen, indem es intrazelluläre Signalwege aktiviert, die das ursprüngliche Signal vom D1-Rezeptor des Dopamins zum Zellkern weiterleiten (1). Die chronische Kokainexposition reguliert mehrere Transkriptionsfaktoren hoch, was zu lang anhaltenden Veränderungen der Genexpression führt, von denen angenommen wird, dass sie neuronalen Anpassungen bei der Kokainabhängigkeit zugrunde liegen (2). ΔFosB, als solcher Transkriptionsfaktor identifiziert (3) wurde gezeigt, dass es die Verhaltensreaktion von Tieren auf Kokain verbessert (4, 5). Daher wird erwartet, dass die Identifizierung der Zielgene, die durch die ΔFosB-Induktion reguliert werden, zu einem besseren Verständnis des molekularen Mechanismus beiträgt, der der Kokainabhängigkeit zugrunde liegt. Kürzlich wurde gezeigt, dass die chronische Behandlung von Tieren mit Kokain die Expression der Cyclin-abhängigen Kinase 5 (Cdk5) und ihres Aktivators p35 im Striatum durch die Induktion von ΔFosB (6, 7).
Cdk5 ist ein Mitglied der Cdk-Familie von Serin / Threonin-Kinasen. Im Gegensatz zu anderen Cdks, die Hauptregulatoren der Zellzyklusprogression sind, ist Cdk5 hauptsächlich an der Phosphorylierung von Substraten in postmitotischen Neuronen beteiligt (8). Die neuronale Spezifität der Cdk5-Aktivität wird durch die Assoziation mit ihren Aktivatoren, entweder p35 oder p39, erreicht, die vorwiegend in postmitotischen Neuronen exprimiert werden (8). Neben der essentiellen Rolle von Cdk5 bei der Entwicklung des Gehirns (9, 10), ichEs wurde auch mit der dopaminergen Übertragung im postnatalen Gehirn in Verbindung gebracht (11, 12). Die Hemmung der Cdk5-Aktivität führt zu einer erhöhten Dopaminfreisetzung im Striatum, was auf eine präsynaptische Funktion von Cdk5 als einen negativen Regulator der Dopaminfreisetzung hinweist (11). Darüber hinaus moduliert Cdk5 die Wirksamkeit postsynaptischer Dopamin-Signaltransduktion durch Phosphorylierung von Dopamin- und cAMP-reguliertem Phosphoprotein, Molekülmasse 32 kDa (DARPP-32) an Thr-75, die DARPP-32 in einen Inhibitor der cAMP-abhängigen Kinase (PKA) umwandelt (12).
Diese Beobachtungen legen nahe, dass Cdk5 und p35 stromabwärts Regulatoren der verlängerten Aktivierung von Dopamin-Signalwegen nach chronischer Kokain-Exposition und damit Kokainabhängigkeit sind. Um die Rolle von Cdk5 bei der Striatum-Dopamin-Signalweiterleitung weiter zu untersuchen, haben wir zwei transgene Mauslinien generiert, in denen entweder Cdk5 oder p35 spezifisch in Neuronen unter der Kontrolle des p35-Promotors überexprimiert wurde. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Cdk5-Aktivität mit erhöhten Werten von p35-Protein, aber nicht von Cdk5-Protein hochreguliert wurde, was darauf hindeutet, dass das Niveau von p35-Protein geschwindigkeitslimitierend für Cdk5-Aktivität ist. Wir bieten hier in vivo Hinweise darauf, dass eine erhöhte Cdk5-Aktivität als Folge der p35-Überexpression zu einer Abschwächung der Kokain-vermittelten Dopamin-Signalübertragung zum Kern durch eine Hemmung der PKA- und extrazellulären Signal-regulierten Kinase (ERK) -Kaskaden führt.
Materialen und Methoden
Antikörper. Polyklonale Antikörper gegen Cdk5 (C-8) und p35 (C-19) wurden von Santa Cruz Biotechnology erworben. Die Phosphorylierungs-abhängigen und -unabhängigen Antikörper gegen ERK-Kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 und cAMP-Antwortelement-bindendes Protein (CREB) wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, MA) erhalten. Die Antikörper gegen Phospho-Thr-34 DARPP 32 (13), Phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), insgesamt DARPP-32 (12), und c-fos (14) wurden wie beschrieben verwendet. Ein Antikörper gegen Aktin wurde von Sigma bezogen.
Experimentelle Tiere. Wir klonierten früher das Maus-p35-Gen Cdk5r1, das für p35-Protein kodiert und seine genomische Struktur charakterisiert (15). Um die transgene Maus mit neuronaler Überexpression von p35 (Tgp35) zu erzeugen, wurde die 6-kb ECORI-ECORI-Fragment, das die 1.2-kb-Promotorregion enthielt, wurde in ein pGEM9Z (-) - Plasmid subkloniert, und ein 45-bp-Tag, abgeleitet von SV40, wurde in das Plasmid eingefügt KpnI Seite stromabwärts von Poly (A+) Signal (Abb.. 1A). Das Tag enthielt a SpeIch Stelle für die Genotypisierung der Tiere. Das 6-kb-Fragment wurde aus dem Plasmid ausgeschnitten und gereinigt, gefolgt von einer pronukleären Injektion des Transgens, um die transgenen Mäuse zu erzeugen. Um das Expressionsprofil des Transgens unter der regulatorischen Kontrolle des 1.2-kb-p35-Promotors zu untersuchen in vivowurde eine doppelt transgene Maus (Tgp35; p35 - / -) unter Verwendung einer zweistufigen Züchtungsstrategie, bei der die Tgp35-Maus in einem endogenen p35-Null-Hintergrund regeneriert wurde, weiter erzeugt. Die anderen in dieser Studie verwendeten Mausmodelle umfassten p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/- und eine transgene Maus mit neuronaler Überexpression von Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotypen dieser Mäuse wurden bestimmt, indem entweder Southern-Blot-Analyse oder PCR an genomischer DNA durchgeführt wurde, die aus den Schwanzbiopsien isoliert wurde. Die Mäuse wurden unter einem 12-h-Licht / 12-h-Dunkelzyklus gehalten. Die gesamte Behandlung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institutes of Health zur Pflege und Verwendung von Labor- und Versuchstieren durchgeführt.
Southern-Blot-Analyse. Genomische DNA, die aus Schwanzbiopsien extrahiert wurde, wurde mit verdaut ECORI und SpeI, Elektrophorese auf einem 0.9% -Agarosegel und Übertragen auf eine Nylonmembran. Die Membran wurde mit einem Random-Primer hybridisiert 32P-markierte Sonde bei 42 ° C über Nacht. Die 485-bp-Sonde zur Genotypisierung von p35-Knockout- (p35 - / -) und Tgp35-Mäusen wurde durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer erzeugt: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'und 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Die hybridisierte Membran wurde zweimal in 2 × SSC / 0.1% SDS bei 42 ° C für 10 min und zweimal in 0.1 × SSC / 0.1% SDS bei 65 ° C für 20 min gewaschen und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Medikamentöse Behandlung. Kokain (Sigma) wurde in steriler Kochsalzlösung gelöst. Die Tiere wurden im Alter von 15 Monaten mit Kokain (3 mg / kg) oder einem gleichen Volumen Kochsalzlösung intraperitoneal injiziert und durch Enthauptung zu verschiedenen Zeitpunkten (15, 30, 60 und 120 min) nach der Injektion getötet. Die Gehirne wurden schnell entfernt und in eiskaltem PBS gekühlt. Die Striata wurden dann herauspräpariert und einer Northern- oder Western-Blot-Analyse unterzogen. Für die immunhistochemische Analyse wurden striatale Schnitte von Mäusen 2 h nach der Injektion erhalten.
Northern Blot Analyse. Gesamt-RNA wurde mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) aus den Striata extrahiert und einer Northern-Blot-Analyse wie beschrieben unterworfen (18). Zum Nachweis von c-fos-mRNA wurde ein 189-bp-Fragment von Maus-c-fos-cDNA als Sonde wie beschrieben verwendet (19). Die Mengen an c-fos-mRNA wurden quantifiziert, indem die optische Dichte der spezifischen Bande unter Verwendung eines Bildanalysesystems mit Nih-Bild-Software, Version 1.62, gemessen wurde.
Western-Blot-Analyse. Striatum-Gewebe wurden in 1% SDS beschallt und für 10 min gekocht. Die Proteinkonzentration in jeder Probe wurde durch BCA-Proteinassay (Pierce) bestimmt. Gleiche Mengen an Protein wurden durch SDS / PAGE getrennt, bevor sie auf eine Nitrozellulosemembran übertragen wurden. Die Membranen wurden in 1 × PBS, enthaltend 5% Magermilch und 0.05% Tween 20, blockiert und mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus- oder Kaninchen-IgG (Sigma) wurde bei Raumtemperatur für 60 min durchgeführt. Ein Signal wurde durch verstärkte Chemilumineszenz (Pierce) nachgewiesen, und die optischen Dichten der Banden wurden wie oben beschrieben quantifiziert.
Cdk5-Kinase-Assay. Striatal-Lysate wurden mit einem Lysepuffer hergestellt, der aus 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid / 1 & mgr; g / ml Aprotinin / 1 & mgr; g / ml Leupeptin / Phosphatase-Inhibitoren (Phosphatase-Inhibitor-Mischung I und II, Sigma). Die Lysate wurden entweder mit Anti-Cdk5- (C-8) oder Anti-p35- (C-19) -Antikörpern immunpräzipitiert. Die Cdk5-Immunopräzipitate wurden durch Inkubation von 300 & mgr; l des Lysats (entsprechend 300 & mgr; g Protein) mit Anti-Cdk5-Antikörper (3 & mgr; g) über Nacht bei 4 ° C hergestellt, gefolgt von weiterer Inkubation mit 25 & mgr; l Protein A-Agarosekügelchen (50 % Aufschlämmung im Lysepuffer; Santa Cruz Biotechnology) für 3 h bei 4 ° C. Zur Herstellung von p35-Immunpräzipitaten wurde 500 & mgr; l des Lysats (entsprechend 1 mg Protein) wie oben beschrieben mit anti-p35-Antikörper (3 & mgr; g) inkubiert. Die Immunopräzipitate wurden zweimal mit dem Lysepuffer und zweimal mit einem Kinasepuffer gewaschen, der aus 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl bestand2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspendiert in 60 & mgr; l des Kinasepuffers. Die Kinaseaktivität wurde unter Verwendung von Histon H1 als Substrat gemessen (18).
Immunhistochemie. Die Mäuse wurden durch ip Injektionen von Avertin (250 mg / kg, Fluka) anästhesiert und transcardial mit 0.1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7.4, perfundiert, gefolgt von Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), einem nicht-vernetzenden Fixiermittel. Zergliederte Gehirne wurden weiter in dem gleichen Fixiermittel über Nacht bei 37 ° C fixiert. Dann wurden die Gehirne in Paraffin eingebettet, in 5-μm-dicke koronale Schnitte geschnitten und immunhistochemisch unter Verwendung der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplextechnik (Vector Laboratories) mit Diaminobenzidin als Substrat unterzogen. Die Schnitte wurden mit einem affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörper gegen c-fos über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Die Färbungsspezifität wurde durch Weglassen des primären Antikörpers beurteilt.
Die Ergebnisse
Erzeugung transgener Mäuse mit neuronaler Überexpression von p35. Das zur Erzielung einer erhöhten neuronalen Expression von p35 verwendete Transgen umfasste das 6-kb-Fragment des klonierten Maus-p35-Gens, das den 1.2-kb-Promotor und die gesamte codierende Sequenz von p35 enthielt (Abb.. 1 A). Die Genotypen von Mäusen wurden durch Southern-Blot-Analyse unter Verwendung einer Sonde bestimmt, die entworfen wurde, um p35 - / - und Tgp35-Mäuse von Wildtyp-Mäusen zu unterscheiden (Abb.. 1 A und B). Um die Transgenexpression unter der Kontrolle des 1.2-kb p35-Promotors zu untersuchen, erzeugten wir doppelt transgene Mäuse (Tgp35; p35 - / -), in denen die p35-Expression nur vom Transgen angetrieben wurde. Die p35 Expression in Tgp35; p35 - / - Mäusen wurde nur im Gehirn beobachtet (Abb.. 1C), wo das räumliche Expressionsmuster dem von Wildtypmäusen ähnlich war (Abb.. 1D). Es wurde gezeigt, dass der Mangel an p35 zu einer abnormalen Schichtstruktur in der Hirnrinde und im Hippocampus von Mäusen führt (10). Die Tgp35; p35 - / - Mäuse zeigten jedoch eine vollständige Rettung des p35 - / - Gehirnphänotyps (Abb.. 1E). Diese Daten zeigten, dass der 1.2-kb-p35-Promotor die Expression des Transgens mit einem ähnlichen Expressionsprofil wie das von p35 aus dem endogenen p35-Gen kontrollierte.
Der p35-Proteingehalt ist geschwindigkeitslimitierend für die Hochregulation der Cdk5-Aktivität. Wir untersuchten die Gen-Dosierungs-Effekte der Gene, die p35 und Cdk5 codieren, auf Proteinexpression in striatalen Extrakten von p35 - / -, p35 +/-, Wildtyp, Tgp35, Cdk5 +/- und TgCdk5 Mäusen im Alter von 3 Monaten. Die Konzentrationen von p35 und Cdk5 korrelierten gut mit den Gendosen (Abb.. 2 A und B). Tgp35-Mäuse zeigten einen ≈1.6-fachen Anstieg des p35-Proteinspiegels im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen, wohingegen Cdk5-Proteinspiegel durch die unterschiedlichen Mengen an p35-Protein nicht beeinflusst wurden. TgCdk5-Mäuse zeigten einen ≈1.9-fachen Anstieg des Cdk5-Proteinspiegels im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen, während p35-Proteinspiegel durch die unterschiedlichen Cdk5-Proteinniveaus nicht beeinflusst wurden. Um die Wirkungen verschiedener Mengen an p35-Protein auf die Cdk5-Aktivität zu untersuchen, wurde Cdk5 aus striatalen Extrakten mit anti-Cdk5-Antikörper immunpräzipitiert und die Kinaseaktivität wurde gemessen. Um die Wirkungen verschiedener Mengen von Cdk5-Protein auf die Kinaseaktivität zu untersuchen, wurde p35 ebenfalls aus Striatumextrakten mit Anti-p35-Antikörper immunpräzipitiert, und die Kinaseaktivität wurde gemessen. Cdk5-Aktivität korrelierte gut mit der Menge an p35-Protein, aber nicht mit der Menge an Cdk5-Protein (Abb.. 2 C und D). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Menge an p35-Protein ein geschwindigkeitsbegrenzender Faktor für die Cdk5-Aktivität ist. Wir haben daher Tgp35-Mäuse verwendet, um die Auswirkungen einer erhöhten Cdk5-Aktivität auf die Striatum-Dopamin-Signalisierung zu untersuchen.
Kokaininduzierte Phosphorylierung von DARPP-32 bei Thr-34 wird in Tgp35-Mäusen abgeschwächt. Die Funktion von DARPP-32 hängt von seinem Phosphorylierungszustand an mehreren Stellen ab (20). PKA phosphoryliert DARPP-32 bei Thr-34, wohingegen Cdk5 DARPP-32 bei Thr-75 phosphoryliert. Daher untersuchten wir den Phosphorylierungszustand von DARPP-32 in striatalen Extrakten von Wildtyp- und Tgp35-Mäusen. Der Spiegel von Phospho-Thr-75 DARPP-32 war in Tgp35-Mäusen höher (Abb.. 3A; 1.6 ± 0.2-Faltung über dem Wert von Wildtyp-Mäusen). Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen einer erhöhten Cdk5-Aktivität auf Striatum-Dopamin-Signalisierung. Wir untersuchten die Kokain-induzierte PKA-Aktivierung in Tgp35-Mäusen durch Analyse des Phosphorylierungszustands von DARPP-32 bei Thr-34. Die Menge an Phospho-Thr-34 DARPP-32 war in Wildtyp-Mäusen 15 min nach der Kokaininjektion erhöht (Abb.. 3B; 1.8 ± 0.2-Faltung über dem Grundniveau). Die Wirkung von Kokain auf die Thr-34-Phosphorylierung von DARPP-32 wurde jedoch in Tgp35-Mäusen abgeschwächt (1.2 ± 0.3-Faltung über dem Basalniveau). Diese Ergebnisse zeigten, dass ein Anstieg der Cdk5-Aktivität die Kokain-induzierte PKA-Aktivierung vermutlich durch die DARPP-32-Phosphorylierung an Thr-75 abschwächte (6, 12). Es ist auch möglich, dass eine Erhöhung der präsynaptischen Cdk5-Aktivität zu einer verminderten Dopaminfreisetzung führt und dass dies zu der reduzierten Wirkung von Kokain beiträgt. Bemerkenswerterweise beeinflusste eine einzige Injektion von Kokain nicht die p35- und Cdk5-Proteinspiegel sowie die Kinaseaktivität (Abb.. 3 C und D). Dies steht im Gegensatz zu einer früheren Studie, in der gezeigt wurde, dass chronische Kokain-Exposition die Expression von p35 und Cdk5 hochreguliert (6).
Hochregulierung der Cdk5-Aktivität dämpft Kokain-induzierte Aktivierung von ERK1 / 2. Jüngste Beweise deuten darauf hin, dass die Dopaminrezeptoraktivierung im Striatum auch andere Signalkaskaden aktiviert, einschließlich des ERK-Signalwegs (21, 22), die eine wichtige Rolle bei der Verhaltensreaktion auf Kokain spielt (23). Wir untersuchten daher, ob die Cdk5-Aktivität die Kokain-induzierte Aktivierung des ERK-Signalwegs beeinflussen könnte. Die Aktivierung des ERK-Signalwegs wurde nach Kokaininjektion in striatalen Extrakten von Wildtyp-Mäusen beobachtet, wie durch erhöhte Phosphorylierung von MEK1 / 2 an Ser-217 und Ser-221 (1.5 ± 0.2-fache über dem Grundniveau) und von ERK1 gezeigt wurde / 2 bei Thr-202 und Tyr-204 (ERK2-Phosphorylierung: 1.5 ± 0.2-fache über dem Grundniveau) (Abb.. 4 A und B). Die Kokain-induzierte Aktivierung von MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-fache über dem Grundniveau) und ERK1 / 2 (ERK2-Phosphorylierung: 1.2 ± 0.2-fache über dem Grundniveau) wurde in Tgp35-Mäusen abgeschwächt (Abb.. 4 A und B). Darüber hinaus waren die Grundlevel von Phospho-ERK1 / 2 in Tgp35-Mäusen niedriger (0.8 ± 0.2-fache unter dem Wert von Wildtyp-Mäusen), wohingegen dieser Trend statistisch nicht signifikant war. Dieses letztere Ergebnis könnte der Cdk5-abhängigen Phosphorylierung von MEK1 an Thr-286 zugeschrieben werden, was zu einer Abnahme der katalytischen Aktivität führt (24). Um diese Möglichkeit zu untersuchen, untersuchten wir den Phosphorylierungszustand von MEK1 bei Thr-286 und fanden heraus, dass höhere Spiegel von Phospho-Thr-286 MEK1 in striatalen Extrakten von Tgp35-Mäusen vorhanden waren (Abb.. 4C; 1.3 ± 0.1-Faltung über dem Wert von Wildtyp-Mäusen). Darüber hinaus wurde der Phosphorylierungszustand von MEK1 bei Thr-286 durch eine einzige Injektion von Kokain nicht verändert, was mit dem Ergebnis übereinstimmt, dass die Cdk5-Aktivität durch die Behandlung nicht beeinflusst wurde (Abb.. 3D).
Die Propagation der Dopamin-Signalübertragung zum Nucleus wird durch erhöhte Cdk5-Aktivität abgeschwächt. Kokain-induzierte Aktivierung mehrerer Signalkaskaden mit PKA und ERK führt zur anschließenden Aktivierung des Transkriptionsfaktors CREB im Zellkern durch Phosphorylierung an Ser-133 (22, 25). Um zu untersuchen, ob die Cdk5-vermittelten inhibitorischen Effekte auf PKA- und ERK-Aktivierungskaskaden auf CREB-Phosphorylierung im Zellkern konvergieren können, untersuchten wir den Phosphorylierungszustand von CREB an Ser-133 in striatalen Extrakten von Wildtyp- und Tgp35-Mäusen. Der Basalspiegel von Phospho-CREB war in Tgp35-Mäusen niedriger (0.7 ± 0.1-fache des Werts von Wildtyp-Mäusen) (Abb.. 5). Als Reaktion auf die Injektion von Kokain war der Spiegel von Phospho-CREB im Striatum von Wildtyp-Mäusen erhöht (1.5 ± 0.1-fache über dem Basalspiegel), aber diese Antwort auf Kokain wurde in Tgp35-Mäusen abgeschwächt (1.2 ± 0.1). Falten über dem Grundniveau) (Abb.. 5).
Die Phosphorylierung von CREB an Ser-133 verstärkt seine Transkriptionsaktivität über ein cAMP-Response-Element in der Promotorregion bestimmter Gene, einschließlich des c-fos-Gens (26). Wir untersuchten daher die Induktion von c-fos im Striatum von Wildtyp- und Tgp35-Mäusen nach Kokaininjektion. In Wildtyp-Mäusen erhöhte sich die Menge an c-fos-mRNA nach der Injektion von Kokain auf einen Spitzenwert (1.8 ± 0.2-fache über dem Grundniveau) 30 min und kehrte anschließend nach der Injektion durch 120 min auf das Basalniveau zurück (Abb.. 6 A und B). Jedoch waren die Mengen an c-fos-mRNA in Tgp30-Mäusen um N35% niedriger als bei Wildtyp-Mäusen bis 30 min nach der Injektion (Abb.. 6 A und B). Die geringere Induktion von c-fos in Tgp35-Mäusen wurde durch Immunhistochemie (Abb.. 6 C-F). Die Verabreichung von Kokain erhöhte die c-fos-Immunreaktivität, sowohl in Wildtyp- als auch Tgp35-Mäusen, stark in den dorsomedial-dorsozentralen Teilen des Striatums und schwach in den lateralen Teilen. Der Kokain-induzierte Anstieg der Anzahl von c-fos-immunopositiven Zellen wurde jedoch im Striatum von Tgp35-Mäusen deutlich abgeschwächt (Abb.. 6G). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass die Kokain-vermittelte Verstärkung der striatalen Dopamin-Signalübertragung an den Zellkern in Tgp35-Mäusen gehemmt wurde, ein wahrscheinliches Ergebnis einer erhöhten Cdk5-Aktivität.
Diskussion
Cdk5 und sein Aktivator p35 wurden als Zielgene identifiziert, die durch chronische Exposition gegenüber Kokain hochreguliert werden (6). Wir berichten hier, dass eine erhöhte Cdk5-Aktivität als Folge einer p35-Hochregulierung anstelle einer Cdk5-Hochregulierung zu einer Abschwächung der Kokain-vermittelten Dopamin-Signalgebung in striatalen Neuronen führt. Um die Auswirkungen der hochregulierten Expression von Cdk5 oder p35 auf striatale Dopamin-Signalwege zu untersuchen, wurden zwei transgene Mauslinien, TgCdk5- und Tgp35-Mäuse, analysiert. Wir fanden heraus, dass die Cdk5-Aktivität im Verhältnis zu einem erhöhten p35-Protein hochreguliert war, aber nicht von einem erhöhten Cdk5-Protein beeinflusst wurde. Unser vorheriger Bericht hat auch gezeigt, dass die Cdk5-Aktivität im TgCdk5-Mausgehirn niedriger war als im Wildtyp-Mausgehirn, wenn die Aktivität unter Verwendung von Cdk5-Immunpräzipitaten gemessen wurde (17), was darauf hindeutet, dass die Cdk5 - Überexpression zu einem erhöhten Gehalt an monomerem Cdk5 führt, wenn der p35 - Spiegel nicht erhöht ist. Diese Ergebnisse zeigten, dass das Niveau des p35-Proteins ein geschwindigkeitslimitierender Faktor für die Cdk5-Aktivität ist.
Tgp35-Mäuse zeigten eine geringere Induktion sowohl der CREB-Phosphorylierung als auch von c-fos im Striatum nach akuter Injektion von Kokain, was nahelegt, dass die striatale Antwort auf Kokain durch erhöhte Cdk5-Aktivität inhibiert wurde. Die Abschwächung der Kokain-vermittelten Dopamin-Signalübertragung in Tgp35-Mäusen wurde wahrscheinlich durch die Cdk5-vermittelte Inhibition multipler Signalkaskaden erreicht, die DARPP-32, PKA und ERK involvierten. Die Kokain-Verabreichung erhöhte die PKA-Phosphorylierung von DARPP-32 bei Thr-34 in Wildtyp-Mäusen, wohingegen diese Antwort in Tgp35-Mäusen abgeschwächt wurde. Es wurde gezeigt, dass die PKA-Phosphorylierung von DARPP-32 an Thr-34 die Aktivität der Proteinphosphatase 1 (PP1) inhibiert, dem Enzym, das für die Dephosphorylierung von Ser-133 von CREB verantwortlich ist (27). Somit würde die PP1-Aktivität nicht über den DARPP-32 / PP1-Weg in Tgp35-Mäusen antagonisiert werden.
Die Kokain-induzierte Aktivierung von ERK1 / 2 wurde auch in Tgp35-Mäusen abgeschwächt. Es gibt verschiedene Mechanismen, durch die Cdk5 die Kokain-induzierte Aktivierung von ERK1 / 2 hemmen könnte. Erstens könnte die Cdk5-abhängige Phosphorylierung von DARPP-32 bei Thr-75 die PKA inhibieren, was zu einer nachfolgenden Inhibierung jeglicher PKA-vermittelter MEK1 / 2-Aktivierung führt, die für die ERK1 / 2-Aktivierung erforderlich ist. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat auch gezeigt, dass die Phosphorylierung von DARPP-32 bei Thr-34 für die Kokain-vermittelte Aktivierung von ERK1 / 2 über mehrere Wege erforderlich ist, einschließlich der indirekten Regulation der MEK-Aktivierung sowie der Regulation von striatalangereicherter Phosphatase, einem Tyrosin Phosphatase, die direkt auf ERK1 / 2 wirkt (28). Eine Unterstützung für diese Möglichkeit wird durch den Befund nahegelegt, dass die Kokain-induzierte Phosphorylierung von MEK1 / 2 an Ser-217 und Ser-221 in Tgp35-Mäusen abgeschafft wurde. Ein weiterer wahrscheinlicher Weg ist über die Cdk5-abhängige Phosphorylierung von MEK1 an Thr-286, was zu einer Abnahme seiner katalytischen Aktivität führen würde und zur Hemmung der ERK1 / 2-Aktivität führen würde (24).
Es wurde gezeigt, dass die Hemmung der Cdk5-Aktivität im Striatum die Verhaltenswirkungen chronischer Kokainbehandlung bei Tieren verstärkt (6). Übereinstimmend mit der Hypothese, dass eine Hochregulierung der Cdk5-Aktivität zur neuronalen Anpassung beitragen kann, um den Effekten einer wiederholten Kokainverabreichung entgegenzuwirken (6), fanden wir, dass Cdk5-vermittelte Phosphorylierung von DARPP-32 und MEK1 zur Abschwächung der Kokain-induzierten Aktivierung von ERK1 / 2 beitrug, was zu einer geringeren Induktion von CREB-Phosphorylierung und c-fos im Striatum führte. Unsere Ergebnisse unterstützen die Idee, dass eine erhöhte Cdk5-Aktivität als Folge der p35-Hochregulation die Genexpression im Striatum nach chronischer Kokainexposition verändern kann. Dies kann durch Veränderungen in den Aktivitäten der Transkriptionsfaktoren wie CREB und c-fos auftreten. Daher kann der Cdk5-Aktivator p35 aufgrund seiner geschwindigkeitsbeschränkenden Wirkung auf die Cdk5-Aktivität zu lang anhaltenden Veränderungen der neuronalen Funktion, die der Kokainsucht zugrunde liegen, beitragen.
Anerkennungen
Wir danken Drs. Mary Jo Danton, Philip Grant und Sashi Kesavapany für das kritische Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grant Z01DE00664-05 (für ABK), dem US Public Health Service Grant DA10044 und Zuschüssen von der Simons Foundation, der Peter J. Sharp Foundation und der Picower Foundation (an PG) unterstützt.
Notizen
Abkürzungen: Cdk5, Cyclin-abhängige Kinase 5; ERK, extrazelluläre signalregulierte Kinase; DARPP-32, Dopamin und cAMP-reguliertes Phosphoprotein, Molekülmasse 32 kDa; PKA, cAMP-abhängige Kinase; MEK, ERK-Kinase; CREB, cAMP-Response-Element-bindendes Protein.
Bibliographie
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