Quelle
Das Nathan Kline Institute, Orangeburg, New York, 10962, USA. [E-Mail geschützt]
Abstract
Kinder und Jugendliche sind in zunehmendem Maße Psychostimulanzien ausgesetzt, entweder illegal oder zur Behandlung üblicher neuropsychiatrischer Zustände, z. B. einer Aufmerksamkeitsdefizit-Störung mit und ohne Hyperaktivität. Trotz der weit verbreiteten Verwendung psychomotorischer Stimulanzien in jüngeren Altersgruppen ist wenig über die chronischen molekularen neuroadaptiven Reaktionen auf diese Substanzen im unreifen Gehirn bekannt. Hier demonstrieren wir das nach chronischer Verabreichung der Psychostimulanzien Kokain mit einem Amphetaminder Transkriptionsfaktor DeltaFosB wird im Nucleus Accumbens von reguliert periadoleszent Mäuse aber nicht in der Entwöhnung oder im Erwachsenenalter Mäuse. Induktion von DeltaFosB kommt auch ausschließlich im caudate putamen von vor periadoleszent Mäuse nachdem Amphetamin Verwaltung. Diese Ergebnisse zeigen die einzigartige Plastizität eines kritischen Moleküls, das die psychostimulierende Wirkung reguliert, im jugendlichen Gehirn und deuten darauf hin, dass diese neuroadaptiven Veränderungen möglicherweise an der Mediation von beteiligt sind verbesserte süchtig machende Tendenzen bei Jugendlichen im Verhältnis zum Erwachsenen.
Einführung
Psychostimulanzien werden bei der Behandlung von häufigen Kinderkrankheiten wie Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung eingesetzt. Darüber hinaus ist der Missbrauch von Stimulanzien, einschließlich Amphetamin und Kokain, bei Jugendlichen üblich. In diesem Alter gibt es Hinweise auf verstärkte Suchttendenzen im Vergleich zu Erwachsenen (Estroff et al., 1989; Myers und Anderson, 1991). Trotz der Daten, die auf entwicklungsregulierte Verhaltensweisen schließen lassen, ist wenig über die molekularen neuroadaptiven Reaktionen im unreifen Gehirn bekannt, die während der Verabreichung dieser Mittel auftreten. Kokain und Amphetamin können langanhaltende Verhaltensänderungen teilweise durch Stimulation von Dopamin D bewirken1Rezeptoren und Erhöhungen der Transkriptionsfaktoren, einschließlich ΔFosB, im dorsalen Striatum (dh Caudat-Putamen) und im ventralen Striatum (dh Nucleus Accumbens) (Chen et al., 1997). Ein Anstieg der ΔFosB-Spiegel, möglicherweise durch Stabilisierung von Proteinprodukten, hält sich nach chronischer Kokain- oder Amphetamin-Exposition für mehrere Wochen an und wird zumindest teilweise durch den Dopamin-Signaltransduktionsweg reguliert (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).
Das zentrale dopaminerge System von Jungtieren ist aufgrund der sich ändernden Konzentrationen kritischer Moleküle während der normalen Entwicklung, einschließlich des Dopamins D, sehr stark im Fluss1Rezeptor DARPP-32 (Dopamin und cAMP-reguliertes Phosphoprotein; Mr von 32 kDa) und cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano et al., 1996; Taraziet al., 1999;Andersen, 2002). Die Exposition gegenüber Psychostimulanzien, die die dopaminerge Neurotransmission verstärken, kann daher zu quantitativen und / oder qualitativ unterschiedlichen molekularen Reaktionen führen, einschließlich Veränderungen der ΔFosB-Expression. Um die Hypothese zu testen, dass bei chronischer Exposition gegenüber Psychostimulanzien altersabhängige neuroadaptive Reaktionen auftreten, wurden drei Gruppen von Mäusen in seriellen Experimenten analysiert: Erwachsene (60 d bei Einsetzen der Injektionen), periadoleszent (33 d bei Einsetzen der Injektionen). und Nachentwöhnung (24 d zu Beginn der Injektion). Dies ist der erste direkte Vergleich molekularer neuroadaptiver Reaktionen auf chronische Psychostimulanzien in diesen drei Altersgruppen. Wir fanden heraus, dass periadoleszente Mäuse nach identischen Behandlungsparadigmen eine erhöhte ΔFosB-Hochregulierung als Reaktion auf sowohl Kokain als auch Amphetamin zeigen.
Material und Methoden
Tier- und Medikamentenverabreichung. Männliche CD-1-Mäuse (Charles River Laboratories, Kingston, NY) wurden in einem 12 hr-Hell / Dunkel-Zyklus (6: 00 AM bis 6: 00 PM) mit untergebracht ad libitumZugang zu Nahrung und Wasser. Die Tiere durften sich vor Beginn der Injektionen für mindestens 10 d im Tierraum aufhalten. Die Tiere wurden von zwei Ermittlern gehandhabt, die alle Injektionen in demselben Raum durchführten, in dem die Tiere untergebracht waren. Alle Tiere wurden im Alter von 21 d abgesetzt. Die Injektionen begannen bei 24 (nach Entwöhnung), 33 (Periadoleszent) oder 60 (Erwachsener) im Alter. Die Tiere erhielten 20 mg / kg Kokain (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg Amphetamin (Sigma) oder intraperitoneal ein gleiches Volumen Salzlösung zwischen 4: 00 und 5: 00 PM täglich für 7 d. Die Tiere wurden nach kurzer CO-Exposition durch Enthauptung getötet2 bei 10: 00 AM am Tag nach der letzten Injektion. Das Gehirn wurde sofort vom Schädel entfernt und das Caudat Putamen und der Nucleus Accumbens wurden schnell auf Eis präpariert. Alle Dissektionen wurden von koronalen Hirnschnitten von einem einzelnen Untersucher durchgeführt, und Proteinextrakte wurden aus frischem Gewebe ohne Gefrieren hergestellt. Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und stimmten mit den National Institutes of Health überein Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
Western-Blot-Analyse. Für Western-Blot-Analysen wurden gleiche Proteinmengen (40 μg für Caudate Putamen und 20 μg für Nucleus Accumbens) aus jeder Probe in jede Spur eines 10% SDS-Polyacrylamidgels geladen, nachdem die Proteinkonzentrationen mit dem BCA-Assay gemessen wurden (Pierce, Rockford, IL). Die gleiche Proteinbeladung wurde auch durch Visualisierung des Gesamtproteins durch Ponceau Red nach Übertragung auf Nitrocellulose und / oder Blotting mit Anti-Actin-Antikörper (1: 500; Sigma) bestätigt. Das Fos-verwandte Antigen (FRA) -Antiserum, das die ΔFosB-Isoformen erkennt, wurde großzügig von Dr. M. Iadarola (National Institutes of Health, Bethesda, MD) zur Verfügung gestellt und in einer Konzentration von 1: 4000 verwendet. Vorherige Studien (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), einschließlich der Vorresorption des FRA-Antiserums mit dem M-Peptid-Immunogen, zeigte die Spezifität dieses Antiserums. Der bei 32: 5 verwendete monoklonale DARPP-1 10,000a-Antikörper wurde großzügig von Drs bereitgestellt. Hugh Hemmings und Paul Greengard (The Rockefeller University, New York, NY). Der Dopamin-Transporter (DAT) -Antikörper stammte von Chemicon (Temecula, CA). Die Blots wurden mit dem Chemilumineszenzsystem NEN-DuPont (Boston, MA) umgesetzt und einem Film ausgesetzt. Densitometrische Werte für die ΔFosB-Immunreaktivität wurden unter Verwendung von ScanAnalysis for Apple (Biosoft, Ferguson, MO) erhalten. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung einer Einweg-ANOVA bestimmt, gefolgt von Post-hoc- Tukeys mehrfacher Vergleichstest oder ein ungepaarter zweiseitiger Student t Test wie in den Legenden der Figuren angegeben. Bei den Medikamentenbehandlungsexperimenten wurde die Analyse jeder Altersgruppe mit einem separaten Blot durchgeführt, und daher wurde jeder Kochsalzgruppe willkürlich ein 100-Wert für den Vergleich zwischen den Altersgruppen zugeordnet. Für die Ontogeniestudien wurden Proben aus allen Altersgruppen zusammen in einem einzigen Blot analysiert.
ERGEBNISSE
Die Induktion von ΔFosB nach Kokain und Amphetamin findet nur im Nucleus Accumbens von periadoleszenten Mäusen statt
Die Expression von ΔFosB wurde im Nucleus Accumbens und Caudate Putamen von postmenschlichen, periadoleszenten und adulten Mäusen nach 7 d einer Amphetamin- oder Kokainverabreichung gemessen. Der Nucleus Accumbens ist die Gehirnregion, von der angenommen wird, dass sie für die Vermittlung der lohnenden Wirkungen von Psychostimulanzien am kritischsten ist. Die ΔFosB-Immunreaktivität (35 kDa) wurde nach chronischer Verabreichung von Amphetamin selektiv in den Nucleus Accumbens von periadoleszenten Tieren induziert (Abb. 1 A) oder Kokain (Abb. 1 B). Im Gegensatz dazu waren die Werte von ΔFosB (35 kDa) im Nucleus Accumbens von Nachentwöhnungs- oder adulten Tieren nicht signifikant verändert (Abb.1 A,B). Auch beim Caudat-Putamen wurden die ΔFosB-Spiegel (35 kDa) nach chronischer Amphetamin-Gabe nur bei periadoleszenten Tieren signifikant hochreguliert (Abb.2 A). Alle drei Altersgruppen zeigten im Caudat-Putamen nach chronischer Kokain-Verabreichung einen signifikanten Anstieg der ΔFosB (35 kDa) -Expression (Abb.2 B). Das Ausmaß der Induktion war jedoch bei periadoleszenten Tieren am größten, insbesondere im Vergleich zu Nachentwöhnung (Abb. 2 B). Andere FRA- und Fos-Isoformen waren in allen Altersgruppen unverändert (Daten nicht gezeigt).
ΔFosB-Immunreaktivität im Nucleus Accumbens nach chronischer Verabreichung von Psychostimulanzien. CD-1-Mäusen wurde einmal am Tag 7 einmal täglich mit Salzlösung, Amphetamin oder Kokain für 24 d injiziert (P24; Nachentwöhnung), Tag 33 (P33; periadolescent) oder Tag 60 (Erwachsenen-). Niveaus der ΔFosB (35 kDa) -Immunreaktivität im Nucleus Accumbens sind nach chronischem Amphetamin (A) oder Kokain (B) Verwaltung. Repräsentative Immunoblots aus Salzlösung (S), Amphetamin- (A) und Kokain- (C) nach dem Entwöhnen injiziert (P24), periadoleszent (P33) und erwachsene Mäuse werden in gezeigt obere Platten. Bodenplatten zeigen den Mittelwert ± SEM-Prozentsatz der Basis-ΔFosB-Expression. n Die Werte für jede Gruppe werden in angezeigt Riegel. Nur bei den periadoleszenten Mäusen wurden signifikante Anstiege von ΔFosB im Nucleus accumbens festgestellt. *p <0.05; ** **.p <0.01 (Schüler t Prüfung; Kochsalzlösung vs. Droge).
ΔFosB-Immunreaktivität im Caudat-Putamen nach chronischer Verabreichung von Psychostimulanzien. CD-1-Mäusen wurde einmal am Tag 7 für 24 d einmal täglich Salzlösung, Amphetamin oder Kokain injiziert (P24; Nachentwöhnung), Tag 33 (P33; periadolescent) oder Tag 60 (Erwachsenen-). Niveaus der ΔFosB (35 kDa) -Immunreaktivität im Caudat-Putamen sind nach chronischem Amphetamin (A) oder Kokain (B) Verwaltung. Repräsentative Immunoblots aus Salzlösung (S), Amphetamin- (A) und Kokain- (Cinjizierte periadoleszente Mäuse (P33) werden in der angezeigtobere Platten. Bodenplatten zeigen den Mittelwert ± SEM-Prozentsatz der Basis-ΔFosB-Expression. n Die Werte für jede Gruppe werden in angezeigt Riegel. Signifikante Amphetamin-induzierte Anstiege der ΔFosB-Immunreaktivität wurden im Caudat-Putamen nur bei periadoleszenten Mäusen festgestellt (A). Die chronische Kokainverabreichung bewirkte in allen drei Altersgruppen einen Anstieg von ΔFosB (B). *p <0.05; ** **.p <0.01 (Schüler t Prüfung; Kochsalzlösung vs. Droge).
DAT- und DARPP-32-Spiegel werden nach chronischem Kokain oder Amphetamin nicht verändert
Mehrere Schlüsselmoleküle, die von dopaminergen und / oder dopaminozeptiven Neuronen exprimiert werden, einschließlich DARPP-32, D1 Dopaminrezeptor und DAT tragen zu akuten und chronischen Reaktionen auf Psychostimulanzien bei (Moratalla et al., 1996; Fienberg et al., 1998; Sora et al., 1998; Gainetdinov et al., 2001). Daten von DARPP-32, D1 Rezeptor- und DAT-Null- und DAT-Knockdown-Mäuse zeigen eine komplizierte Beziehung zwischen ihren Spiegeln, die Regulation der dopaminergen Aktivität und die Reaktionen auf Psychostimulanzien an. Tatsächlich tritt die Induktion von ΔFosB nicht in DARPP-32-Nullmäusen auf, die chronisches Kokain erhalten (Fienberg et al., 1998). Bei erwachsenen Mäusen ändert die 7 d-Exposition gegenüber 20 mg / kg Kokain jedoch nicht die Gesamtmenge an DARPP-32 (Fienberg et al., 1998). DAT-Proteinregulierung wurde bisher nicht bei Mäusen berichtet, die chronisch Psychostimulanzien ausgesetzt waren, obwohl bei einigen Arten über Veränderungen der Radioligandenbindung an den Dopamin-Transporter nach Exposition gegenüber Psychostimulanzien berichtet wurde (Letchworth et al., 2001). Hier haben wir die Konzentrationen von DARPP-32 und DAT-Protein gemessen, um zu bestimmen, ob die Expression dieser Proteine nach chronischer Psychostimulans-Verabreichung in einem der drei Mäusezeitalter verändert wird. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass es keine signifikante Veränderung der Gesamtmenge von DARPP-32 oder DAT im gesamten Caudat-Putamen oder -Nukleus Accumbens nach chronischer Verabreichung von Kokain oder Amphetamin in einer der drei Altersgruppen gab (Tabelle 1).
Relative Densitometriewerte für DARPP-32 und DAT in mit Amphetamin und Kokain behandelten P24, P33 und erwachsenen Mäusen im Vergleich zu Kontrollwerten, Salzwerte, willkürlich auf 100% gesetzt.
Die Ausgangswerte von ΔFosB sind entwicklungsmäßig reguliert
Wir untersuchten die Ontogenese von ΔFosB, weil erwachsene Mäuse mit einer gentechnisch erhöhten Expression von ΔFosB im Striatum eine erhöhte Verhaltensreaktion auf Psychostimulanzien zeigen (Kelz et al., 1999). Wir fanden heraus, dass die Grundlinienwerte von ΔFosB bei jüngeren Tieren sowohl im Caudate Putamen als auch im Nucleus Accumbens signifikant niedriger waren als bei Erwachsenen (Abb.3 A). Gehalte an funktionellen Markern des Dopaminsystems, einschließlich DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano et al., 1996) und Dopamin-Rezeptoren (Teicher et al., 1993; Taraziet al., 1999) sind auch entwicklungsmäßig geregelt. Frühere Berichte in CD-1-Mäusen weisen auf einen Peak in striatalem DARPP-32 am Tag nach der Geburt 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). In Ratten caudate putamen und nucleus accumbens, D1Spitzenwert der Rezeptoren von P28 zu P40 (Teicher et al., 1993; Taraziet al., 1999), aber ähnliche Studien wurden nicht an der Maus durchgeführt. Im Gegensatz dazu fanden wir hier heraus, dass die DAT-Proteinspiegel im Caudate Putamen und im Nucleus Accumbens zwischen 24 am Tag nach der Geburt und im Erwachsenenalter konstant waren (Abb. 3 B). Somit sind die relativen Verhältnisse zwischen D1 Rezeptoren, DAT, DARPP-32 und ΔFosB unterscheiden sich zwischen den Altersgruppen, was möglicherweise zu Unterschieden in D führt1 Rezeptoraktivität, die den Induktionsgrad von ΔFosB beeinflussen könnte.
Entwicklungsausdruck von ΔFosB und DAT. AΔFosB (35-37 kDa) Immunreaktivität im Caudat-Putamen und im Nucleus Accumbens von naiven CD-1-Mäusen als Funktion des Alters. Repräsentative Immunblots sind in gezeigt obere Platten.Bodenplatten zeigen Mittelwerte ± SEM von drei Mäusen pro Gruppe. *p <0.05, Erwachsener gegen P24; #p <0.05, Erwachsener gegen P36 (Tukey-Mehrfachvergleichstest nach ANOVA). BDensitometrische Werte der DAT-Immunreaktivität im Caudat-Putamen und im Nucleus Accumbens für naive CD-1-Mäuse in Abhängigkeit vom Alter. Die DAT-Niveaus unterschieden sich nicht zwischen den drei Altersgruppen.
DISKUSSION
Verhaltensweisen von psychomotorischen Stimulanzien sind altersabhängig. Die süchtig machenden Tendenzen sind im Jugendalter am höchsten, wenn der Konsum illegaler Substanzen eskaliert (Estroff et al., 1989; Myers und Anderson, 1991). Tatsächlich werden jüngere Kinder bei Einnahme von Psychostimulanzien häufig dysphorisch, während Jugendliche und Erwachsene unter Euphorie leiden (Rapoport et al., 1980). In Nagetiermodellen deuten einige Studien darauf hin, dass periadoleszente Tiere ein höheres Aktivitätsniveau aufweisen (Speer und Bremse, 1983) und veränderte Reaktionen auf Psychostimulanzien gegenüber jüngeren und älteren Tieren. Daher zeigen sie eine geringere lokomotorische Stimulation und eine Suche nach Neuheit als Reaktion auf eine akute Verabreichung niedriger Dosis von Psychostimulanzien im Vergleich zu entwöhnten Tieren und adulten Tieren, aber eine erhöhte Hyperaktivität nach einer Behandlung mit hoher Dosis. Bei chronischer Verabreichung ist die Sensibilisierung für Kokain-induzierte Fortbewegung bei periadoleszenten Ratten im Vergleich zu Erwachsenen größer, während die Sensibilisierung für Stereotypie geringer ist. Mikrodialysedaten haben auch Unterschiede zwischen periadoleszenten und adulten Ratten in Bezug auf die Sensibilisierung gegenüber Amphetamin-induzierter Dopaminfreisetzung gezeigt (Laviola et al., 1995; Adriani et al., 1998; Adriani und Laviola, 2000;Laviola et al., 2001). Es gibt jedoch widersprüchliche Studien zur Langzeitreaktivität gegenüber Kokain nach Verabreichung von Methylphenidat bei jugendlichen Ratten (Brandon et al., 2001; Andersenet al., 2002). Diese beiden letzten Berichte zeigen, wie schwierig es ist, Studien zu vergleichen, wenn verschiedene experimentelle Paradigmen verwendet werden. Versuche, Verhaltensstudien bei jüngeren Tieren zu vergleichen, werden durch die Verwendung verschiedener Arten und Stämme weiter beeinträchtigt.
Die Maus wird zu einem zunehmend wichtigen Tiermodell bei der Untersuchung des Gebrauchs und des Missbrauchs von Psychostimulanzien. Dies ist die erste systematische Analyse molekularer neuroadaptiver Reaktionen in drei verschiedenen Entwicklungsaltern bei der Maus oder einer anderen einzelnen Spezies. Frühere Studien, aus denen wir unsere Behandlungsparadigmen abgeleitet haben, haben einen Anstieg von ΔFosB im isolierten dorsalen und ventralen Striatum von erwachsenen Wildtyp-Ratten nach chronischer Kokain- und Amphetamin-Gabe gezeigt (Hope et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeonet al., 1997) aber nur im kombinierten dorsalen und ventralen Striatum oder im isolierten dorsalen Striatum von erwachsenen Wildtypmäusen nach chronischem Kokain (Fienberg et al., 1998; Zachariouet al., 2001).
Wir zeigen nun einen räumlichen und quantitativen Unterschied in durch Psychostimulanzien induzierten ΔFosB bei Mäusen nach Entwöhnung, periadoleszenten und adulten Tieren. Die Beobachtung einer erhöhten Reaktion bei periadoleszenten Tieren im Vergleich zu Erwachsenen und Nachwuchs wird durch die Tatsache verstärkt, dass die Reaktion bei mit Kokain und Amphetamin behandelten Mäusen ähnlich ist. Die Psychostimulanzien Kokain und Amphetamin erhöhen sowohl synaptisches Dopamin als auch Serotonin und Noradrenalin, jedoch auf unterschiedliche Weise. Kokain bindet an die Plasmalemma-Transporter für Dopamin, Serotonin und Norepinephrin und hemmt deren Wiederaufnahme in presynaptische Endgruppen. Im Gegensatz dazu fördert Amphetamin die Freisetzung dieser Sender. Die selektive Induktion von ΔFosB im Nucleus Accumbens nur der periadoleszenten Altersgruppe nach 7 d der Stimulansverabreichung und die relativ erhöhte Induktion von ΔFosB im Caudat-Putamen kann eine neurobiologische Repräsentation oder Ursache für die zuvor erwähnte erhöhte Tendenz zum Missbrauch von Psychostimulanzien sein Altersgruppe (Estroff et al., 1989; Myers und Anderson, 1991) und andere langfristige Veränderungen der Genexpression, die sich zwischen den Altersgruppen unterscheiden (Andersenet al., 2002). Darüber hinaus können diese Unterschiede intrinsisch durch Entwicklungsänderungen in den Konzentrationen der Schlüsselmoleküle reguliert werden, einschließlich ΔFosB selbst. Die möglichen Auswirkungen der Unterschiede bei den Ausgangswerten von ΔFosB zwischen den Altersgruppen sind analog zu den vorgeschlagenen Unterschieden zwischen Rattenstämmen (Haile et al., 2001). Tatsächlich gehen wir davon aus, dass ähnliche Unterschiede zwischen den Inzuchtmäusen auftreten werden. Es ist auch möglich, dass Mäuse unterschiedlichen Alters unterschiedliche molekulare Anpassungen in anderen Gehirnbereichen als dem Nucleus Accumbens zeigen. Zusätzliche Analysen mit periadoleszenten Mäusen mit gentechnisch veränderten Veränderungen der Konzentrationen von Schlüsselmolekülen und gleichzeitigen Verhaltensbeobachtungen werden diese Hypothesen weiter prüfen.
Fußnoten
- Empfangene April 8, 2002.
- Revision erhalten 6. August 2002.
- Akzeptierte 8. August 2002.
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Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für Gesundheit / Nationales Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall NS41871 (MEE und EMU) und dem Nationalen Institut für Drogenmissbrauch P30-DA13429 (EMU) unterstützt.
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Die Korrespondenz sollte an Dr. Michelle E. Ehrlich, die Thomas Jefferson University, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107 gerichtet werden. Email: [E-Mail geschützt] .
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