Quelle
Nathan Kline Institut, Orangeburg, New York, 10962, USA. [email protected]
Abstract
Kinder und Jugendliche sind zunehmend Psychostimulanzien ausgesetzt, sei es illegal oder zur Behandlung häufiger neuropsychiatrischer Erkrankungen wie Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung (ADHS) mit und ohne Hyperaktivität. Trotz des weitverbreiteten Einsatzes von Psychostimulanzien in jüngeren Altersgruppen ist wenig über die chronischen molekularen neuroadaptiven Reaktionen auf diese Substanzen im unreifen Gehirn bekannt. Wir zeigen hier, dass nach chronischer Verabreichung der Psychostimulanzien Kokain und Amphetamin der Transkriptionsfaktor DeltaFosB im Nucleus accumbens von Mäusen im Vorpubertätsalter hochreguliert ist , nicht jedoch bei entwöhnten oder erwachsenen Mäusen . Die Induktion von DeltaFosB erfolgt nach Amphetaminverabreichung ausschließlich im Striatum (Nucleus caudatus/Putamen) von Mäusen im Vorpubertätsalter . Diese Ergebnisse belegen die einzigartige Plastizität eines wichtigen Moleküls im Gehirn von Jugendlichen, das die Wirkung von Psychostimulanzien reguliert, und legen nahe, dass diese neuroadaptiven Veränderungen an der Vermittlung der erhöhten Suchtneigung bei Jugendlichen im Vergleich zu Erwachsenen beteiligt sein könnten.
Einführung
Psychostimulanzien werden zur Behandlung häufiger Störungen im Kindesalter, wie z. B. Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung (ADHS), eingesetzt. Darüber hinaus ist der Missbrauch von Stimulanzien, darunter Amphetamin und Kokain, unter Jugendlichen weit verbreitet – einer Altersgruppe, in der im Vergleich zu Erwachsenen ein erhöhtes Suchtpotenzial nachgewiesen wurde ( Estroff et al., 1989 ; Myers und Anderson, 1991 ). Obwohl Daten auf entwicklungsabhängige Verhaltensänderungen hinweisen, ist wenig über die molekularen neuroadaptiven Reaktionen im unreifen Gehirn bekannt, die während der Verabreichung dieser Substanzen auftreten. Kokain und Amphetamin können langfristige Verhaltensänderungen teilweise durch die Stimulation von Dopamin-D1-Rezeptoren und die Erhöhung des Spiegels von Transkriptionsfaktoren, einschließlich ΔFosB, im dorsalen Striatum (d. h. Nucleus caudatus/Putamen) und im ventralen Striatum (d. h. Nucleus accumbens) bewirken ( Chen et al., 1997 ). Ein Anstieg des ΔFosB-Spiegels, möglicherweise durch Stabilisierung von Proteinprodukten, hält nach chronischer Exposition gegenüber Kokain oder Amphetamin über mehrere Wochen an und wird zumindest teilweise durch den Dopamin-Signaltransduktionsweg reguliert ( Chen et al., 1997 ; Nestler et al., 2001 ).
Das zentrale dopaminerge System junger Tiere unterliegt im Zuge der normalen Entwicklung starken Veränderungen aufgrund schwankender Konzentrationen wichtiger Moleküle, darunter der Dopamin-D1- Rezeptor DARPP-32 (Dopamin- und cAMP-reguliertes Phosphoprotein; Molekülmasse 32 kDa) und cAMP ( Ehrlich et al., 1990 ; Teicher et al., 1993 ; Perrone-Capano et al., 1996 ; Tarazi et al., 1999 ; Andersen, 2002 ). Die Exposition gegenüber Psychostimulanzien, die die dopaminerge Neurotransmission verstärken, kann daher während dieser Phase zu quantitativ und/oder qualitativ veränderten molekularen Reaktionen führen, einschließlich Veränderungen der ΔFosB-Expression. Um die Hypothese zu prüfen, dass es bei chronischer Exposition gegenüber Psychostimulanzien altersabhängige neuroadaptive Reaktionen gibt, wurden drei Mäusegruppen in Serienversuchen untersucht: adulte Mäuse (60 Tage alt zu Beginn der Injektionen), periadoleszente Mäuse (33 Tage alt zu Beginn der Injektionen) und entwöhnte Mäuse (24 Tage alt zu Beginn der Injektionen). Dies ist der erste direkte Vergleich molekularer neuroadaptiver Reaktionen auf chronische Psychostimulanzienexposition in diesen drei Altersgruppen. Wir fanden heraus, dass periadoleszente Mäuse nach identischen Behandlungsbedingungen eine verstärkte ΔFosB-Hochregulation als Reaktion auf Kokain und Amphetamin zeigen.
Material und Methoden
Tiere und Medikamentenverabreichung. Männliche CD-1-Mäuse (Charles River Laboratories, Kingston, NY) wurden in einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus (6:00 bis 18:00 Uhr) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Die Tiere konnten sich mindestens 10 Tage vor Beginn der Injektionen an den Tierraum gewöhnen. Die Tiere wurden von zwei Versuchsleitern betreut, die alle Injektionen im selben Raum durchführten, in dem die Tiere untergebracht waren. Alle Tiere wurden im Alter von 21 Tagen entwöhnt. Die Injektionen begannen im Alter von 24 (nach dem Absetzen), 33 (in der Periadoleszenz) oder 60 (adulten) Tagen. Die Tiere erhielten täglich zwischen 16:00 und 17:00 Uhr über 7 Tage intraperitoneal entweder 20 mg/kg Kokain (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg/kg Amphetamin (Sigma) oder die gleiche Menge Kochsalzlösung. Die Tiere wurden am Tag nach der letzten Injektion um 10:00 Uhr nach kurzer CO₂- Exposition durch Dekapitation getötet . Die Gehirne wurden sofort entnommen und Nucleus caudatus, Putamen und Nucleus accumbens rasch auf Eis präpariert. Alle Präparationen wurden von einem einzigen Untersucher an koronalen Hirnschnitten durchgeführt, und die Proteinextrakte wurden aus frischem Gewebe ohne Einfrieren hergestellt. Alle Tierversuche wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tierversuche genehmigt und entsprachen den Richtlinien des National Institutes of Health (NIH) für die Haltung und Verwendung von Labortieren.
Western-Blot-Analyse. Für die Western-Blot-Analysen wurden gleiche Proteinmengen (40 μg für Nucleus caudatus und Putamen bzw. 20 μg für Nucleus accumbens) jeder Probe nach Bestimmung der Proteinkonzentrationen mittels BCA-Assay (Pierce, Rockford, IL) auf die einzelnen Spuren eines 10%igen SDS-Polyacrylamidgels aufgetragen. Die gleichmäßige Proteinbeladung wurde zusätzlich durch Visualisierung des Gesamtproteins mit Ponceau-Rot nach Transfer auf Nitrocellulose und/oder durch Blotting mit einem Anti-Actin-Antikörper (1:500; Sigma) überprüft. Das Fos-verwandte Antigen (FRA)-Antiserum, das die ΔFosB-Isoformen erkennt, wurde freundlicherweise von Dr. M. Iadarola (National Institutes of Health, Bethesda, MD) zur Verfügung gestellt und in einer Konzentration von 1:4000 verwendet. Frühere Studien ( Chen et al., 1997 ; Hiroi et al., 1997 ), darunter die Präadsorption des FRA-Antiserums mit dem M-Peptid-Immunogen, belegten die Spezifität dieses Antiserums. Der monoklonale Antikörper DARPP-32 5a (Verdünnung 1:10,000) wurde freundlicherweise von Dr. Hugh Hemmings und Dr. Paul Greengard (Rockefeller University, New York, NY) zur Verfügung gestellt. Der Dopamintransporter-(DAT)-Antikörper stammte von Chemicon (Temecula, CA). Die Blots wurden mit dem Chemilumineszenzsystem NEN-DuPont (Boston, MA) inkubiert und auf Film exponiert. Die densitometrischen Werte für die ΔFosB-Immunreaktivität wurden mit ScanAnalysis für Apple (Biosoft, Ferguson, MO) ermittelt. Die statistische Signifikanz wurde mittels einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Tukey-Test für Mehrfachvergleiche bzw. einem ungepaarten, zweiseitigen t-Test nach Student ermittelt ( siehe Abbildungslegenden ). Bei den Experimenten zur Medikamentenbehandlung wurde jede Altersgruppe auf einem separaten Blot analysiert. Daher wurde jeder Kochsalzlösungsgruppe willkürlich ein Wert von 100 % für den Vergleich zwischen den Altersgruppen zugewiesen. In den Ontogenese-Studien wurden Proben aller Altersgruppen gemeinsam auf einem einzigen Blot analysiert.
ERGEBNISSE
Die Induktion von ΔFosB nach Kokain und Amphetamin findet nur im Nucleus Accumbens von periadoleszenten Mäusen statt
Die Expression von ΔFosB wurde im Nucleus accumbens und im Striatum von entwöhnten, präadoleszenten und adulten Mäusen nach 7-tägiger Amphetamin- oder Kokainverabreichung gemessen. Der Nucleus accumbens gilt als die für die Vermittlung der belohnenden Wirkung von Psychostimulanzien wichtigste Hirnregion. Die ΔFosB-Immunreaktivität (35 kDa) wurde selektiv im Nucleus accumbens präadoleszenter Tiere nach chronischer Verabreichung von Amphetamin (Abb. 1A ) oder Kokain (Abb. 1B ) induziert. Im Gegensatz dazu waren die ΔFosB-Werte (35 kDa) im Nucleus accumbens entwöhnter oder adulter Tiere nicht signifikant verändert (Abb. 1A , B ) . Im Nucleus caudatus und Putamen waren die ΔFosB-Spiegel (35 kDa) nach chronischer Amphetamingabe nur bei Tieren im Vorpubertätsalter signifikant erhöht (Abb. 2A ) . Alle drei Altersgruppen zeigten nach chronischer Kokaingabe einen signifikanten Anstieg der ΔFosB-Expression (35 kDa) im Nucleus caudatus und Putamen (Abb. 2B ) . Das Ausmaß der Induktion war jedoch bei den Tieren im Vorpubertätsalter am größten, insbesondere im Vergleich zu Jungtieren nach dem Absetzen (Abb. 2B ) . Andere FRA- und Fos-Isoformen blieben in allen Altersgruppen unverändert (Daten nicht gezeigt).
ΔFosB-Immunreaktivität im Nucleus Accumbens nach chronischer Verabreichung von Psychostimulanzien. CD-1-Mäusen wurde einmal am Tag 7 einmal täglich mit Salzlösung, Amphetamin oder Kokain für 24 d injiziert (P24; Nachentwöhnung), Tag 33 (P33; periadolescent) oder Tag 60 (Erwachsenen-). Niveaus der ΔFosB (35 kDa) -Immunreaktivität im Nucleus Accumbens sind nach chronischem Amphetamin (A) oder Kokain (B) Verwaltung. Repräsentative Immunoblots aus Salzlösung (S), Amphetamin- (A) und Kokain- (C) nach dem Entwöhnen injiziert (P24), periadoleszent (P33) und erwachsene Mäuse werden in gezeigt obere Platten. Bodenplatten zeigen den Mittelwert ± SEM-Prozentsatz der Basis-ΔFosB-Expression. n Die Werte für jede Gruppe werden in angezeigt Riegel. Nur bei den periadoleszenten Mäusen wurden signifikante Anstiege von ΔFosB im Nucleus accumbens festgestellt. *p <0.05; ** **.p <0.01 (Schüler t Prüfung; Kochsalzlösung vs. Droge).
ΔFosB-Immunreaktivität im Caudat-Putamen nach chronischer Verabreichung von Psychostimulanzien. CD-1-Mäusen wurde einmal am Tag 7 für 24 d einmal täglich Salzlösung, Amphetamin oder Kokain injiziert (P24; Nachentwöhnung), Tag 33 (P33; periadolescent) oder Tag 60 (Erwachsenen-). Niveaus der ΔFosB (35 kDa) -Immunreaktivität im Caudat-Putamen sind nach chronischem Amphetamin (A) oder Kokain (B) Verwaltung. Repräsentative Immunoblots aus Salzlösung (S), Amphetamin- (A) und Kokain- (Cinjizierte periadoleszente Mäuse (P33) werden in der angezeigtobere Platten. Bodenplatten zeigen den Mittelwert ± SEM-Prozentsatz der Basis-ΔFosB-Expression. n Die Werte für jede Gruppe werden in angezeigt Riegel. Signifikante Amphetamin-induzierte Anstiege der ΔFosB-Immunreaktivität wurden im Caudat-Putamen nur bei periadoleszenten Mäusen festgestellt (A). Die chronische Kokainverabreichung bewirkte in allen drei Altersgruppen einen Anstieg von ΔFosB (B). *p <0.05; ** **.p <0.01 (Schüler t Prüfung; Kochsalzlösung vs. Droge).
DAT- und DARPP-32-Spiegel werden nach chronischem Kokain oder Amphetamin nicht verändert
Mehrere Schlüsselmoleküle, die von dopaminergen und/oder dopaminozeptiven Neuronen exprimiert werden, darunter DARPP-32, der D1- Dopaminrezeptor und DAT, tragen zu akuten und chronischen Reaktionen auf Psychostimulanzien bei ( Moratalla et al., 1996 ; Fienberg et al., 1998 ; Sora et al., 1998 ; Gainetdinov et al., 2001 ). Daten von DARPP-32-, D1 - Rezeptor- und DAT-Null- sowie DAT-Knockdown-Mäusen deuten auf einen komplexen Zusammenhang zwischen deren Konzentrationen, der Regulation der dopaminergen Aktivität und den Reaktionen auf Psychostimulanzien hin. Tatsächlich findet in DARPP-32-Null-Mäusen, die chronisch Kokain erhalten, keine ΔFosB-Induktion statt ( Fienberg et al., 1998 ). Bei adulten Mäusen verändert eine 7-tägige Exposition gegenüber 20 mg/kg Kokain jedoch nicht den Gesamtspiegel von DARPP-32 ( Fienberg et al., 1998 ). Die Regulation des DAT-Proteins wurde bei Mäusen nach chronischer Exposition gegenüber Psychostimulanzien bisher nicht beschrieben, obwohl Veränderungen der Radioligandenbindung an den Dopamintransporter nach Psychostimulanzienexposition bei einigen Spezies berichtet wurden ( Letchworth et al., 2001 ). In der vorliegenden Studie haben wir die Spiegel von DARPP-32 und DAT-Protein gemessen, um zu bestimmen, ob die Expression dieser Proteine nach chronischer Psychostimulanzienverabreichung in den drei untersuchten Altersgruppen verändert ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es nach chronischer Verabreichung von Kokain oder Amphetamin in keiner der drei Altersgruppen zu signifikanten Veränderungen der Gesamtmenge an DARPP-32 oder DAT im gesamten Striatum (Nucleus caudatus und Putamen) oder Nucleus accumbens kam (Tabelle 1 ).
Relative Densitometriewerte für DARPP-32 und DAT in mit Amphetamin und Kokain behandelten P24, P33 und erwachsenen Mäusen im Vergleich zu Kontrollwerten, Salzwerte, willkürlich auf 100% gesetzt.
Die Ausgangswerte von ΔFosB sind entwicklungsmäßig reguliert
Wir untersuchten die Ontogenese von ΔFosB, weil erwachsene Mäuse mit einer gentechnisch erhöhten Expression von ΔFosB im Striatum eine erhöhte Verhaltensreaktion auf Psychostimulanzien zeigen (Kelz et al., 1999). Wir fanden heraus, dass die Grundlinienwerte von ΔFosB bei jüngeren Tieren sowohl im Caudate Putamen als auch im Nucleus Accumbens signifikant niedriger waren als bei Erwachsenen (Abb.3 A). Gehalte an funktionellen Markern des Dopaminsystems, einschließlich DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano et al., 1996) und Dopamin-Rezeptoren (Teicher et al., 1993; Taraziet al., 1999) sind auch entwicklungsmäßig geregelt. Frühere Berichte in CD-1-Mäusen weisen auf einen Peak in striatalem DARPP-32 am Tag nach der Geburt 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). In Ratten caudate putamen und nucleus accumbens, D1Spitzenwert der Rezeptoren von P28 zu P40 (Teicher et al., 1993; Taraziet al., 1999), aber ähnliche Studien wurden nicht an der Maus durchgeführt. Im Gegensatz dazu fanden wir hier heraus, dass die DAT-Proteinspiegel im Caudate Putamen und im Nucleus Accumbens zwischen 24 am Tag nach der Geburt und im Erwachsenenalter konstant waren (Abb. 3 B). Somit sind die relativen Verhältnisse zwischen D1 Rezeptoren, DAT, DARPP-32 und ΔFosB unterscheiden sich zwischen den Altersgruppen, was möglicherweise zu Unterschieden in D führt1 Rezeptoraktivität, die den Induktionsgrad von ΔFosB beeinflussen könnte.
Entwicklungsbedingte Expression von ΔFosB und DAT. A , ΔFosB (35–37 kDa)-Immunreaktivität im Striatum und Nucleus accumbens naiver CD-1-Mäuse in Abhängigkeit vom Alter. Repräsentative Immunoblots sind in den oberen Abbildungen dargestellt . Die unteren Abbildungen zeigen Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von jeweils drei Mäusen pro Gruppe. * p < 0.05, adult vs. P24; # p < 0.05, adult vs. P36 (Tukey-Test nach ANOVA). B , Densitometrische Werte der DAT-Immunreaktivität im Striatum und Nucleus accumbens naiver CD-1-Mäuse in Abhängigkeit vom Alter. Die DAT-Konzentrationen unterschieden sich nicht zwischen den drei Altersgruppen.
DISKUSSION
Die Verhaltenswirkungen von Psychostimulanzien sind altersabhängig. Die Suchtneigung ist in der Adoleszenz am höchsten, da der Konsum illegaler Substanzen in dieser Zeit zunimmt ( Estroff et al., 1989 ; Myers und Anderson, 1991 ). Jüngere Kinder entwickeln häufig Dysphorie nach dem Kontakt mit Psychostimulanzien, während Jugendliche und Erwachsene Euphorie erleben ( Rapoport et al., 1980 ). Studien an Nagetieren deuten darauf hin, dass Tiere im Vorpubertätsalter ein höheres Aktivitätsniveau aufweisen ( Spear und Brake, 1983 ) und im Vergleich zu jüngeren und älteren Tieren verändert auf Psychostimulanzien reagieren. So zeigen sie nach akuter Gabe niedriger Dosen von Psychostimulanzien im Vergleich zu Jungtieren und erwachsenen Tieren eine geringere motorische Aktivität und weniger Neugier, nach hochdosierter Behandlung hingegen eine erhöhte Hyperaktivität. Bei chronischer Verabreichung ist die Sensibilisierung gegenüber kokaininduzierter Lokomotion bei präadoleszenten Ratten im Vergleich zu adulten Tieren stärker ausgeprägt, während die Sensibilisierung gegenüber Stereotypien geringer ist. Mikrodialyse-Daten zeigten zudem Unterschiede zwischen präadoleszenten und adulten Ratten hinsichtlich der Sensibilisierung gegenüber amphetamininduzierter Dopaminfreisetzung ( Laviola et al., 1995 ; Adriani et al., 1998 ; Adriani und Laviola, 2000 ; Laviola et al., 2001 ). Allerdings gibt es widersprüchliche Studien zur Langzeitreaktivität auf Kokain nach Methylphenidat-Gabe bei adoleszenten Ratten ( Brandon et al., 2001 ; Andersen et al., 2002 ). Diese beiden letztgenannten Berichte verdeutlichen die Schwierigkeit, Studien mit unterschiedlichen experimentellen Paradigmen zu vergleichen. Der Versuch, Verhaltensstudien an jüngeren Tieren zu vergleichen, wird zusätzlich durch die Verwendung unterschiedlicher Arten und Stämme erschwert.
Die Maus gewinnt als Tiermodell in der Erforschung des Gebrauchs und Missbrauchs von Psychostimulanzien zunehmend an Bedeutung. Diese Studie ist die erste systematische Analyse molekularer neuroadaptiver Reaktionen in drei verschiedenen Entwicklungsstadien bei der Maus oder überhaupt bei einer einzelnen Spezies. Frühere Studien, auf denen unsere Behandlungsparadigmen basieren, zeigten einen Anstieg von ΔFosB im isolierten dorsalen und ventralen Striatum adulter Wildtyp-Ratten nach chronischer Kokain- und Amphetamingabe ( Hope et al., 1994 ; Nye et al., 1995 ; Turgeon et al., 1997 ), jedoch nur im kombinierten dorsalen und ventralen Striatum oder im isolierten dorsalen Striatum adulter Wildtyp-Mäuse nach chronischer Kokaingabe ( Fienberg et al., 1998 ; Zachariou et al., 2001 ).
Wir zeigen nun einen räumlichen und quantitativen Unterschied in der durch Psychostimulanzien induzierten ΔFosB-Expression bei entwöhnten, präadoleszenten und adulten Mäusen. Die Beobachtung einer verstärkten Reaktion bei den präadoleszenten Tieren im Vergleich zu adulten und entwöhnten Tieren wird durch die Tatsache untermauert, dass die Reaktion bei mit Kokain und Amphetamin behandelten Mäusen ähnlich ist. Die Psychostimulanzien Kokain und Amphetamin erhöhen beide den synaptischen Dopaminspiegel sowie den Serotonin- und Noradrenalinspiegel, jedoch über unterschiedliche Mechanismen. Kokain bindet an die Plasmamembran-Transporter für Dopamin, Serotonin und Noradrenalin und hemmt deren Wiederaufnahme in präsynaptische Endigungen. Im Gegensatz dazu fördert Amphetamin die Freisetzung dieser Neurotransmitter. Die selektive Induktion von ΔFosB im Nucleus accumbens ausschließlich in der periadoleszenten Altersgruppe nach 7-tägiger Stimulanzienverabreichung und die relativ erhöhte Induktion von ΔFosB im Striatum könnten eine neurobiologische Repräsentation oder Ursache der zuvor beobachteten erhöhten Neigung zum Psychostimulanzienmissbrauch in dieser Altersgruppe ( Estroff et al., 1989 ; Myers und Anderson, 1991 ) sowie anderer langfristiger Veränderungen der Genexpression sein, die sich zwischen den Altersgruppen unterscheiden ( Andersen et al., 2002 ). Darüber hinaus könnten diese Unterschiede intrinsisch durch entwicklungsbedingte Veränderungen der Konzentrationen wichtiger Moleküle, einschließlich ΔFosB selbst, reguliert werden. Die potenziellen Auswirkungen von Unterschieden in den basalen ΔFosB-Konzentrationen zwischen den Altersgruppen sind analog zu den vorgeschlagenen Unterschieden zwischen Rattenstämmen ( Haile et al., 2001 ). Tatsächlich gehen wir davon aus, dass ähnliche Stammunterschiede auch bei Inzuchtmäusen gefunden werden. Es ist auch möglich, dass Mäuse unterschiedlichen Alters in anderen Hirnregionen als dem Nucleus accumbens unterschiedliche molekulare Anpassungen aufweisen. Zusätzliche Analysen mit periadoleszenten Mäusen, bei denen genetisch veränderte Konzentrationen wichtiger Moleküle vorliegen, sowie begleitende Verhaltensbeobachtungen werden diese Hypothesen weiter überprüfen.
Fußnoten
- Empfangene April 8, 2002.
- Revision erhalten 6. August 2002.
- Akzeptierte 8. August 2002.
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Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für Gesundheit / Nationales Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall NS41871 (MEE und EMU) und dem Nationalen Institut für Drogenmissbrauch P30-DA13429 (EMU) unterstützt.
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Korrespondenz richten Sie bitte an Dr. Michelle E. Ehrlich, Thomas Jefferson University, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. E-Mail: [email protected].
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