Präfrontaler kortikaler Kreislauf für depressions- und angstbezogenes Verhalten, vermittelt durch Cholecystokinin: Rolle von ΔFosB (2014)

J Neurosci. 2014 Mar 12; 34 (11): 3878 – 3887.
doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1787-13.2014

PMCID: PMC3951691

Vincent Vialou,^1,^6,^7,⁸ Rosmarin C. Bagot,¹ Michael E. Cahill,¹ Deveroux Ferguson,¹ Alfred J. Robinson,² David M. Dietz,³ Barbara Fallon,² Michelle Mazei-Robison,² Stacy M. Ku,¹ Eileen Harrigan,¹ Catherine A. Winstanley,⁴ Tej Joshi,¹ Jian Feng,¹ Olivier Berton,⁵ und Eric J. Nestler¹

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Abstrakt

Eine verminderte neuronale Aktivität des medialen präfrontalen Kortex (mPFC) ist mit sozialer, durch Niederlagen hervorgerufenen depressions- und angstähnlichen Verhaltensweisen bei Mäusen verbunden. Die molekularen Mechanismen, die der verminderten mPFC-Aktivität und ihrer Rolle als Prodepressiva zugrunde liegen, bleiben jedoch unbekannt. Wir zeigen hier, dass die Induktion des Transkriptionsfaktors ΔFosB in mPFC, insbesondere im Bereich der Prelimbik (PrL), die Anfälligkeit für Stress vermittelt. Die Induktion von ΔFosB in PrL erfolgte selektiv in anfälligen Mäusen nach chronischem sozialem Niederlagenstress und Überexpression von ΔFosB in dieser Region, jedoch nicht im nahegelegenen infralimbischen (IL) -Bereich, was die Anfälligkeit für Stress erhöhte. ΔFosB erzeugte diese Effekte teilweise durch Induktion des Cholecystokinin (CCK) -B-Rezeptors: Die Blockade von CCKB in mPFC induziert einen widerstandsfähigen Phänotyp, während die CCK-Verabreichung in mPFC die anxiogenetischen und depressiv wirkenden Wirkungen von sozialem Stress nachahmt. Wir haben zuvor herausgefunden, dass die optogenetische Stimulation von mPFC-Neuronen in anfälligen Mäusen mehrere Verhaltensauffälligkeiten umkehrt, die nach chronischem Stress bei sozialer Niederlage beobachtet werden. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass eine optogenetische Stimulation kortikaler Projektionen die pathologischen Auswirkungen von CCK in mPFC retten würde. Nach der CCK-Infusion in mPFC stimulierten wir die mPFC-Projektionen auf basolaterale Amygdala oder den Nucleus accumbens, zwei subkortikale Strukturen, die an der Stimmungsregulation beteiligt sind, optogenetisch. Die Stimulierung der Corticoamygdala-Projektionen blockierte die anxiogene Wirkung von CCK, obwohl bei anderen Symptomen der sozialen Niederlage keine Wirkung beobachtet wurde. Umgekehrt kehrte die Stimulation der Corticoaccumbens-Projektionen die CCK-induzierte soziale Vermeidung und Präferenzdefizite der Saccharose um, jedoch nicht die Angstzustände. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass sozialstressinduzierte Verhaltensdefizite teilweise durch molekulare Anpassungen in mPFC mit ΔFosB und CCK durch kortikale Projektionen an verschiedene subkortikale Ziele vermittelt werdens.

Stichwort: Accumbens, Amygdala, Angstzustände, CCK, Depression, MPFC

Einleitung

Einige anatomisch und funktionell miteinander verbundene limbische Hirnregionen, einschließlich des medialen präfrontalen Kortex (mPFC), Hippocampus, Amygdala und Nucleus accumbens (NAc), sind an der Vermittlung der wichtigsten Symptome von Depression und Angst (Bremner, 1999; Drevets, 2001; Keedwell et al., 2005; Mayberg et al., 2005; Bremner, 2006, 2007; Krishnan und Nestler, 2008; Feder et al., 2009). Zum Beispiel korreliert das Fehlen kortikaler Rückwirkungen auf Amygdala mit dysphorischen Emotionen und fällt nach erfolgreicher Behandlung wieder auf normale Werte zurück. Die antidepressiven Wirkungen der tiefen Hirnstimulation des subgenualen cingulären Cortex, einem Bereich von mPFC, stehen mit der Wiederherstellung sowohl der kortikalen als auch der subkortikalen Hirnaktivität auf einem normalen Niveau (Mayberg et al., 2005; Nahas et al., 2010). In ähnlicher Weise ist die tiefe Hirnstimulation von NAc antidepressiv und anxiolytisch und korreliert mit einem veränderten Stoffwechsel in NAc, Amygdala und mPFC (Schlaepfer et al., 2008; Bewernick et al., 2010; Grubert et al., 2011). Diese Daten stützen eine neuronale Netzwerkhypothese von Stimmungsstörungen, bei der antidepressive Behandlungen unabhängig von den Mechanismen die Aktivität sowohl in unteraktiven kortikalen als auch in überaktiven subkortikalen Kreisläufen normalisieren (Kennedy et al., 2001; Mayberg et al., 2005; Kennedy und Giacobbe, 2007; Fales et al., 2008; Fales et al., 2009; Leistedt und Linkowski, 2013).

Tiermodelle mit chronischer Exposition gegenüber physischem oder psychischem Stress beeinträchtigen die Struktur und Funktion von Neuronen in mPFC (Radley et al., 2006), Amygdala (Akirav und Maroun, 2007), Hippocampus (Surget et al., 2011) und NAc (Vialou et al., 2010; Christoffel et al., 2011). Chronischer sozialer Niederlagenstress, ein ethologisch gültiges Depressionsmodell (Berton et al., 2006), verringert die neuronale Aktivität von mPFC, wie aus der reduzierten Expression von Zif268 und c-Fos (Covington et al., 2005; Covington et al., 2010). Darüber hinaus kehrt die optogenetische Stimulation von mPFC diese Defizite um und bewirkt antidepressive Wirkungen (Covington et al., 2010), was die Bedeutung von mPFC in stimmungsbezogenen Phänomenen bestätigt. TWie bei Primaten kontrolliert das Nager-mPFC das emotionale Verhalten teilweise durch Projektionen auf basolaterale Amygdala (BLA) und NAc (Vogt et al., 1992; Barbas und Blatt, 1995; Heidbreder und Groenewegen, 2003). Trotzdem sind die molekularen Mechanismen, die diese Rolle von mPFC vermitteln, unbekannt.

Die vorliegende Studie konzentrierte sich anfangs auf ΔFosB, einen stabilen Transkriptionsfaktor, der durch chronischen Stress bei sozialer Niederlage in NAc induziert wird, wo er gegen Stressanfälligkeit wirkt (Vialou et al., 2010). Wir führten eine hirnweite Kartierung der ΔFosB-Induktion nach Besiegungsstress durch und fanden ähnlich wie in früheren Studien (Perrottiet al., 2004; Nikulina et al., 2008; Lehmann und Herkenham, 2011), robuste Induktion in mPFC. Überraschenderweise haben wir herausgefunden, dass eine solche ΔFosB-Induktion in mPFC die Stressanfälligkeit fördert. Wir identifizierten den Cholecystokinin (CCK) -B-Rezeptor als molekulares Ziel von ΔFosB in mPFC, wobei CCKergic-Neurotransmission sowohl mit anxiogenen als auch mit depressiven Wirkungen von sozialem Stress in Verbindung gebracht wurde (Becker et al., 2001, 2008). Wir haben herausgefunden, dass die CCK-Aktivität in mPFC sowohl notwendig als auch ausreichend ist für die angst- und depressionsähnlichen Auswirkungen von sozialem Stress. Darüber hinaus zeigen wir mithilfe optogenetischer Ansätze spezifische Wirkungen von CCK in mPFC-Subcircuits: CCK in mPFC-BLA-Projektionen vermittelt Angstsymptome, während CCK in mPFC-NAc-Projektionen Depressionssymptome vermittelt.

Materialen und Methoden

Experiment 1: Gehirnweite Kartierung der ΔFosB-Induktion durch chronischen sozialen Niederlagenstress.

Acht Wochen alte männliche C57BL / 6J-Mäuse wurden, wie zuvor beschrieben, an aufeinander folgenden Tagen 10 einem chronischen Stress bei der sozialen Niederlage ausgesetzt (Berton et al., 2006; Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010) (sehen Tabelle 1; Abb.. 1A). Kurz gesagt, jede Maus wurde für 1 min pro Tag einer unbekannten, aggressiven männlichen CD5-Züchtermaus ausgesetzt. Nach direkter Interaktion mit dem CD1-Aggressor (5 min) wurden die Tiere für den nächsten 24 h in einem benachbarten Abteil desselben Käfigs mit sensorischem, jedoch nicht körperlichem Kontakt untergebracht. Kontrolltiere wurden in äquivalenten Käfigen gehalten, jedoch mit Mitgliedern derselben Sorte. Soziale Interaktionstests wurden 24 h nach dem letzten Tag der Niederlage durchgeführt. Die soziale Vermeidung einer unbekannten männlichen CD1-Maus wurde nach veröffentlichten Protokollen beurteilt. Die in der "Interaktionszone" (einem 8-Zentimeter breiten Korridor, der den Käfig umgibt) verbrachte Zeit wurde gemessen. Die Trennung von besiegten Mäusen in anfällige und elastische Subpopulationen wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010). Da die Mehrheit der Kontrollmäuse mehr Zeit mit der Interaktion mit einem sozialen Ziel verbringt als mit einem leeren Zielgehäuse, wird ein Interaktionsverhältnis von 100 (gleiche Zeit, die in der Interaktionszone in Gegenwart oder Abwesenheit eines sozialen Ziels verbracht wird) als Grenzwert verwendet: Mäuse mit Werten <100 werden als "anfällig" und Mäuse mit Werten ≥ 100 als "belastbar" gekennzeichnet. Umfangreiche verhaltensbezogene, biochemische und elektrophysiologische Analysen stützen die Gültigkeit dieser unterschiedlichen anfälligen und belastbaren Subpopulationen (Krishnan et al., 2007; Wilkinson et al., 2009; Vialou et al., 2010).

Mittlere Anzahl (± SEM) von FosB-immunreaktiven Kernen pro mm² In Gehirnregionen von kontrollierten, anfälligen und widerstandsfähigen Mäusen 24 h nach chronischem (10 d) sozialer Niederlage-Stress

Abbildung 1.

Die Induktion von ΔFosB in mPFC fördert die Anfälligkeit für Stress. A, Repräsentative Mikrofotografien der ΔFosB-Immunhistochemie in mPFC 24 h nach der letzten 10-Serie für soziale Niederlagen. BInduktion von ΔFosB tritt bei GABAergic nicht auf ...

Gleich nach dem Test der sozialen Interaktion wurden Mäuse anästhesiert und intrakardial mit 4% Paraformaldehyd / PBS perfundiert. Zellzahlen für ΔFosB⁺ Neuronen in NAc wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Vialou et al., 2010). Die Gehirne wurden mit 30% Saccharose kryoprotektiert und die Koronalschnitte (30 & mgr; m) wurden auf einem Gefriermikrotom geschnitten und für die Immunhistochemie verarbeitet. Freischwimmende Abschnitte wurden in einem Blockierungspuffer mit 0.3% Triton und 3% normalem Ziegenserum vorinkubiert. ΔFosB wurde mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern nachgewiesen, die gegen den N-terminalen Teil des Proteins (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology, Katalog # sc-48) im gleichen Puffer gezüchtet und dann mit biotinylierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern und Avidin-Biotin verarbeitet wurden Peroxidase-Komplex-Methode mit DAB als Substrat (Vector Laboratories). Die Inkubationszeiten von Diaminobenzidin wurden für alle Bedingungen konstant gehalten (100). Scheiben wurden montiert, entwässert und mit Deckglas bedeckt. ΔFosB-immunopositive Zellen zeigten eine spezifische Braunfärbung im Zellkern und wurden durch einen Beobachter quantifiziert, der gegenüber den Behandlungsbedingungen mit einem Mikroskop blind war (20-Vergrößerung). Zur Quantifizierung wurden pro Maus drei ausgewählte Gehirnabschnitte ausgewählt, die jeden Gehirnbereich überspannten. Die anatomische Segregation jeder Hirnregion wurde durchgeführt, indem der Schnitt mit dem Paxinos-Maushirnatlas verglichen wurde. Die Bedingungen für die Immunhistochemie wurden optimiert, um die Hintergrundkonzentration auf ein Minimum zu reduzieren, wodurch die korrekte Identifizierung von ΔFosB-positiven Zellen ermöglicht wird. Die Durchschnittswerte wurden für jedes Tier berechnet und als individuelle Beobachtung für die statistische Analyse betrachtet. Obwohl der verwendete Antikörper sowohl ΔFosB als auch FosB voller Länge erkennt, wissen wir durch Western Blotting, dass unter den untersuchten Bedingungen nur ΔFosB nachweisbar ist (Perrottiet al., 2004; Vialou et al., 2010).

Experiment 2: Identifizierung des durch sozialen Stress induzierten neuronalen ΔFosB-Phänotyps in mPFC.

Um die Expression von ΔFosB in kortikalen GABAergen Neuronen zu untersuchen, verwendeten wir Gewebe von GAD2-tdTomato-Mäusen, die chronischem Stress bei der sozialen Besiedlung ausgesetzt waren, und färbten wie oben beschrieben auf ΔFosB (vgl Abb.. 1B). Mäuse wurden durch Züchten von Knockin-GAD2-Cre-Mäusen erzeugt (Gad2tm2 (cre) Zjh / J; JAX-Bestellnummer 010802) (Taniguchi et al., 2011) mit (B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze / J; JAX-Bestellnummer 007908), die floxed-stop-kontrollierte tdTomato (RFP-Variante) tragen.

Experiment 3: Verhaltenseffekte von ΔFosB-Überexpression in der Prelimbik (PrL) und der Infralimbik (IL) -Kortex.

Stereotaktische Operationen wurden an erwachsenen männlichen Mäusen (8-Wochen) durchgeführt, um HSV-ΔFosB-GFP oder HSV-GFP in die PrL- oder IL-Regionen von mPFC zu injizieren. Kurz gesagt, Mäuse wurden unter Verwendung einer Mischung aus Ketamin (10 mg / kg) und Xylazin (1 mg / kg) anästhesiert, und die folgenden stereotaktischen Koordinaten wurden für die Virusabgabe für PrL verwendet: 1.8 mm (anterior / posterior), 0.65 mm (lateral) ), -2.2 mm (dorsal / ventral); und für IL: 1.9 mm (anterior / posterior), 0.75 mm (lateral), -2.8 mm (dorsal / ventral) in einem Winkel von 10 ° zur Mittellinie (relativ zu Bregma). Insgesamt wurden 0.5 μl gereinigtes Virus über einen Zeitraum von 5 min (0.1 μl / min) bilateral verabreicht, gefolgt von einer Pause von 5 min. Virale Injektionsstellen wurden mit histologischen Standardmethoden bestätigt (siehe Abb.. 1C). Obwohl es nicht möglich ist, PrL gegen IL in Mäusen mit perfekter Genauigkeit gezielt anzugreifen, sind die Daten in Figure 1C veranschaulichen, dass es sehr gut möglich ist, die eine oder andere Region vorwiegend anzuvisieren. In der Tat belegen die unterschiedlichen Verhaltenseffekte, die sich aus der gezielten Ausrichtung der beiden Regionen (siehe Ergebnisse) ergeben, diesen Ansatz. Die erste Gruppe von Mäusen wurde ausschließlich in einem submaximalen Versagen der sozialen Niederlage verwendet (siehe Abb.. 1D). Drei Tage nach der Operation wurden die Mäuse am selben Tag zwei aufeinanderfolgenden Niederlagen ausgesetzt und anschließend auf soziale Interaktion 24 h getestet. Dieses submaximale Niederlagenverfahren wurde zuvor validiert, um Prosuszeptibilitätsphänotypen nach genetischen Manipulationen aufzudecken (Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010).

Eine zweite Charge von Mäusen wurde verwendet, um basale Angstzustände und depressive Verhaltensweisen zu testen (siehe Abb.. 1E – J). Einen Tag nach der Operation wurden Mäuse mit einer 1% (w / v) Sucroselösung gewöhnt. Am folgenden Tag konnten die Mäuse zwischen einer Wasserflasche und einer täglich gewechselten 1-Lösung mit Sucrose-Lösung wählen. Die Saccharoselösung wurde für 24 h am vierten und fünften Tag nach der Operation gemessen und als Prozentsatz der gesamten aufgenommenen Flüssigkeitsmenge ausgedrückt. Die Mäuse wurden im Freiland (Tag 3), erhöhtem Labyrinth (Tag 4), sozialer Interaktion (Tag 5 am Morgen) und erzwungener Schwimmen (Tag 5 Nachmittag) getestet, basierend auf veröffentlichten Protokollen (Vialou et al., 2010). Wir haben festgestellt, dass bei dieser Testreihenfolge die Ergebnisse der nachfolgenden Tests nicht von den vorherigen beeinflusst werden (Krishnan et al., 2007). Die Aktivität von Mäusen im offenen Feld wurde für 5 min unter Verwendung eines Videoaufzeichnungssystems (Ethovision) unter Rotlichtbedingungen aufgezeichnet. Das erhöhte Plus-Labyrinth bestand aus zwei geraden, sich kreuzenden Landebahnen, die 60 cm über dem Boden positioniert und in zwei offene und zwei geschlossene Arme unterteilt waren. Die Mäuse wurden einzeln in die Mitte des Labyrinths gestellt und konnten jeden Arm für einen Zeitraum von 5 min frei erforschen. In den Freiland- und erhöhten Labyrinth-Tests wurde die Zeit, die in den mittleren und offenen Armen verbracht wurde, als inverser Index angstbedingter Reaktionen verwendet. Ein eintägiger erzwungener Schwimmtest wurde für einen Zeitraum von 5 min durchgeführt. Die erhöhte Zeit der Immobilität während des erzwungenen Schwimmtests wurde als prodekompressionsähnliches Verhalten interpretiert. Dieser 1-Tagestest wurde bei Mäusen ausgiebig verwendet und als Maß für die Vorhersagekraft validiert, indem Antidepressiva die Immobilitätszeiten reduzieren.

Schließlich wurde einer separaten Gruppe von Mäusen HSV-ΔFosB intra-mOFC injiziert und auf soziale Interaktion nach einer submaximalen Niederlage getestet (siehe Abb.. 1K).

HSV-Vektoren wurden von Rachael Neve (Massachusetts Institute of Technology) erhalten. Die Gene von Interesse (ΔFosB und GFP) stehen unter einem CMV-Promotor. Diese Vektoren wurden in früheren Publikationen umfassend validiert (z. B. Maze et al., 2010).

Experiment 4: Auswirkungen von chronischem sozialem Stress auf die CCKB-Rezeptor-Spiegel in mPFC.

Bei 24 h nach dem Test der sozialen Interaktion wurden die Gehirne schnell entfernt und seriell in Scheiben geschnitten, und mPFC wurde schnell auf Trockeneis zerlegt und eingefroren (siehe Abb.. 2A,B). RNA-Isolierung, qPCR und Datenanalyse wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Maze et al., 2010; Vialou et al., 2010). RNA wurde mit TriZol-Reagenz (Invitrogen) isoliert und mit RNAeasy-Mikro-Kits von QIAGEN weiter gereinigt. Für alle RNA-Proben wurden 260 / 280- und 260 / 230-Werte ≥1.8 ermittelt. Die umgekehrte Transkription wurde unter Verwendung von iScript (Bio-Rad) durchgeführt. qPCR unter Verwendung von SYBR Green (Quanta) wurde mit einem Applied Biosystems 7900HT RT-PCR-System mit folgenden Zyklusparametern durchgeführt: 2 min bei 95 ° C; 40-Zyklen von 95 ° C für 15s, 59 ° C für 30s und 72 ° C für 33s; und abgestuftes Erhitzen auf 95 ° C, um Dissoziationskurven zur Bestätigung einzelner PCR-Produkte zu erzeugen. Die Daten wurden durch Vergleich von C analysiert_t Werte der Behandlungsbedingung (empfindlich oder elastisch gegenüber Kontrollmäusen oder HSV-ΔFosB gegenüber HSV-GFP) mit dem ΔΔC_t Methode (Tsankova et al., 2006). qPCR-Primer sind wie folgt: ΔFosB, Vorwärts, AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT und Rückwärts, GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG; CCKB, vorwärts, ACCCTTTATGCGGTGATCTTTC und umgekehrt, ATGAGCACGTTCCGCCAA; CCK, Forward, AGCGCGATACATCCAGCAG und Reverse, ACGATGGGTATTCGTAGTCCTC; GAPDH, vorwärts, AGGTCGGTGTGAACGGATTTG und umgekehrt, TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA.

Abbildung 2.

Die Blockade des CCKB-Rezeptors hat eine antidepressive Wirkung. ASoziale Niederlage senkt die CCKB-Rezeptor-Spiegel in mPFC nur bei widerstandsfähigen Mäusen (n = 8-10). *p <0.05 im Vergleich zur Kontrolle (Einweg-ANOVA). ** **.p <0.05 ...

Experiment 5: Auswirkungen von ΔFosB auf den CCKB-Rezeptor- und cFos-Spiegel.

In Mäuse wurde HSV-ΔFosB intra-PrL injiziert. Bei 72 h nach dem Eingriff wurden die Injektionsstellen zum Höhepunkt der viralen Überexpression unter einem Fluoreszenzmikroskop (siehe Abb.. 2C). RNA-Isolierung, qPCR und Datenanalyse wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die qPCR-Primer lauten wie folgt: c-fos, forward, AATCCGAAGGGAACGGAATAAGA und reverse, TGCAACGCAGACTTCTCATCT.

Experiment 6: Auswirkungen der ΔFosB-Blockade auf durch Stress induzierte CCKB-Rezeptor-Spiegel und Resilienz.

Erwachsene Mäuse wurden bilateral HSV-GFP oder HSV-ΔJunD in PrL injiziert (vgl Abb.. 2D-F). ΔJunD ist eine N-terminale verkürzte Mutante von JunD, die als dominant-negativer Antagonist von ΔFosB wirkt. Mäuse wurden zweimal täglich für 5 einer sozialen Niederlage ausgesetzt. D. Dieses beschleunigte Protokoll der sozialen Niederlage, das verkürzt wurde, um mit dem Zeitraum maximaler HSV-Transgenexpression übereinzustimmen, wurde zuvor verwendet und zeigt, dass maximale soziale Vermeidungsgrade induziert werden (Covington et al., 2011). 24 h nach der letzten Stress-Episode wurden Mäuse ohne Anästhesie enthauptet, um Auswirkungen von Anästhetika auf die neuronalen Proteinspiegel zu vermeiden. Infiziertes Gewebe wurde in PBS-haltigen Protease- (Roche) und Phosphatase- (Sigma-Aldrich) -Inhibitoren unter Verwendung eines 15-Gauge-Stempels entfernt und sofort auf Trockeneis eingefroren. Die Proben wurden durch Ultraschallbehandlung in modifiziertem RIPA-Puffer homogenisiert: 10 mm Tris-Base, 150 mm Natriumchlorid, 1 mm EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1% Natriumdesoxycholat, pH 7.4 sowie Protease- und Phosphatase-Inhibitoren als über. Nach Zugabe von Laemmlis Puffer wurden die Proteine auf 4–15% Polyacrylamaid-Gradientengelen (Criterion System; Bio-Rad) aufgetrennt und das Western Blot unter Verwendung des Odyssey-Systems (Li-Cor) gemäß den Protokollen des Herstellers durchgeführt. Die Membranen wurden mit CCKB-Rezeptor-Antikörper (1/1000, Acris, Katalog # AP01421PU-N) geblottet. Einer anderen Gruppe von Mäusen wurde AAV-ΔJunD oder AAV-GFP in PrL injiziert, und dann wurden die Mäuse 5 Wochen nach der Operation dem submaximalen Niederlageprotokoll unterzogen, um eine maximale Transgenexpression zu ermöglichen. Sie wurden 24 h nach der letzten Niederlage auf soziale Interaktion getestet.

Experiment 7: Auswirkungen von Intra-mPFC CI-988, einem CCKB-Antagonisten, auf durch soziale Belastung hervorgerufene soziale Vermeidung und Anhedonie.

Bilaterale Kanülen (1.0 mm Kanüle zu Kanülenabstand, 1.8 mm anterior, Injektor - 2.2 mm dorsal / ventral), die auf mPFC gerichtet waren, wurden in anfällige Mäuse implantiert (siehe Abb.. 2G,H). Eine Woche nach der Operation wurde 10 ng von CI-988 direkt in mPFC infundiert und zielte hauptsächlich auf PrL ab. Die Mäuse wurden dann auf ihr soziales Interaktionsverhalten getestet. Die Saccharosepräferenz wurde für die verbleibenden 24h gemessen. CI-988 (Tocris Bioscience) wurde in Salzlösung gelöst, aliquotiert und eingefroren. Die Endverdünnung wurde am Tag des Experiments hergestellt. Ein weiteres Experiment wurde an empfindlichen Mäusen mit intraperitonealem (988 mg / kg) CI-2 30 min vor dem Test der sozialen Interaktion durchgeführt.

Experiment 8: Auswirkungen von CCKB-Agonisten auf die Anfälligkeit für sozialen Stress und die Umkehrung durch optogenetische Stimulation von mPFC-Projektionen für BLA oder NAc.

AAV-CaMKII-ChR2-EYFP oder AAV-CaMKII-EYFP wurde in die rechte mPFC injiziert, die wiederum hauptsächlich auf PrL abzielte (vgl Abb.. 3A – G). Fünf Wochen später wurden optische Fasern in rechten NAc (1.4 anterior / posterior, 2.6 lateral, -4.7 dorsal / ventral unter einem Winkel von 25 ° zur Mittellinie) oder BLA (-1.6 anterior / posterior, 3.1 lateral, -4.7 dorsal implantiert / ventral ohne Winkel von der Mittellinie). Während desselben chirurgischen Verfahrens wurden bilaterale Kanülen in mPFC implantiert (siehe oben). Kanülen und Fasern wurden mit Dentalzement am Schädel befestigt. Den Mäusen wurde dann erlaubt, sich 1-Woche vor Beginn der Verhaltensexperimente zu erholen. Die Mäuse wurden einer submaximalen Niederlage ausgesetzt, dann 24 h später auf soziale Interaktion getestet, direkt gefolgt von erhöhtem Labyrinth und Saccharosepräferenz für die verbleibenden 24 h. Bei 30 min vor dem Test der sozialen Interaktion wurde die Hälfte der Mäuse mit CCK-8 (10 ng) in mPFC infundiert, während die andere Hälfte Vehikel (Salzlösung) erhielt. Mäuse wurden paarweise getestet (eine Vehikel- und eine CCK-8-behandelte Maus mit AAV-GFP oder AAV-ChR2). CCK-8 (Sigma) wurde in Salzlösung gelöst, aliquotiert und eingefroren. Die Endverdünnung wurde am Tag des Experiments hergestellt.

Abbildung 3.

Die durch CCK-8 induzierte Stressanfälligkeit hängt von bestimmten kortikalen Projektionen ab. ABei 24 h nach submaximaler sozialer Niederlage und 30 min nach der CCK-8-Infusion wurden die mPFC-Projektionsregionen während eines Tests auf soziale Interaktion mit dem Laser stimuliert. CCK-8-Infusion ...

Optische Stimulationen wurden gemäß veröffentlichten Protokollen durchgeführt (Covington et al., 2010). Optische Fasern (Thor Laboratories) wurden chronisch implantiert und über einen FC / PC-Adapter an eine blaue 473-Laserdiode (Crystal Laser, BCL-473-050-M) angeschlossen. Ein Stimulator (Agilent, #33220A) wurde verwendet, um blaue Lichtimpulse zu erzeugen. Während aller Stimulationen wurden 40-ms-Bursts mit 100-Hz-Blaulichtimpulsen (9.9-ms-Spike-Breite) alle 3s an Endregionen in BLA oder NAc nur während der Dauer des sozialen Interaktionstests abgegeben, um ein bordähnliches Muster von kortikalen Strukturen zu imitieren Aktivität. Die Intensität des Lichtleiters wurde vor jeder Verwendung unter Verwendung eines Lichtsensors (Thor Laboratories, S130A) überprüft, und die Lichtintensität betrug ∼15 mW. Dieses Stimulationsprotokoll wurde zuvor elektrophysiologisch validiert (Covington et al., 2010), induzierte keine Anfälle, die auf Verhaltensbeobachtungen und dem Fehlen einer c-Fos-Expression außerhalb von optogenetisch stimulierten Regionen (Covington et al., 2010).

Experiment 9: Wirkungen des CCKB-Agonisten auf die neuronale mPFC-Aktivität, gemessen durch c-Fos-mRNA-Spiegel.

Bilaterale Kanülen wurden an erwachsenen Mäusen implantiert, die auf die mPFC zielen (siehe Abb.. 3H). Nach einer Woche Ruhe wurden die Mäuse submaximal besiegt und später mit CCK-8 24 infundiert. mPFC-Stempel wurden 30 min nach der Medikamenteninfusion entnommen und die Proben für die mRNA-Analyse wie oben beschrieben vorbereitet.

Tierhaltung

Acht Wochen alte männliche C57BL / 6J-Mäuse (The Jackson Laboratory) wurden verwendet. Alle Mäuse wurden mindestens eine Woche lang vor der experimentellen Manipulation an die Tiereinrichtung gewöhnt und bei 1-C-23-C in einem 25-Hell / Dunkel-Zyklus (Lichter an 12: 7 AM) mit gehalten ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Society for Neuroscience und des Institutional Animal Care and Use Committees der Icahn School of Medicine am Mount Sinai durchgeführt.

Statistische Analysen.

Die angezeigten Daten werden als Mittelwert ± SEM (als Fehlerbalken dargestellt) ausgedrückt. Einweg-ANOVAs wurden verwendet, um die Mittelwerte zwischen Kontroll-, anfälligen und belastbaren Mäusen in immunhistochemischen, biochemischen und Verhaltensanalysen zu vergleichen. Einweg-ANOVAs wurden verwendet, um die Mittelwerte zwischen GFP-Kontrollen und ΔFosB-Überexpression in PrL oder IL im Freiland-, erhöhten plus Labyrinth-, erzwungenen Schwimmen- und Saccharose-Präferenztest zu vergleichen. Zwei-Wege-ANOVAs wurden verwendet, um die Mittelwerte zwischen GFP-Kontrollen, ΔFosB-PrL und ΔFosB-IL im Test der sozialen Interaktion zu vergleichen. Zwei-Wege-ANOVAs wurden verwendet, um CCK-8-Effekte mit oder ohne optogenetische Stimulation in allen Verhaltensexperimenten sowie den Einfluss von ΔFosB-Überexpression oder CI-988-Infusion auf die soziale Vermeidung zu vergleichen. Wenn angemessen, Post-hoc- Analysen wurden mit einem Bonferroni durchgeführt Post-hoc- Prüfung. Studenten t Tests wurden verwendet, um die Mittel für die Wirkung von CI-988-Infusion auf Saccharose-Präferenz- und erzwungene Schwimmtests sowie von CCK-8-Tests zu vergleichen c-Fos mRNA-Spiegel. Unterschiede zwischen den experimentellen Bedingungen wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn p ≤ 0.05.

Die Ergebnisse

Gehirnweite Kartierung der ΔFosB-Induktion durch chronischen sozialen Niederlagenstress

Wir untersuchten zunächst die Induktion von ΔFosB durch Immunhistochemie in kontrollierten, anfälligen und widerstandsfähigen Mäusen nach einem Verlauf chronischen (10 d) sozialen Überlastungsstresses, wobei der Schwerpunkt auf den Regionen des Vorderhirns und des Mittelhirns lag, die zuvor in Stressreaktionen involviert waren. Die Tiere wurden 24 h nach der letzten Niederlage-Episode analysiert. Chronischer sozialer Stress induziert ΔFosB in zahlreichen Hirnarealen mit unterschiedlichen Mustern zwischen widerstandsfähigen und anfälligen Mäusen. Wie gezeigt in Tabelle 1 und Figure 1AIL, BLA, gezahnter Gyrus von Hippocampus, dorsalem Striatum und NAc-Kern zeigten bevorzugte Aktivierung in elastischen Mäusen; Diese Ergebnisse in NAc stimmen mit den veröffentlichten Ergebnissen überein (Vialou et al., 2010). In auffallendem Gegensatz dazu zeigten anfällige Mäuse eine stärkere Induktion in PrL, im lateralen Septum und im Bettkern der Stria terminalis. Mehrere Hirnregionen zeigten eine vergleichbare ΔFosB-Induktion in anfälligen und belastbaren Mäusen. Dazu gehörten der orbitofrontale Kortex (OFC, ein weiteres Gebiet der PFC), die NAc-Schale, das dorsale Raphé und das periaqueducale Grau (PAG).

Um den neuronalen Subtyp zu identifizieren, der eine ΔFosB-Induktion in kortikalen Regionen zeigt, wurden GAD2-tdTomato-Mäuse chronischem Stress bei der sozialen Besiedlung ausgesetzt. Die ΔFosB-Immunreaktivität in anfälligen Mäusen war in GABAergen Neuronen nicht nachweisbar (Abb.. 1B), was frühere Ergebnisse der spezifischen Induktion von ΔFosB in kortikalen pyramidalen Neuronen nach anderen Formen chronischer Belastung bestätigt (Perrottiet al., 2004). In unbesiegten Kontrollmäusen Die Basis-ΔFosB-Spiegel in allen Gehirnregionen waren ähnlich wie in früheren Studien berichtet (Perrottiet al., 2004, 2008) mit viel höheren Basalwerten im NAc- und Dorsalstriatum im Vergleich zu allen anderen Regionen, mit der Ausnahme von Gyrus dentatus, die vergleichbare Werte wie in Striatalbereichen aufwies (Tabelle 1).

ΔFosB in mPFC fördert die Anfälligkeit für Stress

Um diese Ergebnisse weiter zu verfolgen, konzentrierten wir uns auf PrL, weil wir zuvor gezeigt hatten, dass die optogenetische Aktivierung dieser Region antidepressive Wirkungen im sozialen Niederlagenparadigma ausübt (Covington et al., 2010). Um die funktionellen Konsequenzen der ΔFosB-Induktion in dieser Gehirnregion zu testen, haben wir ΔFosB in PrL von Kontrollmäusen viral überexprimiert (Abb.. 1C) und sie einem submaximalen Verlauf des sozialen Niederlagenstresses ausgesetzt, der bei normalen Tieren keine soziale Vermeidung auslöst. Mäuse, die ΔFosB in PrL überexprimierten, waren anfälliger für soziale Niederlagen als Kontrollmäuse mit GFP-Injektion, da sie nach submaximaler sozialer Niederlage soziales Vermeidungsverhalten zeigten (Interaktion, F_(2,38) = 2.847, p > 0.05, Haupteffekt des Virus, F_(2,38) = 6.013, p <0.05; Bonferroni Post Test t = 2.447, p <0.05) (Abb.. 1D). Diese Mäuse zeigten auch eine erhöhte Immobilität in einem 1-Tagestest (F_(2,31) = 6.448, p <0.05; Bonferroni Post Test t = 3.518, p <0.05) (Abb.. 1E), ein Effekt, der dem von Antidepressiva erzeugten Effekt entgegengesetzt ist. Im Gegensatz dazu änderte die ΔFosB-Überexpression in PrL nicht mehrere Basiswerte des angstähnlichen Verhaltens, der Saccharosepräferenz, der sozialen Interaktion oder der Bewegungsaktivität (Abb.. 1F – J). Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse die Hypothese, dass die selektive Induktion von ΔFosB in PrL anfälliger Mäuse zur Anfälligkeit für Stress und dessen schädlichen Folgen beiträgt. Im Gegensatz dazu hatte die ΔFosB-Überexpression in einer anderen Region von mPFC, IL, keinen Einfluss auf das emotionale Verhalten der Grundlinie oder auf Reaktionen auf sozialen Stress (Abb.. 1D – J), in der Erwägung, dass die Überexpression von ΔFosB in medialen OFC dazu tendierte, die Widerstandsfähigkeit gegenüber chronischer sozialer Niederlage zu fördern, obwohl dieser Effekt keine statistische Signifikanz erreichte (Interaktion, F_(1,31) = 1.741, p > 0.05, Haupteffekt der Interaktionszeit, F_(1,31) = 14.170, p <0.05; Bonferroni Post Test t = 3.860, p <0.05 innerhalb der GFP-Gruppe; t = 1.960, p <0.05 innerhalb der ΔFosB-Gruppe; Wirkung des Virus, t = 2.447, p <0.05) (Abb.. 1K).

ΔFosB fördert die CCKB-Induktion in mPFC

Eine Vielzahl von Beweisen stützt die Annahme, dass CCK, ein reichlich vorhandenes Neuropeptid im Gehirn, eine wesentliche Rolle in den neurobiologischen Mechanismen von Stress und Angst spielt (Rotzinger und Vaccarino, 2003). Insbesondere die Freisetzung von CCK in mPFC unter sozialem Stress bei Ratten ist mit angstbedingtem Verhalten verbunden (Becker et al., 2001). Obwohl die Beteiligung von CCK an der Depression des Menschen nach wie vor unklar ist, deuten die jüngsten Erkenntnisse auf seine Rolle im Zusammenhang mit sozialem, durch Niederlagen induziertem depressionsähnlichem Verhalten bei Ratten (Becker et al., 2008). Wir stellten daher die Hypothese auf, dass Änderungen der CCK- oder CCKB-Rezeptoren (auch als CCK2-Rezeptor bezeichnet) in mPFC zu Unterschieden zwischen anfälligen und widerstandsfähigen Mäusen beitragen könnten. Bei 48 h nach der letzten Niederlage-Episode waren die CCKB-mRNA-Spiegel nur in mPFC von resilienten Mäusen verringert (F_(2,18) = 8.084, p <0.01; Bonferroni Post Test, t = 3.104, p <0.05 gegen Kontrolle; t = 5.113, p <0.01 vs anfällig) (Abb.. 2A). Es wurde kein Unterschied in den CCK-mRNA-Spiegeln bei anfälligen oder widerstandsfähigen Mäusen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Wir haben eine Zunahme von Δ beobachtetFosB mRNA-Spiegel nur in anfälligen Mäusen im Einklang mit den oben angegebenen Proteindaten (F_(2,18) = 5.246, p <0.01; Bonferroni Post Test t = 3.336, p <0.05 vs anfällig; t Test t₍₁₂₎ = 2.138, p <0.05 gegen Kontrolle) (Abb.. 2B). Weil ΔFosB die Transkription zahlreicher Gene reguliert (McClung und Nestler, 2003; Winstanley et al., 2007), haben wir die Möglichkeit in Betracht gezogen, die CCKB-mRNA-Expression zu regulieren. Um diese Frage zu beantworten, haben wir zuerst ΔFosB in PrL überexprimiert und festgestellt, dass diese Manipulation die CCKB-mRNA-Spiegel in dieser Region hochreguliert (t₍₁₂₎ = 2.012, p <0.05 vs GFP) (Abb.. 2C). Interessanterweise fanden wir auch einen Rückgang in c-Fos mRNA-Spiegel nach ΔFosB-Überexpression (t₍₁₁₎ = 3.382, p <0.01) (Abb.. 2C). TDiese Ergebnisse legen außerdem nahe, dass die Induktion von ΔFosB in PrL von anfälligen Mäusen ein aktiver Mechanismus der Anfälligkeit ist, indem die Unterdrückung von CCKB verhindert wird, die in elastischen Mäusen beobachtet wird.

Zur weiteren Verstärkung dieser Beobachtungen überexprimierten wir ΔJunD, einen ΔFosB-Bindungspartner, dem die Transaktivierungsdomäne fehlt und dadurch als dominanter negativer Antagonist wirkt, und ermittelte seinen Einfluss auf die durch Stress induzierte CCKB-Expression. Wir haben bestätigt, dass chronischer Stress bei sozialer Niederlage den CCKB-Proteinspiegel in PrL der anfälligen Mäuse erhöhtt Test t₍₁₂₎ = 2.289, p <0.05 gegen Kontrolle) (Abb.. 2D,E). Darüber hinaus wurde diese Induktion durch ΔJunD-Überexpression in dieser Region vollständig blockiert (F_(2,20) = 6.306, p <0.01, Bonferroni-Post-Test t = 3.615_, p <0.01) (Abb.. 2D,E), die die Hypothese stützt, dass ΔFosB die durch Stress induzierte CCKB-Expression vermittelt. Darüber hinaus förderte die Blockade der ΔFosB-Aktivität in PrL durch lokale Expression von ΔJunD auch die Widerstandsfähigkeit gegen Stress (t Test t₍₁₆₎ = 2.114, p = 0.05 vs. Kontrolle) (Abb.. 2F). Der Mechanismus, der der Herunterregulierung von CCKB in widerstandsfähigen Mäusen zugrunde liegt, muss noch geklärt werden.

Rolle der CCKB in Bezug auf Widerstandsfähigkeit und Anfälligkeit für Stress

Um die Rolle der CCKB-Regulation in PrL direkt bei der Vermittlung von Anfälligkeit gegenüber Resilienz zu testen, infundierten wir den selektiven CCKB-Rezeptorantagonisten CI-988 (10 ng) direkt in diese Gehirnregion von anfälligen Mäusen. CI-988 wirkt CCKB-Rezeptoren wirksam entgegen in vivo weil es nanomolare Affinität und hohe Selektivität für den CCKB-Rezeptorsubtyp aufweist (Noble et al., 1999). Die Blockade der CCKB-Aktivität hat die soziale Interaktion stark erhöht (Abb.. 2G) (Interaktion, F_(1,20) = 7.795, p <0.05; Arzneimittel F_(1,20) = 5.38, p <0.05, Bonferroni-Post-Test t = 3.615_, p <0.01). Die CI-988-Infusion kehrte auch das bei anfälligen Mäusen beobachtete Defizit an Saccharosepräferenz um (t₍₈₎ = 2.681, p <0.05) (Abb.. 2H). Beide Verhaltensergebnisse zeigen, dass die Blockade der CCK-Wirkung in PrL starke antidepressivitätsähnliche Wirkungen ausübt. Interessanterweise war CI-988 bei intraperitonealer Verabreichung bei der Umkehrung der sozialen Vermeidung nicht wirksam (Daten nicht gezeigt).

Um das Gegenteil zu prüfen, dass die Aktivierung von CCKB in PrL die durch chronischen Stress der sozialen Niederlage induzierte soziale Vermeidung und verminderte Saccharosepräferenz vermitteln könnte, untersuchten wir den Effekt der lokalen Infusion von CCK-8 (10 ng), der vorherrschenden Form von CCK im Gehirn zu Depressionen und Angstzuständen. Die Dosis des Arzneimittels wurde auf der Grundlage vorheriger Ergebnisse in der Literatur ausgewählt (De Witte et al., 1987; Rotzinger und Vaccarino, 2003; Zanoveli et al., 2004). Mäuse wurden vor dem Verhaltenstest einem submaximalen sozialen Niederlagenstress 24 h ausgesetzt (Abb.. 3A). CCK-8, infundiert 30 min vor dem Testen, war ausreichend, um soziale Vermeidung im Test auf soziale Interaktion zu induzieren sowie eine Verkürzung der Zeit, die in den offenen Armen im erhöhten Labyrinth verbracht wurde (SI: BLA, Interaktion, F_(1,22) = 0.79, p > 0.05; Hauptwirkung des Arzneimittels, F_(1,22) = 11.75, p <0.05; Bonferroni Post Test t = 2.957_, p <0.05; NAc: Interaktion, F_(1,26) = 6.688, p <0.05, Bonferroni-Post-Test t = 2.816_, p <0.05; EPM: BLA, Interaktion, F_(1,22) = 8.0, p <0.01; Bonferroni Post Test t = 2.509_, p <0.05 Arzneimittelwirkung; t = 2.528, p <0.05 Viruseffekt; NAc, t Test t₍₁₇₎ = 1.961; p <0.05 Arzneimittelwirkung innerhalb der eYFP-Gruppe) (Abb.. 3SEINlinks). Bei der Saccharosepräferenz wurden keine Unterschiede beobachtet (Abb.. 3F,Glinks). Schließlich hatte die CCK-8-Infusion in diesen Assays keine Auswirkung auf das Verhalten (soziale Interaktion und erhöhtes Labyrinth) von naiven, nicht erodierten Mäusen (Daten nicht gezeigt). TDiese Ergebnisse zeigen, dass die ΔFosB-vermittelte Zunahme der CCKB-Aktivität in PrL von anfälligen Mäusen im Vergleich zu elastischen Mäusen zu einigen stressinduzierten Verhaltensstörungen beiträgt, die diese Tiere aufweisen.

Blockade der CCK-induzierten Stressanfälligkeit durch Aktivierung kortikaler Projektionen gegen BLA gegenüber NAc

Die verminderte neuronale Aktivität von mPFC korreliert mit dem depressionsähnlichen Verhalten bei Mäusen und der optogenetischen Stimulation von mPFC-Neuronen anfälliger Mäuse, die antidepressive Wirkungen hervorrufen (Covington et al., 2010). Wir stellten daher die Hypothese auf, dass CCK in PrL wirken könnte, indem es die neuronale Aktivität hemmt und dadurch ein depressionsähnliches Verhalten verursacht. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese beobachteten wir eine Abnahme von c-Fos mRNA-Spiegel in PrL als Reaktion auf eine CCK-Infusion in diese Gehirnregion (t₍₁₃₎ = 2.235, p <0.05) (Abb.. 3H).

Als nächstes stellten wir die Hypothese auf, dass die optogenetische Stimulation von mPFC ihre antidepressiven Wirkungen ausübt, indem sie die Wirkungen der CCK auf die neuronale Aktivität bekämpft. Bei der Prüfung dieser Hypothese untersuchten wir die subkortikalen Strukturen, die die anxiogenetischen und prodekompressionsähnlichen Wirkungen von CCK vermitteln. Pyramidenneuronen des mPFC projizieren stark auf die NAc und BLA, zwei limbische Strukturen, die an Verhaltensreaktionen auf Stress beteiligt sind. Es hat sich gezeigt, dass eine veränderte Aktivität beider Gehirnregionen eine wesentliche Rolle bei der Expression von angst- und depressionsähnlichem Verhalten spielt (Vialou et al., 2010; Tye et al., 2011). Wir haben daher getestet, ob die Stimulierung der glutamatergen Projektionen von PrL auf NAc oder BLA den schädlichen Auswirkungen der CCK-Mikroinfusion in PrL entgegenwirken würde (Abb.. 3A). Wir injizierten AAV-CaMKII-ChR2-EYFP oder AAV-CaMKII-EYFP als Kontrolle in PrL. Es ist bekannt, dass der CaMKII-Promotor die virale Expression auf glutamatergische pyramidale Neuronen in kortikalen Regionen abzielt. Wir haben dann ausreichend Zeit (6-Wochen) eingeräumt, um die Transgene zu den Nervenenden dieser pyramidalen Neuronen in NAc und BLA zu transportieren (Abb.. 3I). Mäuse erhielten eine submaximale soziale Niederlage. 24 h später infundierten wir CCK-8 in PrL, und 30 min danach wurde die soziale Interaktion während der optogenetischen Stimulation von glutamatergen Terminals in NAc oder BLA gemessen. Unmittelbar nach dem Test der sozialen Interaktion wurden Mäuse in einem erhöhten Labyrinth bewertet, um das angstbedingte Verhalten zu beurteilen, und dann die Saccharose-Präferenz, um Anhedonie zu bewerten.

Optogenetische Stimulation der prL-glutamatergen Projektion auf NAc kehrte die durch Intra-PrL-CCK-8 (Interaktion, F_(1,26) = 6.688, p <0.05, keine Arzneimittelwirkung in der ChR2-Gruppe) (Abb.. 3C). Im Gegensatz dazu hatte eine solche PrL-zu-NAc-Stimulation keinen Einfluss auf das angstähnliche Verhalten, gemessen im erhöhten Plus-Labyrinth (Abb.. 3E); eine solche Stimulation erhöhte jedoch die Saccharosepräferenz im Vergleich zu nicht stimulierten Mäusen (Interaktion, F_(1,20) = 5.77, p <0.05; Bonferroni Post Test t = 2.998_, p <0.05 Stimulationseffekt bei mit CCK-8 behandelten Tieren) (Abb.. 3G).

Ein ganz anderes Verhaltensmuster zeigte sich bei der optogenetischen Stimulation der PrL-glutamatergen Projektionen auf BLA. Eine solche Stimulation verhinderte nicht die durch Intra-PrL-CCK-8-Infusion (Interaktion, F_(1,22) = 0.79, p > 0.05; Hauptwirkung des Arzneimittels, F_(1,22) = 11.75, p <0.05; keine Wirkung in stimulierter Gruppe, t Test t₍₁₂₎ = 2.054, p <0.05) (Abb.. 3B). Die Stimulation von BLA-Afferenzen hatte jedoch eine anxiolytische Wirkung, wie durch eine erhöhte Zeit in den offenen Armen des erhöhten Plus-Labyrinths (Wechselwirkung, F_(1,22) = 8.0, p <0.01; Bonferroni Post Test t = 2.528, p <0.05 Viruseffekt innerhalb der mit CCK-8 behandelten Gruppen) (Abb.. 3D). Die Stimulierung der glutamatergen Projektionen auf BLA hatte keinen signifikanten Effekt auf die Saccharosevorlieben (Interaktion, F_(1,22) = 2.08, p > 0.05) (Abb.. 3F).

Diskussion

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie belegen molekulare Anpassungen in PrL, die der Anfälligkeit für sozialen Stress zugrunde liegen. Wir zeigen die Induktion von ΔFosB in dieser mPFC-Subregion nach chronischem sozialem Niederlagenstress, wobei die Überexpression von ΔFosB die Stressanfälligkeit fördert. Wir identifizierten den CCKB-Rezeptor als ein Zielgen, das durch ΔFosB in PrL reguliert wird, induzierte anscheinend das CCKB-Protein in anfälligen Mäusen und verhinderte die Herabregulierung der CCKB-Expression, die selektiv in elastischen Mäusen auftritt. Wir haben außerdem gezeigt, dass die Infusion eines CCK-Agonisten in PrL depressive und angstähnliche Verhaltensauffälligkeiten als Reaktion auf sozialen Stress fördert, wohingegen die Blockade der CCKB-Rezeptoraktivität in dieser Region anfälliger Mäuse diese Effekte blockiert. Als nächstes verwendeten wir optogenetische Werkzeuge, um die Mikroschaltkreise zu identifizieren, die an Proanxiety-Prodepressions-ähnlichen Aktionen von CCK in PrL beteiligt sind. Obwohl kortiko-NAc-Glutamaterieprojektionen Belohnungsdefizite vermitteln, die durch soziale Vermeidung und verringerte Saccharosepräferenz nachgewiesen werden, beeinflusst dieser Mikroschaltkreis die angstlösenden Wirkungen von in PrL infundiertem CCK nicht. Umgekehrt vermitteln kortikale Projektionen auf BLA die Manifestation angstbedingter Verhaltensweisen, haben jedoch keinen Einfluss auf die durch soziale Belastung hervorgerufene soziale Vermeidung oder auf Saccharose-Präferenzdefizite. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass Veränderungen der PrL-Funktion nach chronischem Stress bei der sozialen Niederlage zahlreiche Verhaltensdefizite über spezifische subkortikale Projektionen vermitteln.

ΔFosB: Abbildung eines limbischen Stressnetzwerks und Rolle in der mPFC

Die ΔFosB-Immunhistochemie identifiziert Neuronen, die von chronischem Stress mit Einzelzellauflösung betroffen sind, und wurde zur Abbildung von stressregulierten neuronalen Schaltkreisen verwendet (Perrottiet al., 2004; Nikulina et al., 2008; Lehmann und Herkenham, 2011). Wir verwendeten diese Methode, um zu zeigen, dass chronischer Stress bei der sozialen Besiedlung ΔFosB in verschiedenen Hirnbereichen mit unterschiedlichen Mustern zwischen elastischen und anfälligen Gruppen induziert, wobei einige Regionen nur bei elastischen Mäusen, andere nur bei empfindlichen Mäusen und andere unter beiden Bedingungen induziert wurden (Tabelle 1). Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Induktion von ΔFosB in NAc oder ventraler PAG die Widerstandsfähigkeit gegen chronischen Stress fördert und zu antidepressiven Reaktionen beiträgt (Berton et al., 2007; Vialou et al., 2010).

Induktion von ΔFosB in PrL von anfälligen Mäusen, gepaart mit früheren Feststellungen, dass die optogenetische Stimulation dieser Region antidepressive Wirkungen ausübt (Covington et al., 2010), veranlassten uns, den Einfluss von ΔFosB in dieser kortikalen Region zu untersuchen. Im Gegensatz zu den Befunden bei NAc und ventraler PAG haben wir festgestellt, dass ΔFosB in PrL die Anfälligkeit für chronischen Stress bei der sozialen Besiedlung fördert und im Zwangs-Swim-Test einen prodepaktionsähnlichen Effekt erzeugt, ohne das angstähnliche Verhalten oder die Saccharose-Präferenz zu beeinflussen. Im Gegensatz zu PrL fanden wir keine Wirkung der ΔFosB-Überexpression in der nahen IL. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurden erhöhte Gehalte an ΔFosB in IL in widerstandsfähigen Mäusen festgestellt, und diese Teilregion wurde mit der Widerstandsfähigkeit gegenüber sozialem Stress in Verbindung gebracht (Lehmann und Herkenham, 2011). Daher sind weitere Studien erforderlich, um die unterschiedlichen Rollen dieser beiden mPFC-Subregionen zu adressieren, von denen gezeigt wurde, dass sie in anderen Verhaltensbereichen entgegengesetzte Auswirkungen haben (Sierra-Mercado et al., 2011; Burgos-Robles et al., 2013; Richard und Berridge, 2013). Wir haben zuvor berichtet, dass depressive Menschen im NAc-untersuchten postmortem NA niedrigere Werte von ΔFosB aufweisen (Vialou et al., 2010), wIn dorsolateralen PFC (Brodmann-Bereich 46) von depressiven Menschen wurden höhere Werte für ΔFosB gezeigt (Teyssier et al., 2011). Andere kortikale Regionen wurden in der letzteren Studie nicht untersucht. In jedem Fall unterstützen diese Befunde zusammen regionenspezifische Anomalien in der ΔFosB-Expression in der Depression von Menschen, bei denen der Transkriptionsfaktor sehr unterschiedliche Auswirkungen auf die Stressanfälligkeit ausübt. In zukünftigen Studien wäre es interessant, den Einfluss von ΔFosB in zahlreichen anderen Gehirnregionen zu untersuchen, in denen es induziert wird (Tabelle 1) zu Stressreaktionen.

Ein Mechanismus, durch den die ΔFosB-Induktion in PrL zu einem depressionsähnlichen Verhalten beitragen könnte, ist die Unterdrückung der PrL-Aktivität. Es wurde gezeigt, dass ΔFosB AMPA-Glutamatreaktionen unterdrückt. und c-Fos Expression, in NAc-Medium stacheligen Neuronen (Renthalet al., 2008; Vialou et al., 2010; Grueter et al., 2013). Ebenso haben wir einen Rückgang in festgestellt c-Fos Ausdruck nach ΔFosB-Überexpression in PrL. Somit könnte die ΔFosB-Induktion in PrL für die verminderte neuronale Aktivität verantwortlich sein, die in dieser Region nach chronischem Stress bei sozialer Niederlage beobachtet wird. Es wird erwartet, dass ein derart niedriger Tonus von PrL gegenüber seinen subkortikalen Zielen wie BLA und NAc die Ängstlichkeit der Angst und die Unfähigkeit, emotionale Reaktionen auf Stress zu beseitigen, erhöht (Fales et al., 2008, 2009). Darüber hinaus induzieren mPFC-Läsionen sensibilisierte Stressreaktionen und Defizite bei der Angstlöschung (Holson, 1986; Silva et al., 1986; Diorio et al., 1993; Milad und Quirk, 2002), was darauf hindeutet, dass die stressinduzierte Beeinträchtigung der mPFC, die teilweise über die Induktion von ΔFosB vermittelt wird, zu Depressionen und anderen stressbedingten Erkrankungen beitragen kann (Choi et al., 2012).

Die Rolle der CCK bei der Anfälligkeit für Stress

Wir liefern Beweise dafür, dass der CCKB-Rezeptor ein Ziel von ΔFosB ist, so dass die ΔFosB-Induktion in PrL von anfälligen Mäusen nur ein Mechanismus ist, durch den ΔFosB seine prodepressionsähnlichen Effekte in dieser Region ausübt. Obwohl die spezifischen Wirkungen von CCK in mPFC-Schaltkreisen weiterhin unklar sind, ist CCK bei Nagetieren innerhalb von GABAergenischen Interneuronen lokalisiert (Somogyi et al., 1984). Man nimmt an, dass es die Aktivität von kortikalen pyramidenförmigen Neuronen unterdrückt, indem es die lokale GABA-Freisetzung erhöht und direkt auf CCKB-Rezeptoren wirkt, die von pyramidenförmigen Neuronen exprimiert werden (Yaksh et al., 1987; Benoliel et al., 1992; Pérez de la Mora ua, 1993; Gallopin et al., 2006). Somit könnte CCKergic Neurotransmission zu der oben erwähnten reduzierten PrL-Aktivität beitragen.

CCK ist ein anxiogener Wirkstoff, bei dem systemische Verabreichung von CCKB-Agonisten Panikattacken bei gesunden Freiwilligen auslöst. Patienten, die zu Panikattacken neigen, werden nach CCK-Exposition hypersensibilisiert (de Montigny, 1989; Bradwejn et al., 1991). Mehrere Studien haben die anxiogenen Wirkungen von CCK bei Nagetieren bestätigt (Rotzinger und Vaccarino, 2003). Die CCK-Freisetzung in mPFC während des Besiegungsstresses bei Ratten ist mit angstbedingtem Verhalten verbunden (Becker et al., 2001); PrL- und IL-Subregionen wurden in dieser Studie nicht unterschieden. In jüngerer Zeit übte eine systemische, chronische Blockade von CCKB mit CI-988 bei Ratten antidepressive Wirkungen aus (Becker et al., 2008). CI-988 normalisierte die Immobilitätszeit im erzwungenen Schwimmtest. Es verhinderte auch Hyperaktivität der Hypothalamus-Hypophyse-Nebennieren-Achse, verringerte das Volumen des Hippocampus und die Zellproliferation und verringerte die Saccharose-Präferenz, die normalerweise durch soziale Niederlagen hervorgerufen wird. Hier bestätigen wir diese Ergebnisse, indem sie eine antidepressivumähnliche Wirkung von CI-988 zeigen, das in PrL von anfälligen Mäusen infundiert wurde, obwohl eine einzelne systemische Injektion diesen Effekt nicht nachahmte.

Zusätzlich zu den akuten Wirkungen von CCK in PrL konnten wir verminderte CCKB-mRNA-Spiegel in resilienten Mäusen feststellen, was eine molekulare Anpassung sein könnte, die der Resilienz zugrunde liegt. In der Tat stellen Veränderungen im CCKergic-Ton, speziell die CCKB-Spiegel, einen wichtigen Mechanismus für die Äußerung von Angst dar. Transgene Mäuse, die CCKB im Vorderhirn überexprimieren, zeigen erhöhte Angst- und Angstreaktionen (Chen et al., 2006). Unser Befund veränderter CCKB-Spiegel zwischen belastbaren und anfälligen Mäusen könnte zu den phänotypischen Unterschieden bei Angstzuständen und depressivem Verhalten beitragen. Hier zeigen wir die PrL als kritisches anatomisches Substrat für die anxiogenen und prodepressiven Wirkungen von CCK im Kontext von sozialem Stress. Dennoch sind mehrere andere Hirnregionen an den Verhaltensaktionen von CCK beteiligt, darunter BLA, Hippocampus, NAc und PAG (De Witte et al., 1987; Belcheva et al., 1994; Noble und Roques, 1999; Zanoveli et al., 2004; Rezayat et al., 2005). Wir fanden auch einen Anstieg der CCKB-Proteinspiegel, aber nicht der mRNA-Spiegel in mPFC von anfälligen Tieren. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass, obwohl die mRNA-Spiegel häufig mit den Proteinwerten korrelieren, dies nicht unbedingt der Fall ist (Gygi et al., 1999).

Unsere optogenetischen Experimente zeigen, dass die zunehmende Aktivität der glutamatergen Projektionen von PrL auf NAc oder BLA die Wirkung von CCK in PrL antagonisiert. Weitere Studien sind erforderlich, um zu zeigen, dass dieser Effekt der optogenetischen Stimulation durch dieselben PrL-Neuronen vermittelt wird, die von der CCK gesteuert werden. Interessanterweise zeigen unsere Daten unterschiedliche Rollen dieser beiden Mikroschaltkreise bei der Vermittlung unterschiedlicher Bereiche von Verhaltensauffälligkeiten. Die Cortico-NAc-Projektion kontrolliert Anhedonie und Belohnung; Die Tatsache, dass es die soziale Vermeidung regelt, bestätigt, dass dieses Symptom eher auf eine verringerte Motivation und Belohnung für soziales Verhalten und nicht auf erhöhte soziale Angst zurückzuführen ist. Diese Schlussfolgerung steht im Einklang mit der Unfähigkeit von Benzodiazepinen, diese Abnormalität zu korrigieren (Berton et al., 2006) und mit der jüngsten Demonstration, dass die mPFC-Stimulation von NAc die Belohnung und Motivation für Drogenmissbrauch erhöht (Britt et al., 2012). Im Gegensatz dazu kontrolliert die Cortico-BLA-Projektion angstbedingte Symptome, was mit einer umfangreichen Literatur bei Nagetieren und Menschen übereinstimmt (siehe oben).

Abschließend Die Ergebnisse der vorliegenden Studie identifizieren ein Muster von limbischen Hirnregionen, die anfällige und widerstandsfähige Tiere betreffen, und zeigen Veränderungen in der PrL, die die Anfälligkeit fördern. Diese Veränderungen beinhalten die Induktion von ΔFosB und dessen Induktion des CCKB-Rezeptors. Im Gegensatz dazu fördert die Blockade der CCK-Wirkungen in PrL antidepressive und anxiolytische Wirkungen. Wir ermitteln auch die subkortikalen Ziele dieser kortikalen pyramidenförmigen Neuronen, die diese Wirkungen vermitteln, mit einem Cortico-NAc-Kreislauf, der für das Verhalten bei Depressionen unerlässlich ist, und einem Kortiko-BLA-Kreislauf, der für das Verhalten bei Angstzuständen unerlässlich ist. Während klinische Studien mit CCKB-Antagonisten bei depressiven Patienten in den 1990 nicht zu vielversprechenden Ergebnissen führten, deuten die vorliegenden Ergebnisse darauf hin, dass das therapeutische Potenzial solcher Wirkstoffe in Teilmengen von Patienten, die starkem Stress ausgesetzt sind, überprüft werden muss.

Fußnoten

Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für psychische Gesundheit (EJN) und der National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression Young Investigator Award der Brain & Behavior Research Foundation an VV unterstützt

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

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