Präfrontaler kortikaler Kreislauf für depressions- und angstbezogenes Verhalten, vermittelt durch Cholecystokinin: Rolle von ΔFosB (2014)

J Neurosci. 2014 Mar 12; 34 (11): 3878 – 3887.
doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1787-13.2014

PMCID: PMC3951691

Vincent Vialou,^1,^6,^7,⁸ Rosmarin C. Bagot,¹ Michael E. Cahill,¹ Deveroux Ferguson,¹ Alfred J. Robinson,² David M. Dietz,³ Barbara Fallon,² Michelle Mazei-Robison,² Stacy M. Ku,¹ Eileen Harrigan,¹ Catherine A. Winstanley,⁴ Tej Joshi,¹ Jian Feng,¹ Olivier Berton,⁵ und Eric J. Nestler¹

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Abstract

Eine verminderte neuronale Aktivität im medialen präfrontalen Kortex (mPFC) ist bei Mäusen mit durch soziale Niederlage ausgelösten depressions- und angstähnlichen Verhaltensweisen assoziiert. Die molekularen Mechanismen, die dieser verminderten mPFC-Aktivität und ihrer prodepressiven Rolle zugrunde liegen, sind jedoch noch unbekannt. Wir zeigen hier, dass die Induktion des Transkriptionsfaktors ΔFosB im mPFC, insbesondere im prälimbischen Bereich (PrL), die Stressanfälligkeit vermittelt. Die ΔFosB-Induktion im PrL trat selektiv bei anfälligen Mäusen nach chronischem sozialem Stress auf, und die Überexpression von ΔFosB in dieser Region, nicht aber im benachbarten infralimbischen Bereich (IL), verstärkte die Stressanfälligkeit. ΔFosB bewirkte diese Effekte teilweise durch die Induktion des Cholecystokinin (CCK)-B-Rezeptors: Die Blockade von CCKB im mPFC induziert einen resilienten Phänotyp, während die Verabreichung von CCK in den mPFC die anxiogenen und depressionsähnlichen Effekte von sozialem Stress nachahmt. Wir hatten zuvor festgestellt, dass die optogenetische Stimulation von mPFC-Neuronen in anfälligen Mäusen verschiedene Verhaltensauffälligkeiten nach chronischem sozialem Stress rückgängig macht. Daher vermuteten wir, dass die optogenetische Stimulation kortikaler Projektionen die pathologischen Effekte von CCK im mPFC aufheben würde. Nach CCK-Infusion in den mPFC stimulierten wir optogenetisch mPFC-Projektionen zur basolateralen Amygdala oder zum Nucleus accumbens, zwei subkortikalen Strukturen, die an der Stimmungsregulation beteiligt sind. Die Stimulation corticoamygdalärer Projektionen blockierte die anxiogene Wirkung von CCK, während andere Symptome sozialer Niederlage unbeeinflusst blieben. Umgekehrt hob die Stimulation corticoaccumbenser Projektionen die CCK-induzierten Defizite in sozialer Vermeidung und Saccharosepräferenz auf, nicht aber die anxiogenen Effekte. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass durch sozialen Stress induzierte Verhaltensdefizite teilweise durch molekulare Anpassungen im mPFC vermittelt werden, die ΔFosB und CCK über kortikale Projektionen zu verschiedenen subkortikalen Zielstrukturen betreffen.

Stichwort: Accumbens, Amygdala, Angstzustände, CCK, Depression, MPFC

Einführung

Einige anatomisch und funktionell miteinander verbundene limbische Hirnregionen, einschließlich des medialen präfrontalen Kortex (mPFC), Hippocampus, Amygdala und Nucleus accumbens (NAc), sind an der Vermittlung der wichtigsten Symptome von Depression und Angst (Bremner, 1999; Drevets, 2001; Keedwell et al., 2005; Mayberg et al., 2005; Bremner, 2006, 2007; Krishnan und Nestler, 2008; Feder et al., 2009). Zum Beispiel korreliert das Fehlen kortikaler Rückwirkungen auf Amygdala mit dysphorischen Emotionen und fällt nach erfolgreicher Behandlung wieder auf normale Werte zurück. Die antidepressiven Wirkungen der tiefen Hirnstimulation des subgenualen cingulären Cortex, einem Bereich von mPFC, stehen mit der Wiederherstellung sowohl der kortikalen als auch der subkortikalen Hirnaktivität auf einem normalen Niveau (Mayberg et al., 2005; Nahas et al., 2010). In ähnlicher Weise ist die tiefe Hirnstimulation von NAc antidepressiv und anxiolytisch und korreliert mit einem veränderten Stoffwechsel in NAc, Amygdala und mPFC (Schlaepfer et al., 2008; Bewernick et al., 2010; Grubert et al., 2011). Diese Daten stützen eine neuronale Netzwerkhypothese von Stimmungsstörungen, bei der antidepressive Behandlungen unabhängig von den Mechanismen die Aktivität sowohl in unteraktiven kortikalen als auch in überaktiven subkortikalen Kreisläufen normalisieren (Kennedy et al., 2001; Mayberg et al., 2005; Kennedy und Giacobbe, 2007; Fales et al., 2008; Fales et al., 2009; Leistedt und Linkowski, 2013).

Tiermodelle, die chronischem physischem oder psychischem Stress ausgesetzt sind, beeinträchtigen die Struktur und Funktion von Neuronen im medialen präfrontalen Kortex (mPFC) ( Radley et al., 2006 ), der Amygdala ( Akirav und Maroun, 2007 ), dem Hippocampus ( Surget et al., 2011 ) und dem Nucleus accumbens (NAc) ( Vialou et al., 2010 ; Christoffel et al., 2011 ). Chronischer sozialer Stress, ein ethologisch valides Depressionsmodell ( Berton et al., 2006 ), verringert die neuronale Aktivität im mPFC, was sich aus der reduzierten Expression von Zif268 und c-Fos ableiten lässt ( Covington et al., 2005 ; Covington et al., 2010 ). Darüber hinaus kann die optogenetische Stimulation des mPFC diese Defizite umkehren und antidepressive Effekte erzielen ( Covington et al., 2010 ), was die Bedeutung des mPFC für stimmungsbezogene Phänomene bestätigt. Der mPFC von Nagetieren steuert, wie auch bei Primaten, das emotionale Verhalten teilweise durch Projektionen zur basolateralen Amygdala (BLA) und zum Nucleus accumbens (NAc) ( Vogt et al., 1992 ; Barbas und Blatt, 1995 ; Heidbreder und Groenewegen, 2003 ). Die molekularen Mechanismen, die diese Funktion des mPFC vermitteln, sind jedoch weiterhin unbekannt.

Die vorliegende Studie konzentrierte sich zunächst auf ΔFosB, einen stabilen Transkriptionsfaktor, der im Nucleus accumbens (NAc) durch chronischen sozialen Stress induziert wird und dort der Stressanfälligkeit entgegenwirkt ( Vialou et al., 2010 ). Wir führten eine gehirnweite Kartierung der ΔFosB-Induktion nach sozialem Stress durch und fanden, ähnlich wie frühere Studien ( Perrotti et al., 2004 ; Nikulina et al., 2008 ; Lehmann und Herkenham, 2011 ), eine starke Induktion im medialen präfrontalen Kortex (mPFC). Überraschenderweise stellten wir fest, dass diese ΔFosB-Induktion im mPFC die Stressanfälligkeit erhöht. Wir identifizierten den Cholecystokinin-B-Rezeptor (CCK-B-Rezeptor) als molekulares Ziel von ΔFosB im mPFC, wo die CCK-vermittelte Neurotransmission sowohl anxiogene als auch depressive Effekte von sozialem Stress vermittelt ( Becker et al., 2001 , 2008 ). Wir fanden heraus, dass die CCK-Aktivität im mPFC sowohl notwendig als auch hinreichend für die angst- und depressionsähnlichen Effekte von sozialem Stress ist. Mithilfe optogenetischer Methoden konnten wir zudem spezifische Wirkungen von CCK in mPFC-Subkreisläufen nachweisen: CCK in mPFC-BLA-Projektionen vermittelt Angstsymptome, während CCK in mPFC-NAc-Projektionen Depressionssymptome vermittelt.

Materialen und Methoden

Experiment 1: Gehirnweite Kartierung der ΔFosB-Induktion durch chronischen sozialen Niederlagenstress.

Acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden, wie bereits beschrieben ( Berton et al., 2006 ; Krishnan et al., 2007 ; Vialou et al., 2010 ) (siehe Tabelle 1 ; Abb. 1A ) , zehn aufeinanderfolgenden Tagen chronischem sozialem Stress ausgesetzt. Kurz gesagt, wurde jede Maus täglich fünf Minuten lang einem unbekannten, aggressiven männlichen CD1-Zuchttier ausgesetzt. Nach der direkten Interaktion mit dem aggressiven CD1-Maustier (5 min) wurden die Tiere für die nächsten 24 Stunden in ein angrenzendes Abteil desselben Käfigs gesetzt, wo sie sensorischen, aber keinen physischen Kontakt hatten. Kontrolltiere wurden in gleichwertigen Käfigen, jedoch mit Artgenossen desselben Stammes, gehalten. 24 Stunden nach dem letzten Tag des Stresses wurden Tests zur sozialen Interaktion durchgeführt. Die soziale Vermeidung gegenüber einem unbekannten männlichen CD1-Maustier wurde gemäß publizierten Protokollen beurteilt. Die im „Interaktionsbereich“ (einem 8 cm breiten Korridor um den Käfig) verbrachte Zeit wurde gemessen. Die Unterteilung der unterlegenen Mäuse in anfällige und resiliente Subpopulationen erfolgte wie bereits beschrieben ( Krishnan et al., 2007 ; Vialou et al., 2010 ). Da die meisten Kontrollmäuse mehr Zeit mit einem sozialen Zielobjekt als mit einem leeren Zielobjektgehege verbringen, wurde ein Interaktionsverhältnis von 100 (gleiche Verweildauer in der Interaktionszone mit bzw. ohne soziales Zielobjekt) als Grenzwert verwendet: Mäuse mit Werten <100 wurden als „anfällig“, solche mit Werten ≥100 als „resilient“ eingestuft. Umfangreiche Verhaltens-, biochemische und elektrophysiologische Analysen bestätigen die Validität dieser distinkten anfälligen und resilienten Subpopulationen ( Krishnan et al., 2007 ; Wilkinson et al., 2009 ; Vialou et al., 2010 ).

Mittlere Anzahl (± SEM) von FosB-immunreaktiven Kernen pro mm² In Gehirnregionen von kontrollierten, anfälligen und widerstandsfähigen Mäusen 24 h nach chronischem (10 d) sozialer Niederlage-Stress

Abbildung 1.

Die Induktion von ΔFosB in mPFC fördert die Anfälligkeit für Stress. A, Repräsentative Mikrofotografien der ΔFosB-Immunhistochemie in mPFC 24 h nach der letzten 10-Serie für soziale Niederlagen. BInduktion von ΔFosB tritt bei GABAergic nicht auf ...

Unmittelbar nach dem Sozialinteraktionstest wurden die Mäuse anästhesiert und intrakardial mit 4 % Paraformaldehyd/PBS perfundiert. Die Zählung der ΔFosB ⁺ -Neuronen im Nucleus accumbens (NAc) erfolgte wie zuvor beschrieben ( Vialou et al., 2010 ). Die Gehirne wurden mit 30 % Saccharose kryoprotektiert und koronale Schnitte (30 μm) mit einem Gefriermikrotom angefertigt und für die Immunhistochemie aufbereitet. Freischwimmende Schnitte wurden in einem Blockierungspuffer mit 0.3 % Triton X-100 und 3 % normalem Ziegenserum vorinkubiert. ΔFosB wurde mit polyklonalen Kaninchenantikörpern gegen den N-terminalen Bereich des Proteins (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Katalognr. sc-48) im gleichen Puffer nachgewiesen. Anschließend erfolgte die Weiterverarbeitung mit biotinylierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern und dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex mit DAB als Substrat (Vector Laboratories). Die Inkubationszeit mit Diaminobenzidin betrug unter allen Bedingungen konstant 100 s. Die Schnitte wurden eingedeckt, entwässert und mit Deckgläsern versehen. ΔFosB-immunopositive Zellen zeigten eine spezifische braune Färbung im Zellkern und wurden von einem gegenüber den Behandlungsbedingungen verblindeten Untersucher mikroskopisch (20-fache Vergrößerung) quantifiziert. Pro Maus wurden drei ausgewählte Hirnschnitte aus jedem Hirnareal für die Quantifizierung herangezogen. Die anatomische Abgrenzung der einzelnen Hirnregionen erfolgte durch Vergleich der Schnitte mit dem Paxinos-Maushirnatlas. Die Bedingungen für die Immunhistochemie wurden optimiert, um die Hintergrundfärbung auf ein Minimum zu reduzieren und so die korrekte Identifizierung ΔFosB-positiver Zellen zu gewährleisten. Für jedes Tier wurden Mittelwerte berechnet und als Einzelbeobachtung in die statistische Analyse einbezogen. Obwohl der verwendete Antikörper sowohl ΔFosB als auch das vollständige FosB erkennt, wissen wir durch Western Blotting, dass unter den untersuchten Bedingungen nur ΔFosB nachweisbar ist ( Perrotti et al., 2004 ; Vialou et al., 2010 ).

Experiment 2: Identifizierung des durch sozialen Stress induzierten neuronalen ΔFosB-Phänotyps in mPFC.

Um die Expression von ΔFosB in kortikalen GABAergen Neuronen zu untersuchen, verwendeten wir Gewebe von GAD2-tdTomato-Mäusen, die chronischem sozialem Stress ausgesetzt waren und wie oben beschrieben auf ΔFosB angefärbt wurden (siehe Abb. 1B ) . Die Mäuse wurden durch Verpaarung von Knock-in-GAD2-Cre-Mäusen (Gad2tm2(cre)Zjh/J; JAX-Stammnummer 010802) ( Taniguchi et al., 2011 ) mit (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J; JAX-Stammnummer 007908) erzeugt, die ein floxiertes, stop-kontrolliertes tdTomato (RFP-Variante) tragen.

Experiment 3: Verhaltenseffekte von ΔFosB-Überexpression in der Prelimbik (PrL) und der Infralimbik (IL) -Kortex.

An acht Wochen alten männlichen Mäusen wurde eine stereotaktische Operation durchgeführt, um HSV-ΔFosB-GFP oder HSV-GFP in die PrL- oder IL-Regionen des mPFC zu injizieren. Die Mäuse wurden mit einer Mischung aus Ketamin (10 mg/kg) und Xylazin (1 mg/kg) anästhesiert. Für die Virusapplikation wurden folgende stereotaktische Koordinaten verwendet: für PrL: 1.8 mm (anterior/posterior), 0.65 mm (lateral), −2.2 mm (dorsal/ventral); und für IL: 1.9 mm (anterior/posterior), 0.75 mm (lateral), −2.8 mm (dorsal/ventral) in einem Winkel von 10° zur Mittellinie (relativ zum Bregma). Insgesamt wurden 0.5 μl gereinigtes Virus bilateral über einen Zeitraum von 5 min (0.1 μl/min) injiziert, gefolgt von 5 min Ruhe. Die Injektionsstellen wurden mittels Standardmethoden der Histologie bestätigt (siehe Abb. 1C ) . Obwohl eine selektive Zielsteuerung von PrL und IL bei Mäusen nicht mit absoluter Genauigkeit möglich ist, zeigen die Daten in Abbildung 1C , dass eine gezielte Ansteuerung der einen oder anderen Region durchaus machbar ist. Die unterschiedlichen Verhaltensauswirkungen der Ansteuerung der beiden Regionen (siehe Ergebnisse) untermauern diesen Ansatz. Die erste Mäusegruppe wurde ausschließlich in einem submaximalen sozialen Unterwerfungsexperiment verwendet (siehe Abb. 1D ) . Drei Tage nach der Operation wurden die Mäuse am selben Tag zwei aufeinanderfolgenden Unterwerfungen ausgesetzt und 24 h später auf soziale Interaktion getestet. Dieses submaximale Unterlegenheitsverfahren wurde bereits zuvor validiert, um nach genetischen Manipulationen Phänotypen der Anfälligkeit aufzudecken ( Krishnan et al., 2007 ; Vialou et al., 2010 ).

Eine zweite Gruppe von Mäusen wurde verwendet, um basale Angst- und depressionsähnliche Verhaltensweisen zu untersuchen (siehe Abb. 1 E–J ). Einen Tag nach der Operation wurden die Mäuse an eine 1%ige (w/v) Saccharoselösung gewöhnt. Am folgenden Tag konnten die Mäuse zwischen einer Wasserflasche und einer Flasche mit 1%iger Saccharoselösung wählen, wobei täglich gewechselt wurde. Die Aufnahme der Saccharoselösung über 24 Stunden wurde am vierten und fünften Tag nach der Operation gemessen und als Prozentsatz der gesamten aufgenommenen Flüssigkeitsmenge angegeben. Die Mäuse wurden anhand publizierter Protokolle ( Vialou et al., 2010 ) im Open-Field-Test (Tag 3), im erhöhten Pluslabyrinth (Tag 4), im Sozialinteraktionstest (Tag 5, morgens) und im Schwimmtest (Tag 5, nachmittags) getestet. Wir haben festgestellt, dass bei dieser Testreihenfolge die Ergebnisse nachfolgender Tests nicht durch vorherige Ergebnisse beeinflusst werden ( Krishnan et al., 2007 ). Die Aktivität von Mäusen im offenen Feld wurde 5 Minuten lang mithilfe eines Videotracking-Systems (Ethovision) unter Rotlichtbedingungen aufgezeichnet. Das erhöhte Pluslabyrinth bestand aus zwei geraden, sich kreuzenden Laufbahnen, die 60 cm über dem Boden angebracht waren und in zwei offene und zwei geschlossene Arme unterteilt waren. Die Mäuse wurden einzeln in die Mitte des Labyrinths gesetzt und konnten jeden Arm 5 Minuten lang frei erkunden. Im Test im offenen Feld und im erhöhten Pluslabyrinth wurde die im Zentrum bzw. in den offenen Armen verbrachte Zeit als inverser Index für angstbezogene Reaktionen verwendet. Ein eintägiger Schwimmtest wurde über 5 Minuten durchgeführt. Eine erhöhte Immobilitätszeit während des Schwimmtests wurde als depressionsähnliches Verhalten interpretiert. Dieser eintägige Test wurde bereits häufig bei Mäusen eingesetzt und als Maß für die prädiktive Validität validiert, da Antidepressiva die Immobilitätszeiten reduzieren.

Schließlich wurde einer separaten Gruppe von Mäusen HSV-ΔFosB intra-mOFC injiziert und anschließend nach einer submaximalen Niederlage auf soziale Interaktion getestet (siehe Abb. 1 K ).

HSV-Vektoren wurden von Rachael Neve (Massachusetts Institute of Technology) bezogen. Die relevanten Gene (ΔFosB und GFP) stehen unter der Kontrolle eines CMV-Promotors. Diese Vektoren wurden bereits in früheren Publikationen umfassend validiert (z. B. Maze et al., 2010 ).

Experiment 4: Auswirkungen von chronischem sozialem Stress auf die CCKB-Rezeptor-Spiegel in mPFC.

24 Stunden nach dem Sozialinteraktionstest wurden die Gehirne schnell entnommen und in Serienschnitte zerlegt. Der mediale präfrontale Kortex (mPFC) wurde rasch präpariert und auf Trockeneis eingefroren (siehe Abb. 2 A , B ). RNA-Isolierung, qPCR und Datenanalyse erfolgten wie zuvor beschrieben ( Maze et al., 2010 ; Vialou et al., 2010 ). Die RNA wurde mit TriZol-Reagenz (Invitrogen) isoliert und anschließend mit RNeasy Micro Kits von QIAGEN weiter aufgereinigt. Alle RNA-Proben wiesen 260/280- und 260/230-Werte ≥ 1.8 auf. Die reverse Transkription erfolgte mit iScript (Bio-Rad). Die qPCR mit SYBR Green (Quanta) wurde mit einem Applied Biosystems 7900HT RT-PCR-System mit folgenden Zyklusparametern durchgeführt: 2 min bei 95 °C; 40 Zyklen mit 95 °C für 15 s, 59 °C für 30 s und 72 °C für 33 s; anschließend stufenweises Erhitzen auf 95 °C zur Erstellung von Schmelzkurven zur Bestätigung einzelner PCR-Produkte. Die Daten wurden analysiert, indem die C<sub> _t </sub>-Werte der Behandlungsgruppen (anfällige oder resiliente vs. Kontrollmäuse bzw. HSV-ΔFosB vs. HSV-GFP) mit der ΔΔC<sub> _t </sub> -Methode verglichen wurden ( Tsankova et al., 2006 ). Die qPCR-Primer lauten wie folgt: ΔFosB, vorwärts: AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT und rückwärts: GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG; CCKB, vorwärts: ACCCTTTATGCGGTGATCTTTC und rückwärts: ATGAGCACGTTTCCGCCAA; CCK, vorwärts: AGCGCGATACATCCAGCAG und rückwärts: ACGATGGGTATTCGTAGTCCTC. GAPDH, Vorwärtssequenz, AGGTCGGTGTGAACGGATTTG und Rückwärtssequenz, TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA.

Abbildung 2.

Die Blockade des CCKB-Rezeptors hat eine antidepressive Wirkung. ASoziale Niederlage senkt die CCKB-Rezeptor-Spiegel in mPFC nur bei widerstandsfähigen Mäusen (n = 8-10). *p <0.05 im Vergleich zur Kontrolle (Einweg-ANOVA). ** **.p <0.05 ...

Experiment 5: Auswirkungen von ΔFosB auf den CCKB-Rezeptor- und cFos-Spiegel.

Mäusen wurde HSV-ΔFosB intra-PrL injiziert. 72 Stunden nach der Operation, zum Zeitpunkt der maximalen Virusüberexpression, wurden die Injektionsstellen unter einem Fluoreszenzmikroskop präpariert (siehe Abb. 2C ) . RNA-Isolierung, qPCR und Datenanalyse erfolgten wie oben beschrieben. Die qPCR-Primer lauten: c-fos, forward, AATCCGAAGGGAACGGAATAAGA und reverse, TGCAACGCAGACTTCTCATCT.

Experiment 6: Auswirkungen der ΔFosB-Blockade auf durch Stress induzierte CCKB-Rezeptor-Spiegel und Resilienz.

Adulte Mäuse wurden bilateral mit HSV-GFP oder HSV-ΔJunD in den PrL injiziert (siehe Abb. 2 D–F ). ΔJunD ist eine N-terminal verkürzte Mutante von JunD, die als dominant-negativer Antagonist von ΔFosB wirkt. Die Mäuse wurden 5 Tage lang zweimal täglich sozialer Unterwerfung ausgesetzt. Dieses beschleunigte Protokoll sozialer Unterwerfung, verkürzt auf die Phase maximaler HSV-Transgenexpression, wurde bereits zuvor angewendet und induzierte maximale soziale Vermeidung ( Covington et al., 2011 ). 24 Stunden nach der letzten Stressepisode wurden die Mäuse ohne Anästhesie dekapitiert, um den Einfluss von Anästhetika auf die neuronalen Proteinspiegel zu vermeiden. Infiziertes Gewebe wurde in PBS mit Protease- (Roche) und Phosphataseinhibitoren (Sigma-Aldrich) mit einer 15-Gauge-Stanze entnommen und sofort auf Trockeneis eingefroren. Die Proben wurden in modifiziertem RIPA-Puffer (10 mM Tris-Base, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA, 0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 1 % Natriumdesoxycholat, pH 7.4) mittels leichter Beschallung homogenisiert. Zusätzlich wurden die oben genannten Protease- und Phosphataseinhibitoren verwendet. Nach Zugabe von Laemmli-Puffer wurden die Proteine auf 4–15%igen Polyacrylamid-Gradientengelen (Criterion System; Bio-Rad) aufgetrennt und mittels Western Blot mit dem Odyssey-System (Li-Cor) gemäß den Herstellerangaben analysiert. Die Membranen wurden mit einem CCKB-Rezeptor-Antikörper (1:1000, Acris, Katalognr. AP01421PU-N) inkubiert. Einer weiteren Gruppe von Mäusen wurde AAV-ΔJunD oder AAV-GFP in die PrL injiziert. Fünf Wochen nach der Operation, um eine maximale Transgenexpression zu gewährleisten, wurden die Mäuse einem submaximalen Defizitprotokoll unterzogen. Ihr Sozialverhalten wurde 24 Stunden nach der letzten Niederlage getestet.

Experiment 7: Auswirkungen von Intra-mPFC CI-988, einem CCKB-Antagonisten, auf durch soziale Belastung hervorgerufene soziale Vermeidung und Anhedonie.

Bilaterale Kanülen (1.0 mm Kanülenabstand, 1.8 mm anterior, Injektor −2.2 mm dorsal/ventral) zur Zielsetzung des mPFC wurden in empfängliche Mäuse implantiert (siehe Abb. 2 G , H ). Eine Woche nach der Operation wurden 10 ng CI-988 direkt in den mPFC infundiert, wobei primär der PrL anvisiert wurde. Anschließend wurde das Sozialverhalten der Mäuse getestet. Die Saccharosepräferenz wurde über die verbleibenden 24 Stunden gemessen. CI-988 (Tocris Bioscience) wurde in Kochsalzlösung gelöst, aliquotiert und eingefroren. Die endgültige Verdünnung wurde am Tag des Experiments hergestellt. Ein zusätzliches Experiment wurde mit empfänglichen Mäusen durchgeführt, denen CI-988 30 Minuten vor dem Sozialverhaltenstest intraperitoneal (2 mg/kg) verabreicht wurde.

Experiment 8: Auswirkungen von CCKB-Agonisten auf die Anfälligkeit für sozialen Stress und die Umkehrung durch optogenetische Stimulation von mPFC-Projektionen für BLA oder NAc.

AAV-CaMKII-ChR2-EYFP oder AAV-CaMKII-EYFP wurde in den rechten mPFC injiziert, wobei erneut primär PrL anvisiert wurde (siehe Abb. 3 A–G ). Fünf Wochen später wurden optische Fasern in den rechten NAc (1.4 anterior/posterior, 2.6 lateral, −4.7 dorsal/ventral in einem Winkel von 25° zur Mittellinie) oder BLA (−1.6 anterior/posterior, 3.1 lateral, −4.7 dorsal/ventral ohne Winkel zur Mittellinie) implantiert. Im Rahmen desselben Eingriffs wurden beidseitig Kanülen in den mPFC implantiert (siehe oben). Kanülen und Fasern wurden mit Zahnzement am Schädel fixiert. Die Mäuse erholten sich eine Woche lang, bevor die Verhaltensexperimente begannen. Mäuse wurden einer submaximalen Niederlage ausgesetzt und 24 Stunden später auf soziale Interaktion, unmittelbar gefolgt vom erhöhten Pluslabyrinth und einem Saccharosepräferenztest über die verbleibenden 24 Stunden getestet. 30 Minuten vor dem Test der sozialen Interaktion wurde der Hälfte der Mäuse CCK-8 (10 ng) in den medialen präfrontalen Kortex (mPFC) infundiert, während die andere Hälfte Vehikel (Kochsalzlösung) erhielt. Die Mäuse wurden paarweise getestet (jeweils eine mit Vehikel und eine mit CCK-8 behandelte Maus, mit AAV-GFP oder AAV-ChR2). CCK-8 (Sigma) wurde in Kochsalzlösung gelöst, aliquotiert und eingefroren. Die endgültige Verdünnung wurde am Tag des Experiments hergestellt.

Abbildung 3.

Die durch CCK-8 induzierte Stressanfälligkeit hängt von bestimmten kortikalen Projektionen ab. ABei 24 h nach submaximaler sozialer Niederlage und 30 min nach der CCK-8-Infusion wurden die mPFC-Projektionsregionen während eines Tests auf soziale Interaktion mit dem Laser stimuliert. CCK-8-Infusion ...

Die optischen Stimulationen wurden gemäß publizierten Protokollen durchgeführt ( Covington et al., 2010 ). Optische Fasern (Thor Laboratories) wurden chronisch implantiert und über einen FC/PC-Adapter mit einer blauen 473-nm-Laserdiode (Crystal Lasers, BCL-473–050-M) verbunden. Ein Stimulator (Agilent, #33220A) erzeugte blaue Lichtimpulse. Während aller Stimulationen wurden alle 3 Sekunden 40 ms lange Impulse mit einer Frequenz von 100 Hz (Impulsbreite 9.9 ms) an terminale Regionen in der BLA oder im NAc abgegeben, um ein burstartiges Muster kortikaler Aktivität zu simulieren. Die Intensität des Lichts in den optischen Fasern wurde vor jeder Anwendung mit einem Lichtsensor (Thor Laboratories, S130A) überprüft und betrug ca. 15 mW. Dieses Stimulationsprotokoll, das zuvor elektrophysiologisch validiert wurde ( Covington et al., 2010 ), löste keine Krampfanfälle aus, basierend auf Verhaltensbeobachtungen und dem Fehlen einer c-Fos-Expression außerhalb der optogenetisch stimulierten Regionen ( Covington et al., 2010 ).

Experiment 9: Wirkungen des CCKB-Agonisten auf die neuronale mPFC-Aktivität, gemessen durch c-Fos-mRNA-Spiegel.

Bei adulten Mäusen wurden beidseitig Kanülen in den medialen präfrontalen Kortex (mPFC) implantiert (siehe Abb. 3H ) . Nach einer Woche Ruhe wurden die Mäuse einer submaximalen Belastung ausgesetzt und 24 Stunden später mit CCK-8 infundiert. 30 Minuten nach der Medikamenteninfusion wurden Gewebeproben aus dem mPFC entnommen und wie oben beschrieben für die mRNA-Analyse aufbereitet.

Tierhaltung

Es wurden acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse (The Jackson Laboratory) verwendet. Alle Mäuse wurden vor Versuchsbeginn mindestens eine Woche lang an die Tierhaltungseinrichtung gewöhnt und bei 23–25 °C in einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus (Licht an um 7:00 Uhr) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Die Experimente wurden gemäß den Richtlinien der Society for Neuroscience und des Institutional Animal Care and Use Committee der Icahn School of Medicine at Mount Sinai durchgeführt.

Statistische Analysen.

Die dargestellten Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben (dargestellt durch Fehlerbalken). Mittels einfaktorieller Varianzanalysen (ANOVA) wurden die Mittelwerte von Kontroll-, anfälligen und resilienten Mäusen in immunhistochemischen, biochemischen und Verhaltensanalysen verglichen. Ebenfalls mittels einfaktorieller ANOVA wurden die Mittelwerte von GFP-Kontrollen und ΔFosB-Überexpression in PrL oder IL im Open-Field-Test, im erhöhten Plus-Labyrinth, im Schwimmtest und im Saccharosepräferenztest verglichen. Zweifaktorielle ANOVA wurden verwendet, um die Mittelwerte von GFP-Kontrollen, ΔFosB-PrL und ΔFosB-IL im Sozialinteraktionstest zu vergleichen. Zweifaktorielle ANOVA wurden eingesetzt, um die Effekte von CCK-8 mit und ohne optogenetischer Stimulation in allen Verhaltensexperimenten sowie den Effekt der ΔFosB-Überexpression oder der CI-988-Infusion auf die soziale Vermeidung mittels zweifaktorieller ANOVA zu vergleichen. Gegebenenfalls wurden Post-hoc- Analysen mit einem Bonferroni- Post-hoc -Test durchgeführt . Zur Untersuchung der Wirkung von CI-988-Infusion auf die Saccharosepräferenz und den erzwungenen Schwimmtest sowie der Wirkung von CCK-8 auf die c-Fos -mRNA-Spiegel wurden t- Tests für unabhängige Stichproben verwendet . Unterschiede zwischen den Versuchsbedingungen wurden als statistisch signifikant betrachtet, wenn p ≤ 0.05.

Ergebnisse

Gehirnweite Kartierung der ΔFosB-Induktion durch chronischen sozialen Niederlagenstress

Wir untersuchten zunächst die ΔFosB-Induktion mittels Immunhistochemie in Kontroll-, anfälligen und resilienten Mäusen nach chronischem (10 Tage) sozialem Stress, wobei wir uns auf Vorder- und Mittelhirnregionen konzentrierten, die zuvor mit Stressreaktionen in Verbindung gebracht wurden. Die Tiere wurden 24 Stunden nach der letzten Stressepisode analysiert. Chronischer sozialer Stress induziert ΔFosB in zahlreichen Hirnarealen, wobei sich zwischen resilienten und anfälligen Mäusen deutliche Unterschiede zeigten. Wie in Tabelle 1 und Abbildung 1A dargestellt , wiesen IL, BLA, Gyrus dentatus des Hippocampus, dorsales Striatum und NAc-Kern eine bevorzugte Aktivierung in resilienten Mäusen auf; diese Ergebnisse im NAc stimmen mit publizierten Befunden überein ( Vialou et al., 2010 ). Im deutlichen Gegensatz dazu zeigten anfällige Mäuse eine stärkere Induktion in PrL, lateralem Septum und Nucleus interstitialis striae terminalis. Mehrere Hirnregionen zeigten eine vergleichbare ΔFosB-Induktion in anfälligen und resilienten Mäusen. Dazu gehörten der orbitofrontale Kortex (OFC, ein weiterer Bereich des PFC), die NAc-Schale, der dorsale Raphe-Kern und das periaquäduktale Grau (PAG).

Um den neuronalen Subtyp zu identifizieren, der in kortikalen Regionen eine ΔFosB-Induktion aufweist, wurden GAD2-tdTomato-Mäuse chronischem sozialem Stress ausgesetzt. Die ΔFosB-Immunreaktivität war in GABAergen Neuronen empfänglicher Mäuse nicht nachweisbar ( Abb. 1B ) , was frühere Befunde einer spezifischen Induktion von ΔFosB in kortikalen Pyramidenneuronen nach anderen Formen chronischen Stresses bestätigt ( Perrotti et al., 2004 ). In nicht-unterlegenen Kontrollmäusen waren die basalen ΔFosB-Werte in den verschiedenen Hirnregionen vergleichbar mit denen früherer Studien ( Perrotti et al., 2004 , 2008 ), wobei die basalen Werte im Nucleus accumbens (NAc) und im dorsalen Striatum deutlich höher waren als in allen anderen Regionen. Eine Ausnahme bildete der Gyrus dentatus, dessen Werte mit denen der Striatumregionen vergleichbar waren ( Tab. 1 ).

ΔFosB in mPFC fördert die Anfälligkeit für Stress

Um diese Ergebnisse weiter zu verfolgen, konzentrierten wir uns auf PrL, weil wir zuvor gezeigt hatten, dass die optogenetische Aktivierung dieser Region antidepressive Wirkungen im sozialen Niederlagenparadigma ausübt (Covington et al., 2010). Um die funktionellen Konsequenzen der ΔFosB-Induktion in dieser Gehirnregion zu testen, haben wir ΔFosB in PrL von Kontrollmäusen viral überexprimiert (Abb. 1C) und sie einem submaximalen Verlauf des sozialen Niederlagenstresses ausgesetzt, der bei normalen Tieren keine soziale Vermeidung auslöst. Mäuse, die ΔFosB in PrL überexprimierten, waren anfälliger für soziale Niederlagen als Kontrollmäuse mit GFP-Injektion, da sie nach submaximaler sozialer Niederlage soziales Vermeidungsverhalten zeigten (Interaktion, F_(2,38) = 2.847, p > 0.05, Haupteffekt des Virus, F_(2,38) = 6.013, p <0.05; Bonferroni Post Test t = 2.447, p <0.05) (Abb. 1D). Diese Mäuse zeigten auch eine erhöhte Immobilität in einem 1-Tagestest (F_(2,31) = 6.448, p <0.05; Bonferroni Post Test t = 3.518, p <0.05) (Abb. 1E), ein Effekt, der dem von Antidepressiva erzeugten Effekt entgegengesetzt ist. Im Gegensatz dazu änderte die ΔFosB-Überexpression in PrL nicht mehrere Basiswerte des angstähnlichen Verhaltens, der Saccharosepräferenz, der sozialen Interaktion oder der Bewegungsaktivität (Abb. 1F – J). Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse die Hypothese, dass die selektive Induktion von ΔFosB in PrL anfälliger Mäuse zur Anfälligkeit für Stress und dessen schädlichen Folgen beiträgt. Im Gegensatz dazu hatte die ΔFosB-Überexpression in einer anderen Region von mPFC, IL, keinen Einfluss auf das emotionale Verhalten der Grundlinie oder auf Reaktionen auf sozialen Stress (Abb. 1D – J), in der Erwägung, dass die Überexpression von ΔFosB in medialen OFC dazu tendierte, die Widerstandsfähigkeit gegenüber chronischer sozialer Niederlage zu fördern, obwohl dieser Effekt keine statistische Signifikanz erreichte (Interaktion, F_(1,31) = 1.741, p > 0.05, Haupteffekt der Interaktionszeit, F_(1,31) = 14.170, p <0.05; Bonferroni Post Test t = 3.860, p <0.05 innerhalb der GFP-Gruppe; t = 1.960, p <0.05 innerhalb der ΔFosB-Gruppe; Wirkung des Virus, t = 2.447, p <0.05) (Abb. 1K).

ΔFosB fördert die CCKB-Induktion in mPFC

Eine Vielzahl von Beweisen stützt die Annahme, dass CCK, ein reichlich vorhandenes Neuropeptid im Gehirn, eine wesentliche Rolle in den neurobiologischen Mechanismen von Stress und Angst spielt (Rotzinger und Vaccarino, 2003). Insbesondere die Freisetzung von CCK in mPFC unter sozialem Stress bei Ratten ist mit angstbedingtem Verhalten verbunden (Becker et al., 2001). Obwohl die Beteiligung von CCK an der Depression des Menschen nach wie vor unklar ist, deuten die jüngsten Erkenntnisse auf seine Rolle im Zusammenhang mit sozialem, durch Niederlagen induziertem depressionsähnlichem Verhalten bei Ratten (Becker et al., 2008). Wir stellten daher die Hypothese auf, dass Änderungen der CCK- oder CCKB-Rezeptoren (auch als CCK2-Rezeptor bezeichnet) in mPFC zu Unterschieden zwischen anfälligen und widerstandsfähigen Mäusen beitragen könnten. Bei 48 h nach der letzten Niederlage-Episode waren die CCKB-mRNA-Spiegel nur in mPFC von resilienten Mäusen verringert (F_(2,18) = 8.084, p <0.01; Bonferroni Post Test, t = 3.104, p <0.05 gegen Kontrolle; t = 5.113, p <0.01 vs anfällig) (Abb. 2A). Es wurde kein Unterschied in den CCK-mRNA-Spiegeln bei anfälligen oder widerstandsfähigen Mäusen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Wir haben eine Zunahme von Δ beobachtetFosB mRNA-Spiegel nur in anfälligen Mäusen im Einklang mit den oben angegebenen Proteindaten (F_(2,18) = 5.246, p <0.01; Bonferroni Post Test t = 3.336, p <0.05 vs anfällig; t Test t₍₁₂₎ = 2.138, p <0.05 gegen Kontrolle) (Abb. 2B). Weil ΔFosB die Transkription zahlreicher Gene reguliert (McClung und Nestler, 2003; Winstanley et al., 2007), haben wir die Möglichkeit in Betracht gezogen, die CCKB-mRNA-Expression zu regulieren. Um diese Frage zu beantworten, haben wir zuerst ΔFosB in PrL überexprimiert und festgestellt, dass diese Manipulation die CCKB-mRNA-Spiegel in dieser Region hochreguliert (t₍₁₂₎ = 2.012, p <0.05 vs GFP) (Abb. 2C). Interessanterweise fanden wir auch einen Rückgang in c-Fos mRNA-Spiegel nach ΔFosB-Überexpression (t₍₁₁₎ = 3.382, p <0.01) (Abb. 2C). TDiese Ergebnisse legen außerdem nahe, dass die Induktion von ΔFosB in PrL von anfälligen Mäusen ein aktiver Mechanismus der Anfälligkeit ist, indem die Unterdrückung von CCKB verhindert wird, die in elastischen Mäusen beobachtet wird.

Zur weiteren Verstärkung dieser Beobachtungen überexprimierten wir ΔJunD, einen ΔFosB-Bindungspartner, dem die Transaktivierungsdomäne fehlt und dadurch als dominanter negativer Antagonist wirkt, und ermittelte seinen Einfluss auf die durch Stress induzierte CCKB-Expression. Wir haben bestätigt, dass chronischer Stress bei sozialer Niederlage den CCKB-Proteinspiegel in PrL der anfälligen Mäuse erhöhtt Test t₍₁₂₎ = 2.289, p <0.05 gegen Kontrolle) (Abb. 2D,E). Darüber hinaus wurde diese Induktion durch ΔJunD-Überexpression in dieser Region vollständig blockiert (F_(2,20) = 6.306, p <0.01, Bonferroni-Post-Test t = 3.615_, p <0.01) (Abb. 2D,E), die die Hypothese stützt, dass ΔFosB die durch Stress induzierte CCKB-Expression vermittelt. Darüber hinaus förderte die Blockade der ΔFosB-Aktivität in PrL durch lokale Expression von ΔJunD auch die Widerstandsfähigkeit gegen Stress (t Test t₍₁₆₎ = 2.114, p = 0.05 vs. Kontrolle) (Abb. 2F). Der Mechanismus, der der Herunterregulierung von CCKB in widerstandsfähigen Mäusen zugrunde liegt, muss noch geklärt werden.

Rolle der CCKB in Bezug auf Widerstandsfähigkeit und Anfälligkeit für Stress

Um die Rolle der CCKB-Regulation in PrL direkt bei der Vermittlung von Anfälligkeit gegenüber Resilienz zu testen, infundierten wir den selektiven CCKB-Rezeptorantagonisten CI-988 (10 ng) direkt in diese Gehirnregion von anfälligen Mäusen. CI-988 wirkt CCKB-Rezeptoren wirksam entgegen in vivo weil es nanomolare Affinität und hohe Selektivität für den CCKB-Rezeptorsubtyp aufweist (Noble et al., 1999). Die Blockade der CCKB-Aktivität hat die soziale Interaktion stark erhöht (Abb. 2G) (Interaktion, F_(1,20) = 7.795, p <0.05; Arzneimittel F_(1,20) = 5.38, p <0.05, Bonferroni-Post-Test t = 3.615_, p <0.01). Die CI-988-Infusion kehrte auch das bei anfälligen Mäusen beobachtete Defizit an Saccharosepräferenz um (t₍₈₎ = 2.681, p <0.05) (Abb. 2H). Beide Verhaltensergebnisse zeigen, dass die Blockade der CCK-Wirkung in PrL starke antidepressivitätsähnliche Wirkungen ausübt. Interessanterweise war CI-988 bei intraperitonealer Verabreichung bei der Umkehrung der sozialen Vermeidung nicht wirksam (Daten nicht gezeigt).

Um das Gegenteil zu prüfen, dass die Aktivierung von CCKB in PrL die durch chronischen Stress der sozialen Niederlage induzierte soziale Vermeidung und verminderte Saccharosepräferenz vermitteln könnte, untersuchten wir den Effekt der lokalen Infusion von CCK-8 (10 ng), der vorherrschenden Form von CCK im Gehirn zu Depressionen und Angstzuständen. Die Dosis des Arzneimittels wurde auf der Grundlage vorheriger Ergebnisse in der Literatur ausgewählt (De Witte et al., 1987; Rotzinger und Vaccarino, 2003; Zanoveli et al., 2004). Mäuse wurden vor dem Verhaltenstest einem submaximalen sozialen Niederlagenstress 24 h ausgesetzt (Abb. 3A). CCK-8, infundiert 30 min vor dem Testen, war ausreichend, um soziale Vermeidung im Test auf soziale Interaktion zu induzieren sowie eine Verkürzung der Zeit, die in den offenen Armen im erhöhten Labyrinth verbracht wurde (SI: BLA, Interaktion, F_(1,22) = 0.79, p > 0.05; Hauptwirkung des Arzneimittels, F_(1,22) = 11.75, p <0.05; Bonferroni Post Test t = 2.957_, p <0.05; NAc: Interaktion, F_(1,26) = 6.688, p <0.05, Bonferroni-Post-Test t = 2.816_, p <0.05; EPM: BLA, Interaktion, F_(1,22) = 8.0, p <0.01; Bonferroni Post Test t = 2.509_, p <0.05 Arzneimittelwirkung; t = 2.528, p <0.05 Viruseffekt; NAc, t Test t₍₁₇₎ = 1.961; p <0.05 Arzneimittelwirkung innerhalb der eYFP-Gruppe) (Abb. 3SEINlinks). Bei der Saccharosepräferenz wurden keine Unterschiede beobachtet (Abb. 3F,Glinks). Schließlich hatte die CCK-8-Infusion in diesen Assays keine Auswirkung auf das Verhalten (soziale Interaktion und erhöhtes Labyrinth) von naiven, nicht erodierten Mäusen (Daten nicht gezeigt). TDiese Ergebnisse zeigen, dass die ΔFosB-vermittelte Zunahme der CCKB-Aktivität in PrL von anfälligen Mäusen im Vergleich zu elastischen Mäusen zu einigen stressinduzierten Verhaltensstörungen beiträgt, die diese Tiere aufweisen.

Blockade der CCK-induzierten Stressanfälligkeit durch Aktivierung kortikaler Projektionen gegen BLA gegenüber NAc

Eine verminderte neuronale Aktivität im mPFC korreliert mit depressionsähnlichem Verhalten bei Mäusen. Die optogenetische Stimulation von mPFC-Neuronen empfänglicher Mäuse führte zu antidepressiven Effekten ( Covington et al., 2010 ). Wir vermuteten daher, dass CCK im PrL durch Hemmung der neuronalen Aktivität wirken und dadurch depressionsähnliches Verhalten hervorrufen könnte. Entsprechend dieser Hypothese beobachteten wir eine Abnahme der c-Fos -mRNA-Spiegel im PrL als Reaktion auf die CCK-Infusion in diese Hirnregion ( t ₍₁₃₎ = 2.235, p < 0.05) ( Abb. 3H ).

Wir stellten als Nächstes die Hypothese auf, dass die optogenetische Stimulation des mPFC ihre antidepressive Wirkung durch die Aufhebung der CCK-Wirkung auf die neuronale Aktivität entfaltet. Um diese Hypothese zu überprüfen, untersuchten wir die subkortikalen Strukturen, die die angstauslösenden und depressionsfördernden Effekte von CCK vermitteln. Pyramidenzellen des mPFC projizieren stark zum NAc und BLA, zwei limbischen Strukturen, die an Verhaltensreaktionen auf Stress beteiligt sind. Eine veränderte Aktivität beider Hirnregionen spielt nachweislich eine wesentliche Rolle bei der Ausprägung von Angst- und depressionsähnlichem Verhalten ( Vialou et al., 2010 ; Tye et al., 2011 ). Daher testeten wir, ob die Stimulation glutamaterger Projektionen vom PrL zum NAc oder zur BLA den schädlichen Effekten einer CCK-Mikroinfusion in den PrL entgegenwirken würde ( Abb. 3A ) . Wir injizierten AAV-CaMKII-ChR2-EYFP oder, als Kontrolle, AAV-CaMKII-EYFP in den PrL. Es ist bekannt, dass der CaMKII-Promotor die virale Expression in glutamatergen Pyramidenzellen kortikaler Regionen steuert. Wir ließen den Transgenen ausreichend Zeit (6 Wochen), um den Transport zu den Nervenendigungen dieser Pyramidenzellen im Nucleus accumbens (NAc) und der Basolateralen Amygdala (BLA) zu ermöglichen ( Abb. 3I ) . Mäuse wurden einer submaximalen sozialen Niederlage ausgesetzt; 24 Stunden später infundierten wir CCK-8 in den präfrontalen Kortex (PrL) und 30 Minuten danach wurde die soziale Interaktion während der optogenetischen Stimulation glutamaterger Endigungen im NAc oder der BLA gemessen. Unmittelbar nach dem Test der sozialen Interaktion wurden die Mäuse im erhöhten Pluslabyrinth auf Angstverhalten und anschließend auf Saccharosepräferenz zur Beurteilung von Anhedonie untersucht.

Optogenetische Stimulation der prL-glutamatergen Projektion auf NAc kehrte die durch Intra-PrL-CCK-8 (Interaktion, F_(1,26) = 6.688, p <0.05, keine Arzneimittelwirkung in der ChR2-Gruppe) (Abb. 3C). Im Gegensatz dazu hatte eine solche PrL-zu-NAc-Stimulation keinen Einfluss auf das angstähnliche Verhalten, gemessen im erhöhten Plus-Labyrinth (Abb. 3E); eine solche Stimulation erhöhte jedoch die Saccharosepräferenz im Vergleich zu nicht stimulierten Mäusen (Interaktion, F_(1,20) = 5.77, p <0.05; Bonferroni Post Test t = 2.998_, p <0.05 Stimulationseffekt bei mit CCK-8 behandelten Tieren) (Abb. 3G).

Ein ganz anderes Verhaltensmuster zeigte sich bei der optogenetischen Stimulation der PrL-glutamatergen Projektionen auf BLA. Eine solche Stimulation verhinderte nicht die durch Intra-PrL-CCK-8-Infusion (Interaktion, F_(1,22) = 0.79, p > 0.05; Hauptwirkung des Arzneimittels, F_(1,22) = 11.75, p <0.05; keine Wirkung in stimulierter Gruppe, t Test t₍₁₂₎ = 2.054, p <0.05) (Abb. 3B). Die Stimulation von BLA-Afferenzen hatte jedoch eine anxiolytische Wirkung, wie durch eine erhöhte Zeit in den offenen Armen des erhöhten Plus-Labyrinths (Wechselwirkung, F_(1,22) = 8.0, p <0.01; Bonferroni Post Test t = 2.528, p <0.05 Viruseffekt innerhalb der mit CCK-8 behandelten Gruppen) (Abb. 3D). Die Stimulierung der glutamatergen Projektionen auf BLA hatte keinen signifikanten Effekt auf die Saccharosevorlieben (Interaktion, F_(1,22) = 2.08, p > 0.05) (Abb. 3F).

Diskussion

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie liefern Hinweise auf molekulare Anpassungen im präfrontalen Kortex (PrL), die der Anfälligkeit für sozialen Stress zugrunde liegen. Wir zeigen die Induktion von ΔFosB in dieser Subregion des medialen präfrontalen Kortex (mPFC) nach chronischem sozialem Stress, wobei die Überexpression von ΔFosB die Stressanfälligkeit erhöht. Wir identifizierten den CCKB-Rezeptor als ein Zielgen, das durch ΔFosB im PrL reguliert wird. Dieser Rezeptor induziert offenbar das CCKB-Protein in anfälligen Mäusen und verhindert die selektive Herunterregulierung der CCKB-Expression in resilienten Mäusen. Weiterhin zeigten wir, dass die Infusion eines CCK-Agonisten in den PrL depressions- und angstähnliche Verhaltensauffälligkeiten als Reaktion auf sozialen Stress hervorruft, während die Blockade der CCKB-Rezeptoraktivität in dieser Region anfälliger Mäuse diese Effekte aufhebt. Anschließend nutzten wir optogenetische Methoden, um die an den angst- bzw. depressionsfördernden Wirkungen von CCK im PrL beteiligten Mikroschaltkreise zu identifizieren. Obwohl glutamaterge Projektionen zwischen Cortico und Nucleus accumbens (NAc) Belohnungsdefizite vermitteln, die sich in sozialer Vermeidung und reduzierter Saccharosepräferenz äußern, beeinflusst dieser Mikrokreislauf nicht die anxiogenen Effekte von in den präfrontalen Kortex (PrL) infundiertem CCK. Umgekehrt vermitteln kortikale Projektionen zur Basolateralen Amygdala (BLA) die Manifestation von Angstverhalten, haben aber keinen Einfluss auf sozialstressbedingte soziale Vermeidung oder Defizite in der Saccharosepräferenz. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass Veränderungen der PrL-Funktion nach chronischem sozialem Stress zahlreiche Verhaltensdefizite über spezifische subkortikale Projektionen vermitteln.

ΔFosB: Abbildung eines limbischen Stressnetzwerks und Rolle in der mPFC

Die ΔFosB-Immunhistochemie identifiziert Neuronen, die von chronischem Stress betroffen sind, mit Einzelzellauflösung und wurde zur Kartierung stressregulierter neuronaler Schaltkreise eingesetzt ( Perrotti et al., 2004 ; Nikulina et al., 2008 ; Lehmann und Herkenham, 2011 ). Wir nutzten diese Methodik, um zu zeigen, dass chronischer sozialer Stress durch soziale Niederlage ΔFosB in verschiedenen Hirnarealen induziert, wobei sich deutliche Muster zwischen resilienten und anfälligen Gruppen zeigen. Einige Regionen wiesen eine Induktion nur in resilienten Mäusen auf, andere nur in anfälligen Mäusen und wieder andere unter beiden Bedingungen ( Tabelle 1 ). Frühere Arbeiten zeigten, dass die ΔFosB-Induktion im Nucleus accumbens (NAc) oder im ventralen periaquäduktalen Grau (PAG) die Resilienz gegenüber chronischem Stress fördert und zu antidepressiven Reaktionen beiträgt ( Berton et al., 2007 ; Vialou et al., 2010 ).

Die Induktion von ΔFosB im PrL anfälliger Mäuse, zusammen mit früheren Befunden, dass die optogenetische Stimulation dieser Region antidepressive Effekte ausübt ( Covington et al., 2010 ), veranlasste uns, den Einfluss von ΔFosB in dieser kortikalen Region zu untersuchen. Im Gegensatz zu den Befunden im NAc und im ventralen PAG stellten wir fest, dass ΔFosB im PrL die Anfälligkeit für chronischen sozialen Stress erhöht und im Schwimmtest einen depressionsähnlichen Effekt hervorruft, ohne angstähnliches Verhalten oder die Saccharosepräferenz zu beeinflussen. Im Gegensatz zum PrL fanden wir keine Wirkung der ΔFosB-Überexpression im benachbarten IL. Eine kürzlich durchgeführte Studie fand erhöhte ΔFosB-Spiegel im IL resilienter Mäuse und brachte diese Subregion mit der Resilienz gegenüber sozialem Stress in Zusammenhang ( Lehmann und Herkenham, 2011 ). Weitere Studien sind daher erforderlich, um die unterschiedlichen Rollen dieser beiden mPFC-Subregionen zu untersuchen, die in anderen Verhaltensbereichen gegensätzliche Effekte gezeigt haben ( Sierra-Mercado et al., 2011 ; Burgos-Robles et al., 2013 ; Richard und Berridge, 2013 ). Wir berichteten bereits, dass depressive Menschen postmortal niedrigere ΔFosB-Werte im NAc aufweisen ( Vialou et al., 2010 ), während im dorsolateralen PFC (Brodmann-Areal 46) depressiver Menschen höhere ΔFosB-Werte nachgewiesen wurden ( Teyssier et al., 2011 ). Andere kortikale Regionen wurden in der letztgenannten Studie nicht untersucht. Zusammengenommen stützen diese Befunde regionsspezifische Anomalien in der ΔFosB-Expression bei menschlicher Depression, wobei der Transkriptionsfaktor sehr unterschiedliche Auswirkungen auf die Stressanfälligkeit hat. Es wäre interessant, in zukünftigen Studien den Einfluss von ΔFosB in zahlreichen anderen Hirnregionen, in denen es induziert wird ( Tabelle 1 ), auf Stressreaktionen zu untersuchen.

Ein möglicher Mechanismus, durch den die ΔFosB-Induktion im PrL zu depressionsähnlichem Verhalten beitragen könnte, ist die Unterdrückung der PrL-Aktivität. Es wurde gezeigt, dass ΔFosB die AMPA-Glutamat-Antwort und die c-Fos -Expression in mittelgroßen Stachelneuronen des NAc hemmt ( Renthal et al., 2008 ; Vialou et al., 2010 ; Grueter et al., 2013 ). Auch wir beobachteten eine verminderte c-Fos -Expression nach ΔFosB-Überexpression im PrL. Daher könnte die ΔFosB-Induktion im PrL für die reduzierte neuronale Aktivität in dieser Region nach chronischem sozialem Stress verantwortlich sein. Ein solcher verminderter Tonus des PrL gegenüber seinen subkortikalen Zielgebieten, wie der BLA und dem NAc, würde erwartungsgemäß die Angstreaktion verstärken und die Unfähigkeit zur Löschung emotionaler Stressreaktionen beeinträchtigen ( Fales et al., 2008 , 2009 ). Darüber hinaus induzieren Läsionen des mPFC sensibilisierte Stressreaktionen und Defizite bei der Furchtextinktion ( Holson, 1986 ; Silva et al., 1986 ; Diorio et al., 1993 ; Milad und Quirk, 2002 ), was darauf hindeutet, dass eine stressbedingte Beeinträchtigung des mPFC, die teilweise über die ΔFosB-Induktion vermittelt wird, zu Depressionen und anderen stressbedingten Störungen beitragen könnte ( Choi et al., 2012 ).

Die Rolle der CCK bei der Anfälligkeit für Stress

Wir liefern Beweise dafür, dass der CCKB-Rezeptor ein Zielmolekül von ΔFosB ist, sodass die ΔFosB-Induktion im PrL nur bei anfälligen Mäusen einen Mechanismus darstellt, über den ΔFosB seine depressionsähnlichen Effekte in dieser Region ausübt. Obwohl die spezifischen Wirkungen von CCK in den Schaltkreisen des mPFC weiterhin unklar sind, ist CCK bei Nagetieren in GABAergen Interneuronen lokalisiert ( Somogyi et al., 1984 ). Es wird angenommen, dass es die Aktivität kortikaler Pyramidenzellen hemmt, indem es die lokale GABA-Freisetzung verstärkt und direkt auf die von Pyramidenzellen exprimierten CCKB-Rezeptoren wirkt ( Yaksh et al., 1987 ; Benoliel et al., 1992 ; Pérez de la Mora et al., 1993 ; Gallopin et al., 2006 ). Somit könnte die CCKerge Neurotransmission zur oben beschriebenen reduzierten PrL-Aktivität beitragen.

CCK ist ein anxiogenes Agens; die systemische Gabe von CCKB-Agonisten induziert Panikattacken bei gesunden Probanden. Patienten mit einer Prädisposition für Panikattacken zeigen nach CCK-Exposition eine Hypersensibilisierung ( de Montigny, 1989 ; Bradwejn et al., 1991 ). Mehrere Studien bestätigten die anxiogene Wirkung von CCK bei Nagetieren ( Rotzinger und Vaccarino, 2003 ). Die CCK-Freisetzung im mPFC während eines Niederlagenstresses bei Ratten ist mit angstbezogenem Verhalten assoziiert ( Becker et al., 2001 ); die PrL- und IL-Subregionen wurden in dieser Studie nicht differenziert. Kürzlich zeigte die systemische, chronische Blockade von CCKB mit CI-988 antidepressivaähnliche Wirkungen bei Ratten ( Becker et al., 2008 ). CI-988 normalisierte die Immobilitätszeit im Schwimmtest. Es verhinderte außerdem eine Hyperaktivität der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse, reduzierte das Hippocampusvolumen und die Zellproliferation und verringerte die normalerweise durch soziale Niederlage hervorgerufene Saccharosepräferenz. Wir bestätigen diese Ergebnisse, indem wir eine antidepressive Wirkung von CI-988 nach Infusion in den präfrontalen Kortex (PrL) empfänglicher Mäuse nachweisen, obwohl eine einmalige systemische Injektion diesen Effekt nicht hervorrief.

Zusätzlich zu den akuten Wirkungen von CCK im PrL identifizierten wir verringerte CCKB-mRNA-Spiegel in resilienten Mäusen, was eine molekulare Anpassung darstellen könnte, die der Resilienz zugrunde liegt. Tatsächlich sind Veränderungen des CCKergen Tonus, insbesondere des CCKB-Spiegels, ein wichtiger Mechanismus für die Expression von Angstzuständen. Transgene Mäuse mit CCKB-Überexpression im Vorderhirn zeigen verstärkte Angst- und Furchtreaktionen ( Chen et al., 2006 ). Unser Befund veränderter CCKB-Spiegel zwischen resilienten und anfälligen Mäusen könnte zu den phänotypischen Unterschieden im Angst- und depressionsähnlichen Verhalten beitragen. Wir zeigen hier, dass der PrL ein entscheidendes anatomisches Substrat für die anxiogenen und prodepressiven Wirkungen von CCK im Kontext von sozialem Stress darstellt. Dennoch sind mehrere andere Hirnregionen an den Verhaltenswirkungen von CCK beteiligt, darunter die BLA, der Hippocampus, der NAc und die PAG ( De Witte et al., 1987 ; Belcheva et al., 1994 ; Noble und Roques, 1999 ; Zanoveli et al., 2004 ; Rezayat et al., 2005 ). Wir beobachteten zudem einen Anstieg des CCKB-Proteinspiegels, jedoch nicht des mRNA-Spiegels, im mPFC von anfälligen Tieren. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass mRNA- und Proteinspiegel zwar häufig korrelieren, dies aber nicht zwangsläufig der Fall ist ( Gygi et al., 1999 ).

Unsere optogenetischen Experimente zeigen, dass eine erhöhte Aktivität glutamaterger Projektionen vom PrL zum NAc oder zur BLA die Wirkung von CCK im PrL antagonisiert. Weitere Studien sind erforderlich, um zu bestätigen, dass dieser Effekt der optogenetischen Stimulation durch dieselben PrL-Neuronen vermittelt wird, die auch durch CCK kontrolliert werden. Interessanterweise zeigen unsere Daten unterschiedliche Rollen dieser beiden Mikroschaltkreise bei der Vermittlung verschiedener Bereiche von Verhaltensauffälligkeiten. Die cortico-NAc-Projektion kontrolliert Anhedonie und Belohnung; die Tatsache, dass sie soziale Vermeidung reguliert, bestätigt, dass dieses Symptom eher eine verminderte Motivation und Belohnung für soziales Verhalten widerspiegelt als eine erhöhte soziale Angst. Diese Schlussfolgerung steht im Einklang mit der Unfähigkeit von Benzodiazepinen, diese Anomalie zu korrigieren ( Berton et al., 2006 ), und mit dem kürzlich erbrachten Nachweis, dass die mPFC-Stimulation des NAc die Belohnung und Motivation für Drogenmissbrauch erhöht ( Britt et al., 2012 ). Im Gegensatz dazu kontrolliert die cortico-BLA-Projektion angstbezogene Symptome, was mit einer großen Anzahl von Studien an Nagetieren und Menschen übereinstimmt (siehe oben).

Zusammenfassend identifizieren die Ergebnisse der vorliegenden Studie ein Muster limbischer Hirnregionen, die bei anfälligen und resilienten Tieren eine Rolle spielen, und zeigen Veränderungen im PrL auf, die die Anfälligkeit fördern. Diese Veränderungen umfassen die Induktion von ΔFosB und dessen Induktion des CCKB-Rezeptors . Im Gegensatz dazu fördert die Blockade der CCK-Wirkung im PrL antidepressive und anxiolytische Effekte. Wir identifizieren zudem die subkortikalen Zielstrukturen dieser kortikalen Pyramidenzellen, die diese Wirkungen vermitteln: ein kortiko-NAc-Schaltkreis ist essenziell für depressionsbezogene Verhaltensweisen, ein kortiko-BLA-Schaltkreis für angstbezogene Verhaltensweisen. Während klinische Studien mit CCKB-Antagonisten bei depressiven Patienten in den 1990er Jahren keine vielversprechenden Ergebnisse lieferten, legen die vorliegenden Befunde eine erneute Prüfung des therapeutischen Potenzials solcher Substanzen bei Patientengruppen mit hoher Stressbelastung nahe.

Fußnoten

Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für psychische Gesundheit (EJN) und der National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression Young Investigator Award der Brain & Behavior Research Foundation an VV unterstützt

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

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