PSMC5, eine 19S-Proteasomal-ATPase, reguliert die Kokainwirkung im Nucleus Accumbens (2015)

Plus eins. 2015. Mai 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Noch nie8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Abstrakt

ΔFosB ist ein stabiler Transkriptionsfaktor, der sich im Nucleus accumbens (NAc), einem wichtigen Teil der Belohnungsschaltung des Gehirns, als Reaktion auf chronische Exposition gegenüber Kokain oder anderen Drogen des Missbrauchs ansammelt. Während bekannt ist, dass ΔFosB mit einem Mitglied der Jun-Familie heterodimerisiert, um einen aktiven Transkriptionsfaktorkomplex zu bilden, wurde bisher keine offene Untersuchung anderer möglicher Bindungspartner für ΔFosB im Gehirn durchgeführt. Hier identifizieren wir unter Verwendung von Hefe-Zwei-Hybrid-Assays PSMC5 - auch bekannt als SUG1, eine ATPase-haltige Untereinheit des 19S-Proteasomkomplexes - als neuartiges interagierendes Protein mit ΔFosB. Wir verifizieren solche Wechselwirkungen zwischen endogenem ΔFosB und PSMC5 in der NAc und zeigen, dass beide Proteine ​​auch Komplexe mit anderen Chromatin-regulatorischen Proteinen bilden, die mit der Genaktivierung assoziiert sind. Wir zeigen weiter, dass chronisches Kokain die PSMC5-Spiegel im NAc im Kern, aber nicht im Zytoplasma erhöht und dass die Überexpression von PSMC5 in dieser Gehirnregion die lokomotorischen Reaktionen auf Kokain fördert. Zusammen beschreiben diese Ergebnisse einen neuen Mechanismus, der zu den Wirkungen von ΔFosB beiträgt und zum ersten Mal PSMC5 in die kokaininduzierte molekulare und Verhaltensplastizität einbezieht.

Zitat: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, eine 19S-Proteasomal-ATPase, reguliert die Kokainwirkung im Nucleus Accumbens. PLoS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Akademischer Redakteur: James Edgar McCutcheon, Universität von Leicester, VEREINIGTES KÖNIGREICH

Empfangen: Dezember 10, 2014; Akzeptiert: April 7, 2015; Veröffentlicht am: 11. Mai 2015

Copyright: © 2015 Ohnishi et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen des Creative Commons Attribution License, die uneingeschränkte Nutzung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, dass der ursprüngliche Autor und die Quelle gutgeschrieben werden

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers.

Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health, des Nationalen Instituts für Drogenmissbrauch und der Ishibashi Foundation und der Japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (KAKENHI-Nummern: 24591735, 26290064, 25116010) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, bei der Datensammlung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Einleitung

ΔFosB, ein verkürztes Produkt der FosB Gen, gehört zur Fos-Familie der Transkriptionsfaktoren, zu denen auch c-Fos, FosB in voller Länge, Fra-1 und Fra-2 gehören. Wie andere Fos-Proteine ​​heterodimerisiert ΔFosB mit einem Protein der Jun-Familie - c-Jun, JunB oder JunD - einen aktiven AP-1 (Aktivator-Protein-1) Transkriptionsfaktor-Komplex, der die Expression spezifischer Zielgene induziert oder unterdrückt [1,2].

Es wurde gezeigt, dass ΔFosB eine Schlüsselrolle bei Drogenabhängigkeit spielt [2]. Einzigartig unter Fos-Familienproteinen, akkumuliert es im Nucleus accumbens (NAc) und anderen belohnungsbezogenen Gehirnregionen nach wiederholter Medikamentenverabreichung aufgrund seiner hohen Stabilität [3,4], die durch den Mangel an C-terminalen Degron-Domänen und durch Phosphorylierung durch mehrere Proteinkinasen vermittelt wird [5-7]. Eine solche Induktion von ΔFosB im NAc vermittelt erhöhte Verhaltensreaktionen auf Drogen. Somit erhöht die Überexpression von & Dgr; FosB in dieser Hirnregion von erwachsenen Tieren, entweder durch Verwendung von viralen Vektoren oder induzierbaren bitransgenen Mäusen, die Empfindlichkeit eines Tieres auf die lokomotorisch aktivierenden und lohnenden Wirkungen von Kokain und Opiaten sowie die Motivation eines Tieres, sich selbst zu verabreichen Kokain [7-11]. Umgekehrt verursacht die Überexpression von dominanten negativen Antagonisten von ΔFosB die entgegengesetzten Verhaltensphänotypen [10-12].

Wir und andere haben zuvor mittels Gel-Shift-Assays bestätigt, dass JunD und möglicherweise andere Proteine ​​der Jun-Familie die wichtigsten Bindungspartner von ΔFosB im Gehirn in vivo sind [13-15]. Bislang gab es jedoch keine offene, unvoreingenommene Bewertung der Bindungspartner von ΔFosB im Gehirn. Hier suchten wir neue Bindungspartner für ΔFosB durch Verwendung eines Hefe-Zwei-Hybrid-Assays [16,17]. Unsere Daten zeigten, dass PSMC5, auch bekannt als SUG1, ein robuster Partner von ΔFosB sowohl in vitro als auch in der NAc in vivo ist, wo es ΔFosB als Teil eines Kokain-induzierten Transkriptionsaktivierungskomplexes verbindet, der auch CBP (CREB-bindendes Protein) enthält ) und p300 - beides Histonacetyltransferasen (HATs) - sowie BRG1 (ein Chromatin Remodeling Protein). Wir werden fortfahren zu zeigen, dass chronische Exposition gegenüber Kokain die nuklearen Spiegel von PSMC5, einer ATPase-enthaltenden Untereinheit des 19S Proteasomal-Komplexes, in der NAc verändert und dass PSMC5 seinerseits die Verhaltensreaktionen auf Kokain kontrolliert.

Material und Methoden

Hefe-Zwei-Hybrid-Screening

MaV203-Hefezellen (Invitrogen Life Technologies) wurden mit pDBLeu co-transfiziert, wobei verschiedene Fragmente des & Dgr; FosB-Proteins angetrieben wurden, und eine Maushirnbibliothek wurde in pPC86 (Invitrogen Life Technologies) subkloniert. Transformierte Zellen wurden auf SC-Medium gezüchtet, dem Leucin, Tryptophan und Histidin fehlten und 10 mM 3-Aminotriazol enthielten. Bindung zwischen FosB-Fragmenten und einem Kandidatenpartner induziert drei Reportergene (His3, Ura3 und LacZ), und die Induktion macht Transformanten fähig, unter den verwendeten Kulturbedingungen zu überleben. Positive Klone wurden erneut mit frischen pDBLeu-ΔFosB-Fragmenten durch Retransformationstests in MaV203-Zellen getestet.

Zelllinien

Maus-Neuro-2A-Neuroblastomzellen (ATCC) wurden in Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (ATCC) gehalten, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C und 5% CO2. Ratten-1A-Zellen waren ein Geschenk von Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japan) [18] und beibehalten in Dulbeccos MEM (DMEM) (Life Technologies), ergänzt mit 10% FBS bei 37 ° C und 5% CO2. Die Transfektion von Zellen mit Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Effecten (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

PSMC5- und ΔFosB-Konstrukte

Mehrere mutierte Formen von PSMC5, die jeweils an ihrem N-Terminus FLAG-markiert sind, wurden zur Verwendung in Immunpräzipitation oder viral-vermittelten Gentransfer-Experimenten erzeugt. Diese umfassten: PSMC5-K196M, PSMC5-Coiled-Coil-Domäne (PSMC5-ΔCC, fehlende Aminosäuren 27-68), PSMC5-NT (bestehend aus dem N-terminalen Fragment des Proteins, Aminosäuren 1-151) und PSMC5 -CT (bestehend aus dem C-terminalen Fragment des Proteins, 172-Aminosäuren) (vgl Abb 1). Wir verwendeten auch N-terminale MYC-markierte Formen des Wildtyps ΔFosB sowie ΔFosB mit einer Mutation in seiner Leucin-Zipper-Domäne (Mutation der Aminosäuren 182 zu 205, die bekanntermaßen die Heterodimerisierung mit Proteinen der Jun-Familie auslöscht [6].

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Bild 1. ΔFosB bindet an PSMC5 in vitro.

 

A. Schema von ΔFosB, ΔFosB-LZM, in dem die Leucin-Zipper-Domäne mutiert ist, um die ΔFosB-Heterodimerisierung mit Jun-Proteinen zu verölen, und Δ2ΔFosB, dem die ersten 78-Aminosäuren des ΔFosB-N-Terminus fehlen. B. Schema von PSMC5, PSMC5-NT, das die ersten 151-Aminosäuren von PSMC5, PSMC5-CT, denen die ersten 235-Aminosäuren von PSMC5 fehlen, und PSMC5-ΔCC, dem die Coiled-Coil-Domäne fehlt (Aminosäuren 28-68), umfasst; . Die AAA-Domäne entspricht einem Motiv, ATPasen, die mit verschiedenen zellulären Aktivitäten assoziiert sind, die in vielen ATPasen vorhanden sind. C. 2.4 & mgr; g pcDNA3.1-ΔFosB (Bahnen 1-4) oder & Dgr; FosB-LZM (Bahn 5) wurde mit 2.4 & mgr; g FLAG-markiertem PSMC5 oder verschiedenen Deletionsmutanten in Neuro2a-Zellen co-transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und einer Immunpräzipitation mit einem Anti-FLAG-Antikörper unterzogen und dann Western-Blotting mit Anti-ΔFosB- oder Anti-FLAG-Antikörper durchgeführt. Man beachte, dass ΔFosB, aber nicht ΔFosB-LZM, robust an PSMC5 oder PSMC5-NT bindet, aber nicht an PSMC5-CT oder PSMC5-ΔCC. Die in der Figur gezeigten Daten wurden in jedem von drei getrennten Experimenten dreifach repliziert.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Tiere

Neun bis 11-Wochen alte männliche C57BL / 6J-Mäuse (The Jackson Laboratory) wurden für alle Experimente verwendet. Die Tiere wurden in einem 12-h Hell-Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten ad libitum und wurden 1 Woche vor dem Experimentieren gewöhnt. Zwei Kokain-Behandlungsschemata wurden verwendet. Um die biochemischen Wirkungen von Kokain zu untersuchen, erhielten die Tiere tägliche 7-Dosen von Kokain (20 mg / kg) oder Kochsalzlösung und wurden nach der letzten Injektion durch Enthauptung 24 Stunden getötet. Dies ist ein Standardprotokoll, von dem gezeigt wurde, dass es zahlreiche molekulare und zelluläre Reaktionen auf das Medikament hervorbringt.7]. Um den Einfluss von PSMC5 im Nucleus accumbens auf Verhaltensreaktionen auf Kokain zu untersuchen, verwendeten wir eine unterschwellige Dosis des Medikaments (7.5 mg / kg; siehe Lokomotorsensibilisierung unten) basierend auf der Hypothese, dass PSMC5, wie ΔFosB, die Empfindlichkeit eines Tieres erhöhen würde Kokain [8]. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Mount Sinai genehmigt.

Immunpräzipitation und Western Blotting

Neuro-2A-Zellen wurden mit Wildtyp- oder Mutantenformen von PSMC5 transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in PBS gewaschen, in RIPA-Puffer lysiert (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% Natriumdesoxycholat, 10 mM Natriumbutyrat, Proteaseinhibitor-Cocktail) . Die Lysate wurden aufgeteilt und mit entweder nicht-immunem IgG (Sigma) oder anti-FLAG-Antikörpern (Sigma) für 3 hr bei 4 ° C inkubiert. Die Immunpräzipitation wurde mit Protein G Beads (Invitrogen) wie beschrieben durchgeführt.19]. Kurz gesagt wurden immunpräzipitierte Proteine ​​einer SDS-PAGE unterzogen und mittels Western-Blotting unter Verwendung von Anti-FosB / & Dgr; FosB-Antikörper (Cell Signaling Technology) auf der Grundlage veröffentlichter Protokolle analysiert.7]. Für In-vivo-Proteinbindungsassays verwendeten wir gereinigte Kernfraktionen von gestanzten NAc von Mäusen nach chronischer Kokainbehandlung (20 mg / kg IP täglich für 7-Tage, wobei Mäuse 24 hr nach der letzten Injektion verwendeten). Co-Immunpräzipitation aus Kernfraktionen wurde unter Verwendung des Nuclear Complex Co-IP-Kits (Active Motif) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: MYC oder ß-Actin, Cell Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 und Histon H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 und BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) und FLAG M2, Sigma.

Immunhistochemie

Die Immunhistochemie wurde gemäß veröffentlichten Verfahren durchgeführt [20]. Die Mäuse wurden anästhesiert und intrakardial mit 4% Paraformaldehyd in PBS perfundiert. Das Gehirn wurde mit 30% Sucrose kryogeschützt und dann eingefroren und bis zur Verwendung bei -80 ° C gelagert. Koronale Schnitte (40 & mgr; m) wurden auf einem Kryostaten geschnitten und für die Immunhistochemie verarbeitet. Frei schwimmende Schnitte wurden in einem Blockierungspuffer, der 0.3% Triton und 3% normales Eselserum enthielt, vorinkubiert. ΔFosB wurde unter Verwendung eines polyklonalen Ziegen-Antikörpers nachgewiesen, der gegen den N-terminalen Teil des Proteins (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology) gerichtet war. PSMC5 wurde unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA) nachgewiesen. Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop (60x-Vergrößerung; Zeiss) aufgenommen.

Lokomotorische Sensibilisierung

Alle Mäuse erhielten täglich IP-Injektionen von Salzlösung für 3-Tage, um sie an den Stress der Injektionen zu gewöhnen. Am nächsten Tag wurde den Mäusen IP Kochsalzlösung oder eine unterschwellige Dosis Kokain (7.5 mg / kg; siehe oben Tiere) injiziert und sofort in neuartige Bewegungsboxen gegeben. Die lokomotorische Aktivität der Mäuse wurde unter Verwendung eines Photobeam-Systems als ambulanter Strahlenbruch für 30 min aufgezeichnet. Diese Behandlungen wurden täglich für 3-Tage wiederholt.

Viraler Gentransfer

Wir haben ausführlich publizierte Methoden für viral vermittelten Gentransfer verwendet [7,8,11,19]. Kurz gesagt, wurden Expressionsplasmide für PSMC5 oder für mehrere seiner Mutanten (siehe oben PSMC5- und & Dgr; FosB-Konstrukte) in das bicistronische p1005 (+) HSV-Plasmid, das GFP unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert, und PSMC5 oder seine Mutanten unter das der cDNA subkloniert IE4 / 5-Promoter. Unter Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg) -Anästhesie wurden Mäuse in einem stereotaktischen Kleintier-Instrument positioniert und die kraniale Oberfläche wurde exponiert. Dreiunddreißig-Gauge-Spritzennadeln wurden verwendet, um 0.5 & mgr; l eines HSV-Vektors bilateral in die NAc bei einem 10 ° -Winkel (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) mit einer Rate von 0.1 & mgr; l / min zu infundieren. Tiere, die HSV-Injektionen erhielten, konnten sich für 2 Tage nach der Operation vor dem Experiment erholen.

Statistiken

ANOVAs und Student-T-Tests wurden verwendet, korrigiert für mehrere Vergleiche, wobei die Signifikanz auf p <0.05 eingestellt war.

Die Ergebnisse

PSMC5: neuer Bindungspartner von ΔFosB

Wir führten vorbereitende Experimente durch, um ein geeignetes Fragment von ΔFosB zu identifizieren, das als Köder in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Test diente, ohne das System zu aktivieren. Holo-ΔFosB induzierte die Reportergenaktivität selbst, ebenso wie das N-terminale 1-78-Aminosäurefragment des Proteins. Ein N-terminales verkürztes ΔFosB (Abb. 1A), bezeichnet als Δ2ΔFosB, dem die ersten 78-Aminosäuren des Proteins fehlen, hatte diesen Effekt nicht. Daher verwendeten wir Δ2ΔFosB als Köderprotein.

Um nach potentiellen Bindungspartnern zu suchen, verwendeten wir eine in pPC86 subklonierte Maus-Gehirn-Bibliothek. Wir haben 11-Kandidaten für Bindungspartner identifiziert. Obwohl diese Proteine ​​die bekannten Heterodimerisierungspartner von ΔFosB, c-Jun und JunD (Tabelle 1) war PSMC5 der bei weitem am häufigsten vorkommende Kandidat. Obwohl dies überraschend war, war dies ein interessantes Ergebnis, da PSMC5 vor Jahren in einem einzigen Bericht gezeigt wurde, dass es in vitro an c-Fos bindet [21]. Es gibt jedoch keine früheren Berichte über die Beteiligung von PSMC5 an der Kokain-Aktion. Aufgrund der Stärke des PSMC5-Signals im Hefe-Zwei-Hybrid-Assay wollten wir jedoch weitere mögliche ΔFosB-PSMC5-Wechselwirkungen untersuchen.

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Tabelle 1 Ergebnisse des Yeast Two-Hybrid Screening mit Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Um die physikalische Interaktion zwischen ΔFosB und PSMC5 zu bestätigen, führten wir zunächst In-vitro-Co-Immunpräzipitationsexperimente durch. Wir fanden, dass FLAG-markierte PSMC5 (Bild 1B), in Neuro-2A-Zellen transfiziert, effektiv ΔFosB (Bild 1C). Zweitens, um die Region in PSMC5 zu identifizieren, die für die Bindung an ΔFosB verantwortlich ist, erzeugten wir mehrere FLAG-markierte PSMC5-Mutanten (Bild 1B) und wiederholte das Co-Immunpräzipitationsexperiment. ΔFosB wurde effektiv mit den N-terminalen 151-Aminosäuren von PSMC5 (PSMC5-NT), aber nicht mit dem C-terminalen 172-Aminosäurefragment des Proteins (PSMC5-CT) (Bild 1C). PSMC5, dem seine Coiled-Coil-Domäne fehlte (PSMC5-ΔCC), war ebenfalls beim Ausfällen von ΔFosB unwirksam. Diese Befunde legen nahe, dass PSMC5 ΔFosB über seine Coiled-Coil-Domäne (Aminosäuren 27-68) bindet. Darüber hinaus fällte FLAG-markiertes PSMC5 keine mutierte Form von ΔFosB mit einer mutierten Leucin-Zipper-Domäne (ΔFosB-LZM) (Bild 1C), was darauf hindeutet, dass ΔFosB entweder PSMC5 durch diese Domäne bindet, oder wahrscheinlicher, dass die ΔFosB-Heterodimerisierung für die PSMC5-Bindung erforderlich ist.

PSMC5-ΔFosB-Bindung in NAc nach chronischer Kokainverabreichung

Basierend auf diesen Ergebnissen in vitro untersuchten wir, ob PSMC5-Spiegel im NAc als Reaktion auf chronische Kokainverabreichung verändert sind. Wir fanden durch subzelluläre Fraktionierung und Western-Blotting, dass chronisches Kokain die nukleären Spiegel von PSMC5 in dieser Hirnregion ohne eine Veränderung der cytoplasmatischen Spiegel erhöht (Abb. 2A). Dieser Effekt wurde nach Einzeldosen von Kokain nicht beobachtet (Daten nicht gezeigt). Als Nächstes untersuchten wir die Lokalisation von PSMC5 und ΔFosB in NAc durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie. Wir analysierten Mäuse 24 hr nach der letzten wiederholten Dosis von Kokain, ein Zeitpunkt, zu dem ΔFosB das einzige nachweisbare ist FosB Genprodukt (siehe Nestler 2008). Wir fanden starke PSMC5-Immunoreaktivität in der NAc, einschließlich eines starken Kernsignals. ~ 85% der ΔFosB + -Kerne, die für PSMC5 mitgefärbt wurden (Bild 2B). Zusätzlich führten wir Co-Immunopräzipitationsexperimente mit NAc-Extrakten durch und fanden, dass nach wirksamer Kokainbehandlung ΔFosB effektiv durch einen Anti-PSMC5-Antikörper (Bild 2C). Im Gegensatz dazu ergab die Analyse von nicht-naiven NAc (nach wiederholten Kochsalzinjektionen) keinen nachweisbaren ΔFosB-Pulldown (Daten nicht gezeigt). Diese Daten stimmen mit unseren Ergebnissen in Zellkultur überein und bestätigen, dass ΔFosB und PSMC5 in vivo in der NAc interagieren.

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Bild 2. PSMC5-Regulierung in Maus-NAc.

 

A. Western Blot von nuklearen und cytosolischen Fraktionen von NAc von Mäusen, die 20 Tage lang täglich mit Kochsalzlösung oder Kokain (7 mg / kg) behandelt wurden, wobei die Tiere 24 Stunden nach der letzten Injektion analysiert wurden. Kokain erhöht die nuklearen, aber nicht die zytosolischen PSMC5-Spiegel. Histon H3 und ß-Actin, die nicht durch Kokain beeinflusst wurden, wurden als Beladungskontrollen verwendet. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM (n = 8–10 / Gruppe, * p <0.05). B. Die Co-Lokalisierung von endogenem PSMC5 (grün) und ΔFosB (blau) in NAc von Mäusen, die chronisch mit Kokain wie in AC behandelt wurden. Kernlysate von Maus-NAc nach chronischer Kokainbehandlung wurden einer Immunpräzipitation mit Anti-PSMC5-Antikörper oder Maus-IgG als Kontrolle unterzogen und dann Western Blot mit Anti-FosB / ΔFosB-Antikörper. Die Abbildung zeigt PSMC5-ΔFosB-Wechselwirkungen in der NAc in vivo. Die Daten in B und C wurden in jedem der drei getrennten Experimente dreifach repliziert.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 verstärkt die Expression von ΔFosB in vitro

Da PSMC5 ein bekanntes Mitglied des Proteasomkomplexes ist, haben wir getestet, ob es ΔFosB-Spiegel unter Verwendung von Ratten-1A-Zellen reguliert. Die Überexpression von PSMC5 hatte keinen Einfluss auf die Basalwerte von ΔFosB, verursachte jedoch eine kleine, aber signifikante Verstärkung der ΔFosB-Induktion bei Serumstimulation der Zellen (Abb. 3A). Ein ähnlicher Trend wurde für FosB in voller Länge beobachtet, aber der Effekt erreichte keine statistische Signifikanz. Umgekehrt beeinflusste die Unterdrückung der endogenen PSMC5-Expression in Ratten-1A-Zellen, die durch die Verwendung von siRNAs, die auf PSMC5 abzielen, erreicht wurde, nicht die basale ΔFosB-Konzentration, sondern stark die ΔFosB-Induktion durch Serum-Stimulation (Bild 3B). Ähnliche Effekte wurden für FosB in voller Länge beobachtet. Diese Daten legen nahe, dass PSMC5 nicht den proteasomalen Abbau von ΔFosB fördert, wie es als Kernuntereinheit des Proteasoms erwartet werden könnte, sondern stattdessen für die maximale Akkumulation von FosB Genprodukte in vitro, vielleicht durch Stabilisierung der Proteine.

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Bild 3. PSMC5-Regulation der FosB / ΔFosB-Expression in Ratten-1A-Zellen.

 

A. Ratten-1A-Zellen wurden mit 4 & mgr; g PSMC5 oder Kontroll-DNA transfiziert. Die Überexpression von PSMC5 hatte keinen Einfluss auf die durch Western Blot bestimmten basalen Expressionsniveaus von FosB- oder ΔFosB-Protein, führte jedoch zu einem kleinen, aber signifikanten Anstieg der Induktion von ΔFosB durch Serumstimulation (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Ratten-1A-Zellen wurden mit 5 pmol einer von zwei siRNAs oder Rührei-RNA (Kontrolle) transfiziert. Beide siRNAs verringerten effektiv die PSMC5-Proteinspiegel im Vergleich zu den Kontrollbedingungen (siRNA Nr. 1, 23 ± 5% der Kontrolle; siRNA Nr. 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). PSMC5-Knockdown hatte keinen Einfluss auf die Grundwerte von FosB oder ΔFosB, schwächte jedoch die Induktion von FosB und ΔFosB durch Serumstimulation ab (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB und PSMC5 bilden Komplexe mit CBP, p300 und BRG1 in NAc

Um die Transkriptionsmechanismen, durch die PSMC5 die ΔFosB-Funktion beeinflussen könnte, besser zu verstehen, untersuchten wir mögliche zusätzliche Bindungspartner für die beiden Proteine ​​in der NAc unter chronischen Kokain-behandelten Bedingungen. Es gibt einen Bericht, dass PSMC5 an CBP-a-HAT bindet und die Histon-H3-Acetylierung am proximalen MHC-II-Promotor in HeLa-Zellen erhöht [22]. Darüber hinaus zeigen Mäuse, denen CBP fehlt, eine verminderte Verhaltenssensitivität gegenüber Kokain sowie eine verminderte Histonacetylierung bei FosB Förderer [23]. Wir testeten daher, ob PSMC5 mit ΔFosB als Teil von Komplexen, die auch CBP und möglicherweise andere Transkriptionsaktivatoren enthalten, binden könnte.

Wir haben zuerst gezeigt, dass ΔFosB sowohl CBP als auch p300, einen verwandten HAT, in Neuro2A-Zellen (Abb. 4A). Im Gegensatz dazu zeigte die Leucin-Zipper-Mutantenform von & Dgr; FosB, wie erwartet, diese Aktivität nicht. In ähnlicher Weise hat PSMC5 CBP und p300 (Bild 4B). Interessanterweise wurde dieser Effekt auch für PSMC5-ΔCC beobachtet, das ΔFosB nicht herunterzog, was anzeigt, dass PSMC5 mit CBP und p300 über andere Domänen des Proteins und unabhängig von seiner Bindung an ΔFosB interagiert.

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Bild 4. ΔFosB und PSMC5 interagieren mit CBP, p300 und BRG1 in vitro und in vivo.

 

A. Neuro2A-Zellen wurden mit 2.4 & mgr; g MYC-markiertem & Dgr; FosB oder MYC-markiertem & Dgr; FosB-LZM transfiziert. Zellextrakte wurden mit Anti-CBP- oder Anti-p300-Antikörper immunpräzipitiert, und Präzipitate wurden Western-Blotting mit dem gleichen Antikörper oder mit Anti-MYC-Antikörper durchgeführt. Sowohl CBP als auch p300 interagieren mit ΔFosB und solche Wechselwirkungen erfordern einen intakten Leucin-Zipper. B. Neuro2A-Zellen wurden mit 2.4 & mgr; g FLAG-markiertem PSMC5 oder FLAG-markiertem PSMC5-& Dgr; CC transfiziert. Zellextrakte wurden mit Anti-CBP- oder Anti-p300-Antikörper immunpräzipitiert, und Präzipitate wurden mit dem gleichen Antikörper oder mit Anti-FLAG-Antikörper Western-geblottet. Sowohl CBP als auch p300 interagieren mit PSMC5 und solche Interaktionen erfordern keine CC-Domäne. C. Kernlysate von Maus-NAc nach chronischer Kokainbehandlung wurden einer Immunpräzipitation mit Anti-CBP- oder Anti-p300-Antikörper unterzogen. Nachfolgendes Western-Blotting der resultierenden Präzipitate mit Anti-FosB / ΔFosB-Antikörper zeigte endogene Interaktionen zwischen ΔFosB und CBP / p300. D. Aliquots derselben Kernlysate wurden einer Immunpräzipitation mit anti-BRG1- oder anti-PSMC5-Antikörper unterzogen, gefolgt von Western-Blotting von Präzipitaten mit anti-FosB / ΔFosB- oder anti-BRG1-Antikörper. Die Ergebnisse zeigen endogene Wechselwirkungen zwischen ΔFosB und BRG1 und BRG1 und PSMC5. E. Schematische Darstellung des Transkriptionsaktivierungskomplexes aus ΔFosB: JunD-Heterodimeren, die mit CBP / p300, BRG1 und PSMC5 interagieren.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Um zu bestätigen, dass diese Wechselwirkungen auch in vivo auftreten, verabreichten wir chronisch Kokain, um ΔFosB- und nukleäre PSMC5-Spiegel zu induzieren, und anschließend immunpräzipitierte NAc-Extrakte mit Anti-CBP- oder Anti-p300-Antikörpern. In Übereinstimmung mit unseren Zellkulturdaten hat die Immunpräzipitation von CBP oder von p300 ΔFosB (Bild 4C). Wir testeten, ob BRG1, eine Kernuntereinheit des SWI-SNF-Chromatin-Remodelling-Komplexes, auch an ΔFosB und PSMC5 binden könnte, basierend auf unseren früheren Befunden, dass BRG1 zusammen mit ihrer Aktivierung in NAc nach chronischem Kokain für bestimmte ΔFosB-Zielgene rekrutiert wird [24]. Wir fanden heraus, dass die Immunopräzipitation von BRG1 ΔFosB in NAc-Extrakten abbaut und dass die Immunpräzipitation von PSMC5 ebenfalls endogenes BRG1 co-präzipitierte (Bild 4D). Zusammengefasst legen diese Ergebnisse nahe, dass ΔFosB-PSMC5 Komplexe in NAc bilden, die auch CBP / p300 und BRG1 (Bild 4E).

PSMC5 Überexpression erhöht lokomotorische Reaktionen auf Kokain

Die prominente Bindung von PSMC5 mit ΔFosB in NAc veranlasste uns zu untersuchen, ob steigende PSMC5-Spiegel in dieser Gehirnregion Verhaltensreaktionen auf Kokain regulieren. Wir erzeugten einen Herpes Simplex Virus (HSV) Vektor, der entweder Wildtyp PSMC5 oder eine seiner Mutanten überexprimiert und die Vektoren in NAc in vivo validierte (Abb. 5A). Viral-vermittelte Expression von PSMC5 überwiegt im Zellkern (Bild 5B). Mäuse, die Wildtyp-PSMC5 überexprimierten, zeigten keine veränderten Reaktionen auf die Anfangsdosen von Kokain, zeigten jedoch eine erhöhte lokomotorische Aktivierung als Reaktion auf wiederholte Kokaindosen im Vergleich zu GFP-exprimierenden Kontrollmäusen. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die eine mutierte Form von PSMC5, die keine Coiled-Coil-Domäne (PSMC5-ΔCC) aufweist, überexprimieren, diesen Effekt nicht (Bild 5B). Interessanterweise verstärkte die Überexpression von PSMC5-K196M, dem die ATPase-Aktivität des Wildtyp-Proteins fehlt, auch die lokomotorischen Reaktionen des Kokains.

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Bild 5. PSMC5-Überexpression in NAc erhöht lokomotorische Reaktionen auf Kokain.

 

A. Repräsentative HSV-vermittelte Transgenexpression in medialer NAc. AC, vordere Kommissur. NAc-Kern- und Schalen-Subregionen sind in der Figur angegeben. B. Repräsentative höhere Vergrößerungen (60x) der immunhistochemischen Färbung von PSMC5 in NAc-Neuronen nach HSV-PSMC5-Injektion, was zeigt, dass das Protein vorwiegend nuklear ist, wie durch DAPI-Färbung markiert. C. Mäuse erhielten bilaterale HSV-Injektionen in NAc, gefolgt von täglichen IP-Injektionen von Kokain-Unterschwellendosen (7.5 mg / kg). Die Reaktionen des Bewegungsapparates werden als Reaktion auf die erste und letzte von drei täglichen Dosen des Arzneimittels gezeigt. Die Überexpression von PSMC3 oder PSMC5-K5M erhöht die Bewegungsreaktionen auf wiederholtes Kokain, ein Effekt, der bei PSMC196-ΔCC nicht beobachtet wird. Es gab keine signifikante Wirkung der Transgene auf die lokomotorischen Reaktionen auf anfängliche Kokain-Dosen. ANOVA F (5) = 3,125, * p <4.163 nach Dunnetts Post-Hoc-Test.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Diskussion

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen einen neuen Mechanismus, durch den ΔFosB seine Auswirkungen auf das Gehirn und einen neuen Mechanismus der Kokainwirkung vermittelt. Unter Verwendung eines unvoreingenommenen Ansatzes, einem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay, identifizierten wir PSMC5 als einen neuen Bindungspartner für ΔFosB. Wir haben diesen Befund sowohl in kultivierten Zellen in vitro als auch in NAc in vivo durch Demonstration der robusten PSMC5-ΔFosB-Bindung validiert. Wichtig ist, dass die nukleären Spiegel von PSMC5 in NAc durch chronische Kokain-Verabreichung induziert werden. Wir zeigten weiter, dass die PSMC5-ΔFosB-Bindung zusammen mit mehreren anderen Transkriptionsaktivatorproteinen auftritt, nämlich CBP und p300 (zwei HATs) und BRG1 (ein Schlüsselbestandteil von SWI-SNF-Chromatin-Remodelling-Komplexen). Zusammenfassend stützen unsere Ergebnisse die Hypothese, dass PSMC5 Teil des Transkriptionsaktivierungskomplexes ist, der im Verlauf der chronischen Kokainverabreichung für mindestens bestimmte ΔFosB-induzierte Gene rekrutiert wird (Bild 4E). Übereinstimmend mit dieser Hypothese ist der zusätzliche Befund, dass die Überexpression von PSMC5 in NAc, wie die Überexpression von ΔFosB selbst, Verhaltensreaktionen auf Kokain fördert. In zukünftigen Studien wäre es interessant, diese In-vivo-Beobachtungen mit der Charakterisierung von PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1-Wechselwirkungen unter Verwendung von in vitro-Reporter-Assays zu verfolgen.

Die Beteiligung von PSMC5 an Kokain ist völlig neuartig. Ursprünglich wurde PSMC5 als Mitglied einer großen Familie von ATPasen identifiziert, die das Proteasom bilden, und es wurde im Laufe der Jahre gezeigt, dass es mit mehreren Transkriptionsfaktoren einschließlich c-Fos, p53, nukleären Hormonrezeptoren und Bestandteilen des basalen Transkriptionskomplexes interagiert.25] wurden jedoch im Laufe der Jahre nur wenige funktionelle Studien durchgeführt [26]. Seine am besten etablierte Wirkung ist die Förderung der Aktivität von MYC-Transkriptionsfaktoren in kultivierten Zellen [27]. Die Implikation von PSMC5 in transkriptionelle Mechanismen hat eine mögliche Rolle für Ubiquitinierung-proteasomale Aktivität in der Regulierung der Gentranskription angedeutet, aber die Beteiligung von PSMC5 an einer solchen Regulation ist bis heute praktisch ungetestet [28,29].

Über die PSMC5-Funktion im Gehirn ist sehr wenig bekannt. Eine frühere Studie zeigte eine weit verbreitete Expression von PSMC5 mRNA im gesamten Gehirn [30], aber seine funktionelle Aktivität wurde nicht untersucht. Unsere Ergebnisse veranlassen nun weitere Untersuchungen dieses interessanten Proteins, um seine Rolle bei der Regulierung der Gentranskription und ihre Beziehung zu Ubiquitinierung-Proteasom-Funktion im Gehirn besser zu verstehen. Die Bindung von PSMC5 an ΔFosB wird durch die Coiled-Coil-Domäne von PSMC5 vermittelt. Darüber hinaus erfordert die Fähigkeit von PSMC5, lokomotorische Reaktionen auf Kokain zu fördern, während die Coiled-Coil-Domäne benötigt wird, nicht die ATPase-Aktivität, die dem Protein innewohnt. Diese Ergebnisse erhöhen die Möglichkeit, dass zumindest in unserem System die Hauptaktivität von PSMC5 durch seine Bindung an & Dgr; FosB und andere Transkriptionsregulationsproteine ​​und nicht durch seine proteasomal-bezogene Aktivität per se vermittelt wird. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um diese und alternative Möglichkeiten direkt zu testen. Die Hypothese, dass die virale Überexpression von PSMC5 lokomotorische Reaktionen auf Kokain über Wechselwirkungen mit ΔFosB erhöht, ist trotz der Verwendung eines 3-Tages-Kokain-Behandlungsplans plausibel, da bekannt ist, dass innerhalb dieses Zeitrahmens nennenswerte Konzentrationen von ΔFosB im Gehirn akkumulieren [3].

Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen den Nutzen der Verwendung unvoreingenommener, experimenteller Ansätze mit offenem Ende bei der Untersuchung der molekularen Grundlagen der Hirnregulation. Unsere erste Aufmerksamkeit auf PSMC5 basierte ausschließlich auf seiner prominenten Bindung an ΔFosB in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay, doch scheint es ein wichtiger Bestandteil von Transkriptionsänderungen zu sein, die in NAc durch wiederholte Kokainverabreichung rekrutiert werden. Ein besseres Verständnis der detaillierten Mechanismen, durch die PSMC5-Nuklearspiegel durch Kokain induziert werden, und von denen wiederum PSMC5 zu Kokain-induzierten Transkriptionsaktivierungskomplexen beiträgt, sind Gegenstand aktueller Untersuchungen. Unser Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zeigte mehrere zusätzliche mutmaßliche Bindungspartner von ΔFosB (Tabelle 1), die jetzt auch eine direkte Untersuchung in Kokainmodellen rechtfertigen. Zusammen tragen diese Arbeiten zu einem wachsenden Verständnis der komplexen molekularen Mechanismen bei, durch die Kokain die NAc-Funktion verändert.

Anerkennungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Nationalen Instituts für Drogenmissbrauch sowie der Ishibashi Foundation und der Japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (KAKENHI-Nummern: 24591735, 26290064, 25116010) unterstützt.

Autorenbeiträge

Konzipiert und gestaltet die Experimente: YHO YNO EJN. Führte die Experimente durch: YHO YNO PJK RN. Analysiert die Daten: YHO YNO EJN. Mitwirkende Reagenzien / Materialien / Analysewerkzeuge: TN MO OY AN RN TT. Schrieb das Papier: YHO EJN.

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