Receptores de CRF no nucleus accumbens modulam a preferência de parceiros em pragas da pradaria (2007)

Horm Behav. Manuscrito do autor; disponível no PMC Dec 10, 2007.

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PMCID: PMC2128037

NIHMSID: NIHMS22254

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Sumário

Evidências recentes sugerem um papel para o fator de liberação de corticotropina (CRF) na regulação da união de pares em pragas de pradaria. Mostramos anteriormente que espécies de ratazanas monogâmicas e não monogâmicas possuem distribuições drasticamente diferentes do tipo de receptor de CRF 1 (CRF1) e receptor tipo CRF 2 (CRF2) no cérebro, e esse CRF1 e CRF2 as densidades de receptores no nucleus accumbens (NAcc) estão correlacionadas com a organização social. Pradarias monogâmicas e pinheiros têm níveis significativamente mais baixos de receptores tipo CRF 1 (CRF1) e níveis significativamente mais altos do tipo 2 (CRF2) ligação, em NAcc, de campas não-monogâmicas e montanhesas. Aqui, nós relatamos que microinjeções de CRF diretamente no NAcc aceleram a formação de preferências de parceiros em machos da pradaria. As injeções de controle de CSF em NAcc, e CRF em putamen de caudate, não facilitaram a preferência de parceiro. Da mesma forma, as injeções de CRF no NAcc de ratos de prado não monogâmicos também não facilitaram a preferência do parceiro. Em ratos da pradaria, este efeito de facilitação do CRF foi bloqueado pela co-injeção de CRF1 ou CRF2 antagonistas do receptor em NAcc. Coloração imunocitoquímica para CRF e Urocortina-1 (Ucn-1), dois ligantes endógenos para DRC1 ou CRF2 receptores no cérebro, revelou que o CRF, mas não o Ucn-1, fibras imunorreativas estavam presentes no NAcc. Isso apóia a hipótese de que a liberação local do CRF no NAcc poderia ativar o CRF1 ou CRF2 receptores na região. Em conjunto, nossos resultados revelam um novo papel para os sistemas de ACR no comportamento social.

Palavras-chave: nucleus accumbens, ligação, CRF1, CRF2, fator de liberação de corticotropina, hormônio liberador de corticotrofina, ratazana, receptores de neuropeptídeos, ligação de par, comportamento social, monogamia, diferenças de espécies

O sistema do fator liberador de corticotropina (CRF) está envolvido na neurobiologia subjacente ao estresse e ansiedade, mas muito menos é conhecido sobre seu papel no comportamento social. Os roedores de microtina exibem diversas organizações sociais e, portanto, oferecem uma excelente abordagem comparativa no estudo da neurobiologia do comportamento social (Jovem e Wang, 2004). Pradaria (Microtus ochrogaster) e de pinheiro (Microtus pinetorum) são monogâmicos; os companheiros adultos formam laços de par seletivos de longa duração no campo e no laboratório (Getz, Carter e Gavish, 1981; Salo, Shapiro e Dewsbury, 1993). Em contraste, prado proximamente relacionado (Microtus pennsylvanicus) e ratazanasMicrotus montanus) são promíscuos e solitários (Gruder-Adams e Getz, 1985; Shapiro e Dewsbury, 1990). Pesquisas anteriores revelaram que a distribuição do cérebro de receptores neuropeptídicos para a oxitocina e a vasopressina parece ser responsável pelas diferenças na organização social das espécies (Insel e Shapiro, 1992; Insel, Wang e Ferris, 1994; Lim, Wang, Olazabal, Ren, Terwilliger e Young, 2004b). No entanto, evidências mais recentes sugerem que outro sistema de neuropeptídeos, o CRF, também parece modular a união de pares em ratos da pradaria (DeVries, Guptaa, Cardillo, Cho e Carter, 2002).

Há relativamente poucos estudos examinando o papel dos hormônios do estresse no comportamento social. Um estudo descobriu que a administração de corticosterona exógena a ratos machos da pradaria facilitou a formação de ligações de par com uma fêmea nova (DeVries, DeVries, Taymans e Carter, 1996). Um estudo subseqüente descobriu que o CRF administrava a preferência de parceiro facilitada intracerebroventricularmente (icv) em ratos machos da pradaria, mesmo em doses extremamente baixas que não pareciam afetar a atividade locomotora ou o comportamento semelhante à ansiedade (DeVries et al., 2002). Além disso, a preferência do parceiro foi bloqueada pela administração icv de CRF alfa-helicoidal que bloqueia não seletivamente os receptores de CRF no cérebro (DeVries et al., 2002). Estes dados sugerem que o CRF pode desempenhar um papel na formação de ligações em pares através de mecanismos independentes da ansiedade, através do envolvimento de receptores cerebrais de ação central. No entanto, o CRF com infusão de icv poderia estar atuando em qualquer número de regiões do cérebro para facilitar a preferência do parceiro, e atualmente não se sabe quais regiões cerebrais estão especificamente envolvidas.

Uma vez que o sistema CRF foi implicado na regulação da formação de ligações de pares, previmos que os circuitos neurais para este sistema seriam diferentes entre espécies monogâmicas e não monogâmicas. Mostramos anteriormente que, embora as distribuições de mRNA e peptídeo do CRF pareçam altamente conservadas entre as espécies de argana, as distribuições dos tipos de receptor de CRF 1 e 2 (CRF1 e CRF2) diferem radicalmente em todo o cérebro em quatro espécies de arganazes que exibem diferentes organizações sociais (Lim, Nair e Young, 2005; Lim, Tsivkovskaia, Bai, Young e Ryabinin, 2006). A ligação do receptor pareceu correlacionar-se com a estrutura social monogâmica em várias regiões do cérebro; no entanto, apenas o nucleus accumbens (NAcc) segregou consistentemente com ambas as espécies de ratazana monogâmicas e ambas as espécies de ratazanas não monogâmicas. Pradarias monogâmicas e pinheiros têm níveis significativamente mais baixos de receptores tipo CRF 1 (CRF 1) e níveis significativamente mais altos do tipo 2 (CRF2) vinculativo, em NAcc, do que as campas não-monogâmicas de prado e montano (Lim et al., 2005).

Baseado em nossos estudos neuroanatômicos que demonstram diferenças de espécies no CRF1 e CRF2 Em NAcc, as densidades aumentaram a hipótese de que a ação de CRF dentro do NAcc, em particular, era crítica para o comportamento social monogâmico em prados de campo. Primeiro, determinamos se o CRF injetado diretamente no NAcc pode facilitar a formação de preferência do parceiro após um tempo de coabitação abreviado com o parceiro. Em seguida, realizamos o experimento idêntico em ratos-do-prado não monogâmicos. Então, nós manipulamos o CRF1 e CRF2 no NAcc usando antagonistas farmacológicos para determinar as suas contribuições relativas à formação de preferência de parceiros facilitada pelo CRF. Por fim, mostramos evidências de coloração imunorreativa de dois ligantes endógenos para DRC1 e CRF2 receptores no cérebro, CRF e Urocortin-1 (Ucn-1), em NAcc em ratos da pradaria. Os resultados desses estudos demonstram, pela primeira vez, que o CRF, atuando no NAcc, pode promover o apego social e, além disso, que tanto o CRF1 e CRF2 receptores estão envolvidos neste processo.

MÉTODOS

Assuntos

Os animais eram adultos, sexualmente ingênuos, prados masculinos e femininos (70-100 dias de idade) de uma colônia de reprodução de laboratório da Universidade Estadual da Flórida que eram originalmente derivados de ratos capturados no campo em Illinois, EUA. Os ratazanas adultas e ingênuas sexualmente ingênuas eram da colônia de reprodução de laboratório da Universidade Emory. Após o desmame aos 21 dias de idade, os indivíduos foram alojados em pares de irmãos do mesmo sexo ou trios e água e ração de coelho Purina fornecida ad libitum. Todas as gaiolas foram mantidas num ciclo 14: 10 luz: escuro com a temperatura a 20. Dados de machos de pradaria macho 87 foram incluos nas expericias de farmacologia de CRF, juntamente com neros iguais de ratazanas de pradaria femininas para o ensaio de ligao em pares. Dados de machos de prado machos 10 também foram usados, junto com números iguais de fêmeas de prado fêmeas de estímulo. Oito pradarias foram utilizadas nos estudos de imunocitoquímica do CRF (n = 4 para cada sexo).

Facilitação de CRF da preferência de parceiros

Machos de pradaria machos adultos (n = 31) foram canulados bilateralmente em NAcc usando métodos estereotáxicos como descrito anteriormente (Aragona, Liu, Curtis, Stephan e Wang, 2003a; Liu e Wang, 2003). Os indivíduos foram anestesiados com pentobarbital sódico (2.5 mg por 40 gm peso corporal), e as cânulas guia bilaterais 26 (Plastics One, Roanoke, VA) destinadas ao NAcc foram implantadas estereotaxicamente (Anterior 1.7 mm, Bilateral ± 1 mm, Ventral-4.0 mm para bregma). Injeções de controle (n = 6) foram destinadas ao putâmen-caudado (Anterior 1.7 mm, Bilateral ± 1 mm, Ventral-2.5 mm para bregma). Após a recuperação dos dias 3 – 5, os indivíduos receberam microinjeções (200 nl por lado) de qualquer LCR artificial ou medicamento dissolvido no LCR. As injeções foram feitas com uma agulha de calibre 33 que estendeu 1 mm abaixo da cânula guia para a área alvo. A agulha foi conectada a uma seringa Hamilton (Hamilton, Reno, NV) através de tubos de polietileno-20, através dos quais a solução foi infundida lentamente por uma bomba (unidade padrão MasterFlex L / S, Modelo 7016-21) a uma velocidade de 200 nl / min, por lado. O CRF humano / de rato foi obtido da Sigma (St. Louis, MO).

Os animais foram divididos em um de quatro grupos: controle do LCR (n = 7), 0.01 pg CRF em NAcc (n = 9), 0.1 pg CRF em NAcc (n = 15) e 0.1 pg CRF em putâmen caudado (n = 6). O putâmen-caudado (CP) é uma região do cérebro apenas dorsal ao NAcc e também contém CRF2 receptores, servindo, assim, como uma região anatômica de controle dos efeitos da CRF. Cada animal recebeu injeções bilaterais de volume 200 nl antes de uma coabitação abreviada de 6 hora com uma fêmea nova. A concentração de 0.01 pg CRF em 200 nL é 10 nM, enquanto a concentração de 0.1 pg CRF em 200 nL é 100 nM. O K calculadoi para CRF1 é 11 nM, enquanto o Ki calculado para CRF2 é 25 nM relativo a 125I-sauvagina (Primus, Yevich, Baltazar e Gallager, 1997). A coabitação para as horas 6 sem acasalamento consistentemente não induz a preferência do parceiro, como demonstrado em estudos anteriores (Aragona e outros, 2003a; Aragona, Liu, Yu, Curtis, Detwiler, Insel e Wang, 2006). Imediatamente após a coabitação, os participantes foram testados quanto à preferência do parceiro.

O teste de preferência do parceiro consistiu em colocar o macho em um aparelho com câmara 3 no qual a parceira estava presa em uma gaiola, e uma fêmea nova (“estranha”) da mesma idade e experiência sociosexual estava amarrada em uma segunda gaiola, como anteriormente descrito (Carter, DeVries e Getz, 1995). Cada estímulo feminino foi usado em dois testes separados de preferência de parceiros, uma vez como parceiro e novamente como estranho de outro sujeito e, portanto, cada fêmea teve exposição social e sexual equivalente durante a coabitação de horas 20. Os indivíduos foram autorizados a vagar livremente por todo o aparelho, e o tempo gasto em contato com o parceiro e com o estranho foi quantificado ao longo do teste da hora 3.

A atividade locomotora foi medida durante o teste de preferência do parceiro para determinar se as doses escolhidas de tratamento com CRF afetavam a atividade locomotora geral ou o comportamento semelhante à ansiedade, como descrito anteriormente (Hotta, Shibasaki, Arai e Demura, 1999). O número de cruzamentos de gaiola através de ambos os túneis do aparelho de preferência de parceiros foi avaliado usando detectores de infravermelho. Existem quatro feixes infravermelhos nas três gaiolas do aparelho de preferência de parceiros, com dois feixes flanqueando cada túnel conectando duas gaiolas. O número total de quebras foto feixe foi totalizado para cada animal durante o período de três horas. Após o teste comportamental, os participantes foram sacrificados e os locais de injeção foram verificados histologicamente.

Ratazanas adultas machos (n = 10) também foram testadas para facilitação de CRF de preferência de parceiros. Os animais foram canulados bilateralmente em NAcc como descrito acima e distribuídos aleatoriamente em um de dois grupos: controle do LCR (n = 4) ou CRF 0.1 pg (n = 6). Os testes de coabitação e de preferência de parceiros foram realizados exatamente como descrito acima para ratos da pradaria. Os ratazanas adultas machos da nossa colónia normalmente não formam preferências de parceiros quando coabitam com uma fêmea (Lim et al., 2004b).

CRF1- e CRF2farmacologia seletiva e preferência de parceiro

As ratazanas adultas das pradarias foram canuladas bilateralmente em NAcc como descrito acima e divididas em um de três grupos: 0.1 pg CRF (n = 10), 0.1 pg CRF mais 10 pg CRF1 antagonista (CP-154,526) (n = 25) e 0.1 pg CRF mais 10 pg CRF2 antagonista (anti-sauvagina-30) (n = 15). O anti-sauvagine-30 foi obtido da Sigma (St. Louis, MO) e o CP-154,526 da Michael Owens, Ph.D. (Emory University, Atlanta, GA). A concentração de 10 pg CRF1 O antagonista de oxigénio (CP-154,526) na solução 200 nL é 100 nM, enquanto a concentração de 10 pg CRF2 O antagonista (anti-sauvagina-30) na solução 200 nL é 10 nM. Cada animal recebeu injeções bilaterais de volume de 200 nl diretamente no NAcc antes de uma coabitação de hora 6 abreviada com uma fêmea nova. Imediatamente após a coabitação, os participantes foram testados quanto à preferência do parceiro como descrito acima. Após o teste comportamental, os participantes foram sacrificados e os locais de injeção foram verificados histologicamente. Os animais cujos locais de canulação foram colocados fora do NAcc foram excluídos da análise de dados e não foram refletidos no número total de animais utilizados.

Análise de Dados

Os dados do teste de preferência de parceiros para cada experimento foram analisados ​​usando um ANOVA do modo 2 no qual o estímulo (parceiro ou estranho) e o tratamento foram fatores. Além disso, os testes t de Student foram usados ​​para comparar o tempo em contato com o parceiro e o estranho dentro de cada grupo de tratamento. As correções de Bonferroni para o nível de significância foram feitas para cada experimento a fim de minimizar o risco de erro de erro do tipo I devido a comparações múltiplas. Os homens foram categorizados como tendo desenvolvido uma preferência de parceiro se passaram mais do que o dobro do tempo em contato com o parceiro do que o estranho.

Os dados coletados para a atividade locomotora foram somados como o número de quebras do feixe de infravermelho para cada animal e a média de cada grupo de tratamento. Os resultados foram analisados ​​usando um one-way ANOVA com tratamento como o fator independente.

Imuno-histoquímica com CRF e Urocortina-1

As ratazanas adultas das pradarias foram profundamente anestesiadas entre as horas de 10: 00 e 14: 00 com isoflurano e perfundidas com solução salina seguida de 2% paraformaldeído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 10 mM (pH 7.4). Os cérebros dissecados foram pós-fixados durante a noite na solução de 2% paraformaldeído / PBS e crioprotegidos em 30% de sacarose / PBS. Cortes coronais flutuantes de 30 mm de espessura foram cortados em um criostato e processados ​​para imuno-histoquímica de acordo com os protocolos padrão (Ryabinin, Criado, Henriksen, Bloom e Wilson, 1997; Weitemier, Tsivkovskaia e Ryabinin, 2005) com ajustes para tecidos de ratazana feitos em experimentos anteriores (Lim et al., 2006). Resumidamente, a actividade da peroxidase endógena foi atenuada por incubação de 15 minutos com 0.3% de peróxido de hidrogénio. Para o anticorpo específico de Urocortina-1, o bloqueio foi realizado por incubação de cinco horas com 2% de albumina sérica bovina, 0.1% heparina, 0.01% Triton X-100 em PBS. Para o anticorpo específico para o CRF, o bloqueio foi realizado por uma incubação de cinco horas com 4.5% de soro de cabra, 0.3% de Triton X-100 em PBS. Os anticorpos primários de coelho que reconhecem Urocortina-1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram utilizados na diluição 1: 5,000. Os anticorpos primários que reconhecem o CRF (Peninsula Laboratories, San Carlos, CA) foram utilizados na diluição 1: 15,000. Anticorpos secund�ios anti-coelho biotinilados (Vector Laboratory Inc., Burlingame, CA) foram utilizados para detectar os anticorpos prim�ios. A detec�o dos anticorpos secund�ios foi feita utilizando o kit Vectastain ABC (Vector) e o desenvolvimento enzim�ico foi feito com o kit DAB Enhanced Metal (Pierce, Rockford, IL, EUA). A especificidade da imunocoloração foi avaliada por uma completa falta de imunorreatividade em áreas não conhecidas por expressarem CRF ou Urocortin-1. Além disso, os experimentos de pré-absorção de controle para esses anticorpos foram previamente realizados (Bachtell, Weitemier, Galvan-Rosas, Tsivkovskaia, Risinger, Phillips, Grahame e Ryabinin, 2003).

A análise de imagem qualitativa foi realizada usando um sistema que consiste em um microscópio Olympus BX40 e uma câmera de vídeo digital de alta resolução (Olympus Qcolor3) em interface com um computador pessoal Macintosh executando o OS-X. Imagens de uma única seção melhor combinadas entre os animais para cada região do cérebro foram coletadas digitalmente na mesma intensidade de iluminação. Uma vez que não foi observada coloração imunopositiva nos corpos celulares em NAcc, o número de neurónios imunorreactivos não foi contado quantitativamente.

RESULTADOS

Manipulação Farmacológica de Receptores de CRF em NAcc

Demonstrou-se previamente que a infusão de CRF icv facilita a preferência do parceiro em ratos-do-campo (DeVries et al., 2002). Com base em nossos dados neuroanatômicos demonstrando diferenças de espécies no CRF1 e CRF2 Na NAcc, supomos que o NAcc era o local de ação para a facilitação de preferências de parceiros pelo CRF. O estudo anterior mostrou que a administração icv de CRF dependente da dose poderia facilitar as preferências dos parceiros em machos da pradaria do sexo masculino após uma coabitação abreviada com uma fêmea (DeVries et al., 2002). Com base neste estudo, projetamos doses de CRF para injeções específicas do local no NAcc. As doses utilizadas, 0.1 pg e 0.01 pg CRF dissolvidas em solução isotónica de 200 nL (ou 100 nM e 10 nM, respectivamente), foram muito inferiores às doses mínimas eficazes de 0.1 ng e 1 ng CRF dissolvidas em 1 μL (ou 210 nM e 2.1 μM, respectivamente) (DeVries et al., 2002). Embora o CRF tenha se mostrado preferencialmente ligado ao CRF1, também se liga ao CRF2 com afinidade substancial (Ki igual a 11 e 25, respectivamente) (Primus et al., 1997).

A análise do conjunto de dados geral usando uma ANOVA de 2 fatores revelou um efeito principal significativo do animal de estímulo (F (1,66) = 6.77, p <0.05), mas nenhum outro efeito principal ou interação foi detectado. Para determinar quais grupos preferencialmente passaram mais tempo em contato com os parceiros em vez de estranhos, os testes t de Student foram realizados com correções de Bonferroni do valor p. Ratazanas da pradaria de controle com injeções bilaterais de CSF artificial no pólo septal NAcc, ou 0.1 pg CRF no putâmen-caudado, não passaram significativamente mais tempo em contato com o parceiro do que o animal de estímulo estranho (p> 0.3, teste t de Student , Nível de Bonferroni definido em p <0.01) (Figura 1A) Ratazanas da pradaria injetadas com a menor dose de CRF, 0.01 pg, tendiam a passar mais tempo em contato com o parceiro do que o estranho (p> 0.08, teste t de Student, nível de Bonferroni estabelecido em p <0.01). Em contraste, ratazanas da pradaria recebendo injeções bilaterais da dose de CRF 10 vezes maior, 0.1 pg no pólo septal NAcc, passaram significativamente mais tempo em contato com o parceiro do que o estranho (p <0.01, teste t de Student, nível de Bonferroni definido em p <0.01) (Figura 1A). Além disso, enquanto apenas 6 dos animais de controlo 13 exibiam uma preferência de parceiro, definida como passar duas vezes mais tempo em contacto com o parceiro em comparação com o estranho, 12 dos animais 15 que recebiam 0.1 pg de CRF exibiam uma preferência de parceiro (Figura 1B). Os animais 3 que não exibiram uma preferência de parceiro tinham fortes preferências estranhas, o que provavelmente contribuiu para a falta de um efeito principal do tratamento ou um efeito de interação na ANOVA de 2-way. Assim, enquanto as infusões de CRF no NAcc aumentaram significativamente o tempo de contato com o parceiro em relação ao estranho, isso não resultou em um aumento geral no tempo de contato com o parceiro.

Figura 1 

Microinjeções bilaterais de CRF na NAcc facilitam a preferência do parceiro em ratos machos da pradaria. (A) Os animais de controle que receberam LCR artificial no NAcc, ou 0.1 pg CRF no caudado-putâmen (CP), não preferiram significativamente o parceiro sobre ...

Devido às diferenças dramáticas de espécies no CRF1 e CRF2 densidades em NAcc, hipotetizamos que a ação de CRF dentro de NAcc só facilitaria a formação de preferência de parceiro em ratos-da-pradaria, e não em ratos-do-campo não monogâmicos. De fato, ratazanas do prado injetadas com CSF, ou a alta dose de 0.1 pg de CRF, não passam significativamente mais tempo em contato com o parceiro do que o estranho (p> 0.5, teste t de Student) (Figura 2).

Figura 2 

Microinjeções bilaterais de CRF no NAcc não facilitam a preferência do parceiro em ratos machos não-monogâmicos. Vespas adultas tratadas com CSF artificial, ou 0.1 pg de CRF no NAcc, não passaram mais tempo em contato com o parceiro do que ...

Baseado nas diferenças de espécies no CRF1 e CRF2 distribuição em NAcc, hipotetizamos que tanto o CRF1 e CRF2 iria modular o comportamento de preferência do parceiro, talvez em direções opostas. A análise do conjunto geral de dados usando uma ANOVA de 2 fatores revelou um efeito principal significativo do animal de estímulo (F (1,94) = 7.52, p <0.05), mas nenhum outro efeito principal ou interação foi detectado. Arganazes da pradaria injetados com um coquetel de 0.1 pg de CRF, mais 10 pg de CRF seletivo2 antagonista anti-sauvagina-30, não passou significativamente mais tempo com o parceiro ou o estranho (p> 0.3, teste t de Student, nível de Bonferroni estabelecido em p <0.016) (Figura 3A). Curiosamente, os ratos-do-mato injetados com um coquetel de 0.1 pg de CRF, além de 10 pg seletivo CRF1 antagonista CP-154,526-1, também mostrou um bloqueio da preferência do parceiro (p> 0.5, teste t de Student, nível de Bonferroni estabelecido em p <0.016) (Figura 3A) Ratazanas da pradaria de controle injetadas com 0.1 pg de CRF no NAcc foram testadas simultaneamente e foram encontradas para replicar os resultados originais de facilitação da preferência do parceiro (p <0.01, teste t de Student, nível de Bonferroni estabelecido em p <0.016) (Figura 3A). Além disso, enquanto 8 fora dos campos de pradaria tratados com 10 CRF mostrou uma preferência de parceiro, apenas 11 dos animais 25 receberam CRF1 antagonista e 6 de animais 15 que recebem CRF2 antagonista, exibiu uma preferência de parceiro (Figura 3B). Nossos resultados sugerem que a ativação de ambos os CRF1 e CRF2 Os receptores no NAcc são necessários para a facilitação induzida pelo CRF da preferência do parceiro em ratos da pradaria.

Figura 3 

Ambos CRF1 e CRF2 receptores no NAcc são necessários para a formação de preferência de parceiro facilitada por CRF em ratazanas da pradaria. (A) Animais injetados com 0.1 pg de CRF em NAcc passaram mais tempo em contato com o parceiro do que o estranho (p <0.01, Student's ...

A atividade locomotora não diferiu significativamente entre os grupos de tratamento (F (1,80) = 1.37, p> 0.05, ANOVA unilateral), embora a atividade locomotora tendesse a ser menor nos animais que receberam CRF no NAcc. Os resultados são mostrados em tabela 1. Uma seção de histologia representativa mostrando o local da canulação para o NAcc é mostrada em Figura 4.

Figura 4 

Verificação histológica da colocação da cânula. (a) O autorradiograma do receptor na metade esquerda descreve a localização do CRF2 em ratazana de pradaria NAcc. (b) Fotomicrografia representativa da secção do cérebro corada com Nissl mostrando a colocação da cânula terminando dentro de ...
tabela 1 

Atividade locomotora representada pelo número total de quebras de feixe infravermelho ou cruzamentos de gaiola, em média dentro de cada grupo de tratamento. Não há diferenças significativas entre os grupos de tratamento (F = 1.37, p> 0.05, ANOVA de uma via).

Imunorreatividade de CRF e Ucn-1 em NAcc

Para mostrar fotomicrografias de quais ligandos do receptor de CRF endógenos estão presentes no NAcc, realizamos imunorreatividade de CRF e Urocortin-1 (Ucn-1) em ratos adultos da pradaria. Seções representativas do cérebro processadas para imunocitoquímica do CRF são mostradas em Figura 5. As fibras imunorreativas ao CRF foram observadas no NAcc em ambos os sexos, sem diferenças óbvias na distribuição ou densidade das fibras (Figura 5b). Fibras Ucn-1 não foram detectadas em NAcc em machos ou fêmeas de pradaria (Figura 5c). Assim, é possível que o CRF seja um dos ligantes endógenos que poderiam fisiologicamente1 e CRF2 receptores na NACC para facilitar a preferência do parceiro. De nota, o CRF foi mostrado para ligar a ambos os CRF1 e CRF2, com afinidade de aproximadamente duas a dez vezes maior afinidade por CRF1 (Primus et al., 1997). No entanto, não podemos descartar a possibilidade de que outros ligantes endógenos, como Urocortin-2 ou Urocortin-3, também possam contribuir no controle neural da formação de pares de pontes.

Figura 5 

Imunorreatividade de CRF e Ucn-1 em pragas de capoeira. a) Diagrama do atlas do rato, mostrando a área da ampliação 10x do NAcc (ver rectângulo) (Paxinos e Watson, 1998). (b) Seção de ratazana de pradaria mostrando fibras imunorreativas a CRF em NAcc (ver setas). c) pradaria ...

DISCUSSÃO

Nos estudos anteriores, identificamos diferenças de espécies no CRF acumbal1- e CRF2 expressão que se correlacionou com a organização social em quatro espécies de ratazanas. Pradarias monogâmicas e pinheiros tiveram maiores níveis de CRF2 em NAcc e níveis mais baixos de CRF1 em NAcc, em comparação com espécies de ratazanas não-monogâmicas e de ratazanasLim et al., 2005). Com base nesses dados, levantamos a hipótese de que a ação de CRF dentro do NAcc foi fundamental para o comportamento social monogâmico em capoeiras de pradarias. No presente estudo, mostramos pela primeira vez que as microinjeções de CRF diretamente no NAcc facilitam de fato a preferência do parceiro em machos da pradaria. A análise ANOVA de duas vias detectou um efeito principal do estímulo animal, ou seja, em geral, mais tempo foi gasto em contato com o parceiro do que o estranho, mas nenhum efeito principal do tratamento ou interação foi detectado. As preferências por estranhos fortes em animais 3 do grupo NAXX pg CRF NAcc inflaram a variância, impedindo a detecção de um efeito de interação. No entanto, as comparações separadas do tempo gasto com os versículos do parceiro revelaram preferências significativas para o parceiro no grupo 0.1 pg CRF NAcc. Este efeito foi replicado no estudo antagonista, atestando a robustez do efeito. Essa mudança nas preferências dos parceiros não foi associada a um aumento estatisticamente significativo no tempo gasto com o parceiro ou a uma diminuição no tempo gasto com um estranho, mas sim foi o resultado de uma preferência geral aumentada pelo parceiro em relação ao estranho. Em contraste, o CRF não tem efeito sobre a preferência do parceiro em vespas campestres não monogâmicas. Além disso, mostramos que esse efeito de facilitação é modulado pela ação do CRF em ambos os CRF1 e CRF2 receptores. Por fim, mostramos evidências de fotomicrografia de que as fibras imunorreativas ao CRF estão presentes dentro do NACC da ratazana da pradaria, indicando que o CRF pode ser um dos ligantes endógenos que atuam sobre o CRF1 e CRF2 receptores em NAcc durante a formação de preferência de parceiro. Em conjunto, esses dados demonstram um novo papel para os sistemas de CRF que atuam dentro do NAcc no comportamento social.

Nossos dados mostrando que o CRF em NAcc facilita a preferência de parceiros apóia nossa hipótese inicial de que sistemas de CRF acumbal estão envolvidos na formação de vínculos em pares em capoeiras de pradarias. Nós tínhamos ainda a hipótese de que CRF2 receptores, em particular, foram críticos, dada a abundância de CRF2 receptores nas duas espécies de ratazana monogâmicas mas não nas duas espécies de ratazanas não monogâmicas (Lim et al., 2005). Os resultados do experimento de arganaz-do-prado apóiam essa hipótese, porque a infusão de CRF não tem efeito sobre a preferência do parceiro em uma espécie que efetivamente não possui CRF2 receptores em NAcc. Além disso, descobrimos que a co-administração de um CRF2antagonista seletivo bloqueia a preferência de parceiros em ratos da pradaria. Estes dados revelam um papel potencialmente crítico para o CRF2 receptores na formação da ligação do par.

Contudo, também descobrimos que a co-administração de um1Antagonista selectivo bloqueou a preferência do parceiro em ratos da pradaria. Este resultado foi mais surpreendente, dado que o CRF1 os receptores são expressos em NAcc em espécies não monogâmicas e monogâmicas. Em conjunto, esses dados ressaltam a importância de ambos subtipos de receptores para a expressão da preferência do parceiro, e apontam para a possibilidade de que a especificidade do receptor é uma questão complexa que pode se beneficiar de exploração adicional. É possível que haja interação dinâmica entre os dois subtipos de receptores no NAcc durante o comportamento de união de pares, e pode ser interessante explorar mais os fenótipos celulares do CRF1- e CRF2-expressão de neurônios, ou para ver se CRF1 e CRF2 os receptores podem até colocar-se nos mesmos neurônios. Também é possível que outros agentes, como a proteína de ligação a CRF, que pode atuar como um reservatório para CRF endógeno, possam estar envolvidos (Jahn, Eckart, Brauns, Tezval e Spiess, 2002).

As doses efetivas de CRF para injeções específicas do local no NAcc que facilitaram a preferência do parceiro resultaram em nenhum efeito significativo do tratamento medicamentoso sobre a atividade locomotora, que é comumente interpretado como comportamento semelhante à ansiedade. DeVries e Carter (2002) encontraram doses efetivas de CRF icv para preferência de parceiros em 0.1 e 1.0 ng (210 nM e 2.1 μM, respectivamente), e não detectaram diferenças na atividade locomotora entre os grupos de tratamento (DeVries et al., 2002). As suas doses foram de 1000 para 10,000 vezes maior e pelo menos duas a vinte vezes mais elevadas em concentração do que as doses que utilizámos especificamente em NAcc (10 nM e 100 nM). Em nosso estudo, embora não tenhamos detectado diferenças significativas na atividade locomotora entre os grupos de tratamento, houve, no entanto, uma ligeira tendência para menos cruzamentos de gaiola nos animais que receberam apenas CRF no NAcc. Embora seja possível que o CRF possa exercer efeitos sutis sobre o comportamento semelhante à ansiedade e, portanto, a locomoção, que por sua vez pode afetar a formação de preferência do parceiro, acreditamos que a explicação mais plausível é que o cruzamento reduzido da gaiola no grupo somente CRF é um subproduto do aumento preferência do parceiro, ou seja, o tempo gasto apenas na gaiola do parceiro. Isso apoia a hipótese de que o CRF pode ter um papel novo e separado na regulação do comportamento social, possivelmente independente dos efeitos do eixo HPA na ansiedade.

Também mostramos evidências de fotomicrografia de imunorreatividade de CRF em NAcc na mesma região do CRF2 receptores em ratos de pradaria monogâmicos. Isto sugere que o CRF pode ser um dos ligandos endógenos que age sobre o CRF1 e CRF2 receptores em NAcc. Embora o CRF tenha se mostrado preferencialmente ligado ao CRF1, também se liga ao CRF2 com afinidade substancial (Primus et al., 1997). As fibras imunorreactivas Ucn-1 não foram observadas no NAcc, mas foram observadas em outras regiões do cérebro, como o núcleo de Edinger-Westphal (Lim et al., 2006). Não foi possível mapear as fibras Urocortin-2 ou Urocortin-3 no cérebro da ratazana devido à falta de imunocoloração específica; no entanto, seria interessante determinar se esses potenciais ligantes, que também se ligam a CRF2 receptores com alta afinidade, também estão presentes no NAcc junto com o CRF2 receptores.

O prosencéfalo ventral, e particularmente o NAcc, tem sido repetidamente identificado como a região crítica do cérebro para a formação de vínculo em pares em ratos da pradaria. Dado o papel do NAcc na via de recompensa da dopamina mesolímbica, tem sido hipotetizado que a recompensa natural e os mecanismos de reforço são subjacentes à formação de vínculo em pares, de tal forma que o parceiro é seletivamente associado à recompensa (Aragona e outros, 2003a; Lim, Murphy e Young, 2004a). Nós mostramos anteriormente através de manipulações farmacológicas e genéticas que os receptores V1a do prosencéfalo anterior da VAR são necessários para a formação da ligação de pares masculinos, mesmo quando superexpressos em espécies de ratos não monogâmicos (Lim et al., 2004b; Lim e Young, 2004). Os receptores de ocitocina no NAcc são necessários para a preferência do parceiro em fêmeas de pradaria (Young, Lim, Gingrich e Insel, 2001). Os receptores dopaminérgicos D1 e D2 da Accumbal também demonstraram modular a formação e manutenção de preferências de parceiros tanto em machos quanto em fêmeas, e de fato a dopamina interage com a ocitocina durante esse processo comportamental (Aragona e outros, 2003a; Aragona e outros, 2006; Aragona, Liu, Yu, Damron, Perlman e Wang, 2003b; Liu e Wang, 2003). Assim, a ativação do receptor de CRF provavelmente contribui para um circuito maior que converge no NAcc para produzir esse comportamento social complexo. Consistente com essa hipótese, há evidências de que os receptores de CRF no NAcc podem modular a liberação de dopamina no estriado (Lu, Liu, Huang e Zhang, 2003), e recentes evidências preliminares sugerindo que a ativação do receptor CRF NAcc pode estimular a barra pressionando para reforço natural (Berridge, Pecine e Schulkin, 2004). Outro estudo mostrou que o CRF2 os receptores na área ventral tegmentar, que envia projeções dopaminérgicas ao NAcc, podem induzir uma potenciação de longo prazo, um correlato fisiológico da aprendizagem comportamental e associação de recompensa (Inútil, Singh, Crowder, Yaka, Ron e Bonci, 2003). Como a preferência do parceiro é postulada como uma forma de aprendizado de recompensa natural, os receptores de CRF no NAcc podem desempenhar um papel similar na potenciação sináptica subjacente durante a formação de vínculo em pares nas pragas da pradaria.

A formação de vínculos em pares na natureza é um processo cognitivo complexo que requer a integração de muitos estímulos externos e estados internos. A formação de vínculos em pares resulta da síntese de vários processos comportamentais, incluindo reconhecimento social, abordagem e motivação social, e envolve aprendizado e memória. A ocitocina e a vasopressina estão integralmente envolvidas no processamento neural de estímulos sociais e na formação de memórias sociais (Bielsky, Hu, Szegda, Westphal e Young, 2004; Ferguson, Young, Hearn, Matzuk, Insel e Winslow, 2000). A dopamina pode estar envolvida no estado motivacional elevado que impulsiona a interação social com o parceiro e o reforço necessário para estabelecer uma preferência de parceiro. O CRF pode fornecer um mecanismo pelo qual o estado de estresse interno modula a preferência do parceiro. A sinalização de CRF também poderia permitir as mudanças a longo prazo na plasticidade neural durante a formação de ligações de pares. Cada sistema de neurotransmissores desempenha um papel diferente, mas crucial, no comportamento complexo da ligação de pares, e o bloqueio de qualquer sistema interromperia a formação de uma ligação de par.

O papel da ACR na regulação do comportamento social tem sido minimamente estudado, apesar da abundância de estudos relacionando a ACR aos comportamentos de estresse e ansiedade. Há fortes evidências de que o CRF2 funções de ativação do receptor para diminuir a ansiedade e comportamentos semelhantes à depressão em camundongos (Bale, Contarino, Smith, Chan, Ouro, Sawchenko, Koob, Vale e Lee, 2000; Bale e Vale, 2003). O comportamento social, o estresse e a ansiedade estão fortemente inter-relacionados, especialmente em comportamentos que envolvem apoio social ou enfrentam o isolamento social. As ratazanas da pradaria que formaram ligações de pares apresentam níveis elevados de corticosterona no plasma durante a separação social do parceiro e a reunião com o parceiro retorna esses níveis de volta à linha de base (Carter, DeVries, Taymans, Roberts, Williams e Getz, 1997). Machos de pradaria machos submetidos a natação forçada, um estressor psicológico, mostram uma facilitação da formação de um par de pares após uma coabitação abreviada com o parceiro (DeVries et al., 1996). Finalmente, machos pareados que são separados de seus parceiros mostram estratégias de coping mais passivas no teste de nado forçado do que suas contrapartes separadas entre irmãos, e tais mudanças comportamentais são acompanhadas por um aumento de RNAm de CRF no NAcc (Bosch, Nair, Neumann e Young, 2005).

Esses dados sugerem que os comportamentos sociais e de estresse têm uma relação recíproca e, além disso, as mesmas moléculas implicadas no estresse e na ansiedade também desempenham um papel importante no comportamento social. De fato, há evidências de que os neuropeptídeos “sociais” vasopressina e ocitocina podem modular o estresse e o comportamento de ansiedade (Bielsky e outros, 2004; Landgraf, Gerstberger, Montkowski, Probst, Wotjak, Holsboer e Engelmann, 1995; Liebsch, Wotjak, Landgraf e Engelmann, 1996; Mantella, Vollmer, Li e Amico, 2003; Anel, Malberg, Potestio, Ping, Boikess, Luo, Schechter, Rizzo, Rahman e Rosenzweig-Lipson, 2006; Windle, Shanks, Lightman e Ingram, 1997). Assim, as mesmas moléculas que modulam o estado de tensão interna podem contribuir para a regulação de comportamentos sociais, como a formação de ligações em pares, e que as moléculas e circuitos desenvolvidos para o propósito de um comportamento podem, de fato, controlar dinamicamente o outro.

Agradecimentos

Na Emory University, gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael J. Owens por gentilmente nos fornecer o composto CP-154,526. Gostaríamos também de agradecer a Lorra Miller e Meera Modi por sua ajuda com o experimento da ratazana do prado. Por fim, gostaríamos de agradecer ao Drs. A. Courtney DeVries, da Universidade Estadual de Ohio, e C. Sue Carter, da Universidade de Illinois, em Chicago, por seu trabalho pioneiro sobre CRF em pradaria e a correspondência do Dr. DeVries sobre os experimentos farmacológicos.

Conceder apoio: Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH concede MH65050 para MML, AA13738 para AER, MH58616 para ZXW, MH64692 para LJY e NSF STC IBN-9876754 e o Yerkes Center Grant RR00165.

Notas de rodapé

Isenção de responsabilidade do editor: Este é um arquivo PDF de um manuscrito não editado que foi aceito para publicação. Como um serviço aos nossos clientes, estamos fornecendo esta versão inicial do manuscrito. O manuscrito será submetido a edição de texto, formatação e revisão da prova resultante antes de ser publicado em sua forma final citável. Observe que, durante o processo de produção, podem ser descobertos erros que podem afetar o conteúdo, e todas as isenções legais que se aplicam ao periódico pertencem a ele.

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