Inibidores da histona desacetilase facilitam a formação de preferências de parceiros em fêmeas de pradaria (2013)

Nat Neurosci. Manuscrito do autor; disponível no PMC Jan 1, 2014.

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PMCID: PMC3703824

NIHMSID: NIHMS477621

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Sumário

Na ratazana pradaria socialmente monogâmica (Microtus ochrogaster), o acasalamento induz ligações duradouras de pares iniciadas pela formação de preferência do parceiro e reguladas por uma variedade de neurotransmissores, incluindo ocitocina, vasopressina e dopamina. Aqui nós examinamos potenciais mecanismos epigenéticos que mediam a regulação de pares de ligações. Mostramos que os inibidores de histona desacetilase butirato de sódio e TrichoStatin A (TSA) facilitam a formação de preferência de parceiros em fêmeas de pradaria na ausência de acasalamento. Isto foi associado a um up-regulation específico de ocitocina (OTR) e receptores de vasopressina V1a (V1aR) no nucleus accumbens, através de um aumento na acetilação de histona no seu respectivo promotor. Além disso, a preferência do parceiro facilitado pela TSA foi prevenida pelo bloqueio OTR ou V1aR no nucleus accumbens. É importante ressaltar que a preferência de parceiro induzida pelo acasalamento desencadeou a mesma regulação epigenética dos promotores do gene OTR e V1aR como TSA. Essas observações indicam, assim, que a TSA e o acasalamento facilitam a preferência do parceiro por meio de eventos epigenéticos, fornecendo a primeira evidência direta de uma regulação epigenética da ligação de pares.

Introdução

A afiliação social é uma característica essencial dos comportamentos sociais humanos e os déficits cognitivos sociais são características comuns em uma infinidade de transtornos neuropsiquiátricos, incluindo esquizofrenia e transtornos do espectro do autismo, assim como o vício e a depressão.1. Os ratos da pradaria socialmente monogâmicos (Microtus ochrogaster) emergiram como um modelo muito interessante para a investigação das bases neurobiológicas do apego social, já que tanto os indivíduos de laboratório quanto os de vida livre estabelecem laços de par de longo prazo.2-4, que são primeiramente iniciados pela formação de comportamentos de afiliação seletiva em relação ao parceiro, chamados de preferência de parceiro5. Essa formação de preferência do parceiro envolve uma variedade de neurotransmissores e sistemas hormonais, incluindo os neuropeptídeos ocitocina e vasopressina (AVP) e dopamina mesolímbica.5.

IEm geral, a formação de preferência de parceiro é mediada pela neurotransmissão de AVP no palato ventral e septo lateral (LS) em homens, e neurotransmissão de ocitocina no nucleus accumbens (NAcc) e córtex pré-límbico em fêmeas de pradaria6-8.

Tipicamente envolvida na recompensa natural, como o acasalamento, a dopamina também atua como um mediador crítico da preferência do parceiro em ratos da pradaria. A ativação dos receptores do tipo D2 da dopamina (D2R) no NAcc facilita enquanto a ativação dos receptores do tipo D1 da dopamina (D1R) inibe a formação da preferência do parceiro tanto em machos quanto fêmeas9-11.

É importante ressaltar que variações na expressão gênica de receptores de ocitocina e AVP V1a, OTR e V1aR, respectivamente, podem, elas próprias, afetar dramaticamente a preferência do parceiro. Em fêmeas de pradaria, por exemplo, a superexpressão de OTR no NAcc facilita a preferência do parceiro na ausência de acasalamento12-14.

Além da regulação da ligação de pares, a ocitocina e a AVP também estão implicadas em uma ampla gama de comportamentos sociais, incluindo reconhecimento social, agressão e cuidado materno.15, 16. Notavelmente, rupturas do último comportamento em roedores induzem neuroadaptações de longa duração através de mecanismos epigenéticos, incluindo a metilação do DNA do receptor de estrogênio alfa.17 e genes AVP18, bem como a acetilação de histonas do promotor do receptor de glucocorticóides19. Além disso, os inibidores da histona desacetilase (HDAC), aumentando a expressão gênica através do aumento da acetilação de histonas no cérebro de roedores20, pode reverter essas alterações19e influenciar diretamente os comportamentos sociais, como a receptividade sexual21. É importante ressaltar que, em uma linhagem de células de câncer de pulmão, o inibidor de HDAC tricostatina A (TSA) melhora diretamente a transcrição de OTR por promover localmente a acetilação de histonas.22.

Portanto, uma base epigenética na formação de preferência de parceiros em ratos do campo pode ser sugerida. Para testar esta hipótese, primeiro avaliamos os efeitos de dois inibidores de HDAC, butirato de sódio (NaB) e TSA, na formação de preferência de parceiros em fêmeas adultas de pradaria. Posteriormente, investigamos os mecanismos moleculares que mediam os efeitos da TSA na indução da preferência do parceiro em fêmeas de pradaria. Finalmente, procuramos determinar se as alterações epigenéticas induzidas pela TSA durante a coabitação também foram desencadeadas pelo acasalamento.

Consistentes

O tratamento TSA facilita a preferência do parceiro

As fêmeas sexualmente ingênuas da pradaria foram injetadas intracerebroventricularmente (icv.) com CSF ou CSF contendo 0.08, 0.4 ou 4 ng de TSA imediatamente antes da coabitação 6-hora com um macho sem acasalamento, e a preferência do parceiro foi então testada. Seis horas de coabitação com um macho sem acasalamento não induzem a formação de preferência do parceiro em fêmeas de arraias da pradaria4 e, portanto, este paradigma comportamental tem sido amplamente utilizado para avaliar os efeitos de várias drogas na facilitação da formação de preferências dos parceiros.5.

Os animais tratados com CSF exibiram contacto não selectivo lado-a-lado com o parceiro ou o estranho após 6 horas de coabitação sem acasalamento (t15= 0.76, P = 0.46; Fig. 1a). No entanto, os animais tratados com TSA em todas as doses testadas passaram preferencialmente mais tempo com o parceiro do que com o estranho (t8= 4.35, P = 0.002 para o TSA 0.08 ng grupo; t15= 3.63, P = 0.002 para o TSA 0.4 ng grupo; e t8= 2.58, P = 0.03 para o TSA 4 ng grupo). Importante, não foram encontradas diferenças de grupo na atividade locomotora (F3,46 = 1.25, P= 0.30, Fig. 1be não foi observado comportamento agressivo da test fêmea em relação ao estranho ou ao parceiro, demonstrando que os efeitos da TSA eram específicos de uma preferência social, em vez de serem secundários a uma alteração de locomoção ou aversão social ao estranho.

Figura 1  

Uma injeção aguda de tricostatina A (TSA) facilita a formação de preferência do parceiro em fêmeas de pradaria na ausência de acasalamento. a) As mulheres tratadas com líquido cefalorraquidiano (LCR) expostas a um macho por 6 horas, na ausência de acasalamento, mostraram ...

Para investigar se o TSA aumenta a acetilação de histona em estruturas cerebrais envolvidas na formação da preferência do parceiro, um lote separado de fêmeas foi injetado com a dose média de TSA (0.4 ng) e coabited com um macho na ausência de acasalamento durante 30 min, 2 ou 9 horas. Notavelmente, nenhuma variação significativa nos níveis globais de acetilação de histonas H3 (Lys14) pôde ser detectada em qualquer ponto no tempo tanto no putamen NAcc quanto no caudado (P > 0.05 para todos os grupos, Fig. 1c e d). Isto demonstra que a TSA facilita a formação de preferência do parceiro na ausência de acasalamento, apesar de não afectar a acetilação global da histona H3 no NAcc ou no putâmen caudado.

É importante ressaltar que o butirato de sódio também facilitou a preferência do parceiro em fêmeas de pradaria após a coabitação com um macho por 6 horas sem acasalamento, associado a um aumento na acetilação global de histonas H3 (Lys14) no NAcc (Figura suplementar 1). Os efeitos da TSA na formação da preferência de parceiros poderiam, assim, ser reproduzidos com outro inibidor de HDAC, sugerindo o envolvimento da inibição da HDAC, em vez de um efeito não específico da TSA na facilitação da preferência do parceiro. Considerando que o TSA é um inibidor de HDAC de classe I / II mais específico e afim23, 24, e que os efeitos comportamentais da TSA foram mais pronunciados que NaB, optamos por usar TSA sobre NaB para investigar os correlatos moleculares específicos nas seguintes partes do estudo.

Correlatos moleculares da preferência de parceiro facilitado pela TSA

Como variações nos níveis de expressão gênica na NAUC foram associadas a diferentes estratégias de acasalamento entre ratos monogâmicos e não-monogâmicos, e com alteração da formação de preferência de parceiros em espécies de várzea em particular12, 13, 25, 26, avaliamos se a formação de preferência de parceiros facilitada por TSA estava associada a variações de expressão gênica no NAcc.

Tratamento TSA (0.4 ng, icv) induziu um aumento nos níveis de RNAm de OTR no NAcc após 2 horas de coabitação, em comparação com os controles tratados com CSF (t10 = 2.38, P = 0.038, Fig. 2a), que tendeu a ser sustentado após 9 horas de coabitação (t9 = 2.17, P = 0.058, Fig. 2b). Embora um ligeiro mas não significativo aumento no ARNm de V1aR pudesse ser observado nas horas NAcc 2 após a injeção de TSA, nenhuma outra diferença de grupo foi detectada em qualquer momento para qualquer um dos outros mRNAs medidos, incluindo D1R ou D2R (P > 0.05, Fig. 2a, b). É importante ressaltar que não foram observadas diferenças entre os grupos no putâmen caudado em nenhum momento e para qualquer RNA mensurado (P > 0.05 para todos os grupos, Fig. 2c, d), sugerindo que o aumento do ARNm de OTR observado em animais tratados com TSA foi específico para o NAcc. Além disso, tal regulação positiva estava presente somente após a coabitação com um macho, já que os níveis de RNAm de OTR e V1aR no NAcc permaneceram inalterados 2 horas após a injeção de TSA sem coabitação (OTR: 100.0% ± 11.70 para grupo CSF, 86.7% ± 12.11 para TSA grupo, t12 = 0.79, P = 0.444; V1aR: 100.0% ± 26.24 para o grupo CSF, 92.3% ± 13.75 para o grupo TSA, t9 = 0.27, P = 0.791).

Figura 2  

Tratamento TSA (0.4 ng) regula positivamente os receptores de ocitocina (OTR) e vasopressina (V1aR) em fêmeas de pradaria durante a coabitação com um macho na ausência de acasalamento. Os níveis de ARNm (a, b) e proteína (e, f) de OTR foram regulados positivamente após 2 (a, e) e 9 horas ...

Em consonância com os níveis mais elevados de ARNm de OTR, os animais tratados com TSA também exibiram níveis de proteína OTR mais elevados em ambos os pontos no NAcc (2 horas: t10 = 2.34, P = 0.041; 9 horas: t10 = 3.16, P = 0.01, Fig. 2e, f), mas não caudate putamen (t10 = 0.41, P = 0.69, Fig. 2g, h). Curiosamente, enquanto nenhuma alteração significativa dos níveis de mRNA V1aR pode ser detectada no NAcc em 2 ou 9 horas após a injeção de TSA (Fig. 2a, b), os níveis de proteína V1aR aumentaram significativamente em 9 horas, em comparação com os animais tratados com CSF, no NAcc (t9 = 3.46, P = 0.007, Fig. 2f) mas não caudado putamen (t10 = 0.98, P = 0.35, Fig. 2h). Embora com algumas variações, os níveis de proteína D1R e D2R no NAcc e no putâmen caudado não foram significativamente afetados pela administração da TSA (P > 0.05, Fig. 2e-h).

TSA facilita a acetilação de histonas de oxtr e avpr1a

O aumento nos níveis de mRNA e de proteína para OTR após a coabitação após o tratamento com TSA sugeriu que a TSA provavelmente aumentou a transcrição de oxtr, o gene que codifica para OTR, em vez de alterar a tradução ou o turnover da proteína. Além disso, os níveis de proteína V1aR foram mais elevados no NAcc, associado a um ligeiro mas não significativo aumento nos níveis de mRNA após o tratamento com TSA (FIG. 2). Considerando que o TSA é um poderoso inibidor de HDAC classe I e II23, 24, 27, hipotetizamos que a TSA aumentou a acetilação de histonas no oxtr e avpr1a promotores no NAcc, reforçando depois a sua transcrição. Um novo lote de animais recebeu icv. injecção de TSA (0.4 ng) e imediatamente coabitado com um macho sem acasalar por 30 minutos antes de ser sacrificado. A janela de tempo 30-min foi escolhida com base em trabalhos anteriores relatando um aumento máximo de acetilação de histona após injeção local de TSA em ratos e camundongos28, 29. Acetilação H3K14 no oxtr e avpr1a Os promotores foram então analisados ​​por imunoprecipitação da cromatina.

Em consonância com o aumento nos níveis de ARNm e proteína OTR previamente observados, os animais tratados com TSA exibiram um aumento muito elevado (+ 460%) na acetilação da histona H3 no oxtr promotor do gene, em comparação com os controles tratados com CSF, no NAcc (t10 = 5.88, P = 0.0002), mas não putamen caudado (t9= 0.31, P = 0.76, Fig. 3a). Além disso, a acetilação da histona H3 no avpr1a O promotor foi significativamente elevado 30 min após a administração de TSA (+ 196%) no NAcc (t10 = 3.12, P = 0.01), mas não putamen caudado (t9= 0.38, P = 0.71), em comparação com os controles tratados com CSF (Fig. 3b). Portanto, o TSA aumentou o local de acetilação de histonas especificamente no NAcc, logo 30 minutos após o início da coabitação com um macho.

Figura 3  

O tratamento com TSA aumenta a acetilação de histonas de oxtr e avpr1a promotores durante a coabitação com um homem na ausência de acasalamento. Acetilação de Histona H3 (Lys14) em oxtr (a) e avpr1a (b) os promotores aumentaram no nucleus accumbens (NAcc), mas não ...

O TSA facilita a preferência dos parceiros via OTR e V1aR

A partir do conjunto anterior de experimentos, um modelo molecular de ação emerge, onde durante a coabitação, o TSA potencializa a acetilação de histonas no oxtr e avpr1a promotores, a partir daí aumentando a sua transcrição e resultando em níveis mais elevados de proteína OTR e V1aR até 9 horas após o início do período de coabitação. Importante, este efeito TSA é específico do local, já que o putamen caudado permanece inalterado. Aqui testamos se este aumento de OTR e V1aR induzido por TSA está relacionado à facilitação da formação de preferência de parceiros. As ratazanas fêmeas da pradaria receberam uma injeção intra-NAcc de TSA (0.04ng por lado) com ou sem injeção prévia (30minutos antes da injeção de TSA, 0.5ng por lado) de CSF ou CSF contendo um de dois antagonistas diferentes de OTR, OTA (B) e OTA (T), ou um antagonista de V1aR (V1aRA). Imediatamente após a injeção de TSA, as fêmeas foram coabitadas com um macho por 6 horas sem acasalamento, seguido por um teste de preferência do parceiro.

Animais tratados com CSF não mostraram uma preferência de parceiro (t5 = 0.17, P = 0.87, Fig. 4a). Entretanto, os animais tratados com TSA passaram significativamente mais tempo em contato lado a lado com o “parceiro” do que com o “estranho”, sugerindo que uma única injeção de TSA diretamente no NAcc é suficiente para facilitar a formação de preferência do parceiro sem acasalamento (t5 = 7.04, P = 0.0009). Curiosamente, o bloqueio de OTR ou V1aR por pré-tratamento com OTA (B), OTA (T) ou V1aRA impediu os efeitos da TSA (P > 0.05 para todos os grupos). Como nenhuma diferença de grupo foi encontrada na atividade locomotora (F4,32 = 1.89, P = 0.14, Fig. 4b), estes dados sugerem que o TSA no NAcc facilita a formação de preferências de parceiros via mecanismos mediados por OTR e V1aR de uma maneira específica do comportamento.

Figura 4  

A preferência do parceiro facilitado pela TSA requer a neurotransmissão mediada pelos receptores de ocitocina (OTR) e vasopressina (V1aR) no núcleo feminino accumbens. (a) TSA facilita a preferência do parceiro quando infundido no núcleo accumbens (0.04 ng por lado), ...

Acasalamento induz neuroadaptações similares como TSA

Seguindo as nossas observações anteriores, estabelecemos que a potencialização epigenética da neurotransmissão de ocitocina e vasopressina na NAcc feminina foi suficiente para facilitar a formação de preferência de parceiro na ausência de acasalamento. Para investigar se estas neuroadaptações também ocorrem durante a formação natural da preferência do parceiro, ratazanas fêmeas da pradaria foram coabitadas com um macho durante 24 horas na presença de acasalamento, o que induz a preferência do parceiro4e sacrificado. Observamos um aumento nos níveis de RNAm e V1aR e proteína no NAcc, em comparação com as sexualmente ingênuas (OTR: + 38%, t10 = 2.68, P = 0.02 para mRNA e + 58%, t8 = 3.05, P = 0.01 para proteína; V1aR: + 89%, t14= 2.53, P = 0.02 para mRNA e + 26%, t20 = 2.23, P = 0.037 para proteína, Fig. 5a, b).

Figura 5  

A coabitação com o acasalamento induz uma regulação positiva dos receptores ocitocina (OTR) e vasopressina (V1aR) no nucleus accumbens (NAcc) das fêmeas da pradaria. 24h Coabitação com um macho com acasalamento regula o mRNA e proteína de OTR (a) e V1aR (b) ...

Como os níveis de mRNA e proteína para OTR e V1aR foram aumentados pela coabitação com o acasalamento, em seguida, investigamos se esta regulação positiva estava associada a um realce epigenético de oxtr e avpr1a transcrição de genes. Um novo lote de fêmeas foi assim coabitado com um macho para 6 horas com acasalamento e acetilação H3K14 no oxtr e avpr1a promotores medidos por imunoprecipitação da cromatina. De acordo com os níveis de RNAm e proteína OTR e V1aR, as ratazanas fêmeas da pradaria exibem maior acetilação de H3K14 oxtr e avpr1a promotores do NAcc, em comparação com as sexualmente ingênuasoxtr: t9 = 2.64, P = 0.02; avpr1a: t9 = 2.91, P = 0.017 Fig. 5c, d). Estes dados sugerem que os paradigmas de coabitação que induzem, de forma confiável, a preferência do parceiro em fêmeas de pradaria, desencadeiam uma regulação positiva da expressão de OTR e V1aR no NAcc através de mecanismos epigenéticos, como observado após o tratamento com TSA.

Discussão

No presente estudo, relatamos pela primeira vez uma regulação epigenética da formação de preferências de parceiros. Primeiro, demonstramos que o aumento da acetilação de histona no NAcc pela administração de um inibidor de HDAC facilita a formação de preferência de parceiro em fêmeas de pradaria adultas na ausência de acasalamento. Tuando revelamos evidências diretas de que a formação de preferência de parceiro nas fêmeas é impulsionada epigeneticamente, como a coabitação e o acasalamento com um macho aumentaram oxtr e avpr1a expressão de genes através da acetilação aumentada de histonas no NAcc. A administração de TSA na preferência de parceiro induzido por NAcc levou a níveis mais elevados de ARNm de OTR e proteínas no NAcc. Além disso, embora a acetilação global de histonas H3 não tenha sido afetada em fêmeas tratadas com TSA, um acentuado enriquecimento da acetilação de histonas no oxtr O promotor no NAcc foi observado logo aos 30 minutos após a administração do TSA. Finalmente, bloquear o OTR no NAcc foi suficiente para impedir a preferência dos parceiros facilitados pelo TSA. Uma vez que modificações semelhantes conduzidas epigeneticamente foram detectadas após a coabitação com o acasalamento, sob procedimentos conhecidos por induzir a preferência do parceiro, nossos dados apresentam um modelo para uma regulação epigenética do comportamento social. Durante coabitação com um macho, TSA ou acasalamento, induz rapidamente uma acetilação específica da histona H3 no oxtr promotor no NAcc que aumenta a sua transcrição, resultando em níveis mais elevados de ARNm e proteína OTR, que depois facilitam a formação de preferência do parceiro.

Em machos de pradaria fêmeas, 6 horas de coabitação com um macho sem acasalamento não induz a formação de preferência do parceiro4, e este paradigma comportamental tem sido usado para examinar os efeitos das manipulações farmacológicas na indução da preferência do parceiro5. Em nosso estudo, enquanto os controles tratados com solução salina ou LCR não desenvolveram a preferência do parceiro, fêmeas de pradaria tratadas com NaB ou TSA o fizeram. Como nem o NaB nem o TSA afetaram a locomoção geral, seus efeitos na preferência do parceiro pareciam ser efeitos específicos do comportamento e não secundários na locomoção. Este efeito específico da TSA foi confirmado pelas nossas observações moleculares. De fato, embora administrado icv., fomos capazes de detectar uma alteração específica da expressão gênica no NAcc, mas não em uma estrutura adjacente, o putamen caudado. Além disso, mesmo dentro do NAcc, os níveis de mRNA e proteína D1R e D2R não foram afetados. Tal especificidade parece ser surpreendente para um amplo inibidor de HDAC como o TSA, que afeta tanto os HDACs de classe I como os de classe II. No entanto, foi relatado que TSA afeta a expressão de apenas um pequeno subconjunto de genes no genoma dos mamíferos.30-32, inclusive em ratos20.

Nós demonstramos aqui que a acetilação da histona H3 em Lys14 na oxtr promotor, uma modificação associada à transcrição genética melhorada, incluindo durante a plasticidade cerebral33, 34, sublinha os níveis mais elevados de ARNm e proteína OTR. Em resposta a TSA, a acetilação de histonas no oxtr promotor aumenta e facilita a ativação de sua transcrição em linhagem celular humana22, apoiando nossa descoberta de que oxtr pode ser regulado epigeneticamente. Como um bloqueio local de OTR no NAcc foi suficiente para prevenir os efeitos comportamentais do TSA, nossos dados sugerem que a expressão de OTR induzida por TSA no NAcc durante a coabitação mediou a facilitação da formação de preferência por parceiros. Além disso, as horas 24 de coabitação com o acasalamento, um procedimento conhecido por induzir de forma confiável a preferência do parceiro em fêmeas de pradaria, induziram um aumento similar na expressão de OTR no NAcc feminino. Isto está de acordo com o envolvimento conhecido da ocitocina e do seu receptor na neurobiologia da formação de preferências de parceiros em fêmeas de ratazanas. O acasalamento induz um aumento nos níveis de ocitocina extracelular no NAcc25e a infusão local de oxitocina no NAcc facilita a formação de preferência do parceiro na ausência de acasalamento8. Além disso, os antagonistas do OTR bloqueiam a formação de preferências do parceiro induzida pela administração de ocitocina ou acasalamento8, 35. É importante ressaltar que a superexpressão do OTR mediada pelo vírus na NAcc feminina é suficiente para facilitar a formação de preferências do parceiro12, 13.

Além de fortalecer o papel da OTR, nossos resultados também fornecem evidências para uma ativação da expressão do gene OTR através de mecanismos epigenéticos durante a coabitação com um macho na ausência de acasalamento. De fato, apesar de insuficiente para induzir a preferência do parceiro, tal coabitação sem acasalamento por curtos períodos de tempo ativa os processos neurobiológicos subjacentes à formação de preferências dos parceiros.. Por exemplo, duas horas de exposição livre a um homem induzem elevações leves, mas não significativas, na liberação de ocitocina na mulher NAcc.25. Portanto, pode-se propor que TSA ou NaB potencializem as neuroadaptações induzidas pela coabitação com um macho, facilitando o desenvolvimento da preferência do parceiro. Curiosamente, tal potencialização já foi relatada em roedores onde inibidores de HDAC classe I e II, incluindo NaB e TSA, facilitam a consolidação de um evento de aprendizagem que não resulta na formação de memória de longo prazo em animais de controle.36, 37. Em apoio a esta noção, períodos mais longos de coabitação (por exemplo., 48hours) pode induzir a preferência do parceiro mesmo na ausência de acasalamento4. Também é importante notar que a coabitação com o acasalamento desencadeou na NAcc feminina uma regulação positiva da expressão de OTR e V1aR através dos mesmos mecanismos epigenéticos observados após a coabitação com o tratamento TSA, o que demonstra que a TSA e o acasalamento afetam as mesmas vias de promoção formação de preferência de parceiro. Importante, TSA não induz uma regulação positiva de OTR e V1aR no NAcc feminino na ausência de coabitação com um macho. Em conjunto, isto suporta a hipótese de que a TSA facilita a formação da preferência do parceiro através da potencialização de neuroadaptações endógenas naturalmente desencadeadas pela coabitação com um macho, em vez de ativar por si só estas ou diferentes neuroadaptações.

OSeu estudo também destaca o papel crítico do NAX V1aR na formação de preferências de parceiros do sexo feminino, já que os animais tratados com TSA exibem níveis mais altos de V1aR, cujo bloqueio impediu a formação de preferência de parceiros facilitada pelo TSA.. Além disso, esses efeitos foram associados à maior acetilação de histonas no avpr1a promotor, apesar de não haver elevação significativa do mRNA V1aR, provavelmente devido a um ponto de tempo não ótimo. Embora não possamos descartar uma regulação da estabilidade proteica por TSA através da acetilação de proteínas não-histonas38, este achado sugere que, semelhante ao oxtr promotor, a TSA pode promover avpr1a transcrição através de acetilação local de histonas. Enquanto a contribuição do AVP na ligação de pares masculinos foi descrita5, seu papel no comportamento da mulher ainda é controverso. Por um lado, icv. A injeção de AVP facilita a formação de preferência de parceiro em ratos machos e fêmeas, o que é impedido pelo bloqueio de V1aR ou OTR39. Por outro lado, um icv. A injecção do antagonista de V1aR bloqueia a preferência do parceiro induzido pelo acasalamento em ratazanas da pradaria machos, mas não em fêmeas40. No entanto, todos esses estudos usaram icv. injeções, impedindo qualquer visão adicional sobre as estruturas envolvidas. Aqui, nós fornecemos a primeira evidência de que a neurotransmissão de AVP dentro do NAcc pode estar envolvida na formação de preferência de parceiros nas fêmeas, enquanto a maioria da literatura descreve seu envolvimento em diferentes áreas, como o palato ventral, septo lateral, o núcleo do leito stria terminalis e amígdala em homens5. Portanto, torna-se interessante notar que o bloqueio de OTR ou V1aR no NAcc da fêmea foi suficiente para evitar a formação de preferência do parceiro após o tratamento com TSA, sugerindo que a formação de preferência do parceiro requer a ativação de ambos V1aR e OTR..sua descoberta está de acordo com, e apóia, uma observação anterior em machos de pradaria macho que um acesso simultâneo a ambos OTR e V1aR no LS é essencial para a preferência de parceiros induzida por AVP6. Além disso, a observação de um aumento específico nos níveis de OTR e V1aR em animais tratados com TSA suporta ainda a exigência de uma activação simultânea das neurotransmissões de AVP e ocitocina para ligação de pares.

Em combinação com ocitocina e AVP, a neurotransmissão de dopamina no NAcc modula a formação de preferência de parceiros nos ratos fêmeas9. Embora o acasalamento induza a liberação de dopamina no NAcc9, variações nos níveis de receptores são observadas somente após um longo período - maior que 24h - de coabitação com o acasalamento, importante para a manutenção da união de pares10. Em consonância com estas observações, as ratazanas fêmeas da pradaria tratadas com TSA exibiram preferência por parceiros sem variação significativa nos receptores dopaminérgicos D1R e D2R. Portanto, essa ausência de regulação do receptor de dopamina fornece outra prova para a especificidade da TSA.

Nossos dados relatam pela primeira vez um componente epigenético na neurobiologia da ligação de pares, e sugerem que a TSA induz um “estado permissivo” em fêmeas de pradaria, potencializando a resposta molecular natural à coabitação e promovendo a formação de grupos sociais mais fortes. interações que levam à preferência do parceiro. Por conseguinte, é tentador formular a hipótese de que uma preferência de parceiros facilitada pela TSA poderia ser reforçada e levar a uma ligação persistente. Embora as HDACs específicas envolvidas ainda não tenham sido identificadas, seria interessante investigar melhor os efeitos da TSA em outros comportamentos associados à estratégia de vida monogâmica em pragas da pradaria, como a agressão seletiva e o cuidado bioparental. Considerando a relevância das pradarias em modelar os mecanismos neurobiológicos de pareamento em humanos5e os promissores inibidores de HDAC já em ensaios clínicos24, 41, 42, nossos dados abrem caminho para novas possibilidades farmacológicas influenciarem os comportamentos sociais.

O Propósito

Assuntos

Sexualmente ingênuas voles fêmeas da pradaria (Microtus ochrogaster) de uma colónia de reprodução laboratorial foram desmamados aos 21 dias de idade e alojados em pares de irmãos do mesmo sexo em jaulas plásticas (12 28 16 cm) com água e alimentos fornecidos ad libitum. Todas as gaiolas foram mantidas sob um ciclo 14: 10 h claro-escuro, e a temperatura foi de aproximadamente 20 ° C. Todos os animais foram distribuídos aleatoriamente em grupos experimentais quando atingiram 70 - 90 dias de idade. O número de animais utilizados baseou-se em estudos anteriores realizados no campo pelo nosso grupo e por outros, combinados com uma análise de potência. Procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual da Flórida.

Drogas

O butirato de sódio (NaB), dissolvido em solução salina, e a Tricostatina A (TSA), dissolvida em transportador de fluido cerebrospinal artificial (CSF, BioFluids, Rockville, MD) foram adquiridos à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). NaB foi injetado por via intraperitoneal (ip) numa dose de 600 mg / kg, que é conhecida por induzir a acetilação de histonas em várias estruturas cerebrais em ratinhos43, 44. Da mesma forma, a faixa de dose utilizada para TSA foi baseada em trabalhos anteriores, determinando sua eficácia na indução de eventos locais de acetilação de histonas e variações na expressão gênica em roedores.19, 20. O antagonista seletivo do receptor V1aR V1aRA, d(CH2)5[Tyr (Me)] AVP e o antagonista de OTR OTA (B), [d(CH2)5Tyr (eu)2, Thr4Tyr-NH29] -OVT), foram obtidos de Bachem (Torrance, CA). Um segundo antagonista OTR mais seletivo, OTA (T), dGly-NH2-d(CH2)5 [Tyr (eu)2, Thr4] OVT45, foi gentilmente cedido pelo Dr. Maurice Manning (Universidade de Toledo, OH). Estes antagonistas e doses utilizadas foram escolhidos com base em estudos anteriores que demonstram a sua selectividade para V1aR ou OTR, respectivamente.35, 39, 46-49.

Canulação estereotáxica e microinjeção

As fêmeas foram anestesiadas com pentobarbital sódico (1mg / 10g peso corporal), e cânulas guia de aço inoxidável 26 (Plastics One, Roanoke, VA) foram implantadas estereotaxicamente, direcionadas para o ventrículo lateral (unilateralmente; barra nasal a 2.5 mm, 0.6 mm rostral, 1.0 mm lateral e 2.6 mm ventral a bregma) ou site-specific da NAcc (bilateralmente; barra nasal a X2.5 mm, 1.7 mm rostral, ± 1.0 mm bilateral e 4.5 mm ventral a bregma). Após 3 dias de recuperação, os indivíduos receberam microinjeções de CSF ou CSF contendo diferentes concentrações de TSA. Quando antagonistas seletivos para OTR ou V1aR foram usados, eles foram injetados 30 minutos antes da TSA. As injecções foram efectuadas com uma agulha de calibre 33 que alargou 1 mm abaixo da cânula-guia para a área alvo, num volume de injecção de 500 nL no ventrículo lateral (icv.) ou 200 nL por lado no NAcc. A agulha foi ligada a uma seringa Hamilton (Hamilton, Reno, NV) através de tubos de polietileno-20 e a depressão do êmbolo foi realizada lentamente, necessitando de 1 minuto por injecção. No final do experimento, todos os indivíduos foram sacrificados por rápida decapitação e os cérebros extraídos para verificar a colocação das cânulas por um observador cego às condições experimentais. Indivíduos com cânulas perdidas foram excluídos da análise de dados.

Teste de coabitação e preferência de parceiros

Imediatamente após ip., icv., ou injeções intra-NAcc de drogas, as fêmeas foram cohabited com um macho por 6 horas sem acasalamento. A ausência de acasalamento foi verificada examinando o comportamento gravado em vídeo. Para a investigação das neuroadaptações desencadeadas pela coabitação com fêmeas acasaladas com estrogênio (2µg por dia, ip, por 3 dias) foram coabitados com um macho durante 6 ou 24 horas, e a presença de acasalamento foi verificada a posteriori em vídeo (variando de 6 a 11 durante as primeiras 6 horas de coabitação).

O teste de preferência do parceiro foi realizado imediatamente após a coabitação com 6-hora, como descrito anteriormente11. Resumidamente, o aparelho de teste de três câmaras consistia em uma gaiola neutra conectada a duas gaiolas idênticas paralelas, cada uma abrigando um animal de estímulo - um homem desconhecido "estranho" ou um "parceiro" masculino familiar usado durante o período de coabitação. Os sujeitos do sexo feminino ficaram livres para se mover pelo aparelho durante o teste de 3 horas, e os homens do estímulo foram amarrados dentro de suas gaiolas, não permitindo o contato direto uns com os outros. Toda a sessão foi gravada em vídeo e a duração do contato lado a lado do sujeito com o parceiro ou com o estranho foi posteriormente quantificada por um experimentador treinado que não conhecia os grupos biológicos. Uma preferência de parceiro foi definida como sujeitos passando significativamente mais tempo em contato corporal com o parceiro em relação a um estranho, conforme determinado por um par de t-teste. Além disso, o aparelho de três câmaras foi equipado com sensores de fotobolhas, permitindo a determinação da atividade locomotora indicada pelo número de entradas da fêmea nas câmaras de estímulo. Este escore locomotor nos permite, assim, controlar os efeitos secundários putativos das drogas no comportamento das fêmeas, tais como atividade geral, ansiedade ou exploração alterada de um ambiente novo, como comumente usado por nosso grupo e outros.12.

Extração de RNA e proteínas

As fêmeas foram sacrificadas por rápida decapitação e os cérebros foram imediatamente extraídos e congelados em gelo seco. Cortes coronais (200 µm) foram cortados em um criostato e congelados montados em lâminas de microscópio. Perfuradores de tecido bilateral com um diâmetro de 1 mm foram retirados de todo o putamen NAcc e caudado, sendo este último uma área de controle, e armazenado a −80 ° C até ser processado. RNA total e proteínas foram extraídos usando o protocolo TRI-Reagent de acordo com as instruções do fabricante (Molecular Research Center, Cincinnati, OH).

Análise da expressão proteica por Western-blot

Após a separação num gel de poliacrilamida 10% (15% para histonas), as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e incubadas com os seguintes anticorpos primários: anti-OTR (sc-8102, 1: 1000), -V1aR (sc-18096, 1: 500), -D1R (sc-33660, 1: 1000), -2R (sc-9113, 1: 1000, Santa Cruz Biotecnologia, Santa Cruz, CA), -actina (A2066, 1: 1000, Sigma Aldrich. St Louis, MO), ou anti-acetil histona H3 (Lys14, #06-911, 1: 1000) e H3 total (#05-928, 1: 1000, Millipore, Temecula, CA). Todos os anticorpos são validados para seu uso em humanos, ratos e camundongos, com os quais os ratos da pradaria compartilham altos percentuais de homologia (variando de 81 a 96%). Ap hibridao com um anticorpo secundio conjugado com HRP, as membranas foram reveladas com ECL (substrato ECL SuperSignal West Dura, Pierce Biotechnologies, Rockford, IL) e expostas em filme Fuji XAR (Fuji Film, Tóquio, Jap). A quantificação foi realizada usando o software AIS 6.0 Image (Imaging Research, St. Catharines, Ontário, Canadá), e todos os sinais foram normalizados dentro da mesma membrana para actina, exceto para o sinal acetil-H3 que foi normalizado para o sinal total de histona H3. Os dados normalizados são então expressos como percentagem de animais tratados com CSF.

Reação em cadeia da polimerase semi-quantitativa em tempo real (RT-PCR)

0.5 µg de RNA total foi processado para a síntese de DNA complementar e, em seguida, analisado conforme descrito anteriormente50 com normalização do gene da nicotinamida adenina dinucleotide desidrogenase (NADH). Todas as reações foram realizadas em triplicatas e sua especificidade verificada por análise de curva de fusão e separação em gel de Agarose 2%. As sequcias de iniciadores utilizadas foram as seguintes: 5'-TCCAAGGCCAAAATCCGCACGG-3 '(Fwd) e 5'-GGCAGAAGCTTCCTTGGGCGC-3' (Rev) para OTR, 5'-GAGGTGAACAATGGCACTAAAACC-3 '(para) e 5'-CCAGATGTGGTAGCAGATGAAGC-3' (Rev) para AVP1aR, 5'-TTAACAACAATGGGGCTGTG-3 '(para) e 5'-GGCATGAGGGATCAGGTAAA-3' (Rev) para D1R, 5'-GTGAAGGCGCTGTAGAGGAC-3 '(para) e 5'-CGGTGTGTTCATCATCTGCT-3' (Rev ) para D2R e 5'-CTATTAATCCCCGCCTGACC-3 '(para) e 5'-GGAGCTCGATTTGTTTCTGC-3' (Rev) para NADH. Os dados normalizados são expressos como uma percentagem de animais tratados com CSF.

Imunoprecipitação de Cromatina

A acetilao Histona H3 (Lys14) em punes de tecido NAcc e putamen caudado foi analisada utilizando o kit de tecido G da protea Magna ChIP (Millipore, Temecula, CA) seguindo as instrues do fabricante. Resumidamente, após a reticulação com 1% formaldeído, a cromatina foi cortada usando um Misonix XL-2000 para fragmentos de 200-600 bp. A imunoprecipitao de histona acetilada H3 (Lys14) foi ent realizada com 10 de anticorpo anti-acetil-H3 (Lys14) (Millipore) durante a noite a 4. Após lavagens, eluição das esferas e reversão da ligação cruzada, o ADN imunoprecipitado foi purificado e analisado em triplicado por RT-PCR numa plataforma iCycler (ver acima) com uma curva padrão interna feita a partir de amostras de INPUT reunidas. Os primers foram projetados para amplificar uma região 236 bp longa localizada 128 bp a montante do primeiro exon que codifica a ratazana pradaria OTR (oxtr, Acesso ao Genbank #AF079980), ou região 192 bp longa localizada 141 bp a montante do primeiro exon que codifica a ratazana pradaria V1aR (avpr1a, Acesso ao Genbank #AF069304). As sequências foram as seguintes: 5'-CTCCGGAGCCGGGGCTAAGT-3 '(Fwd) e 5'-ACCGCTTCCCCGAGAGTAGGG-3' (Rev) para oxtre 5'-GGTGGACCAGCCAGACCCCA-3 '(Fwd) e 5'-TGCAGAGCCAGGCGCTTTCC-3' (Rev) para avpr1a. Cada amostra foi normalizada pelo respectivo valor INPUT e os dados são então expressos como uma percentagem de animais tratados com CSF.

Análises estatísticas e processamento de dados

Para as análises de preferência dos parceiros, foram excluídos os animais que apresentaram comportamentos de acasalamento durante o período de coabitação ou com cânulas fora do lugar. Para todas as outras análises moleculares, um máximo de um ponto de dados por grupo biológico foi excluído quando identificado como outlier. A maioria dos experimentos foi replicada, exceto quando os resultados foram muito claros. O tempo gasto em contato lado a lado com qualquer estímulo animal durante o teste de preferência do parceiro foi analisado com um par bicaudal t-teste. Os escores de locomoção foram analisados ​​usando-se um bicaudal t-teste (para dois grupos) ou ANOVA unidirecional (para mais de dois grupos) e, quando apropriado, PLSD de Fischer post-hoc testes foram conduzidos com um limiar de significância P <0.05. Após verificação da normalidade, todos os outros dados foram analisados ​​com um modelo bicaudal t-teste assumindo variâncias iguais ou desiguais testadas previamente. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software StatView (SAS Institute). Quando os dados são padronizados para seus respectivos controles (% de grupos CSF, Saline ou Mating), as análises estatísticas foram realizadas nos dados brutos.

Material suplementar

1

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde Mental (NIMH) concede MHR21-083128 para MK e ZW, e MHR01-058616 para ZW Também agradecemos ao Dr. Maurice Manning pelo generoso presente do antagonista de OTR OTA (T).

Notas de rodapé

 

Conflito de interesses: Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Contribuições do autor

HW, FD e YL realizaram os experimentos. HW e FD analisaram os dados. HW, FD, ZW e MK projetaram o estudo. FD, ZW e MK escreveram o artigo. Todos os autores discutiram os resultados e comentaram o manuscrito.

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